Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Диагностическая ценность ПЦР-тест-систем при туберкулёзе животных

На правах рукописи

Калмыкова Марина Станиславовна

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ПЦР-ТЕСТ-СИСТЕМ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ ЖИВОТНЫХ

16 00 03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

оози < у

Москва-2007

003071122

Работа выполнена в лаборатории микобактериозов ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я Р Коваленко Россельхозакадемии (ВИЭВ), ФГУ Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория, учебно-методическом центре НПЦ «Диагностика генно-инженерными системами»

Научный руководитель доктор ветеринарных наук, профессор,

заслуженный ветеринарный врач Российской Федерации Али Хусинович Найманов

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Олег Анатольевич Верховский доктор биологических наук, профессор Лариса Николаевна Черноусова

Ведущая организация ФГУ Всероссийский государственный Центр

качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов

Защита диссертации состоится « 30 » мая 2007 г в II00 часов на заседании диссертационного совета Д 006 033.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им Я.Р Коваленко по адресу 109428, Москва, Рязанский проспект, 24/1, ВИЭВ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ. Автореферат разослан «Д б » апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор -- _— — " Н П Овдиенко

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В общем комплексе противотуберкулезных мероприятий большое значение имеет своевременная и точная диагностика Внутрикожная туберкулиновая проба была и остается основным методом прижизненной диагностики туберкулеза животных в нашей стране и за рубежом Тем не менее, имеются противоречивые мнения о диагностической ценности и практической значимости туберкулина

В настоящее время большие сомнения и трудности в постановке диагноза в благополучных хозяйствах создают массовые выявления животных с неспецифическими реакциями на туберкулин и недовыявление инфицированных туберкулезом животных в неблагополучных хозяйствах (АНШаров, 1982, 1985, НПОвдиенко, 1991, 2002, АХ.Найманов, 2002, 2003)

В последнее время появились работы некоторых исследователей, которые считают, что при многократных инъекциях туберкулина нельзя исключить возможность размножения адаптивных форм возбудителя туберкулеза, поступающих с туберкулином в организм крупного рогатого скота

Достижения в области молекулярной генетики привели к разработке новых подходов к обнаружению возбудителя в исследуемом материале. На протяжении последних лет широко используются молекулярные технологии, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР), для генотипирования и дифференциации микроорганизмов на уровне хромосомной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК)

В последние годы продолжаются исследования по изучению возможности применения ПЦР при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота (И Л Обухов с соавт, 1995, 1997, И П Суханов, 1999, АНШаров, 1998, 2000, 2003, Т В Гребенникова с соавт, 1999, 2004, Б И Антонов, 2002, ИВЕфимычев, 2002, ТА Борисова с соавт, 2004, А X Найманов с соавт, 2004; Е П Осипова, 2004, Т И Алипер с соавт, 2006)

В настоящее время в ветеринарных лабораториях России применяют ПЦР-тест-системы четырех производителей, в том числе, три комплексные для выявления ДНК Mycobacterium bovis и Mycobacterium tuberculosis производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (ЦНИИЭ), ЗАО «ЛАГИС», ООО «Компания «БИОКОМ» и одну дифференцирующую Mycobacterium bovis от Mycobacterium tuberculosis производства НПО «НАРВАК». Кроме того, для выявления ДНК Mycobacterium avium используют тест-систему «АВИУМ» производства ЦНИИЭ

Анализ представленных в доступной литературе данных показывает, что при применении ПЦР-тест-систем разных производителей получены существенные отличия и неоднозначные результаты До настоящего времени единого мнения о диагностической значимости и возможности применения ПЦР-тест-систем разных производителей при диагностике туберкулеза животных нет, поэтому этот метод не нашёл широкого применения в ветеринарной практике нашей страны и за рубежом. Главной причиной этого является получение при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота значительного количества ложноположительных и ложноотрицательных результатов ПЦР-исследования

Разработанный в последние годы гибридизационно-флуоресцентный метод детекции продуктов ПНР, получивший название «Real-time PCR», в отличие от классической ПЦР, имеет ряд преимуществ количественное определение ДНК/РНК, определение двух и более видов возбудителя в ходе одной реакции, высокая чувствительность, отсутствие стадии электрофореза Указанные преимущества позволяют минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР и снизить число ложноположительных результатов

Кроме того, имеются не изученные и недостаточно изученные вопросы о возможностях применения метода ПЦР при диагностике туберкулеза животных Так, в доступной литературе мы не нашли сообщений о возможности применения полимеразной цепной реакции при диагностике

туберкулеза у других видов животных (коз, кроликов, морских свинок, кур) и исследовании объектов внешней среды

Поэтому, учитывая сложную эпидемическую и эпизоотическую ситуации по туберкулезу в нашей стране, недостаточную изученность некоторых важных вопросов диагностики, дальнейшее совершенствование и изучение возможности применения метода ПЦР при диагностике туберкулеза у крупного рогатого скота и других видов животных является своевременным и актуальным

Целью исследований являлось изучение диагностической ценности коммерческих тест-систем для диагностики туберкулеза животных методом ПЦР, используемых в ветеринарных лабораториях Российской Федерации

Основные задачи исследований:

1 Провести ПЦР-исследование «Туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих» производства ФГУП «Курская биофабрика» - фирма БИОК с целью определения возможности выделения из туберкулина возбудителя М bovis и ДНК M.bovis

2 Провести сравнительное изучение диагностической ценности ПЦР-тест-систем четырех производителей ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, НПО «НАРВАК», ЗАО «ЛАГИС», ООО «Компания «БИОКОМ».

