Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Фармако-токсикологические свойства и применение левотила при колибактериозе телят

На правах рукописи

00349341=^

КАЗАКОВ ВЛАДИМИР ИВАНОВИЧ

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕКСИЕ СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ЛЕВОТИЛАПРИ КОЛИБАКТЕРИОЗЕ ТЕЛЯТ

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология. 16.00.04 - ветеринарная фармакология с токсикологией.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Краснодар- 2010

003493463

Работа выполнена в лаборатории терапии ГНУ Краснодарский научно- исследовательский ветеринарный институт и ГНУ Всероссийский НИВИ патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии.

Научные руководители: доктор ветеринарных наук

Басова Наталья Юрьевна

доктор ветеринарных наук, профессор Шабунин Сергей Викторович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Терехов Владимир Иванович кандидат ветеринарных наук Поветкин Сергей Николаевич

Ведущая организация: Донской государственный аграрный

университет

Защита состоится «28» января 2010_года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.038.07. при ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044, г.Краснодар, ул.Калинина, 13.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет»

Автореферат размещен на официальном сайте ФГОУ ВПО «Кубанский ГАУ» http://www.kubsau.ru «о&Г » 2009 г.

Автореферат разослан « оЬ£> » фв^О-Я/РА/ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор вет. наук

Родин И.А.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. В настоящее время возрастает значение фар-макопрофилактики и лечения болезней молодняка сельскохозяйственных животных в связи с появлением инфекций со сложной этиологией, обусловленной повышением вирулентности условно-патогенных микроорганизмов. Часто эти болезни имеют общую симптоматику поражения дыхательных путей или пищеварительного тракта, приобретают характер смешанных инфекций, отличающихся от классических форм проявления той или иной болезни с осложненным течением. (В.А.Мищенко с соавт., 2000,2001).

В специализированных хозяйствах, особенно в межхозяйственных предприятиях, широкое распространение получили желудочно-кишечные болезни молодняка, на долю которых приходится до 80% общей заболеваемости (В.П.Иноземцев с соавт.,1997, 2000). Комплексное изучение их этиологии показало, что на фоне нарушения технологии получения и выращивания молодняка, возбудителями диарей у телят являются энтеропатогенные и энтеротоксигенные эшерихии, псевдомонады, энтеробактеры, протеи, стрептококки, сальмонеллы и др. (А.Г. Шахов 1999; О.В. Вавина с соавт. 1999; А.Ф. Иванов 1999; В.В. Субботин, М. А. Сидоров,2004).

Огромный экономический ущерб, причиняемый животноводческим хозяйствам желудочно-кишечными заболеваниями, вызывает необходимость поиска путей и методов совершенствования и изыскания новых эффективных средств в их профилактике и лечении.

В комплексе мероприятий по борьбе с желудочно-кишечными болезнями бактериальной этиологии у молодняка сельскохозяйственных животных широкое применение нашли такие химиотерапевтические средства, как сульфаниламиды, антибиотики, нитрофураны и др. (В.Ф. Ковалев с соавт., 1988; A.B. Голиков с соавт., 1994; Н.Т. Климов с соавт., 2000; И.П.Кондрахин,2003). Однако длительное и бессистемное применение их в животноводстве привело к появлению резистентных штаммов микроорганизмов (М.И. Немченко, 1987; И.Х. Рахмонов, 1988; А.Г.Шахов с соавт.,1996).

Одним из путей, повышающих эффективность лечения животных и уменьшающих расхода лекарств, при этом, является создание комплексных препаратов. Известно, что широкий спектр антимикробной активности препаратов, как правило, достигается путем комбинирования нескольких лекарственных субстанций на базе одной или нескольких групп химических веществ. При этом сочетание различных химических структур в композиции позволяет достичь синергидного эффекта и получить препараты с новыми полезными свойствами. (М.Д. Машковский,1998; С.В.Шабунин, 1999; Т.Н.Ракова, 1999).

В связи с этим перспективным является создание комплексных препаратов пролонгированного действия, обладающих широким спектром антимикробной активности и высокой эффективностью при лечении желудочно-

кишечных заболеваний бактериальной этиологии у молодняка крупного рогатого скота.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка, изучение фармако-токсикологических свойств нового антибактериального препарата левотил, клиническое изучение препарата при лечении колибактериоза у молодняка крупного рогатого скота.

Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распространение желудочно-кишечных болезней телят.

2. Изучить этиологическую структуру желудочно-кишечных болезней у телят и чувствительность выделенных микроорганизмов к антимикробным препаратам;

3.Разработать состав и лекарственную форму пролонгированного композиционного препарата левотил;

4. Изучить антимикробную активность левотила;

5. Изучить фармако-токсикологические свойства левотила;

6. Изучить терапевтическую эффективность левотила при колибакте-риозе у телят;

7.Разработать нормативную документацию по контролю и применению

левотила.

1.3.Научная новизна. Разработан и экспериментально обоснован состав нового препарата левотил на основе левомицетина и тилозина, изучены его фармако-токсикологические свойства, разработано применение, определена его эффективность при терапии желудочно-кишечных болезней бактериальной этиологии у телят.

1.4. Практическая значимость и внедрение. Изучена этиологическая структура желудочно-кишечных болезней телят. Разработан и изучен новый комплексный антибактериальный препарат для лечения желудочно-кишечных болезней бактериальной этиологии у телят - левотил. Разработаны методы контроля его качества, схемы применения и определены оптимальные дозы левотила, сроки возможного убоя животных после лечения левотилом. Разработана и утверждена в установленном порядке нормативная документация на левотил (Технические условия, Временное наставление по применению препарата при желудочно-кишечных болезнях бактериальной этиологии у телят №ООЮ51-ОП от 25.05.2002 г.)

1.5.0сновные положения, выносимые на защиту:

- распространение желудочно-кишечных болезней телят;

- этиологическая структура желудочно-кишечных болезней телят;

- разработка и обоснование состава препарата левотил;

- фармако-токсилогические свойства левотила;

- терапевтическая эффективность левотила при колибактериозе телят.

1.6. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены:

- на 4-ой Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции», Москва, 2002 г.;

- на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях», Воронеж, 2002 г.;

- на заседаниях научно-технического совета научно-производственного предприятия «Агрофарм» 2000-2002 г.г.;

- на заседании Ветфармсовета Департамента ветеринарии (протокол №2 от 12 апреля 2000 г.).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 7 статьях, в том числе 1 в издании, рекомендованном ВАК РФ.

1.8. Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста в компьютерном варианте и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований, заключения, выводов, практических предложений. Список литературы содержит 191 источник, в том числе 45 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 51 таблицей, 5 рисунками.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в 2000-2007 годах в Всероссийском НИВИ патологии, фармакологии и терапии, ГНУ Краснодарский НИВИ.

Экспериментальные и научно-производственные опыты проведены в соответствии с требованиями к врачебно-биологическому эксперименту по подбору аналогов, постановке контроля, соблюдению одинаковых условий кормления и содержания животных в период проведения работы и учета результатов (И.Т.Фролов, 1965). При постановке опытов бьши использованы токсикологические, фармакологические, физиологические, клинические, биохимические, морфологические, иммунологические и другие методы исследований.

В лабораторных и клинических опытах использовано 178 белых мышей с массой тела 18-22 г, 284 белых беспородных крысы с массой тела 170250 г, 10 морских свинок с массой тела 250-300 г, 25 кроликов с массой тела 2,5-3,0 кг, а также 527 телят 5-10-дневного и 2,0-2,5-месячного возраста.

Анализ заболеваемости и отхода крупного рогатого скота проводили по данным ветеринарной отчетности РФ и Краснодарского края.

Бактериологические исследования - общепринятыми методами согласно «Методическим указаниям по диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями» (1999), «Методическим указаниям по диагностике колибактериоза животных и птицы» (2000), «Методическим указаниям по лабораторной диагностики стрептококкоза животных» (1990). Чувствительность выделенных культур к антимикробным препаратам — методом диффузии в агаровом геле (среда АГВ) с использованием дисков, лунок. Оценку чувствительности осуществляли по диаметру зоны ингибиции роста тест-культуры.

Изучение оптимального соотношения компонентов в левотиле в опытах in vivo, общего действия на организм и лечебной эффективности препарата при желудочно-кишечных болезнях бактериальной этиологии у телят проведены в специализированных хозяйствах по выращиванию крупного рогатого скота.

