Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Иммунобиологические свойства вируса инфекционного гидроперикардита птиц

I

I

На правах рукописи

Л '

КРОН НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО ГИДРОПЕРИКАРДИТА ПТИЦ

16.00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, литология с микотоксикологаей и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Санкт-Петербург 2003

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте птицеводства.

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук, профессор Алиев Алаутдив Серажутдинович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор Калишин Михаил Николаевич; доктор ветеринарных наук, главный научный сотрудник Бакулин ВалерийАлексавдрович

Ведущее учреждение - Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. ИЭ.Баумана

часов на заседании диссертационного совета д ¿¿и.шу.ш. при санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины.

Защита диссертации

Автореферат разослан

2003г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

Чсркш^ З.Н.

2оо?- А

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Инфекционный гидроперикардит птиц (ИГЛ) - высококонтагиозное вирусное заболевание цыплят, основными признаками которого являются накопление транссудата в перикардиальной полости, гепатит и нефрозо-нефриты. В настоящее время инфекционной гидроперикарцят (ИГЛ) регистрируется в Пакистане (Anjum М.А. et aL, 1989), Индии (Kumar R. et aL, 1997), Ираке (Abdul-Aziz T.A., Al-Attar M.A., 1991), Кувейте, Японии (Abe Т. et al., 1998), Мексике (Borrego J.L., Soto E., 1995), Перу (Fernandez D.M., 1989), Эквадоре (Mazáheri A. et al., 1988), Чили (Toro H. et aL, 1999) и Египте (Azab A. et al., 1992).

С момента установления болезни и до настоящего времени ведутся широкие исследования по изучению морфологии и лммунобиологических свойств возбудителя (Afea! M.R. et ah, 1991; Cowen Rü.,1992), которые имеют большое научное и практическое значение, так как на основе всестороннего изучения свойств возбудителя разрабатываются эффективные методы диагностики и средства специфической профилактики болезни.

Специфическая профилактика ИГЛ занимает ведущее место в борьбе с этой болезнью. За рубежом создана и успешно применяется инактивироваиная вакцина (Chishti М.А. et al., 1989; Anjum A.D.,1990; Ahmad M.I. et al.,1990). В 90-е годы прошлого столетия ъспышки инфекционного гидроперикардита с высоким уровнем смертности регистрировались на территории России (Алиев А.С. с соавт., 1996; Borisov V.V. et al., 1997; Бакулин В.А. с соавт., 1998; Виноходов В.О., 1998).

Цель н задачи работы. Целью настоящих исследований явилось изучение иммунобиологических свойств вируса и конструирование инактивированной вакцины прошв инфекционного гидроперикардита птиц.

В соответствии с поставленной целыо было необходимо рещить следующие задачи:

-провести эпизоотологическое обследование ряда птнцехезяйегв с целью выделения и идентификации вируса ИГП;

- изучить иммунобиологические свойства вируса ИГП;

- испытать реакцию диффузионной преципитации для диагностики ИГП;

- изучить антигенные свойства вируса ИГП;

- изучить физико-химические и морфологические свойства вируса ИГП;

-разработать технологию изготовление и контроля инактивированной вакцины против ИГП; -разработать схему иммунизации;

-провести испытания вакцины в лабораторных и производственных условиях.

Научная новизна. Впервые в нашей стране проведено изучение морфологии, физико-химических и иммунобиологических свойств возбудителя ИГП; доказана инфекционная природа болезни, выделен и охарактеризован инфекционный агент.

Установлена патогенность вируса ИГП для эмбрионов кур, а также цыплят и перепелят.

Изучены эпизоотологические особенности болезни (возрастная восприимчивость цыплят и некоторые пути передачи возбудителя), клинические признаки и патологоанатомические изменения у больных цыплят в экспериментальных и производственных условиях.

Определена диагностическая ценность реакции диффузионной преципитации (РДГ1) при ИГП.

Разработана инакпшированная вакцина для специфической профилактики ИГП.

Практическая ценность. Разработана технология изготовления и контроля инактивнрованной вакцины и предложена эффективная схема профилактики болезни.

Вопросы, выносимые на защиту.

1 .Инфекционная природа болезни птиц с признаками гидроперикардит

2 .Характеристика иммунобиологических свойств штамма "АДВ":

-чувствительность культуры клеток к заражению вирусом;

- патогеииоегь для эмбрионов кур и цыплят;

- распределение вируса в органах и тканях экспериментально зараженных эмбрионов кур и цыплят.

3.Обоснование выбора чувствительной системы для титрации штамма "АДВ".

4.Эффективность реакции диффузионной преципитации для диагностики ИГП.

5.Характеристика антигенных свойств штамма "АДВ".

6.Характеристика физико-химических свойств штамма "АДВ":

- устойчивость к воздействию различных температур;

.H.'Si..-; £

«г е.-

- устойчивость к эфиру, хлороформу, формалину и изменению рН среды.

7.Характеристика морфологических свойств вируса ИГЛ.

8.Техн алогические параметры изготовления, у слови», схема применения и контроль инактивированной вакцины против ИГП из штамма "АДВ".

Апробация работы. Основные -положения диссертации доложены на Методических к Ученых советах Всероссийского ветеринарного НИИ птицеводства (1996-2003); на научно-производственной конференции, посвященной 190-летию высшего ветеринарного образования в России и 100-летию ветеринар«ой науки (г.Санкт-Петербург, 1998), и на научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудник«» и аспирантов Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины (г.Санкт-Пегербург, 2003).