3 Провести сравнительное изучение ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» и детекцией методом электрофореза

4 Изучить диагностическую ценность ПЦР при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота, а также экспериментально зараженных разными видами микобактерий коз, морских свинок, кроликов и кур.

5 Установить возможность выделения ДНК возбудителей туберкулеза из объектов внешней среды методом ПЦР

Научная новизна.

Впервые проведено культуральное и ПЦР-исследование ППД-туберкулина для млекопитающих и установлено, что ППД-туберкулин для млекопитающих не содержит возбудителя М bovis и ДНК M.bovis

Установлено преимущество гибридизационно-флуоресцентной детекции результатов ПЦР в режиме «реального времени» и возможность применения метода ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» для диагностики туберкулеза у разных видов животных

Показано, что метод ПЦР недостаточно эффективен для прижизненной диагностики туберкулеза у экспериментально зараженных разными видами микобактерий коз, но обладает 100% эффективностью при исследовании послеубойного патологического материала от этих животных

Установлено, что экспериментально зараженные туберкулезом козы выделяют возбудителя во внешнюю среду. Метод ПЦР выявляет ДНК возбудителей туберкулеза из патматериала от лабораторных животных и объектов внешней среды

Впервые предложено использовать метод ПЦР для лабораторного контроля качества текущей и заключительной дезинфекции помещений ферм и прифермских территорий

Практическая значимость.

Результаты исследований включены в «Методические рекомендации по диагностике микобактериальных инфекций животных», утвержденных директором ГНУ ВИЭВ, академиком Россельхозакадемии М И. Гулюкиным 22 марта 2007 г

Личный вклад соискателя заключается в исследовании биоматериапа от разных видов животных, объектов внешней среды и культур микобактерий методом полимеразной цепной реакции с использованием тест-систем четырёх производителей, проведении экспериментальных

исследований на козах, морских свинках, кроликах и курах, анализе и обобщении результатов исследований

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Международной научно-практической конференции «Эпизоотология и профилактика инфекционных болезней крупного рогатого скота» (Киев, 2006), Международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России (Курск, 2006), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР, доктора ветеринарных наук, профессора, академика ВАСХНИЛ Я Р Коваленко (Москва, 2006), Межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ (Москва, 2007), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы молекулярной диагностики в ветеринарной медицине» (Феодосия, 2007) Материалы диссертации используются при чтении цикла лекций врачам -бактериологам ветеринарных лабораторий субъектов РФ на курсах повышения квалификации ветеринарных врачей в ФГУ Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория.

Основные положения, выносимые на защиту.

Полученные результаты исследований позволяют вынести на защиту следующие основные положения.

1 Результаты культурального и ПЦР-исследования «Туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих» производства ФГУП «Курская биофабрика» - фирма БИОК

2 Результаты сравнительного изучения диагностической ценности ПЦР-тест-систем четырёх производителей с детекцией методом электрофореза и гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

3. Результаты изучения диагностической ценности ПЦР-тест-систем четырех производителей при исследовании биоматериала от крупного рогатого скота с неспецифическими реакциями на туберкулин и экспериментально зараженных разными видами микобактерий коз, морских свинок, кроликов и кур

4 Результаты исследования различных объектов внешней среды ПЦР-тест-системами четырех производителей.

5. Определение роли и места ПЦР в общем комплексе профилактических и оздоровительных мероприятий на современном этапе борьбы с туберкулезом животных

Публикации результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано шесть статей

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на ^^страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений и списка литературы Список цитируемой литературы содержит 383 источника, из них 140 зарубежных Работа иллюстрирована 11 таблицами, 6 фотографиями и 8 графиками

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. Материалы и методы исследований. Работа выполнена в 2002-2006 гг. в лаборатории микобактериозов ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им Я Р Коваленко (ВИЭВ), на опытной базе о Лисий Вышневолоцкого отдела ВИЭВ, ФГУ Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория (ЦНМВЛ), учебно-методическом центре НПЦ «Диагностика генно-инженерными системами»

Аллергические, патологоанатомические и патоморфологические исследования проведены совместно с А Х.Наймановым, В С Суворовым, О В Якушевой, Э Л.Колосковой, В И Строгоновым. Культуральные

исследования выполнены совместно с Н Г Толстенно Е П Вангели, Е Э Соколовой Исследования методом полимеразной цепной реакции выполнены самостоятельно в ФГУ ЦНМВЛ и НПЦ «Диагностика генно-инженерными системами»

Для исследования использовали «Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих» производства ФГУП «Курская биофабрика» - фирма БИОК, серия 9, контроль 9, изготовленный 10 08 2006 г

Для сравнительного изучения ПЦР-тест-систем и исследования ППД-туберкулина использовали три комплексные тест-системы «МТБ-КОМ» (ЦНИИЭ), «ДиаГен-Mycobactena» (ЗАО «ЛАГИС»), «GenePak DNA PCR test Mtu+bo» (ООО «Компания «БИОКОМ») и две ПЦР-тест-системы для выявления и дифференциации возбудителей туберкулеза М bovis и М tuberculosis производства НПО «НАРВАК» и Института молекулярной генетики РАН

Для определения чувствительности ПЦР-тест-систем в качестве положительного материала использовали кровь крупного рогатого скота, содержащую культуру М bovis (штамм BCG) в разной концентрации Отрицательным (контрольным) материалом служила кровь здорового крупного рогатого скота из благополучного по туберкулезу хозяйства

Специфичность тест-систем определяли на 62 музейных культурах микобактерий М tuberculosis-10, М bovis-22, М avium-10, М paratuberculosis-3, М phlei-4, М smegmatis-4, М fortuitum-3, М xenopy-3, М scrofulaceum-3.