Изучение оптимального соотношения компонентов композиции лево-мицетина и тилозина, определение синергидности комбинаций in vitro проводили определением активности препарата с различным соотношением компонентов методом серийных разведений, вычислением и сравнением фракциональной ингибирующей концентрации (ФИК) и суммы ФИК (ФИК-индекс). Антимикробную активность левотила изучали методом серийных разведений E.coli, типированных по морфологическим, культуральным, биохимическим и серологическим свойствам. Минимальную бактериостатиче-скую концентрацию (МБсК) выявляли в мясопептонном бульоне, минимальную бактерицидную концентрацию (МБцК) - путем высева из пробирок с МПБ на плотные питательные среды. Содержание микробных клеток в одном мл среды составляло 200 тыс., рН мясопептонного агара и мясопептон-ного бульона составляла 7,2-7,6. Результаты опытов учитывали в течение 7 суток.

Общетоксические свойства левотила оценивали путем определения острой и субхронической токсичности, возможных побочных свойств и отдаленных последствий в соответствии с «Методическими указаниями по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве», утвержденными ГУВ СССР и «Методическими рекомендациями по токсико-экологической оценке лекарственных средств, применяемых в ветеринарии», одобренных секцией отделения ветеринарной медицины РАСХН (1998).

Изучение острой токсичности левотила проводили на белых мышах и крысах общепринятыми методами (М.П. Беленький,1963; И.В.Саноцкий, 1970; О.Н. Елизарова,1971). Исследуемый препарат вводили перорально и подкожно. Во время клинических наблюдений учитывали внешний вид, поведение, потребление корма, изменение массы тела, динамику морфологического и биохимического состава крови.

На основании гибели животных от применения разных доз исследуемых соединений методом интегрирования по Беренсу (1929) устанавливали: абсолютно смертельную дозу (LD,00) и максимально переносимую дозу (МПД). Значения LD)6 и LD84, найденные по характеристической кривой, построенной на основании интегральных данных, использованы для определения коэффициентов вариабельности смертельных доз.

Подострую токсичность левотила. изучали на белых крысах при длительном подкожном введении препарата в дозах, в 3 и в 5 раз превышающих ориентировочно-терапевтическую. Препарат вводили ежедневно в течение 21 суток. Наблюдение за клиническим состоянием животных вели на протяжении 31 суток от начала опыта. Определение массы тела у всех животных проводили до начала введения препарата, а также на 7, 14, 21,31 сутки. На 21 сутки от начала введения левотила и на 31 сутки от начала опыта у 3 животных из каждой группы определяли относительную массу (коэффициенты) внутренних органов - головного мозга, печени, почек, легких, сердца, селезенки, надпочечников и семенников (В.М.Гацура, 1974).

Изучение кумулятивных свойств левотила проводили на 20 белых крысах с массой тела 180-200 г по методу Лима (И.В.Саноцкий, И.П.Уланова, 1975).

Оценку результатов проводили по Ю.С. Кагану и В.В. Станкевичу (1974).

Местное действие проверяли на кроликах путем однократного и многократного применения препарата на кожу, а также конъюнктивальной пробой (Г.А. Хмельницкий, 1987). Изучение кожно-резорбтивного действия левотила проводили на кроликах методом накожных аппликаций при однократном и многократном нанесении и втирании. Для выявления резорбции препарата с поверхности кожи кроликов использовали метод с трипановым синим. Кожно-резорбтивное действие изучали на белых мышах и крысах методом погружения хвоста в раствор препарата, аллергенность левотила с помощью конъюнктивальной (Г.П.Трубецкая, 1976) и кожно-провокационной проб (О.Л.Алексеева, Л.А. Дуева, 1978) при накожной аппликации и выявлению аллергического энтерита, изотонической дегидратации и изучению содержания гистамина в тонкой кишке при пероральном введении препарата.

Изучение эмбриотоксического и тератогенного действия левотила проведено по методике А.П. Шицковой с соавт. (1977) на самках белых крыс массой 220,0+20,0 г. Раннюю и позднюю резорбцию, общую эмбриональную смертность, выживаемость подсчитывали по формулам, предложенным A.M. Малашенко и И.К. Егоровым (1977). В целях выявления патологии внутренних органов эмбрионов материал фиксировали в жидкости Боуэна и 70° спирте. Аномалии скелета выявляли по методу Даусона (1984).

Влияние левотила на качество мясопродуктов проведено с использованием слепого метода по 9-ти бальной шкале для органолептической оценки качества вареного мяса и бульона, разработанного ВНИИМП (1985).

Исследования по фармако-токсикологической и клинической оценке эффективности применения левотила при лечении колибактериоза телят про-

ведены в условиях животноводческих комплексов. Структура опытов представлена по тексту.

Общее действие препарата при внутримышечном применении телятам оценивали по клиническому состоянию, морфологическим, биохимическим и иммунологическим показателям крови. Кровь для исследования брали у телят из яремной вены в утреннее время до кормления. В крови и сыворотке определяли количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, лейкограмму - общепринятыми методами, общий белок - рефрактометрически, фракции белка - по Оллу и Маккорду (С.А. Карпюк, 1962) или электрофорезом в ага-розном геле. В сыворотке крови определяли бактерицидную активность (О.В. Смирнова, Т.А.Кузьмина, 1966), комплементарную активность (Г.Ф. Вагнер, 1963), содержание лизоцима (О.В. Бухарин с соавт., 1974), циркулирующие иммунные комплексы (Д.В.Белокриницкий, 1987), общие иммуноглобулины набором фирмы «Лахема», концентрацию общих липидов, триглициридов, мочевины, глюкозы, креатинина, активность аспартат — и аланинаминотра-сферазы (АсАТ и АлАТ), щелочной фосфатазы — наборами фирмы «Лахема», билирубин - набором фирмы «Коне» (Финляндия), молочную кислоту - по Н.С.Балаховскому, Ю.В. Надточину (1973), пировиноградную кислоту по П.М. Бабаскину (1976), холестерин - по В.В. Меньшикову (1973).

Определение левомицетина в биологическом материале проводили методом, описанным Д.С. Гров и В.А. Рендалл (1958) с некоторыми модификациями. В частности, для диазотирования использовали 0,5% раствор монокалиевой соли 2-амино-8-нафтол-2,4-дисульфокислоты. Поглощение окрашенного раствора определяли на спектрофотометре СФ-26 или СФ-46 при Х-520 им. При использовании указанного реактива минимальная концентрация левомицетина была менее 1 мкг/мл или 1 мкг/г. Калибровочный график строили по стандартному образцу левомицетина с активностью 985 мкг/мг, полученному в ВГНКИ вет. препаратов.

Определение содержания тилозина проводили микробиологическим методом диффузии в агар. При проведении исследований руководствовались "Методическими указаниями по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства" № 3049-84 от 29.06.84. Приготовление тест-культур, приготовление микробной взвеси, агаризованных сред и буферных растворов, приготовление основного и промежуточных растворов стандарта антибиотика и построение стандартной кривой (В.Ф. Ковалев с соавт.,1988). Тест-микроб M.luteus АТСС 9341 был получен в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича. Определение содержания тилозина проводили в надосадочной жидкости. Сыворотку крови и мочу закапывали в лунки чашек Петри без предварительной обработки.

Определение стабильности левотила при хранении препарата проводили в соответствии с требованиями технических условий. При проведении анализа использован рабочий стандартный образец тилозина основания по PCO 9347-191-00494185-99 с содержанием активного вещества 1002 ЕД/мг и

рабочий стандартный образец левомицетина по PCO 9348-008-00494189-00 с содержанием активного вещества 993 мкг/мг.

Экономическая эффективность применения левотила рассчитана в соответствии с «Методикой экономической эффективности использования в сельском хозяйстве результатов научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ, новой техники и рационализаторских предложений», М., 1980, а также «Методикой определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий». - М., 1982.

Статистическая обработка полученных данных проведена методами математической статистики (Г.Ф.Лакин,1973; Е.В.Гублер,1978), а также с использованием прикладных программ «STATGRAPHICS» и «QUATTRO PRO» на PC «Pentium 200 ММХ».

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Распространение болезней органов пищеварения крупного рогатого скота

Анализ данных ветеринарной отчетности свидетельствует о высокой заболеваемости КРС в РФ. В период 2001-2005 годы ежегодно заболевало 4631100 - 9988700 голов крупного рогатого скота, в среднем - 7523980 в год.

Ежегодный падеж крупного рогатого скота в РФ 403100 - 722000 голов или 2,8%- 3,9% к обороту стада, в том числе молодняка - 235500 -405500 голов или 1,1% - 2,7% к обороту стада.