Публикация ясслсдсмяяй. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Структура и объем, работы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 7 фотографиями, 24 таблицами н 3 рисунками. Список литературы включает 151 источник, в том числе 121 зарубежный.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1.Материалы и методы

Вирусный мягтертл. Патологический материал получали из птицефабрик, в которых наблюдался повышенный отход птиц с признаками пвдроп ери кардита: "Буранная" и "С ооновская" Челябинской области, "Красноярская" Красноярского края, Тайская" Оренбургской области, "Владимирская" Владимирской области, "Петрозаводская" республики Карелия, "Фягежская" Курской области, "Чебоксарская" республики Чувашия, "Светлый путь" Липецкой области, "Роскар" Ленинградской области и "Лебедевская" Новосибирской области.

Изолят выделяли путем заражения бройлеров в возрасте 15 суток гомогенатом печени, полученным от павших цыплят, и дополнительно исследовали при помощи электронной микроскопии.

Для проведения опытов и изготовления инактивироваяной вакцины использовали штамм "АДВ" вируса ИГП, выделенный из печени цыплят, павших с явлениями гидроперикардита во время вспышки заболевания на птицефабрике "Сосновская" Челябинской области. Штамм был получен путем проведения пяти последовательных пассажей на 15-суточных цыплятах.

Подопытные животные. В лабораторных исследованиях было использовано 100 цыплят, выведенных из эмбрионов СПФ-кур (фирма "Ломанн" Германия), 1600 цыплят-бройлеров кроссов "Бройлер-6|", "Смена-2", "Арбор", "Барос-123", 50 цыплят породы белый леггорн и 50 перепелят.

Культуры клеток и куриные эмбрионы. В опытах использовали: первичную культуру фибробластов эмбриональных кур (ФЭК), а также 300 развивающихся эмбрионов СПФ-кур 5-11-суточной инкубации (фирма "Ломанн" Германия).

Постановка реакции диффузионной преципитации при инфекционном гидроперикардите птиц. Реакцию даойной иммунодиффуэин (РДП) в агаровом геле ставили по методу, предложенному Оухгерлоии (1948).

В качестве положительного антигена использовали 10%-ный гомогенаг печени павших с признаками ИГП цыплят.

Гипериммунную сыворотку получали путем введения цыплятам вначале инакгивированного формалином, а затем патогенного вируса в нарастающих объемах (0,3мл, 0,5мл и 1мл). Биологическая активность вируса составляла 4,21цИД5о/мл.

Изучение устойчивости вируса ИГП к воздействию физико-химических факторов. Устойчивость к физико-химическим факторам исследовали по следующим критериям: -к действию различных температур {-18°С,+40С+37°С, +56°С); -к действию эфира (метод Andrewes С.Н., Horstmann D.M., 1949); -к Действию хлороформа (мегодТеМтап H.A., Wang S.S., 1961); -к действию 10%-ного раствора формалина (по общепринятой методике);

-к действию pH среды в диапазоне от 3 до 10. Нужную концентрацию водородных ионов устанавливали с помощью 0, IN HCL и 0, IN NaOH.

О влиянии физико-химических факторов на вирус судили по результатам титрации на 6-суточных эмбрионах СПФ-кур до и после воздействия указанных веществ.

Морфологические свойства возбудителя Hill изучали во Всероссийском НИИ особо чистых препаратов. Материалом для электронно-микроскопического исследования служили иэоляты, выделенные из патматериала птицефабрик "Красноярская", "Сосновская", "Буранная", "Петрозаводская" и "Фатежская". Для этого гомогенаты печени обрабатывали методом негативного контрастирования noNerm«it(1975).

Изготовление и контроль опытных образцов инактивнрованной

вищвны.

В качестве антигена для изготовления инактивироианной вакцины использовали 10%-пый гомогенат печени цыплят, экспериментально зараженных ИГЛ. Для наиболее полного выхода вируса из клеток гомогенат нечени дополнительно обрабатывали ультразвуком. Инактивацию вируссодержащего материала проводили 10%-ным водным раствором формалина. При изучении условий инактивации вируса ИГЛ использовали различные концентрации формалина (0,05%-0,5%), разный температурный режим и различную экспозицию с инактиватором. Полученную суспензию термостагаровали при +37® С и при- +4°С в течение 48 тагов при равномерном перемешивании. В процессе инактивации, через определенные промежутки времени (12, 24, 36 и 48 часов) отбирали пробы обработанного инактиватором материала и приостанавливали процесс инактивации 20%-ным раствором тиосульфата натрия. Для изготовления сорбированной формы вакцины использовали стерильный коллоидный 2%-ный тель -гидроокиси алюминия (ГОД), который смешивали с инактивированным вирусом ИГП до конечной концентрации от 0,5 до 1,5%.

Контроль качества вакцины против ИГП включает определение стерильности, полноты шактивации вируса, безвредности, антигенной и иммуногенной активности.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ

2.2.1 .Эпиэооггалогическое обследование пцетпйств.

Впервые инфекционный гидроперикардвт (ИГЛ) в нашей стране был зарегистрирован в 1992г. на птицефабрике "Сосновская" Челябинской области (Алиев А.С. с соаяг, 1996).