Для ПЦР-исследований биоматериалов от разных видов животных использовали тест-системы «МТБ-КОМ» и «МТБ-КОМ-FRT» (ЦНИИЭ), «Тест-систему для выявления и дифференциации возбудителей туберкулеза М bovis и М tuberculosis» (НПО «НАРВАК»), «ДиаГен-Mycobactena» (ЗАО «ЛАГИС»), «GenePak DNA PCR test Mtu+bo» (ООО «Компания «БИОКОМ») Для выявления ДНК М avium применяли тест-систему «АВИУМ» (ЦНИИЭ)

Выделение ДНК, постановку ПЦР и учет результатов проводили в соответствии с наставлениями по применению тест-систем Постановку ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» проводили на приборе ЯоЮгСепе-бООО производства «СогЬеИЯезеагсЬ» (Австралия) Полученные в ходе экспериментов данные анализировали с помощью программного обеспечения «ЯоЮгОепе 6 0» Результаты реакции интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией в виде графика зависимости интенсивности флуоресценции от количества циклов, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла «СЪ> в таблице результатов

Для культурального исследования пробы туберкулина высевали на питательные среды Левенштейна-Йенсена, ФАСТ-ЗЛ и ВКГ. Патматериал обрабатывали по методу АПАликаевой (1967,1979), посев проводили на среды Левенштейна-Йенсена и ФАСТ-ЗЛ

Для повышения информативности проб патологического материала каждую пробу исследовали в трех параллелях

От крупного рогатого скота исследовали 15 проб крови, 15 проб носовой слизи, 15 проб мочи, 15 проб фекалий, 45 проб патматериала (кусочки паренхиматозных органов и лимфатические узлы, заглоточные, подчелюстные, бронхиальные, средостенные, брыжеечные, области илеоцекального соединения)

От коз исследовали 147 проб крови, 147 проб носовой слизи, 147 проб фекалий, 504 пробы патматериала (кусочки паренхиматозных органов и лимфатические узлы подчелюстные, заглоточные, бронхиальные, средостенные, портальные, брыжеечные, илеоцекального соединения и подвздошной кишки)

От 30 морских свинок, 30 кроликов и 24 кур исследовали кусочки паренхиматозных органов и лимфатические узлы (по 90 проб от морских свинок и кроликов, 72 пробы от кур)

Исследовано 135 проб смывов со стен боксов, где содержались зараженные туберкулезом козы, 135 проб смывов со стенок поилок и 135 проб воды из поилок

Статистическую обработку данных проводили по критерию х2 с использованием пакета программ Excel, пособия В П Еремина «Элементы математической обработки биологического эксперимента» (Ленинград, 1974)

Результаты исследований 1. Исследование «Туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих» производства ФГУП «Курская биофабрика» - фирма БИОК.

Исследование ППД-туберкулина для млекопитающих на наличие ДНК М bovis провели с использованием тест-систем «МТБ-КОМ», «МТБ-КОМ-FRT», «ДиаГен-Mycobacteria», «GenePak DNA PCR test Mtu+bo» и двух тест-систем для выявления и дифференциации возбудителей туберкулеза М bovis и М tuberculosis Во всех случаях получены отрицательные результаты, ДНК М bovis не обнаружена.

Кроме того, провели культуральное исследование туберкулина на питательных средах Левенштейна-Иенсена, ФАСТ-ЗЛ и ВКГ Перед посевом на среду ВКГ туберкулин предварительно суспендировали в стимуляторе роста в соотношении 1 1 и инкубировали при 37°С в течение 48 часов Затем высевали на чашки Петри За посевами на средах Левенштейна-Иенсена и ФАСТ-ЗЛ наблюдали в течение трех месяцев, на среде ВКГ - 10 суток На средах Левенштейна-Иенсена и ФАСТ-ЗЛ возбудителя туберкулеза М bovis не выделили На среде ВКГ адаптивных и трансформационных форм возбудителя туберкулеза М bovis не выделили

Дополнительно для ПЦР-исследования были взяты смывы с поверхности питательных сред, засеянных туберкулином ПЦР-исследованием смывов ДНК М bovis также не обнаружена

Таким образом, проведённые нами культуральные и ПЦР-исследования позволяют заключить, что «Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих» производства ФГУП «Курская биофабрика» - фирма БИОК не содержит возбудителя М bovis и ДНК М bovis

2. Сравнительное изучение ПЦР-тест-систем разных производителей.

Для определения чувствительности ПЦР-тест-систем в качестве положительного биоматериала использована кровь крупного рогатого скота с добавлением культуры М bovis (штамм BCG) в концентрации - от 70 млн до 10 микробных клеток М bovis (штамм BCG) в 0,1 мл крови Отрицательным (контрольным) материалом служила кровь здорового крупного рогатого скота из благополучного по туберкулезу хозяйства

Таблица 1

Сравнительная чувствительность тест-систем

№ про бы Количество возбудителя (микробных клеток в 0,1 мл пробы) Результат исследования тест-системами

I II III IV V

1 70 000 000 + + + + +

2 7 000 000 + + + + +

3 700 000 + + + + +

4 100 000 + + + + +

5 10 000 + + + + +

6 1 000 + + + + +

7 100 + + - + +

8 10 + + - + +

9 Кровь КРС (без М bovis) - - - - -

10 К+ + + + + +

11 К- - - - - -

Представленные в таблице 1 результаты показывают, что тест-системы I, II, IV, V имеют одинаковую чувствительность - 10 клеток М bovis в пробе (минимально взятая концентрация), тест-система III имеет чувствительность ниже - 1000 клеток М bovis в пробе, что при низкой бактериальной нагрузке пробы может быть причиной получения ложноотрицательных результатов