Основными заболеваниями животных являются болезни органов пищеварения, доля которых составляет 36,9%.

Наиболее подвержен болезням молодняк. В 2005 году в РФ заболело 3615300 телят или 86,5% к полученному приплоду и 55,8% - ко всему заболевшему поголовью, в т. ч. болезнями органов пищеварения - 35,8% к приплоду или 50,4% к заболевшему молодняку. Отход по этой причине составил 52,7% от всего павшего молодняка, а вынуждено убито - 95300 телят или 23% от числа заболевших. Наиболее часто заболевают и гибнут телята до месячного возраста, в период развития острых расстройств органов пищеварения. В возрасте младше месяца заболевает 69,7% телят, а падеж в этой возрастной группе составляет 64,6% от числа павших телят. В возрасте старше 30 дней эти показатели снижаются до 30,3% и 35,4% соответственно.

В Краснодарском крае в 2005-2007 годах заболеваемость крупного рогатого скота колебалась в пределах 51,2%- 52,9%, или ежегодно заболевало 346900-400200 животных. За период 2005-2007 годы болезнями органов пищеварения ежегодно заболевало 102800 - 113300 телят или 28,02% - 29,6% (28,64%±0,49), а отход по этой причине колебался в пределах 46,9% - 49,6% от числа павших.

Ежегодный падеж крупного рогатого скота от болезней органов пищеварения за последние 3 года в крае составил 48,27%±0,78, а вынужденный убой - 46,02%±0,16. В РФ регистрируется высокая смертельность телят от инфекционных болезней бактериальной этиологии..

Наиболее часто у телят регистрируют колибактериоз. Ежегодно коли-бактериозом заболевает 14300 - 19600 телят или 36,4 - 45,3% от заболевших инфекционными болезнями, летальность от колибактериоза колеблется в пределах 35,6 - 38,9%.

В Краснодарском крае инфекционными болезнями бактериальной этиологии (согласно данным ветеринарной отчетности) ежегодно переболе-вает 3150 - 3367 телят, или 1,19 - 1,25% к получаемому приплоду, а летальность составляет в среднем 21,3 - 21,5%. Наиболее часто регистрируется колибактериоз -51,9- 52,1%. Летальность телят при колибактериозе достигает 23,9-24,9%.

У новорожденных телят при диареях, как правило, в 95 - 98% случаев регистрируют смешанное течение болезни: колибактериоз и стрептококкоз, колибактериоз и псевдомоноз, УП бактерии семейства Enterobacteriaceae и псевдомоноз, УП бактерии семейства Enterobacteriaceae и стрептококкоз.

3.2. Этиологическая структура желудочно-кишечных болезней телят и чувствительность возбудителей к антимикробным препаратам.

Изучив видовой состав бактерий, выделенных от больных диарейными заболеваниями новорожденных телят, установили, что наиболее часто из патологического материала, полученного от павших и вынужденно убитых животных, изолировали микроорганизмы кишечной группы - 44 изолята или 56,4%. В том числе Е. coli - 24,3%, P. mirabilis - 8,9%, микроорганизмы рода Klebsiella -10,3%.

Стрептококки были выделены в 28,2% случаев, стафилококки - 7,7%, как и P. aerugenosa. В видовом аспекте превалировали так же Б. coli - 24,3% от всех видов выделенных бактерий.

При изучении серологической структуры эшерихий, выделенных от больных диареей новорожденных телят установили, что адгезивные антигены присутствовали у 36,8% выделенных культур. У 14% присутствовали антигены А-20,10,5% - К-88, в 5,3% - Е. coli F-41 и 3,5% - Р987. Характерный для телят адгезивный антиген К-99 выявлен у 3,5% культур.

При изучении серологических вариантов Е. coli по карпускулярному антигену установили наличие 8 серологических вариантов. Наиболее часто изолировали вариант Oi -в 15,8%, реже - в 12,3% случаев СЬо, Ощ, и Ои5 в 10,5%, вариант Oi8- 8,8%, 033 выделяли в 5,3% и 078 - 1,7%, а не типирова-лись имеющимися в наличие сыворотками 20 культур или 35,1%. 79% выделенных культур Е. coli были патогенны для белых мышей.

При определении чувствительности культур 8 родов к 30 фармакологическим антимикробным препаратам установили широкое распространение среди микроорганизмов, вызывающих желудочно-кишечные болезни телят, антибиотикорезистентных культур. Из 30 протестированных антимикробных препаратов, входящих в группы, наиболее часто применяемых при терапии желудочно-кишечных болезней телят: пенициллины, тетрациклины, цефа-лоспорины, нитрофураны, аминогликозиды, стрептомицины, левомицетин, макролиты, производные хиноксалина и оксихинолина, комплексные препа-

раты, только 5 были активны в отношении всех культур Е. coli - ципрофлок-сацин, офлаксоцин, тилазин, леномак, леводиоксид. По отношению к Proteus ssp. бьши активны только 4 препарата, к Ps. aerugenosa - 7, Streptococcus ssp. - 8. Только 2 препарата - офлоксацин и тилозин бьши активны по отношению ко всем тестируемым культурам.

Активность левомицетина колебалась в пределах 12,80 мм ± 2,56 -19,00 мм ±0, тилозина- 14,67 мм ± 1,33 - 24,13 мм ± 0,98.

Из тестированных микроорганизмов не было выявлено родов и видов, абсолютно, на 100% устойчивых к левомицетину и тилозину.

Наиболее активными в отношении выделенных от телят, больных диа-рейными заболеваниями, бактерий оказались комплексные препараты.

3.3. Состав, физико-химические свойства, получение левотила и оптимального соотношения левомицетина и тилозина

На основании проведенных исследований, был сконструирован новый комплексный препарат - левотил, содержащий в качестве действующих веществ левомицетин (5,0%), тилозин основание (5,0%), спирт бензиновый, а также пролонгаторы - полиэтиленоксид 400 - 20,0 г и 1,2 пропиленгликоль -до 100,0 мл.

Препарат представляет собой вязкую прозрачную жидкость светло-зеленоватого цвета.

Стабильность левотила изучалась на трех сериях препарата (031002, 041102 и 010103) при естественном хранении в хорошо укупоренной таре в сухом защищенном от света месте при температуре от 5°С до 10°С в течение одного года. Установлено, что при хранении препарата в течение одного года качественные и количественные показатели отвечают требованиям технических условий.

Изучение различных соотношений левомицетина с тилозином в отношении кишечной палочки - Escherichia coli (А-20/08), сальмонеллы - Salmonella dublin, стрептококка - Streptococcus faecalis показало, что наиболее выраженным антимикробным действием в отношении изученных штаммов микроорганизмов обладает комбинация в соотношении: левомицетина - 5,0: тилозин - 5,0. Минимальная бактериостатическая концентрация (МБсК) данной комбинации в отношении Salmonella dublin и Streptococcus faecalis составила 3,1 мкг/мл, а в отношении Escherichia coli (A-20/0s) - 6,25 мкг/мл и превосходила МБсК, как составных частей комбинации (левомицетина, тилозина), так и комбинаций с другими соотношениями компонентов.

3.3.1. Антимикробная активность левотила

Фракциональная ингибирующая концентрация (ФИК) левомицетина оптимальной комбинации в опыте со Staphylococcus aureus составила 0,008, тилозина - 0,01, а сумма фракциональных ингибирующих концентраций (ФИК-индекс) - равнялся 0,018, ФИК левомицетина в опыте с культурой Echerichia coli (А-20/08) составил 0,008, тилозина - 0,011. ФИК-индекс ком-

бинации в опыте с культурой Escherichia coli (A-20/0s) равнялся 0,019. ФИК левомицетина в опыте с культурой Staphylococcus aureus составила 0,04, ти-лозина - 0,02; ФИК-индекс составил 0,024.

Для лечения больных колибактериозом телят применяли левотил в дозе 0,3 мл/кг массы тела с интервалом между введениями 48 часов до исчезновения клинических признаков заболевания. Назначение левотила уменьшает срок лечения животных, больных колибактериозом на 14,3% по сравнению со сроками лечения левотилом с другими соотношениями компонентов (таблица 1).