В 1998г. нами было проведено эпизоотадогическое обследование п/ф "Петрозаводская" республики Карелия. В данном хозяйстве резко увеличился падеж цыплят-бройлеров в возрасте 30-40 суток от болезни невыясненной этиологии. Заболевание прошлялось отказом от корма, сонливостью, вялостью, азьерошенностыо оперения и быстрой потерей массы тела. Некоторые цыплята погибали внезапно без проявления клинических признаков. Продолжительность болезни составляла 7-10 суток. Заболеваемость и смертность нарастали быстро, достигая максимума на 3-4 день, в течение последующих 6-7 суток отмечали снижение заболеваемости и гибель птиц прекращалась. Отход птицы от болезни в разных партиях составлял от 12,5 до 19,2%. При вскрыши павших цыплят обнаруживали истеричность подкожной клетчатки и внутреннего жира, скопление в перикардиальяой полости прозрачного соломенно-желтого транссудата водянистой шш желеподобной консистенции, тепатиты различной степени тяжести, отечность легочной ткани, увеличенные почки с контурированными мочеточниками, увеличение селезенки, бледное окрашивание костного мозга.

В период с 19% по 2000гг. мы наблюдали заболевание со сходной патологоан атомической картиной на бройлерных птицефабриках "Буранная" Челябинской области, "Красноярская" Красноярского края, "Чебоксарская" Чувашии, "Светлый путь" Липецкой области, "Фатежская" Курской области и на птицефабрике "Лебедевская" Новосибирской области, а также на яичных птицефабриках 'Тайская" Оренбургской области, "Владимирская" Владимирской области и птицефабрике "Роскар" Ленинградской области. Во всех выше перечисленных птицехозяйствях от трупов цыплят были отобраны пробы печени, из которых изготавливали гомогенат. После проверки на стерильность гомогенат подкожно вводили цыплятам-бройлерам 15-суточного возраста в объеме 0,3мл. В ходе проведения экспериментов мы установили, что клиническое проявление заболевания и гибель цыплят с патологоанатомическими

изменениями, аналогичными выявленным в хозяйствах, имели место при заражении гомогенатами печени от павших цыплят из птицефабрик "Красноярская", "Сосновская", "Буранная", "Петрозаводская" н "Фатежская".

Инкубационный период ври экспериментальном заражении составлял 2-3 суток. Заболевание характеризовалось расстройством рефлекторной возбудимости, общей депрессией дтицы (вялость, скученность, сонливость, угнетение, отказ от корма, группирование цыплят и адинамия). Гибель птицы иногда происходила до проявления клинических признаков. Отход а условиях эксперимента отмечался в течение короткого периода времени - с третьего по шестой день после заражения. Уровень смертности составлял от 55 до 70%.

Результаты биопробы при исследовании патматериага из остальных тггицехозяйств были отрицательными, что указывает на необходимость лабораторного подтверждения диагноза ввиду полиэтиологичности синдрома "гидроперикардит".

Результаты исследований по установлению инфекционного гидроперикардита птиц в России вскоре были подтверждены другими исследователями (Бакулин В.А. с соакг., 1998; Вииоходов В.О. с соавт., 1998; Сурнев Д.С. с соаат., 2000; Вопво* У.У. еХ а!., 15»97).

Изучение клинических признаков, течения болезни, а также пагсшого анатомических изменений у цыплят после экспериментального заражения вирусом инфекционного гидроперикардита птиц дает ответ на вопрос о возможности применения биологической пробы для диагностики заболевания.

Данные по заражению цыплят материалом различного происхождения показали, что наиболее высокий уровень смертности (70%) вызывал изолят "Сосновская", поэтому для дальнейших исследований использовали штамм "АДВ", полученный из этого изолята путем пятикратного пассажирования на 15-суточных цыплятах. Для заражения цыплят использовали разведение вируса 1:10 в объеме 0,3мл. Цыплят-бройлеров в возрасте 15 суток заражали штаммом "АДВ" внутривенно, подкожно, внутримышечно, перорально, а также контактно. Контактное заражение осуществлялось путем совместного содержания ннтшетной и зараженной птицы.

Инкубационный период был минимальным при парентеральном введении вируса (2-3 суток), а при пероральыом и контактном заражении более продолжительным и составил - 5-6 суток. Отход

среда больных цыплят колебался в широких пределах, от 20% до 90%, и зависел от метода введения вируса. Так, наиболее низкие показатели отхода птиц выявлены при контактном и пероральном заражении цыплят - 20% и 30% соответственно. Парентеральное введение вируса всегда приводило к массовой гибели зараженной птицы. Отход при этом был равен 70-90%. Продолжительность заболевания обычно составляла 5-7 суток, после чего общее состояние _цыплят начинало постепенно улучшаться и клинические признаки угасали, однако переболевшая птица значительно отставала в росте и развитии.

На основании результатов проведенных опыте® при постановке биопробы рекомендуем парентеральный метод введения вируса.

При изучении чувствительности цыплят разного возраста и пород установили, что наиболее восприимчивыми к экспериментальному заражению являются цыплята 1-10-суточдого возраста. С увеличением возраста птиц происходило снижение чувствительности к вирусу.

Цыплята яичных пород были менее восприимчивы к заражению, чем цыплята мясных кроссов. В производственных условиях вспышек этого заболевания среди цыплят яичных пород или несушек мы не наблюдали, хотя в литературе имеются отдельные сообщения (АИйаг 8. е! а1„ 1992).