Изучение специфичности тест-систем провели на 62 культурах микобактерий

Таблица 2

Результаты выявления разных видов микобактерий

Характеристика пробы Кол- во проб Результат исследования тест-системами

положительный отрицательный

I II III IV V I II III IV V

Содержит М bovis и М tuberculosis 32 28 32 32 32 32

Содержит другие виды микобактерий 30 24 28 32 32 32

Процент специфичности 87, 5 100 100 100 100 80 93, 3 100 100 100

Результаты исследования показали (табл 2), что все испытанные тест-системы обладают разной специфичностью Показатель специфичности варьирует от 80% до 100% при исследовании разных культур Так, при исследовании культур М tuberculosis и M.bovis специфичность тест-систем II, III, IV, V составила 100%, тест-системы I - 87,5%, те ложноотрицательные результаты получены в четырех случаях из 32

При исследовании других культур микобактерий специфичность тест-систем III, IV, V составила 100%, I - 80%, II - 93,3%, те ложноположительные результаты получены в шести и двух случаях из 30 соответственно

Таким образом, при исследовании различных культур микобактерий тест-системами III, IV, V культуры правильно идентифицированы в 100% случаев, тест-системой I - в 84%, II - в 96,7%

В результате проведенных исследований установлено преимущество тест-системы V, которая обладает высокой чувствительностью и 100% специфичностью, перед тест-системами I и II.

Испытанные дифференцирующие тест-системы III и IV обладают 100% специфичностью, но разной чувствительностью Так, чувствительность тест-системы IV составила 10 клеток М bovis в 0,1 мл пробы, тест-системы III -1000 клеток В этих тест-системах используется «гнездовая» модификация метода ПЦР («nested PCR»), позволяющая проводить дифференциацию М bovis и М tuberculosis, повышающая в несколько раз специфичность реакции, но более трудоемкая за счет постановки двух раундов ПЦР, требующая высокой квалификации персонала лаборатории и строгого соблюдения режима работы. Для одновременного выявления и дифференциации возбудителей туберкулеза в дальнейших исследованиях мы выбрали тест-систему IV

3. Изучение диагностической ценности ПЦР-тест-систем при исследовании биоматериалов от крупного рогатого скота

Для изучения диагностической ценности ПЦР-тест-систем провели исследование биоматериалов от 15 голов крупного рогатого скота с неспецифическими реакциями на туберкулин из благополучных по туберкулезу хозяйств, где установлена сенсибилизация животных нетуберкулезными микобактериями

При убое 15 реагировавших коров характерных для туберкулеза патологоанатомических изменений не обнаружено ни в одном случае При лабораторном исследовании (культуральном и биологическом) патматериала от убитых животных возбудитель туберкулеза не выделен

При исследовании биоматериалов (крови, носовой слизи, мочи и фекалий) получены ложноположительные результаты тест-системами I - в носовой слизи (13,3%) и фекалиях (6,7%), II - в носовой слизи и фекалиях (по 6,7%), IV - в носовой слизи (13,3%) и моче (6,7%), V - в носовой слизи (13,3%) и моче - (6,7%) При исследовании проб крови тест-системами I, IV и

V получены отрицательные результаты, тест-системой II получены ложноположительные результаты в 13,3% случаев Однако, статистически значимых различий результатов ПЦР по сравнению с результатами патологоанатомического и культурального исследований не получено (Р>0,05)

При исследовании этих биоматериалов тест-системой VI в 100% случаев получены отрицательные результаты

При исследовании послеубойного материала тест-системами И, IV, V и

VI во всех случаях получены отрицательные результаты, тест-системой I в 33,3% случаев получены положительные результаты, что, возможно, связано с недостаточной специфичностью тест-системы. Статистические различия результатов патологоанатомического и культурального исследований и числа положительных результатов ПЦР были достоверны (Р<0,05)

Полученные результаты ПЦР-исследований тест-системой VI коррелируют с результатами патологоанатомического и бактериологического исследований

4. Изучение диагностической ценности ПЦР при диагностике туберкулеза экспериментально заражённых разными видами микобактерий коз.

В эксперименте использовано 17 коз в возрасте до одного года В начале опыта всех животных исследовали симультанной туберкулиновой пробой с ППД-туберкулином для млекопитающих и KAM Биоматериалы от подопытных коз (кровь, носовая слизь, фекалии) исследовали тест-системами I, II, IV, V, VI и «АВИУМ» При учете результатов аллергических и ПЦР-исследований были получены отрицательные результаты.

В дальнейшем животные были разделены на пять групп по три козы и заражены орально одна группа - М bovis (в эту же группу были поставлены на контакт две козы, не зараженные возбудителями туберкулеза), две группы -М tuberculosis, одна - М avium Одна группа коз составила контрольную группу

Первое исследование коз провели через 21 день после последнего заражения Последующие исследования проводили каждые 30-60 дней пальпебральной туберкулиновой пробой и методом ПЦР

Установлено, что проявление аллергических реакций было не стабильным Более интенсивные аллергические реакции на пальпебральную пробу наблюдали у зараженных М bovis и M.tuberculosis коз, менее выраженные - М avium. Козы контрольной группы не реагировали на пальпебральную пробу Через два месяца после заражения пала зараженная М bovis коза №4

При первом ПЦР-исследовании ДНК возбудителя туберкулёза выделили из биоматериала от заражённой М tuberculosis козы №9 При этом, тест-системами II, IV, V и VI ДНК выделена из носовой слизи этой козы, при исследовании тест-системой I - из носовой слизи и крови При дифференциации тест-системой IV возбудитель отнесен к человеческому виду При исследовании биоматериала от остальных коз получены отрицательные результаты.