Таблица 1 - Эффективность применения левотила с различным соотношением левомицетина и тилозина при лечении колибактериоза у телят

Показатели Соотношение левомицетина и тилозина

6:4 5:5 4:6

Количество животных, гол. 50 51 49

Продолжительность лечения, дней 4,3±0,3 3,6±0,4 4,1±0,4

Выздоровело, гол. % 43 86,0 47 92,2 42 85,7

Осталось больными, гол. 4 2 4

% 8,0 3,9 8,2

Пало, гол. 3 2 3

% 6,0 3,9 6,1

Лечебная эффективность, % 86,0 92,2 85,7

В группе телят, которым для лечения колибактериоза применяли левотил с оптимальным соотношением компонентов, выздоровело 92,2% животных, в тоже время в двух других группах лечебная эффективность препарата составила 86,0% и 85,7%, а падеж животных составил 3,9% и 6,0%, 6,1%.

В результате проведенных исследований было установлено, что после однократного введения препарата левомицетин и тилозин обнаруживали в сыворотке крови уже через один час после введения, максимальная концентрация достигалась к 3 часу. Терапевтическая концентрация обоих компонентов сохранялась в крови в течение 48 часов.

3.4.Токсикологические свойства левотила

Острую токсичность левотила изучали на белых мышах и крысах. Группы животных формировали по принципу парных аналогов, учитывая массу тела (у мышей - 18-20г, у крыс - 180-210г), развитие и клиническое состояние. Препарат вводили однократно внутрь в дозах от 5,0 до 30,0 мл/кг массы тела в объеме 0,6 мл на мышь и 6,0 мл на крысу (дозы являются предельно допустимыми по объему для перорального введения). За весь период наблюдения (14 дней) гибели опытных животных зарегистрировано не было. Патоморфологическое изучение по окончании эксперимента не выявило на-

рушений в структурной организации внутренних органов животных, участвующих в эксперименте.

Среднелетальную дозу - ЬО50 левотила при пероральном введении определить не удалось. Левотил относится к IV классу опасности - малоопасные вещества (ГОСТ 12.1.007-76). При подкожном способе введения в двух повторностях в диапазоне доз от 2,5 до 9,0 мл/кг массы тела, дозой левотила, являющейся максимально переносимой, является доза 2,5 мл/кг (ЬБ0). Доза 6,19 мг/кг массы тела для белых мышей и 5,51 мг/кг массы тела для белых крыс, вызвавшая гибель 50% животных, является среднесмертельной и соответствует 1^50 Доза 9,0 мг/кг массы тела, является абсолютно смертельной для обоих видов лабораторных животных и соответствует ЫЭюо

Подострую токсичность левотила изучали на белых крысах при длительном подкожном введении препарата в терапевтической дозе, а также дозах, в 3 и в 5 раз превышающих терапевтическую.

В результате проведенных исследований отмечено, что длительное (21 сутки), внутримышечное применение левотила в дозах 0,3; 0,9 и 1,5 мл/кг массы тела животного не вызывает существенных изменений в клиническом состоянии лабораторных крыс. При проведении патоморфологических исследований у лабораторных животных как опытных, так и контрольной групп, макроскопически не было вьивлено отклонений и особенностей в строении внутренних органов. Введение препарата животным в меньших дозах (0,3 и 0,9 мл/кг массы тела) не вызывало выраженного изменения относительной массы внутренних органов.

При исследовании крови животных, получавших левотил в дозе 0,3 мл/кг массы тела, не отмечено достоверных изменений в морфологическом составе крови, биохимических показателях и показателях иммунного статуса по сравнению с показателями в крови животных контрольной группы.

Изучение субхронической токсичности левотила в дозах 0,3 и 0,9 мл/кг массы тела, проведенное на 24-х телятах 2-х месячного возраста не оказывает заметного влияния на морфобиохимические и иммунологические показатели телят.

Для изучения кумулятивных свойств левотила препарат вводили белым крысам в течение 28 дней подкожно с начальной дозой 0,10 от 1Л}50. Дозы левотила - 70,53 мл/кг не вызвали гибели животных. Учитывая, что полученные дозы составляют 12,8 ЛД50, возможный коэффициент кумуляции превышает 12, что, согласно классификации кумулятивного действия (Медведь Л.И. с соавт., 1968) определяет левотил как вещество со слабо выраженной кумуляцией.

Однократное нанесение левотила на кожные покровы кроликов при плотности аппликации от 0,020 до 0,10 мл/см2, не вызывает повреждения кожи в виде эритемы или ее отеков, что позволяет ответную реакцию организма оценить как отрицательную. При определении раздражающих свойств препарата при внутрикожном методе введения кроликам установлено, что через 30 минут после введения красителя левотил оказывал слабое раздра-

жающее действие, через 60 и 180 минут раздражающее действие препарата было умеренным, через 4 часа - слабым, а через 5 часов отсутствовало. В опытах установлено, что 20-ти кратная аппликация левотила на кожные покровы крыс не вызывает гибели животных, не нарушает целостности кожи на месте нанесения, не нарушает функционирования организма животных, что свидетельствует об отсутствии кожно-резорбтивного действия левотила

Результаты опытов по изучению аллергенных свойств левотила проведенные на белых крысах в чистом виде при накожном применении и сенсибилизирующего действия - на морских свинках, свидетельствуют, что препарат не обладает аллергизирующими свойствами.

Установлено, что левотил в дозе 0,3 мл/кг массы тела не оказывает отрицательного влияния на процессы овуляции и эмбриогенеза. Препарат не оказывает влияния на продолжительность беременности. Уродств, аномалий развития внутренних органов и скелета не обнаружено. Тератогенным действием левотил не обладает.

Исследования влияния терапевтических доз левотила на качество мя-сопрдуктов, проведенных на кроликах, свидетельствуют, что левотил в дозе 0,3 мл/кг массы тела не влияет отрицательно на качество и вкусовые особенности мяса животных.

3.6. Фармакологические свойства левотила

Изучение фармакокинетики левотила проведено по определению содержания левомицетина и тилозина в органах, тканях и биологических жидкостях телят, а также по определению остаточных количеств составляющих препарата (левомицетина и тилозина) в организме животных

С этой целью были подобраны 17 телят 2,0-2,5-месячного возраста с массой тела 60-80 кг, которым внутримышечно однократно вводили левотил в дозе 0,3 мл/кг массы тела. Через 3, 6, 12, 24, 48 часов после введения препарата проводили забой 3-х подопытных животных. Через 3 и 48 часов осуществлялся забой и по одному контрольному теленку, которым препарат не вводили. Как видно из данных, представленных в таблице 3, через 3 часа после применения препарата, левомицетин в разной степени обнаруживается в органах и тканях. Бактериостатическая концентрация антибиотика в крови сохраняется в течение 48 часов, достигая максимума через 3 часа после инъекции. Максимальная концентрация в почках и печени наблюдается через 6 часов.

Следовательно, терапевтическая концентрация действующих веществ левотила при применении его в дозе 0,3 мл/кг массы тела однократно сохраняется до 48 часов. Бактериостатическая концентрация тилозина также сохраняется на протяжении 48 часов, достигая максимума через 3 часа после введения препарата. Наивысшая концентрация тилозина в почках и печени установлена через 12 часов после введения (5,12 и 4,72 мкг/г соответственно).

Таблица 2 - Содержание левомицетина и тилозина в органах и тканях телят после введения левотила в дозе 0,3 мл/кг массы тела

Биосубстрат Содержание левомицетина (мкг/г/мл) через, часов

3 6 12 24 48

Кровь 3,07±0,105 2,9110,154 2,84+0,043 2,4410,102 1,3410,082

Печень 0,99±0,114 2,1910,269 3,0410,332 2,8710,089 1,6210,244

Почки 2,34±0,131 4,1310,106 5,3910,147 5,2510,096 2,39+0,261

Мышцы 0,1110,031 0,2610,124 0,92+0,106 1,0710,104 0,0010,000

Моча 1,57+0,217 4,5510,149 4,74+0,200 4,5810,226 3,4210,096

Сод. толстого кишечн. 0,80+0,078 1,4610,131 2,3310,135 2,3710,125 2,0210,145

Содержание тилозина (мкг/г/мл), через, часов

3 6 12 24 48

Кровь 5,24+0,311 4,4010,083 4,35+0,320 3,2010,521 1,5210,208

Печень 3,09+0,301 4,2410,167 5,1210,183 4,0510,469 2,3210,061

Почки 2,3210,243 2,9610,205 4,7210,144 3,9210,101 1,9610,046

Мышцы 0,0010,000 0,2410,038 0,61+0,215 0,8410,069 0,0010,000

Моча 0,7210,061 4,12+0,349 4,5610,189 5,2010,302 1,8410,183

Сод. толстого кишечн. 0,9610,183 3,9910,450 4,57+0,301 4,5210,288 3,8410,205

Проведенные исследования по изучению остаточных количеств компонентов левотила (левомицетин, тилозин) в органах, тканях и биологических жидкостях телят после 5-ти кратного применения препарата, позволяют с полной уверенностью установить срок ожидания для левотила по всем компонентам - 7 суток.