Инкубационный период у перепелят составил 48 часов. Заболевшие перепелята переставали потреблять корм, становились вялыми, оперение было взъерошено. Падеж наблюдался на протяжении 3-5 суток и составил 40%. У пявптих птиц наблюдались очаги некроза в печени. Признаков гидроперикардита при заражении перепелят нами зарегистрировано не было.

Для определения локализации вируса в органах павших цтиц использовали гомогенаты печени, почек, бурсы Фабрициуса и перикардиальную жидкость, которые вводили цыплятам-бройлерам 15-суточного возраста.

В ходе выполнения эксперимента было установлено, что заболеваемость и гибель цыплят происходили при введении им гомогената печени. Это послужило основанием рекомендовать отбор печени от больной и павшей птицы для проведения лабораторной диагностики на инфекционный гидроперикардит птиц.

2.2.2.Культнвирование штамма "АДВ" вируса И111.

Штамм "АДВ" вируса инфекционного гидронерикардита лтиц оказался патогенным для 6-суточных эмбрионов СПФ-кур, зараженных в желточный мешок. При этом наблюдали их гибель, отставание в росте и развитии, а также разлитые геморрагии на коже головы, тела и конечностей, отеки головы, подчелюстного пространства и брюшной полости.

Специфическая гибель эмбрионов при заражении в желточный мещок в первом пассаже начиналась на 5 сутки после заражения и составляла 43%. С увеличением количества проведенных пассажей вируса инкубационный период сокращался и увеличивался нроцент павших эмбрионов. Так, в восьмом пассаже инкубационный нериод был равен трем дням ж отход составил 97%. Материал третьего пассажа использовали для определения инфекционной активности вируса. По итогам титрования инфекционная активность штамма "АДВ" вируса ИГЛ в третьем пассаже составила Э,91§ЗДДзд/мл.

При вскрытии зародышей отмечали изменения в печени. Печень у погибших на 3-4 сутки была увеличена, кровенаполнена, темного цвета, а в более поздний срок (5-6 суток) - желто-коричневого цвета со множеством некротических очажков (пятнистая). ХАО » единичных случаях были отечны и непрозрачны.

При введении вируссодержжцего материала в аллшггокеную полость и на ХАО эмбрионов специфические признаки поражения исчезали во втором или. в третьем пассажах, что свидетельствовало о низкой адаптационной способности возбудителя при этих методах инокуляции.

Была изучена тропностъ вируса к тканям печени, хориоаллантоисной оболочки и кожно-мышечной ткани эмбрионов кур. Для этого производили заражение в желточный мешок гомогенагами указанных тканей, полученных от павших эмбрионов.

В ходе проведения эксперимента было установлено, что характерные паггологоан атомические изменения и гибель эмбрионов наблюдались только при заражении их гомогенатом печени.

Дня исключения контаминации гемагтлютинирующими вирусами материал на всех этапах культивирования на куриных эмбрионах проверяли в реакция гемагглютинации.

Исследования показали, что штамм "АДВ" вируса ИГЛ не вызывал агглютинации эритроцитов петуха, барана, кролика, лошади и кпупиого тнтгатого скота.

Первично-трипсинизированная культура клеток фиброблдстов эмбриональных кур (ФЭК) оказалась непригодной для культивирования вируса ИГО, так как видимое цитопатическое действие вируса не наблюдали в течение пята последовательных пассажей вируса в ФЭК. Отсутствие вируса в культуре было подтверждено заражением 6-суточных эмбрионов СПФ-кур в желточный мешок.

Результаты опытов по культивированию вируса ИГЛ в развивающихся эмбрионах СПФ-кур дают возможность использовать этот метод для титрования вируса. Однако высокая стоимость и трудность доставки не позволяет рекомендовать их для широкой практики, поэтому нами была проведена серия опытов по определению пригодности цыплят для этих целей.

В предыдущих опытах было установлено, что наиболее восприимчивыми к экспериментальному заражению являются цыплята 1-10-суточвого возраста, поэтому для ппрации вируса использовали цыплят-бройлеров суточного возраста.

Биологическая активность вируса при титрации его на цыплятах составила 4,21§ИД5о/мл. Таким образом установлено, что цыплята-бройлеры могут быть использованы для титрации.

ШЛрнмевенис реакции диффузионной преципитации (РДП) для диагностики ИГП.

В исследованиях была изучена возможность применения РДП с целью ретроспективной диагностики инфекционного гидроперикардита птиц.

В предварительных опытах изучали оптимальные условия постановки РДП при инфекционном гидроперикардите птиц. В качестве антигена использовали гомогенат печени.

Установили, что оптимальными условиями для постановки РДП при инфекционном гидроперикардите птиц являются: концентрация агарового геля-1,5%, 8% концентрация хлористого натрия, толщина агаровой пластинки - 3-4мм, расстояние между лунками-5-8ш-1 и температура +37°С. Для постановки реакции антиген необходимо использовать в исходной концентрации, а иммунную сыворотку в рабочем разведении. Предварительный учет реакции производится через 12 часов, окончательный - через 24- часа. Выполнение перечисленных условий обеспечивает наиболее быстрое и четкое проявление линий преципитации.

С целью изучения распространения аденовирусов были исследованы в РДП с антигеном ИГП сыворотки крови птиц, доставленные из 11 благополучных по ИГТТ птицефабрик различных областей России. Всего было исследовано 623 пробы сывороток. В 105 случаях реакция была положительная, что составляет 16,9% от общего количества.