При исследовании методом ПЦР биоматериала от коз через 55, 103, 134, 164, 218 и 266 дней во всех случаях получены отрицательные результаты

Через 296 дней были получены единичные положительные результаты ПЦР-исследования При исследовании биоматериалов от коз тест-системами I, IV, V и VI ДНК возбудителя туберкулеза выделена только из крови зараженной M.tuberculosis козы №7 При дифференциации тест-системой IV возбудитель отнесен к человеческому виду При исследовании биоматериалов от коз тест-системой II положительные результаты получены при исследовании носовой слизи и фекалий от козы №16 контрольной группы и носовой слизи козы №3, зараженной М avium

При исследовании биоматериалов от зараженных М avium коз тест-системой «АВИУМ» во всех случаях получены отрицательные результаты

Через 296 дней после заражения все животные были убиты, проведен патологоанатомический осмотр и отобран патматериал для культурального и ПЦР-исследования.

При патологоанатомическом осмотре трех зараженных М bovis коз, двух поставленных на контакт в эту группу коз, четырех зараженных М tuberculosis коз (№7, №8, №9 и №14) и трех зараженных М avium коз были обнаружены характерные для туберкулеза изменения У коз контрольной группы характерных для туберкулеза изменений не обнаружили.

Культуральными исследованиями патматериала от коз на среде Левенштейна-Йенсена выделено шесть исходных культур Выделенные культуры исследованы методом ПЦР.

Таблица 3

Результаты исследования выделенных культур микобактерий

№ козы (культуры) из группы, зараженной Результаты ПЦР-исследования тест-системами

I II ~ IV V VI Авиум

M.t.+b. M.t.

№3 (М.avium) - - - - - - +

№5 (М bovis) + + + - + +

№7 (М tuberculosis) + + + + + +

№8 (М tuberculosis) + + + + + +

№11 (на контакте с М bovis) - - + - + +

№14 (М tuberculosis - - + + + +

Полученные результаты (табл 3) свидетельствуют, что все испытанные тест-системы позволяют с разной степенью эффективности выявлять микобактерии туберкулезного комплекса в бактериальных культурах, тест-система IV позволяет дифференцировать М bovis от М tuberculosis.

Для дифференциации культур методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией мы использовали экспериментальную мультиплексную тест-систему производства ЦНИИЭ, позволяющую в ходе одной реакции дифференцировать М bovis, М tuberculosis, М bovis (шт BCG) В результате дифференциации культуры №5 и №11 отнесены к М bovis, №7,

№8 и №14 - M tuberculosis Из культуры №3 ДНК М bovis и М tuberculosis не выделили

Таким образом, результаты наших исследований доказывают, что метод ПЦР является эффективным экспресс - методом для индикации и дифференциации культур микобактерий Более того, внедрение в ветеринарную практику гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме «реального времени» и создание новых мультиплексных тест-систем позволяет в ходе одной реакции провести не только выявление возбудителей туберкулезного комплекса, но и одновременную их дифференциацию Патматериал от павшей и убитых коз исследовали методом ПЦР

Таблица 4

Результат ПЦР-исследования патологического материала от коз

Группа Результат исследования тест-системами

I II IV V VI АВИУМ

М bovis

№4 + + + + +

№5 + + + + +

№6 + + + + +

№11 - - + + +

№12 + + + + +

М tuberculosis

№7 + + + + +

№8 + + + + +

№9 + + + + +

М avium

№1 + - - - - +

№2 - - - - - +

№3 - - - - - +

М tuberculosis

№13 - - - - -

№14 - - + + +

, №15 - - - - -

Контрольная

№10,16,17 - - - - - -

Таблица 4 иллюстрирует, что при исследовании патматериала от заражённых М bovis (№4,5,6,11,12) и М tuberculosis (№7,8,9) коз тест-

системами IV, V, VI во всех случаях получены положительные результаты, от коз второй зараженной М tuberculosis группы положительный результат получен от одной козы (№14) Тест-системами I и II положительные результаты получены при исследовании патматериала от зараженных М bovis (№4,5,6,12) и М tuberculosis (№7,8,9) коз

От зараженных М avium коз тест-системой «АВИУМ» во всех случаях выделена ДНК М avium, тест-системами II, IV, V получены отрицательные результаты, тест-системой I от козы №1 получен положительный результат.

При исследовании патматериала от коз контрольной группы во всех случаях получены отрицательные результаты

Эффективность культурального исследования патматериала составила

35,0%

Таким образом, число положительных результатов ПЦР при исследовании патматериала от зараженных туберкулезом коз достоверно преобладало (Р<0,05) над положительными результатами культурального исследования

Подводя итоги данному разделу можно заключить, что метод ПЦР недостаточно эффективен для прижизненной диагностики туберкулеза у экспериментально зараженных туберкулезом коз Однако, метод ПЦР позволяет до 100% случаев выявлять ДНК возбудителя туберкулеза в патологическом материале

Исследование лабораторных животных, находившихся в контакте с зараженными козами

Для биологического контроля заражения коз М bovis, М tuberculosis и М avium в боксах с зараженными козами и козами контрольной группы содержали по три морские свинки, три кролика и три курицы После окончания эксперимента все животные были убиты, проведены патологоанатомические исследования, а паренхиматозные органы от лабораторных животных исследованы культуральным методом и методом ПЦР.