3.7. Эффективность применения левотила

Для лечения больных колибактериозом телят левотил применяли в дозах 0,15 мл/кг; 0,3 мл/кг; 0,6 мл/кг массы тела с интервалом между введениями 48 часов до исчезновения клинических признаков заболевания. Лечебную эффективность различных доз левотила оценивали по количеству выздоровевших телят в течение 14 дней со дня начала курса лечения.

В группе, где левотил применяли в дозе 0,15 мл/кг, исчезновение клинических признаков заболевания наступило на 7 день лечения и отмечено у 48 голов, что составило 75%. В группе, где левотил применяли в дозе 0,3 мл/кг, исчезновение клинических признаков заболевания наступило на 4 сутки лечения и отмечено у 60 голов, что составило 92,3%. В группе, где левотил применяли в дозе 0,6 мл/кг, исчезновение клинических признаков заболевания наступило на 4 сутки лечения и отмечено у 59 голов, что составило 92,2%.

Левотил в дозе 0,3 мл/кг обладает значительным терапевтическим эффектом, количество выздоровевших животных составило 92,3%, в то время как при дозировке 0,15мл/кг - 75,0%, что на 17,3% ниже.

При дальнейшем повышении дозировки до 0,6мл/кг лечебный эффект существенно не увеличился, что говорит об экономической необоснованности применения левотила в дозе 0,6мл/кг.

Таким образом, оптимальной терапевтической дозой левотила при лечении колибактериоза телят, является доза 0,3мл/кг.

Изучение терапевтической эффективности левотила проводили в трех сериях опытов в хозяйствах Белгородской, Воронежской областей и Краснодарского края на телятах 2-10 дневного возраста, больных колибактериозом в сравнении с зинапримом и байтрилом. Животным опытной группы (25 голов) при лечении применяли левотил внутримышечно в дозе 0,3 мл/кг живой массы один раз в сутки с интервалом 48 часов. При тяжелом течении болезни препарат вводили трехкратно с интервалом между введениями 24 часа. Телятам контрольной группы препараты вводили в дозах и кратности, согласно наставлениям по их применению. За животными вели ежедневное клиническое наблюдение в течение 10-15 дней, при этом учитывали общее состояние, падеж, скорость роста, сроки выздоровления.

Левотил обладает более высокой терапевтической эффективностью по сравнению с зинапримом и байтрилом. При его применении клиническое улучшение (прекращение диареи) и улучшение аппетита наступало чаще всего через 3-4 дня лечения. В контрольной группе клинические признаки заболевания исчезали обычно на 4-5 день лечения. При применении левотила значительно снижался падеж телят - с 26,3 %, в контрольной группе до 8,0 %, при применении зинаприма и с 26,5% в контрольной группе до 7,7% - в опытной - байтрилом. Лечение животных левотилом не снижает эритропоэз, гемопоэз. Снижение относительного количества нейтрофильных гранулоци-тов свидетельствует о затухании воспалительной реакции. Нормализуется белковый обмен и активизируется фагоцитоз. Среднесуточный прирост массы тела у телят опытной группы был выше на 24,7%.

Левотил является эффективным средством для лечения колибактериоза у телят.

Экомический эффект применения левотила при колибактериозе у телят составляет 15,69 рублей на 1 рубль затрат.

4. ВЫВОДЫ

1. Желудочно - кишечные болезни телят широко распространены в РФ и ЮФО. Ежегодно ими заболевает только в Краснодарском крае 28,3 - 29,6% от приплода. Отход от болезней органов пищеварения составил: падеж -48,27%±0,78, вынужденный убой - 46,02%±0,16 от количества погибших телят. Наиболее часто у телят регистрируют колибактериоз. Ежегодно колибактериозом заболевает 14300 - 19600 телят, летальность телят от колибактериоза колеблется в пределах 35,6 - 38,9%,

2. Видовой состав бактерий, изолированных от больных диареей телят широк, включает 19 видов. Наиболее часто, в 24,3% выделяли Е. coli, в том числе патогенных - 79%. Адгезивные антигены присутствовали у 36,8% выделенных культур. У 14% - А-20, 10,5% - К-88, в 5,3% - Е. coli F-41 и 3,5% -Р987, К-99 выявлен у 3,5% культур. Из корпускулярных антигенов наиболее часто выявляли Oi -в 15,8%. Выделенные культуры Е. coli высоко резистентны к антимикробным препаратам: только 5 из 30 антибиотиков были активны в отношении всех культур Е. coli.

3.Разработан новый комплексный инъекционный препарат левотил для лечения желудочно-кишечных заболеваний бактериальной этиологии у телят, в состав которого входят левомицетин и тилозин, растворенные в полиэтиле-ноксиде-400 и 1,2-пропиленгликоле. Препарат представляет собой вязкую жидкость с удельным весом 1,19 г/см3 от темно-желтого до красновато-желтого цвета, без запаха, горького вкуса. Стабилен в течение 12 месяцев хранения. Фракциональная ингибирующая концентрация (ФИК-индекс) тило-зина с левомицетином в левотиле в соотношении 5:5 составляет 0,018-0,024, что показывает высокую синергидность компонентов препарата.

4.Левотил обладает широким спектром антимикробной активности в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, основных возбудителей желудочно-кишечных болезней телят, с минимальной бак-териостатической концентрацией левотила 3,12-12,5 мкг/мл.

5. Комплексный антибактериальный препарат на основе левомицетина и тилозина по параметрам острой токсичности согласно ГОСТ 12.1.007-76 относится к 4 классу опасности - вещества малоопасные: среднелетальную дозу- LD50 левотила при пероральном введении определить не удалось, т.к. как при введении препарата в максимально возможных объемах 0,6 мл - белым мышам и 6,0 мл - белым крысам, не отмечалось гибели животных. ЛД50 левотила при подкожном введении составила для мышей 6,19 мл/кг, а для белых крыс - 5,51 мл/кг массы тела.

6. Внутримышечное введение левотила в дозе, превышающей в 5 раз терапевтическую, белым крысам в течение 14 дней повышает нагрузку на почки и печень животных и частично проявляет нефротоксическое и гепатотоксиче-ское действие при отсутствии клинических признаков интоксикации. Коэффициент по методу Лима превышает 12. Левотил не обладает эмбриотоксиче-ским и тератогенным свойствами. Не оказывает отрицательного влияния на продолжительность беременности и плодовитости крыс, не вызывает уродств, аномалий развития внутренних органов и скелета плодов, не обладает кожно-раздражающим и кожно-резорбтивным действием. Многократные аппликации левотила на кожу кроликов в течение 14 дней не выявили аллергенных свойств препарата. По токсикологической оценке препарат относится к малоопасным веществам - 4 класс токсичности.

Многократное внутримышечное применение левотила телятам в дозах, равной терапевтической, 3-х и 5-ти кратно превышающей терапевтическую дозу, не оказывает негативного влияния на клиническое состояние, поведение и аппетит животных, не снижает скорости роста телят. Длительное примене-

ние левотила в течение 15 суток клинически здоровым телятам не оказывает отрицательного влияния на морфологические и иммунобиохимические показатели крови, улучшает эритропоэз, повышает уровень общего белка и, особенно, гамма-глобулинов.

Левотил не оказывает отрицательного влияния на качество мяса и мясопродуктов. Убой животных на мясо возможен через 10 дней после прекращения применения препарата.

7. Лечебная эффективность левотила при колибактериозе телят при внутримышечном введении в дозе 0,3 мл/кг массы тела один раз в сутки с интервалом 48 часов составляет 92%. Экомический эффект применения левотила при колибактериозе у телят составляет 15,69 рублей на 1 рубль затрат.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Левотил для терапии колибактериоза телят следует применять внутримышечно в дозе 0,3 мл/кг массы тела один раз в сутки с интервалом 48 часов. При тяжелом течении болезни препарат вводят трехкратно с интервалом между введениями 24 часа.

2. Разработано Временное наставление по применению левотила в ветеринарии (Утверждено Главным управлением ветеринарии Минсельхоза России за№ 001051-ОП от 25.05.2002 г.)

6. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Казаков В. И. Разработка комплексного препарата левотил и его антимикробная активность /В.И. Казаков Л.Ю. Сошнина // Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях Матер. Меж-дунар. науч.- практ. конференции. - Воронеж, 2002.- С.287-288.