Перекрестное исследование в РДП изолхгов, полученные от павших цыплят птицефабрик "Сосновская", "Буранная", "Красноярская", "Петрозаводская" и "Фатежская" показало их антигенную идентичность.

2.2.4. Изучение антигенных свойств штамма "АДВ" вируса ИГП.

Сроки появления и динамика накопления вируцирецииширующих антител у цыплят, зараженных вирусом ИГП, имеют важное значение при проведении серологических исследований.

Для изучения этого вопроса был проведен следующий опыт. 70 цыплят-бройлеров кросса "Бройлер-61" 15-суточного возраста, серо негативных к штамму "АДЕ", заразили подкожно вирусом с инфекционной активностью 4,2%ИД»/мя в объеме 0^3 мл. 10 цыплят такого же возраста использовали в качестве контрольных. В результате заражения в опытной группе погибло 48 голов. У выживших, цыплят опытной группы, а также у контрольных производили взятие крови на 6 и 7 сутки после заражения, а затем через каждые 7 суток в течение 77 дней и исследовали сыворотки в реакции диффузионной преципитации.

В ходе проведения опыта было установлено, что у цыплят, зараженных штаммом "АДВ", преципитирующне антитела появлялись на 7 сутки после заражения, достигали максимума на 21 cynpi и массово выявлялись до 42 дня после заражения.

2.2.5.Изучение стеяеян устойчивогш штамма "АДВ" вируса ИГП к воздействию физике диидчсскнж фмсгаров.

Инфекционная активность вируса Hill не снижалась при хранении в замороженном состоянии (при -18°С) в течение двух лет (срок наблюдения).

Хранение вируса при температуре +4°С вызывало снижение инфекциониости в 1,9 раза через 1 месяц, а в конце 4 месяца храпения препарат становился неинфекционным.

При температуре +37°С материал утрачивал инфекционные свойства через 7 суток.

Вирус сохранял инфекционную активность при воздействии температуры +56°С в течение 30 минут. Резкое снижение инфекционности происходило через 2 часа, а через 4 часа вирус полностью инактивировался.

Воздействие эфира, хлороформа и изменения рН среды в диапазоне от 3 до 10 не снижали инфекционную активность вируса.

С целью подбора эффективного инактиватора нами было изучено действие раствора формалина на вирус ИГЛ. Установлено, что оптимальная конечная концентрация формалина для инактивации вируса ИГЛ - 0,1% и экспозиция 24 часа при температуре -КУ7°С. При таком режиме инактивации преципитирующая активность вируса соответствовала активности наганного препарата, в то время- как концентрация 0,2% и выше снижала антигенную активность. Формалин в этой концентрации обеспечивал получение стерильной вирусной суспензии при посеве на твердые и жидкие питательные среды.

2.2.6.Изучение морфологических свойств штамма "АДВ* вируса

ИГЛ.

При электронно-микроскопическом исследование в исследуемых образцах выявляли отдельные вирионы (полные и интактные) или их скопления, имеющие форму икосаэдра. Вирионы не имели суперкаясидной оболочки, нуклеотид был покрыт одним слоем капсомеров и каждая грань содержала по б капсомеров.

Анализ данных, полученных в ходе исследований, показал, что выявляемые в электронном микроскопе вирусные частицы имеют одинаковую морфологическую структуру, характерную для семейства аденовирусов. Вирусов из других семейств выявлено не было.

2.2.7.Технологня изготовление, схема применения я контроль инактивироваиной вакцины.

Для производства ятгцины использовали гомогеаат печени от павших цыплят с признаками ИГЛ. Биологическая активность

вируссодержащего материала составляла не менее 4,2 {¡¿ИДя/мл и преципитирующая активность от 1:8 и выше.

В качестве инактаватора использовали раствор формалина в конечной концентрации 0,1%.

Образцы вакцин готовили из инакгивированной вируссодержащей суспензии, которую соединяли с гелем гидрата окиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации от 0,5 до J,5%. В качестве контроля использовали инактивированный препарат без ГОА. Антигенную активность препаратов контролировали; на цыплятах 15-суточного возраста через 21 сутки после введения препаратов в РДП с антигеном вируса ИГЛ.

Установлено, что антигенная активность вакцины повышалась с увеличением содержания ГОА. Наименее выраженный иммунный ответ отмечали у цыплят, привитых антигеном без адъюванта (0,43±0,1 log2 в РДП). Наиболее высокие титры антител были установлены при введении препаратов содержащих 1 и 1,5% ГОА, причем различия в уровне антител у цыплят, пришлых этими препаратами были несущественны.

Таким образом, было установлено, что оптимальным количеством ГОА в вакцинном препарате следует считать концентрацию 1%.

Опытные серии вакцины изготавливали по трем прописям. Для этого антиген разводили фосфатным буфером в соотношениях J Ú, 1:3 и 1:4, а затем добавляли равный объем ГОА.

Вакцины вводили подкожно в объеме 0,3мл в область нижнем трети, шеи.

Иммуногенносгь вакцин оценивали по результатам контрольного заражения цыплят вирусом ИГП через 21 день после вакцинации.

На основании полученных результатов, при изготовлении инактивированной вакцины против ИГП, использовали следующую пропись: антигена - 17%, фосфатного буфера - 33% и гидроокиси алюминия - 50%.