При патологоанатомическом исследовании характерные для туберкулеза изменения обнаружены у двух морских свинок, находившихся в контакте с зараженными М bovis козами, и у одной курицы, находившейся в контакте с зараженными М avium козами

Культуральным исследованием патматериала от лабораторных животных возбудитель туберкулеза выделен из патматериала от двух кур, находившихся в контакте с зараженными М avium козами При дифференциации двух выделенных культур методом ПЦР тест-системой АВИУМ получено два положительных результата, т е обнаружена ДНК М avium

ПЦР-исследованием патматериала от морских свинок, кроликов и кур, находившихся в контакте с зараженными М bovis козами, тест-системами I, IV, V и VI ДНК микобактерий выделена из патматериала от одной морской свинки, тест-системой II получены отрицательные результаты

ПЦР-исследованием патматериала от морских свинок, кроликов и кур, находившихся в контакте с зараженными М tuberculosis козами, ДНК микобактерий выделены тест-системой I из патматериала от трех морских свинок, тест-системами IV, V и VI - от двух морских свинок, тест-системой II - от одной морской свинки

ПЦР-исследованием патматериала от лабораторных животных, находившихся в контакте с зараженными М avium козами, тест-системой «АВИУМ» ДНК М avium выделена из патматериала от двух кур, тест-системами И, IV, V и VI получены отрицательные результаты, тест-системой I ДНК возбудителя туберкулеза выделена из патматериала от одной морской свинки и от двух кур.

Комплекс исследований лабораторных животных, находившихся в контакте с козами контрольной группы, был отрицательным

Таким образом, ПЦР-исследованиями установлено, что экспериментально заражённые козы выделяют возбудителя туберкулеза во внешнюю среду, что является источником заражения лабораторных

животных Морские свинки наиболее восприимчивы к контактному заражению М bovis и М tuberculosis, а куры - к М avium.

5. Исследование патматернала от лабораторных животных, экспериментально заражённых разными видами микобактерин

На начальном этапе пять бактериальных культур микобактерий (№1-М bovis, №2-М tuberculosis, №3-М avium, №4-М phlei, №5-М smegmatis) исследовали тест-системами для ПЦР-диагностики туберкулеза четырех производителей Проведенные исследования показали, что из бактериальных культур M.bovis и М tuberculosis всеми испытанными тест-системами выделены ДНК возбудителей туберкулеза При дифференциации этих культур тест-системой IV установлено, что культура №1 является M.bovis, культура №2 - М tuberculosis. При исследовании культуры №3 с тест-системой «АВИУМ» выделена ДНК M.avium При исследовании культуры М smegmatis всеми тест-системами получены отрицательные результаты, культуры Mphlei отрицательные результаты получены с тест-системами II, IV, V, с тест-системой I получен положительный результат

Вторым этапом было заражение культурами М bovis, М tuberculosis, М avium, М phlei и М smegmatis лабораторных животных Одна группа морских свинок, кроликов и кур составила контрольную группу. Через три месяца после заражения животные были убиты и проведены патологоанатомические, культуральные и ПЦР-исследования

При патологоанатомическом исследовании характерные для туберкулёза изменения обнаружены у всех морских свинок и всех кроликов, зараженных М bovis и М tuberculosis, а также у трех кроликов и трех кур, зараженных М. avium

Культура возбудителя туберкулеза выделена в одном случае из патматернала от кролика и в двух случаях из патматериала от кур, зараженных М avium ПЦР-исследованием выделенных культур тест-системой «АВИУМ» выделена ДНК М avium

Метод ПЦР в зависимости от применяемой тест-системы позволил выделить из патматериала от зараженных М bovis и М tuberculosis морских свинок и кроликов ДНК М bovis и М tuberculosis с эффективностью от 83,3 до 100% тест-системами I и II - 83,3%, IV и V - 92%, VI - 100% Тест-система IV позволяет со 100% достоверностью дифференцировать ДНК М bovis от ДНК М tuberculosis

ПЦР-исследованием патматериала от зараженных М avium лабораторных животных тест-системой «АВИУМ» ДНК М avium выделена из патматериала от одного кролика и двух кур

При исследовании патматериала от лабораторных животных, зараженных М avium, М phlei, М smegmatis, а также контрольной группы, во всех случаях получены отрицательные результаты

Полученные результаты ПЦР-исследования патологического материала от лабораторных животных, зараженных разными видами микобактерий, коррелируют с результатами биологического исследования

Как показывают результаты наших исследований, число положительных результатов ПЦР достоверно преобладало (Р<0,05) над положительными результатами культурального исследования 6. Исследование объектов внешней среды.

Объекты внешней среды (смывы со стен, смывы со стенок поилок и воду из поилок) из боксов, где содержали экспериментально заражённых разными видами микобактерий коз, исследовали тест-системами I, II, IV, V, VI и «АВИУМ» до заражения, через 21, 55, 103, 134, 164, 218, 266, 296 дней после заражения, а также после убоя коз и проведения дезинфекции боксов

В начале эксперимента и на протяжении восьми месяцев после заражения коз результаты ПЦР-исследования объектов внешней среды были отрицательные. В дальнейшем, через 266 и 296 дней после заражения коз, были получены положительные результаты ПЦР при исследовании воды и смывов со стенок поилок.