2. Казаков В. И. Эффэктивновность левотила при колибактериозе поросят и телят /В.И.Казаков// Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. Матер, Междунар. науч.- практ. конференции. -Воронеж, 2002,- С.288-289.

3. Казаков В.И. Фармакокинетика левотила / В.И.Казаков Г.А. Вострои-лова, П.А Паршин.// Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. Матер, Междунар. науч.- практ. конференции. -Воронеж, 2002,- С.290

4. Казаков В.И. Токсикометрическая характеристика комплексного антимикробного препарата левотил /В.И. Казаков П.А. Паршин// Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. Матер, Междунар. науч.- практ. конференции. - Воронеж, 2002.- С.291-292.

5. Казаков В.И. Токсические и кумулятивные свойства левотила /В.И.Казаков П.А. Паршин.//Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно - санитарного контроля сельскохозяйственной продукции, Матер, IV междунар. науч.- практ. конференции. - Москва, 2002,- С.28-29.

6. Казаков В.И. Влияние левотила на качество мясопродуктов / В.И.Казаков // Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно - санитарного контроля сельскохозяйственной продукции, Матер, IV Междунар. науч.- практ. конференции.- Москва, 2002.- С.29-30.

7. Казаков В.И. Фармако-токсикология и лечебная эффективность левотила /В.И.Казаков //Ветеринарная патология.-2007,- N 2,- С.202-205.

Актуальность темы. В настоящее время возрастает значение фарма-копрофилактики и лечения болезней сельскохозяйственных животных в связи с появлением инфекций со сложной этиологией, обусловленной повышением вирулентности условно-патогенных микроорганизмов. Часто эти болезни имеют общую симптоматику поражения дыхательных путей или пищеварительного тракта, приобретают характер смешанных инфекций, отличающихся от классических форм проявления той или иной болезни, осложненным течением. (В.А.Мищенко с соавт., 2000, 2001).

В специализированных хозяйствах, особенно в. межхозяйственных предприятиях, широкое распространение получили желудочно-кишечные болезни молодняка сельскохозяйственных животных, на долю которых приходится до 80% общей заболеваемости (В.П.Иноземцев с соавт., 1997, 2000). Комплексное изучение их этиологии показало, что на фоне нарушения^ технологии получения« и выращивания молодняка, возбудителями диарей.у телят. являются энтеропатогенные и энтеротоксигенные эшерихии, псевдамонады, энтеробактеры, протеи, стрептококки, сальмонеллы и др. (А.Г. Шахов 1999; I

О.В. Вавина с соавт. 1999; А.Ф. Иванов 1999; В.В. Субботин, М. А. Сидо-ров,2004).

Огромный экономический ущерб, причиняемый животноводческим.хозяйствам желудочно-кишечными заболеваниями, вызывает необходимость поиска путей и методов совершенствования и изыскания'новых эффективных средств в их профилактике и лечении.

В-комплексе мероприятий по'борьбе с желудочно-кишечными болезнями бактериальной этиологии у молодняка сельскохозяйственных животных широкое применение нашли такие химиотерапевтические средства, как ' ч . сульфаниламиды, антибиотики, нитрофураны и др. (В.Ф. Ковалев с соавт., 1988; А.В. Голиков с соавт., 1994; Н.Т. Климов с соавт., 2000; И.ШСондрахин,2003). Однако длительное и бессистемное применение их в животноводстве привело к появлению резистентных штаммов микроорганизмов (М.И. Немченко, 1987; И.Х. Рахмонов, 1988; А.Г.Шахов с со-авт.,1996).

Одним из путей, повышающих эффективность лечения животных и уменьшающих расхода лекарств, при этом, является создание комплексных препаратов.

Известно, что широкий спектр антимикробной активности препаратов, как правило, достигается путем комбинирования нескольких лекарственных субстанций на базе одной или нескольких групп химических веществ. При этом сочетание различных химических структур в композиции позволяет достичь синергического эффекта и получить препараты с новыми полезными свойствами. (М.Д. Машковский,1998; С.В.Шабунин, 1999; Т.Н.Ракова, 1999). При использовании пролонгатора создается депо действующих веществ в месте введения препарата.

В. связи с этим перспективным является создание комплексных препаратов г прологированного действия, обладающих широким спектром антимикробной1 , . активности и высокой эффективностью, при лечении желудочно-кишечных заболеваний бактериальной этиологии у молодняка крупного рогатого скота. *

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка, изучение фармако-токсикологических свойств нового антибактериального препарата левотил, клиническое изучение препарата при лечении ко-либактериоза у молодняка крупного рогатого скота.

Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распространение желудочно-кишечных болезней телят.

2. Изучить этиологическую структуру желудочно-кишечных болезней у телят и чувствительность выделенных микроорганизмов к антимикробным I препаратам;

3.Разработать состав и лекарственную форму пролонгированного композиционного препарата левотил;

4. Изучить антимикробную активность левотила;

1,4 5. Изучить фармако-токсикологические свойства левотила;

6. Изучить терапевтическую эффективность левотила при колибакте-риозе у телят;

7. Разработать нормативную документацию по контролю и применению левотила.

Научная новизна. Разработан и экспериментально обоснован состав нового препарата левотил на основе левомицетина и тилозина, изучены его фармако-токсикологические свойства, разработано применение, определена его эффективность при терапии желудочно-кишечных болезней бактериальной этиологии у телят.

Практическая значимость и внедрение. Изучена этологическая структура желудочно-кишечных болезней телят. Разработан и изучен новый комплексный антибактериальный препарат для лечения желудочно-кишечных болезней бактериальной этиологии у телят - левотил. Разработаны методы контроля его качества, схемы применениями определены оптимальные дозы левотила, сроки возможного убоя животных после леченияшевотилом. Разработана и утверждена* в установленном порядке нормативная документация. наг левотил (Технические условия, Временное наставление по применению препарата при желудочно-кишечных болезнях бактериальной этиологии у телят ьООЮ51-ОП от 25.05.2002 г.) 1

Основные положения, выносимые на защиту:

- распространение желудочно-кишечных болезней телят;

- этиологическая структура желудочно-кишечных болезней телят;

- разработка и. обоснование состава препарата левотил;

- фармако-токсилогические свойства левотила;

- терапевтическая эффективность левотила при колибактериозе телят.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены:

- на 4-ой Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного конI троля сельскохозяйственной продукции», Москва, 2002 г.;

- на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях», Воронеж, 2002 г.;

- на заседаниях научно-технического совета научно-производственного предприятия «Агрофарм» 2000-2002 г.г.;

- на заседании Ветфармсовета Департамента ветеринарии (протокол №2 от 12 апреля 2000 г.).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 7 статьях, в том числе 1 в издании, рекомендованном ВАК РФ.

7. ВЫВОДЫ

1. Желудочно — кишечные болезни телят широко распространены в РФ и ЮФО. Ежегодно ими заболевает только в Краснодарском крае 28,3 - 29,6% от приплода. Отход от болезней органов пищеварения составил: падеж -48,27%±0,78, вынужденный убой - 46,02%±0,16 от количества погибших телят. Наиболее часто у телят регистрируют колибактериоз. Ежегодно коли-бактериозом заболевает 14300 - 19600 телят, летальность телят от колибак-териоза колеблется в пределах 35,6 - 38,9%,

2. Видовой состав бактерий, изолированных от больных диареей телят широк, включает 19 видов. Наиболее часто, в 24,3% выделяли Е. coli, в том числе патогенных - 79%. Адгезивные антигены присутствовали у 36,8% выделенных культур. У 14% - А-20, 10,5% - К-88, в 5,3% - Е. coli F-41 и 3,5% -Р987, К-99 выявлен у 3,5% культур. Из карпускулярных антигенов наиболее часто выявляли Oi -в 15,8%. Выделенные культуры Е. coli высоко резистентны к антимикробным препаратам: только 5 из 30 антибиотиков! были активны в отношении всех культур Е. coli.

3. Разработан новый комплексный инъекционный препарат левотил для лечения желудочно-кишечных заболеваний бактериальной этиологии у телят, в состав которого входят левомицетин и тилозин, растворенные в полиэтиле-ноксиде-400 и 1,2-пропиленгликоле. Препарат представляет собой вязкую л жидкость с удельным весом 1,19 г/см от темно-желтого до красновато-желтого цвета, без запаха, горького вкуса. Стабилен в течение 12 месяцев хранения. Фракциональная ингибирующая концентрация (ФИК-индекс) тило-зина с левомицетином в левотиле в соотношении 5:5 составляет 0,018-0,024, что показывает высокую синергидность компонентов препарата.