Оптимальную дозу препарата определяли на 15-суточных цыплятах путем подкожного или внутримышечного введения вакцины в разных объемах. Иммуногенную активность оценивали через 21 сутки после вакцинации контрольным заражением патогенным штаммом возбудителя. Проведенные исследования показали, что введение вакцины в объемах 0,3мл и 0,5мл обеспечивало 100%-я у ю

защиту цыплят от контрольного заражения, независимо от метода введения препарата.

Для изучения продолжительности поствакцинального иммунитета и влияния кратности вакцинации на ее эффективность использовали цьшдят-бройлероа 10- и 15-суточного возраста, серонегативных к вирусу ИГЛ.

На основании полученных результатов сделали »»""", что вакцинация цыплят в 15-суточном возрасте вызывает более продолжительный и напряженный иммунитет, чем вакцинация в 10-суточном возрасте. При »«^шишт щщлят в 10-суточном возрасте необходимо проводить повторную вакцинацию через 10 суток.

Контроль вакцины осуществляли по следующей схеме:

1.на стерильность - путем высева на питательные среды (МПА, МПБ, МППБ под вазелином и бульон Сабуро) согласно ГОСТу 2808589;

2.на полноту инактивации вируса - путем подкожного введения по 0,3мл цыплятам 15-суточного возраста;

3.на безвредность - путем введения 10-краггаой дозы препарата 15-сугочным цыплятам;

4.на антигенную активность - путем определения титра прецишшшов через 21 день после вакцинации;

5.на иммуногенность - по уровню специфической защиты цыплят от действия патогенного вируса при контрольном заражении.

2.2.8.Иепытанне ишянмрммиоН вакцины в экспериментальных и производственных условиях.

В экспериментальных условиях комиссионные испытания вакцины проводились на базе ВНИВИП согласно цро1рамме утвержденной 28 апреля 2003г. директором института. Для проведения испытаний были изготовлены три опытные серии препарата.

Результаты проверки показали, что все три серии испытуемой вакцины были свободны от посторонней микрофлоры, авирулеитны для цыплят 15-сугочного возраста и не вызывали у привитых птиц осложнений местного или общего характера. Вакцина обладает антигенной и иммуногеиной активностью и обеспечивает специфическую защиту привитого поголовья цыплят от заражения вирулентным штаммом вируса ИГЛ.

Производственные испытания опытных серий вакцины проводили на двух птицефабржах мясного направления, в которых наблюдали острое течение ИГЛ, подтвержденное вирусологическими и серологическими исследованиями.

На птицефабрике "Петрозаводская" вакцина была применена на поголовье 350 тысяч цыплят 15-суточного возраста. В качестве контроля служили 30 тысяч невакцинированных птиц из этой же партии. В ходе испытаний вакцины признаков манифестации ИГП у привитой птицы не регистрировалось на всем протяжении выращивания бройлеров, в то время как в контрольной труппе имело место переболевание цыплят с характерной для ЖП клиникой и картиной патвскрытия. Общий экономический эффект от применения вакцины составил 235 тысяч рублей.

В период с 27 февраля по 10 апреля 2000г. вакцину применяли на птицефабрике "Красноярская" Красноярского края на поголовье 200 тысяч цыплят-бройлеров 15-суточного возраста кросса "Сибиряк". Вакцину вводили подкожно в область нижней трети шеи в объеме 0,3мл. В качестве контрольных использовали 20 тысяч голов цыплят такого же возраста, не вакцинированных против данной болезни.

В результате применения вакцины установлено, что вакцина обеспечивает повышение сохранности птиц на 11%, увеличение среднесуточного привеса на 3 грамма и уменьшение затрат корма на 1 центнер привеса на 0,13 ц.кг.ед. Общий экономический эффект от применения вакцины составил 75 тысяч рублей.

Таким образом, применение инактивированной вакцины позволило купировать инфекцию за короткий промежуток времени, что чрезвычайно важно в условиях высокой концентрации птиц, а также предупредить распространение болезни в другие птицехозяйства. Оздоровление данных птицефабрик от ИГП было достигнуто без смены всего птицепоголовья.

ВЫВОДЫ

1 .Проведенные комплексные исследования позволили установить инфекционную природу заболевания цыплят-бройлеров с признаками гидроперикардита.

2.Изучены эпизоотологические особенности болезни (возрастная восприимчивость цыплят и некоторые пути передачи возбудителя), клинические признаки и пагологоанатомические изменения у больных цыплят в экспериментальных и производственных условиях.

3.Выделенные от больных цыплят пять изолятов возбудителя ИГЛ идентичны в антигенном отношении и по своим биологическим и морфологическим свойствам являются типичными представителями семейства аденовирусов.

4.0пределены оптимальные условия постановки РДП для ретроспективной диагностики ИГП: концентрация агара-1,5%, концентрация хлористого натрия - 8%, толщина агаровой пластицки -3-4мм, расстояние между лунками - 5-8мм и температура окружающей среды + З^С-Предварительный учет реакции проводится через 12 часов, окончательный - через 24 часа. Для постановки реакции антиген берут в исходной концентрации, а иммунную сыворотку - в рабочем разведении.

5 .Установлены параметры инактивации вируса ИГП под действием раствора формалина: конечная концентрация -0,1% в течение 24 часов при температуре +37°С.