Таблица 5

Результаты ПЦР-исследования объектов внешней среды через 266 и 296 дней после заражения коз

Группы коз и объекты исследования Результаты исследования ПЦР-тест-системами через дней

I II IV V VI АВИУМ

266 296 266 296 266 296 266 296 266 296 266 296

M.bovis

Смывы со стен

Смывы со стенок поилок - + + + + + + + + +

Вода - + + + - + - + + +

М. tuberculosis (материал + культура)

Смывы со стен

Смывы со стенок поилок - + - + + + - + + +

Вода - - - + - + - + + +

M.avium

Смывы со стен

Смывы со стенок поилок

Вода

М. tuberculosis (культура)

Смывы со стен

Смывы со стенок поилок

Вода

Контрольная

Смывы со стен - - - + - - - - - - - -

Смывы со стенок поилок - - - + - - - - - - - -

Вода

Данные таблицы 5 показывают, что при исследовании смывов со стен боксов, где содержались зараженные туберкулезом козы, ни в одном случае не было получено положительных результатов

В боксе, где содержались зараженные M.bovis козы, ДНК М bovis обнаружили в смывах со стенок поилок тест-системами И, IV, V, VI в обоих случаях, тест-системой I - в одном случае, в воде из поилок тест-системами I, IV, V - в одном случае, тест-системами II и VI - в обоих случаях

В боксе, где содержались зараженные М tuberculosis козы, ДНК М tuberculosis обнаружили в смывах со стенок поилок тест-системами I, И, V

- в одном случае, тест-системами IV и VI — в обоих случаях, в воде из поилок

- тест-системами II, IV, V - в одном случае, тест-системой VI - в обоих случаях, тест-системой I - получили отрицательный результат

В боксах, где содержались зараженные М avium козы и во второй группе зараженных M.tuberculosis коз, не было получено ни одного положительного результата ПЦР

При исследовании объектов внешней среды бокса, где содержались козы контрольной группы, тест-системами I, IV, V и VI не было получено положительных результатов, тест-системой II из смыва со стен бокса и со стенки поилки были получены однократные положительные результаты

После убоя коз, проведения очистки и дезинфекции боксов положительных результатов ПЦР не получено.

Полученные результаты доказывают, что выделение возбудителей туберкулеза и их концентрация на объектах внешней среды зависит от тяжести заболевания туберкулезом экспериментально зараженных коз и вида объекта внешней среды На стенках поилок и в воде оседает и накапливается значительное количество микобактерий, выделенных из организма зараженных туберкулезом животных, что позволяет выделять ДНК М bovis и М tuberculosis из смывов со стенок поилок и воды из поилок

Выводы

1. «Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих» производства ФГУП «Курская биофабрика» - фирма БИОК не содержит возбудителя туберкулеза М bovis и ДНК M.bovis

2 Тест-системы I, II, IV, V обладают одинаково высокой чувствительностью - 10 клеток М bovis в 0,1 мл пробы (минимально взятая концентрация), тест-система III имеет более низкую чувствительность- 1000 клеток М bovis в 0,1 мл пробы.

3 Специфичность тест-систем III, IV, V составляет 100% к М bovis, М tuberculosis, М avium, М paratuberculosis, Mphlei, Msmegmatis, М fortuitum, М хепору и M.scrofulaceum Специфичность тест-системы I к М tuberculosis и М bovis составляет 87,5%, к М.avium, М paratuberculosis, М phlei, М smegmatis, М fortuitum, М хепору и М scrofulaceum - 80% Специфичность тест-системы II к М bovis и М tuberculosis составляет 100%, к М avium, М paratuberculosis, М phlei, М smegmatis, М fortuitum, М хепору и М scrofulaceum - 93,3%

4 При исследовании биоматериалов (носовой слизи, мочи и фекалий) от реагирующих на туберкулин коров с неспецифическими реакциями получены ложноположительные результаты тест-системами I - в носовой слизи (13,3%) и фекалиях (6,7%), II - в носовой слизи и фекалиях (по 6,7%), IV и V - в носовой слизи (13,3%) и моче (6,7%). При исследовании проб крови тест-системами I, IV и V получены отрицательные результаты, тест-системой II получены ложноположительные результаты (13,3%)

При исследовании тест-системой VI биоматериалов и патматериала от этих животных в 100% случаев получены отрицательные результаты

5 При послеубойном исследовании патматериала от реагировавших на туберкулин коров с неспецифическими реакциями получены отрицательные результаты тест-системами II, IV и V; тест-системой I в 33,3% случаев получены ложноположительные результаты

6 Метод ПЦР обладает незначительной эффективностью при исследовании биологических материалов (кровь, носовая слизь, фекалии) в целях прижизненной диагностики туберкулеза экспериментально зараженных разными видами микобактерий коз

7 Метод ПЦР обладает высокой эффективностью при исследовании патологического материала от экспериментально заражённых разными видами микобактерий коз ПЦР выявляет в 100% случаев ДНК исходной культуры возбудителей туберкулеза М bovis, M.tuberculosis и М avium из

патматериала убитых животных Эффективность культурального исследования этого патматериала составляет 35,0%

8 Гибридизационно-флуоресцентная детекция результатов ПЦР в режиме «реального времени» обладает более высокой чувствительностью и специфичностью, чем детекция методом электрофореза

9 Результаты ПЦР-исследования патологического материала от зараженных разными видами микобактерий морских свинок, кроликов и кур коррелируют с результатами биологического исследования этих животных

10. Экспериментально зараженные разными видами микобактерий козы выделяют возбудителя туберкулеза во внешнюю среду, что подтверждается положительными результатами ПЦР-исследования объектов внешней среды из боксов с зараженными животными и патматериала от лабораторных животных, содержащихся в этих боксах

Практические предложения

1 При лабораторной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота для исследования патматериала от убитых животных следует применять биологическую пробу и метод ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени»

2 При проведении оздоровительных и профилактических мероприятий в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах для лабораторной проверки контроля качества проведённой текущей и заключительной дезинфекции помещений ферм и прифермских территорий объекты внешней среды исследовать методом ПЦР на наличие ДНК возбудителей туберкулеза

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1 Калмыкова М.С Сравнительное испытание тест-систем для ПЦР-диагностики туберкулеза животных / Калмыкова М С //Ветеринарная патология - 2006 - №3.- С 151-154

2 Калмыкова М С Применение метода ПЦР при диагностике туберкулеза коз / Калмыкова М С , Осипова Е П , Толстенко Н Г , Строганов В И //Ветеринарная патология - 2006 - №3.- С.149-151