4. Левотил обладает широким спектром антимикробной активности в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, основных возбудителей желудочно-кишечных болезней телят, с минимальной бак-териостатической концентрацией левотила 3,12-12,5 мкг/мл.

5. Комплексный антибактериальный препарат на основе левомицетина и тилозина по параметрам острой токсичности согласно ГОСТ 12.1.007-76 относится к 4 классу опасности - вещества малоопасные: среднелетальную дозу- 1Л350 левотила при пероральном введении определить не удалось, т.к. как при введении препарата в максимально возможных объемах 0,6 мл — белым мышам и 6,0 мл - белым крысам, не отмечалось гибели животных. ЛД50 левотила при подкожном введении составила для мышей 6,19 мл/кг, а для белых крыс — 5,51 мл/кг массы тела.

6. Внутримышечное введение левотила в дозе, превышающей в 5 раз терапевтическую, белым крысам в течение 14 дней повышает нагрузку на почки и печень животных и частично проявляет нефротоксическое и гепатотоксиче-ское действие при отсутствии клинических признаков интоксикации. Коэффициент по методу Лима превышает 12. Левотил не обладает эмбриотоксиче-ским и тератогенным свойствами. Не оказывает отрицательного влияния на продолжительность беременности и плодовитости крыс, не вызывает уродств, аномалий развития внутренних органов и скелета плодов, не обладает кожно-раздражающим и кожно-резорбтивным действием. Многократные аппликации левотила на кожу кроликов в течение 14 дней не выявили аллергенных свойств препарата. По токсикологической оценке препарат относится к малоопасным веществам - 4 класс токсичности. Многократное внутримышечное применение левотила телятам в дозах, равной терапевтической, 3-х и 5-ти кратно превышающей терапевтическую дозу, не оказывает негативного влияния на клиническое состояние, поведение и аппетит животных, не снижает скорости роста телят. Длительное применение левотила в течение 15 суток клинически здоровым телятам не оказывает отрицательного влияния на морфологические и иммунобиохимические показатели крови, улучшает эритро-поэз, повышает уровень общего белка и, особенно, гамма-глобулинов. Левотил не оказывает отрицательного влияния на качество мяса и мясопродуктов. Убой животных на мясо возможен через 10 дней после прекращения применения препарата.

7. Лечебная эффективность левотила при колибактериозе телят при внутримышечном введении в дозе 0,3 мл/кг массы тела один раз в сутки с интервалом 48 часов составляет 92%. Экомический эффект применения лево-тилапри колибактериозе у телят составляет 15,69 рублей на 1 рубль затрат.

8. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Левотил для терапии колибактериоза телят следует применять внутримышечно в дозе 0,3 мл/кг массы тела один раз в сутки с интервалом 48 часов. При тяжелом течении болезни препарат вводят трехкратно с интервалом между введениями 24 часа.

2. Разработано Временное наставление по применению левотила в ветеринарии (Утверждено Главным управлением ветеринарии Минсельхоза России за № ООЮ51-ОП от 25.05.2002 г.)

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее в скотоводческих хозяйствах серьезной проблемой являются желудочно-кишечные болезни телят, в том числе колибактериоз, наносящие огромный экономический ущерб животноводству.

Анализ заболеваемости телят желудочно- кишечными болезнями свидетельствует, что % болезнями органов пищеварения в РФ за последнее время ежегодно переболевало- 29,2% телят, а отход по этой причине составил 9,1%. Полученные данные согласуются с результатами исследований, приведенных А.Г.Шаховым ( 2002), который указывает, что до 85% телят гибнет от болезней органов пищеварения и дыхания.

Наиболее часто заболевают и гибнут телята до месячного возраста, в период развития острых расстройств органов пищеварения. В возрасте младше месяца заболевает 69,7% телят, а падеж в этой возрастной группе составляет 64,6% от числа павших телят. В возрасте старше 30 дней эти показатели снижаются до 30,3% и 35,4% соответственно. Аналогичные данные приводят В.С.Шйпилов с соавт.,(1981; 1988), П.П.Голыщенков, (1983), В.Г.Зароза,(1989; 1991), С.И.Джупина (2002), В.И. Терехова (2002), К. Геров с соавт(1978).

По данным В.И.Терехова (2002) при анализе значительного количества случаев заболеваний молодняка в хозяйствах Краснодарского края установлено, что непосредственно алиментарно-функциональная диарея имеет место в 9т 10 %, обусловленная смешанной кишечной инфекцией — 80-85 % и моно инфекциями — 5-10 %. По нашим наблюдениям смешанное течение болезни наблюдали в болыпенстве случаев — 89-93% при диареях от телят изолоро-вали бактериальные ассоциации.

При изучении серологической структуры эшерихий, выделенных от больных диареей новорожденных телят установили, что адгезивные антигены присутствовали у 36,8% выделенных культур. У 14% присутствовали антигены А-20, 10,5% - К-88, в 5,3% - Е. coli F-41 и 3,5% - Р987. Характерный для телят адгезивный антиген К-99 выявлен у 3,5% культур.

Роль E.coli, как возбудителя заболеваний молодняка крупного рогатого скота подчеркивали В.А. Малов, С.Г. Пак, (1996). Ведущая роль в развитии диареи новорожденных телят, по их данным, принадлежит энтеротоксиген-ным штаммам эшерихий с адгезивными антигенами К88, К99, 987 Р, F41, F18, А 20, Att 25.

Изучив чувствительность бактериальных культур, выделенных от больных телят с синдромом диареи, установили их высокую резистентность к антибиотикам. В.Д.Соколов, (1977) так же указывает, что при лечении молодняка животных антибиотиками необходимо учитывать закон специфичности: определенные препараты действуют на определенных возбудителей. Исходя из этого, особенно важны правильная диагностика, раннее выявление этиологического фактора, оценка клинического разнообразия инфекции. В соответствии с задачами терапии осуществляется выбор антибиотика с учетом спектра его антимикробного действия и дозы.

Многие проблемы отечественного животноводства обусловлены низкой' эффективностью проводимой фармакотерапии и профилактики заболеваний животных, а также острым дефицитом эффективных ветеринарных препаратов (С.М. Навашин с соавт., 1982; Е.П. Бернасовская с соавт., 1984; A.B. Вальдман, 1986; В.А. Антипов, 1995). Поэтому в мировой и отечественной практике задачи, связанные с низкой эффективностью и дефицитом, решались, решаются и должны решаться путем синтеза новых препаратов, использования синергидных сочетаний, применения антимикробных средств с препаратами, способствующими лучшему проникновению в ткани, более длительной циркуляции в организме антибиотических веществ, а также с использованием средств, повышающих защитные силы организма (С.И. Дьяков с соавт., 1988; В.Д. Соколов, 1977; 1984; 1989; 1990; 1992; 1997; В.Ф. Ковалев, 1991).

Если говорить о синтезе новых антимикробных средств, например антибиотиков, нитрофуранов или сульфаниламидов, то в этом направлении за последнее десятилетие достижения очень незначительны. В самом деле, можно лишь упомянуть фрадизин, который выпускается в мизерном количестве, фуракрилин, выпуск которого еще не налажен. Поэтому вполне правомерно утверждение о том, что в процессе поиска путей борьбы с устойчивостью патогенной микрофлоры рассчитывать на синтез новых, неизвестных ранее, препаратов не приходится (В.Ф. Ковалев, 1983; В.Д. Соколов, 1990 и ДР-)

В этой связи оправдало себя наше предположение о том, что антимикробный спектр действия препаратов необходимо повышать при комбинировании нескольких лекарственных препаратов на основе одной группы химических веществ, таких, как тилозин.

Известно, что сам тилозин в последние годы довольно интенсивно применяется в ветеринарии, как антимикробный препарат против различных аэробных и анаэробных микроорганизмов (Е.М. Сазонова с соавт.; 1994 Е.Чалева с соавт., 1996) как в отдельности, так и в сочетании с другими антимикробными препаратами;

С учетом данных литературы (В.А. Антипов с соавт., 1991; В.И. Дорож-кин с соавт., 1993; Е.М. Сазонова с соавт., 1994; В.А. Миронова с соавт., 1997 и др.) и результатов собственных исследований разработан новый тилозин-содержащий препарат левотил, обладающий синергидным действием и новыми полезными свойствами. Исследования по изучению антимикробной активности, острой, подострой токсичности и кумулятивных свойств, кожно-резорб-тивного, аллергенного, тератогенного и эмбриотоксического действия препарата, его влияние на функциональное состояние органов и;систем;, а также на качество продуктов питания после его применения проведены на лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Нами обосновано оптимальное соотношение компонентов) левотила по ФИК-индексу (О.М. ЕИоп еЬ а!., 1954; 8.Ы.М. ВшЬЬу еЬ. а1., 1968); которое позволило определить величину ФИК для. каждого компонента препарата.