6.На основе штамма "АДВ" разработана технология изготовления и контроля инактивированной сорбированной вакцины против ИГП.

7.Испытания вакцины в лабораторных и производственных

условиях показали высокую эффективность препарата и возможность /_

его применения дня специфической профилактики ИГ71 в неблагополучных птицехозяйствах.

8.В зависимости от эпизоотической ситуации и срока выращивания бройлеров в хозяйстве рекомендуется однократная вакцинация цыплят в возрасте 15 суток или двукратная в возрасте 10 и 20 суток.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1.На основании проведенных исследований предлагаются методические рекомендации "Инфекционный гидроперикардит у цыплят-бройлеров" по диагностике заболевания для использования в

работе научно-исследовательских учреждений и производственных ветеринарных лабораторий.

2.Разработана технология изготовления и контроля инактивированной сорбированной вакцины против ИГЛ птиц из штамма "АДВ".

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Никитина Н.В.

Гидроперикардит - инфекционная болезнь || Всероссийская конференция молодых ученых и аспирантов по птицеводству. Тезисы докладов. Сергиев Посад.-1996.- С.20.

2.Алиев A.C., Никитина Н.В.

Диагностика и специфическая профилактика инфекционного гидроперикардита птиц || Мат. научно-производственной конференции, посвященной 190-летию высшего вет. образования в России и 100-летаю вет. науки. С-Петербурп -1998. - 4.1. - С. 14-15

3.Алиев A.C., Сираждинов P.C., Никитина Н... Алиева А.К. Клинико-анатомическая характеристика инфекционного гидроперикардита птиц || Мат. Международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию Ставропольской НИВС. Ставрополь. -1999. -С.34-35.

4. Алиев A.C., Сираждинов P.C., Никитина Н.В. Инфекционный гидроперикардит у цыплят-бройлеров || Методические рекомендации, С-Петербург,- 2000.-20 с.

5 .Алиев A.C., Крон Н.В., Кузьмин. В. А. Чувствительность нытигг-бройлеров к экспериментальному заражению вирусом инфекционного гидроперикардита Ц Мат. научн. конф. СПБГАВМ. С-Петербург. - 2003. - С.7-8.

6. Alijev A.S., Djavadov E.D., Nikitma N. V. Aetiology of hydropericardium in broiler chicks Ц Proc. XTth bit Congr. of the World Veterinaiy Poultry Ass., Hungary, Bukest. - 1997. - P.257.

7. Alijev A.S., Nikitina N.V. Specific prophylactic of chicken infectious hydroperycardium J Proc. 10th Evropean Poultry Conf., Israel, Jerusalem. - 1998. - P.71.

2.оо5

* 19699

Отпечатано копировально-множительным участком отдела обслуживания учебного процесса физического факультета СПбГУ. Приказ № 571/1 от 14.05.03. Подписано в печать 21.11,03 с оригинал-макета заказчика. Ф-т 30x42/4, Усл. печ. л. 1,25. Тираж 100 экз., Заказ № 056/с 198504, СПб, Ст. Петергоф, ул. Ульяновская, д. 3, тел. 428-43-00.

Аюуальность работы. Особенную опасность для птицеводства в настоящее время представляют болезни вирусной этиологии. Недостаточная изученность, высокая контагиозность, разнообразие путей передачи вирусов вынуждают отнести вызываемые ими заболевания к числу важнейших, требующих исключительного внимания со стороны ветеринарной науки и практики.

Инфекционный гидронерикардит птиц - высококонтагиозное вирусное заболевание цыплят, основными признаками которого являются накопление транссудата в нерикардиальной полости, гепатит и нефрозо-нефриты. В настоящее время инфекционный гидроперикардит ( ИГП ) регистрируется в Пакистане (Anjum MA. et al., 1989), Индии (Kumar R. ct al., 1997), Ираке (A)>dul-Aziz T.A., Al-Attar M.A., 1991), Кувейте, Японии (Abe Т. et al., 1998), Мексике (Borrego J.L., Soto E., 1995), Перу (Fernandez D.M., 1989), Эквадоре (Mazaheri A. et al., 1988),Чили (Toro H. et al., 1999) и Египте (Azab A. et al., 1992). Первые вспышки ИГП в России наблюдались в бройлерных хозяйствах Челябинской области и Красноярского края (Алиев А.С. с соавт.,1996; Борисов В.В. с соавт., 1997; Бакулин В.А. с соавт., 1998; Виноходов В.О. с соавт.,1998).

Экспериментально доказано, что в возникновении ИГП доминирующая роль принадлежит высокопатогенной группе аденовирусов.

Степень тяжести ИГП в природных условиях во многом зависит от влияния р^оторых иммунодепрессивных агентов, таких как вирус инфекционной бурсаш>ной болезни, болезни Марека и инфекционной анемии цыплят.

С момента открытия болезни и до настоящего времени ведутся широкие исследования по изучению морфологии и иммунобиологических свойств возбудителя, устойчивости его к физико-химическим факторам и устойчивости во внешней среде (Afzal M.R. et al.,1991; Cowen B.S.,I992), которые имеют большое научно-теоретическое и практическое значение, так как на основе всестороннего изучения свойств возбудителя разрабатываются эффективные методы диагностики и средства специфической профилактики болезни.

За рубежом создана и успешно применяется инактивированая вакцина для профилактики ИГП (Chishti М.А. et al.,1989; Anjum A.D., 1990; Ahmad MX et al.,1990). В связи с отсутствием доступной и эффективной вакцины в нашей стране, ИГП наносит значительный экономический ущерб бройлерному птицеводству и это послужило основанием при выборе направления нашей работы.

Цель и задачи работы. Целью настоящих исследований явилось изучение иммунобиологических свойств вируса и конструирование инактивированной вакцины против инфекционного гидроперикардита птиц.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. провести эпизоотологическое обследование ряда птицехозяйств с целью выделения и идентификации вируса ИГП;

2. изучить иммунобиологические свойства вируса ИГП;

3. испытать реакцию диффузионной преципитации для диагностики ИГП;

4. изучить антигенные свойства вируса ИГП;

5. изучить физико-химические и морфологические свойства вируса

ИГП;

6.разработать технологию изготовления и контроля инактивированной вакцины против ИГП;

7. разработать схему иммунизации;

8. провести испытания вакцины в лабораторных и производственных условиях.

Научная новизна. Впервые в нашей стране проведено изучение морфологии, физико-химических и иммунобиологических свойств возбудителя ИГП, доказана инфекционная природа болезни, выделен и охарактеризован инфекционный агент.

Установлена натогенность вируса ИГП для эмбрионов кур, а также цыплят и перепелят.

Выявлены эпизоотологические особенности болезни (возрастная восприимчивость цыплят и некоторые пути передачи возбудителя), клинические призиаки и патологоанатомические изменения у больных цыплят в условиях птицехозяйств и в эксперименте.

Проведена оценка диагностической ценности РДП при ИГП.

Разработан эффективный препарат для специфической профилактики

ИГП.

Практическая ценность. Разработана технология изготовления, схема применения и контроль инактивированной вакцины для специфической профилактики ИГП.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Методических и Ученых советах Всероссийского ветеринарного НИИ птицеводства, (1996-2003); на научно-производственной конференции, посвященной 190-летию высшего ветеринарного образования в России и 100-летию ветеринарной науки, г.Санкт-Петербург (1998) и на научной конференции профессорско-преподавательского состава, лаучных сотрудников и аспирантов СПБГАВМ, г.Санкт-Петербург (2003).

Публикация исследований. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введепия, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 7 фотографиями, 24 таблицами и 3 рисунками. Список литературы включает 151 источник, в том числе 121 зарубежный.

Вопросы, выносимые на защиту.

1.Инфекционная природа болезни птиц с признаками гепатита/гидроперикардита.

2. Характеристика иммунобиологических свойств штамма "АДВ":

- чувствительность культуры клеток к заражению вирусом;

- патогенность для эмбрионов кур и цыплят;

- распределение вируса в органах и тканях экспериментально зараженных эмбрионов кур и цыплят.

3. Обоснование выбора чувствительной системы для определения биологической активности штамма "АДВ".

4. Эффективность реакции диффузионной преципитации для диагностики ИГП.

5. Характеристика антигенных свойств штамма "АДВ".

6. Характеристика физико-химических свойств штамма "АДВ":

- устойчивость к воздействию различных температур;

- устойчивость к эфиру, хлороформу, формалину и изменению рН среды.

7. Характеристика морфологических свойств вируса ИГП.

8. Технологические параметры изготовления, схема применения и контроль инактивированной вакцины против ИГП.

110 выводы

1 .Проведенные комплексные исследования позволили установить инфекционную природу заболевания цыплят-бройлеров с признаками гидроперикардита.

2.Изучены эпизоотологические особенности болезни (возрастная восприимчивость цыплят и некоторые пути передачи возбудителя), клинические признаки и патологоанатомические изменения у больных цыплят в экспериментальных и производственных условиях.

3.Выделенные от больных цыплят пять изолятов возбудителя ИГП идентичны в антигенном отношении и по своим биологическим и морфологическим свойствам являются типичными представителями семейства аденовирусов.

4.0нределены оптимальные условия постановки РДП для ретроспективной диагностики ИГП: концентрация агара-1,5%, концентрация хлористого натрия - 8%, толщина агаровой пластинки — 3-4мм, расстояние между лунками - 5-8мм и температура окружающей среды - + 37°С.Предварительный учет реакции проводится через 12 часов, окончательный - через 24 часа. Для постановки реакции антиген берут в исходной концентрации, а иммунную сыворотку - в рабочем разведении.

5.Установлены параметры инактивации вируса ИГП под действием раствора формалина: конечная концентрация 0,1% в течение 24 часов при температуре +37°С.

6.На основе штамма "АДВ" разработана технология изготовления и контроля инактивированной сорбированной вакцины против ИГП.

7.Испытания вакцины в лабораторных и производственных условиях показали высокую эффективность препарата и. возможность его применения для специфической профилактики ИГП в неблагополучных птицехозяйствах.

Ill

8.В зависимости от эпизоотической ситуации и срока выращивания бройлеров в хозяйстве рекомендуется однократная вакцинация цыплят в возрасте 15 суток или двукратная в возрасте 10 и 20 суток.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1.Ha основании проведенных исследований предлагаются методические рекомендации "Инфекционный гидроперикардит у цыплят-бройлеров" по диагностике заболевания для использования в работе научно-исследовательских учреждений и производственных ветеринарных лабораторий.

2.Разработана технология изготовления и контроля инактивированной сорбированной вакцины против Ш11 тггиц-из штамма "АДВ".