Известно, что если ФИК-индекс меньше единицы, то наблюдается синер1 гизм; чем меньше сумма, тем больше синергизм. Такой подход позволил т vitro определить или выбрать оптимальный вариант соотношения в левотиле его компонентов.

В эксперименте установлено, что наиболее выраженным антимикробным действием обладает комбинация тилозина и левомицетина в соотношении 5:5 (ФИК-индекс этой комбинации в опыте с Salmonella dublin составил 0,018; с культурой Escherichia coli (А-20/08)- 0,019; с Staphylococcus aureus -0,024.

В опытах in vitro нами выявлен устойчивый эффект усиления антимикробного действия тилозина при его комбинированном применении с левоми-цетином. Следовательно, сочетанное применение тилозина с левомицетином позволяет снизить дозы этих препаратов в несколько раз, сохранив при этом их бактерицидные свойства.

Но некоторые исследователи отмечают, что антибактериальный эффект препаратов in vitro не всегда совпадает с эффектом in vivo (С.М. Навашин с соавт., 1982). Испытание левотила с соотношением составляющих компонентов 5:5 в клинических опытах при колибактериозе у телят показало его высокую лечебную эффективность, что подтверждает правомерность выбранного нами соотношения компонентов препарата в опытах in vivo.

Проведенное, согласно общепринятым стандартам, изучение токсикологических свойств левотила установило его слабую токсичность. Так, в частности, для белых мышей LD50 левотила составила 6,19 мл/кг, a LDioo - 9,00 мл/кг. Для белых крыс LD50 левотила составила 5,51 мл/кг. При этом токсичность левотила определялась при подкожном введении, позволяющем инъецировать большие дозы.

При изучении подострой токсичности левотила на белых крысах нами было установлено, что внутримышечное применение препарата в терапевтической и в 5 раз превышающей, терапевтическую дозах в течение 14 дней не оказывает токсического действия на организм животных. Изменений в морфологическом составе крови, биохимических показателях и показателях иммунного статуса по сравнению с показателями крови животных контрольных групп установлено не было. Средние результаты содержания эритроцитов, лейкоцитов, цветового показателя и лейкоцитарной формулы были характерны для физиологической нормы растущих животных. При длительном применении препарата в пятикратной терапевтической дозе у крыс опытной группы достоверно возрастало содержание в сыворотке крови мочевины, в среднем на 40,5%, креатинина - на 26,0%, активность АлАТ повышалась на 64,3 % и уровень билирубина - на 91,7%. Однако среднее значение этих показателей у крыс опытной группы не выходило за верхние границы нормы для данного вида животных. С увеличением дозы левотила наблюдалось также достоверное возрастание бактерицидной активности сыворотки крови.

При проведении патоморфологических исследований у лабораторных животных как опытных, так и контрольной групп, макроскопически не было выявлено отклонений и особенностей в строении внутренних органов. Их расположение было анатомически правильным, нормальных объемов, серозные оболочки полостей имели ярко-розовый цвет, гладкую и блестящую поверхность. Однако увеличение терапевтической дозы препарата в 5 раз повышает нагрузку на почки и печень животных, не выводя при этом их функциональное состояние за верхние границы нормы. Эти изменения носили обратимый характер и отражали адаптационно-компенсаторные сдвиги в органах в ответ на сравнительно длительное воздействие препарата.

Анализ данных подострого эксперимента на клинически здоровых телятах не выявил отрицательного влияния терапевтической дозы левотила на основные показатели крови животных. Исследования биохимических показателей сыворотки крови установили недостоверное возрастание концентрации общего белка и его гамма-глобулиновой фракции в пределах физиологической нормы. На наш взгляд, это может быть связано с неблагополучием хозяйств по желудочно-кишечным болезням телят этого возрастного периода, с одной стороны, и отсутствием угнетающего действия левотила на процессы иммуногенеза в организме, с другой. Остальные показатели не претерпевали существенных изменений и не отличались от контрольных.

Изучение кожно-резорбтивного действия и аллергизирующих свойств левотила на белых крысах, морских свинках и кроликах при однократном и многократном нанесении, а также путем воспроизведения анафилактического шока и выявления кожных реакций (отека, зуда) у предварительно сенсибилизированных животных не выявило негативного влияния препарата, как в месте нанесения, так и на общую ответную реакции организма. Это характеризует его как препарат, не оказывающий патологически значимых изменений местного аллергического характера на животных.

Результаты проведенных исследований по оценке эмбриотоксического и тератогенного действия установили, что назначение левотила в терапевтической дозе беременным животным не оказывает негативного влияния на течение беременности и роды. Потомство, рожденное от крыс, получавших препарат во время беременности, не отличалось от крысят контрольных животных. Различий в их росте, развитии и поведении обнаружено не было.

Исходя из результатов токсикометрической оценки установлено, что по всем параметрам левотил относится к 4 классу токсичности, то есть является малотоксичным веществом, что соответствует литературным данным (Б. Донев с соавт., 1998).

Проведение ветеринарно-санитарной экспертизы продуктов убоя, в ходе которой оценивался комплекс органолептических показателей, не установил отрицательного действия препарата на качество и вкусовые свойства мяса.

Проведенные исследования по изучению активности компонентов! левотила (левомицетин, тилозин) в органах, тканях и биологических жидкостях телят после 5-ти кратного применения препарата показали, что бактериоста-тическая концентрация антибиотиков в крови сохраняется в течение 48 часов, достигая максимума через 3 часа после инъекции.

Установлено, что левотил в течение 7 суток полностью выводится из организма, что было доказано при определении его остаточных количеств в биологическом материале. При этом сам тилозин, входящий в состав препарата, полностью выводится из организма в течение 1-2 суток (В.А. Антипов, 1987).

При изучении антимикробной активности левотила установлено его выраженное действие в отношении как грам позитивных, так и грам негативных бактерий, в отношении которых действие тилозина не значительно ( М.Д.Машковский, 1997).

Таким образом, проведенные всесторонние экспериментальные исследования по изучению специфической активности, острой, подострой и хронической токсичности, аллергенных свойств, кожно-резорбтивного действия, фармакокинетики, эмбриотоксического и тератогенного действия, общего действия на организм животных, влияния на качество мяса и других свойств левотила позволяют заключить, что:

- композиция тилозина и левомицетина обладает синергидными свойствами; - в опытах in vitro и in vivo определены наиболее эффективные антибактериальные соотношения состава левотила;

- левотил обладает широким спектром антибактериальной активности в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов -основных возбудителей острых желудочно-кишечных болезней молодняка телят;

- левотил по токсикометрическим параметрам относится к 4 классу токсичности, то есть является малотоксичным;

-препарат не обладает кожно-раздражающим и кожно-резорбтивным действием, кумулятивными и.аллергизирующими свойствами;

- левотил не оказывает отрицательного влияния на морфологический состав крови, иммунологический статус и неспецифическую резистентность организма клинически здоровых животных. При длительном его применении качество мяса и мясопродуктов не изменяется.

С учетом указанных выше особенностей левотила разработаны и утверждены Наставление по применению левотила и Технические условия (№ ООЮ51-ОП от 25.05.2002 г.)

Эффективность применения левотила при колибактериозе у телят достаточно высока. Результаты клинических исследований свидетельствуют, что левотил обладает более выраженной терапевтической эффективностью при колибактериозе у телят, по сравнению с зинапримом и байтрилом. При его применении клиническое улучшение (прекращение диареи и улучшение аппетита) наступало на 3-4 дни лечения. В контрольной группе, где применяли зинаприм и байтрил, клинические признаки заболевания исчезали на 4-5 дни лечения.

При применении левотила значительно снижался падеж телят — с 26,5% в контрольной группе до 7,7% - в опытной. Среднесуточный прирост массы тела у телят опытной.группы был выше на 24,7%.

Таким образом, левотил является эффективным средством для лечения колибактериоза у телят.

Экомический эффект применения левотилапри колибактериозе у телят составляет 15,69 рублей на 1 рубль затрат, в то время как при применении зинаприма — всего 5,84 рублей.