3 Калмыкова М С Сравнительное изучение ПЦР-тест-систем разных производителей при исследовании биоматериала от реагирующих на туберкулин животных / Калмыкова МС, Найманов АХ., Осипова ЕП,.// Материалы международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России - Курск, 2006 -С 125-131

4 Калмыкова М С Экспериментальный туберкулез коз / Овдиенко Н П, Найманов А X , Якушева О В , Строганов В И, Строганов И В , Суворов В С , Осипова Е П , Калмыкова М С , Толстенко Н Г, Чебан С С , Колоскова Э Л И Материалы международной научн -практ конф «Эпизоотология и профилактика инфекционных болезней крупного рогатого скота» - Киев, 2006 - С 64

5 Калмыкова М С Туберкулез коз / Овдиенко Н.П, Найманов А X , Осипова Е П, Калмыкова М С , Строганов В И, Толстенко Н Г , Якушева О.В, Суворов В С, Степнова С.Н, Колоскова Э Л // Международная научн -практ. конф «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», посвященная 100-летию со дня рождения заел деятеля науки РСФСР, доктора ветеринарных наук, профессора, академика ВАСХНИЛ Я Р Коваленко - Москва, 2006

6 Калмыкова М С Диагностическая ценность ПЦР при туберкулезе КРС / Осипова Е П , Найманов А.Х , Овдиенко Н П., Калмыкова М С , Корнева И Н , Демкин В В // Международная научн -практ конф «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», посвященная 100-летию со дня рождения заел деятеля науки РСФСР, доктора ветеринарных наук, профессора, академика ВАСХНИЛ Я Р Коваленко - Москва, 2006

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09 2000 г Подписано в печать 25 04 07 Тираж 100 экз Уел пл 1,68 Печать авторефератов (495) 730-47-74,778-45-60

Актуальность темы. В общем комплексе противотуберкулёзных мероприятий большое значение имеет своевременная и точная диагностика. Внутрикожная туберкулиновая проба уже более ста лет остаётся основным методом прижизненной диагностики туберкулёза животных в нашей стране и за рубежом. Тем не менее, имеются противоречивые мнения о диагностической ценности и практической значимости туберкулина как основного средства аллергической диагностики туберкулёза крупного рогатого скота.

В настоящее время большие сомнения и трудности в постановке диагноза в благополучных хозяйствах создают массовые выявления животных с неспецифическими (парааллергическими) реакциями на туберкулин, вызываемыми сенсибилизацией организма животных нетуберкулёзными микобактериями, и недовыявление инфицированных туберкулёзом животных в неблагополучных хозяйствах. (А.Н. Шаров, 1982, 1989; Н.П.Овдиенко, 1983, 1999; А.Х. Найманов, 2002). Массовые выявления неспецифических реакций на туберкулин приводят к убою значительного количества здоровых животных, что увеличивает размеры экономического ущерба и вызывает обоснованные сомнения в правильности диагностики туберкулёза. Поэтому, прижизненная диагностика туберкулёза только одной аллергической внутрикожной туберкулиновой пробой в настоящее время становится недостаточной (А.Х.Найманов с соавт., 2004).

В последнее время появились работы некоторых исследователей (А.П. Лысенко с соавт., 1998; В.В. Власенко с соавт., 2003), которые считают, что в процессе изготовления туберкулина не происходит глубокой биологической очистки, т.к. технологический регламент не может обеспечить стерильность и специфичность препарата. Поэтому, нельзя исключить возможность размножения адаптивных форм возбудителя туберкулёза, которые поступают с туберкулином в организм крупного рогатого скота после многократных инъекций при туберкулинизации.

Сложность постановки диагноза на туберкулёз также состоит и в том, что заболевание считают установленным при: обнаружении у животных характерных для туберкулёза патологоанатомических изменений; выделении возбудителя туберкулёза культуральным методом; положительной биологической пробе на лабораторных животных, т.е., только при подтверждении патогенных свойств возбудителя инфекции.

Тем более, что традиционные лабораторные методы диагностики туберкулёза являются трудоёмкими, длительными (до 6 месяцев и более) и обладают относительно низкой эффективностью.

Поэтому, изучение возможности применения современных высокоэффективных методов диагностики туберкулёза остаётся актуальнейшей проблемой и в настоящее время (И.Г. Мальков с соавт., 1993; А.Н. Шаров с соавт., 1998, 2003; Т.В. Гребенникова с соавт., 1999; А.Х. Найманов с соавт., 2004; Г.М. Дяченко с соавт., 2005; Т.И. Алипер, 2006; J. Thole, W.J. Keulen, A. Kolk, 1987; R.J. Patel, J. Fries, W.F. Piessens, D.F. Wirth, 1990; P.W. Hermans, A.R. Schuitema, D.V. Soolingem et al., 1990; P. Shankar et al., 1990, 1991; T.S.B.Yen, J.B. You, J.S. Moa et al., 1990; M. Stermann, A. Bohrssen, C. Diephaus, S. Maass, F.-C. Bange, 2003; M. J. Espy et al., 2006).

Достижения в области молекулярной генетики привели к разработке новых подходов к обнаружению возбудителя в исследуемом материале. На протяжении последних лет широко используются молекулярные технологии, в частности полимеразная цепная реакция (ПНР), для генотипирования и дифференциации микроорганизмов на уровне хромосомной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Метод ПЦР был разработан К. Мюллисом в 1983 году и основан на уникальной способности ДНК к самовоспроизведению - репликации, включающей расплетение двойной спирали ДНК, расхождение ее нитей и достраивание на них дочерних цепей ДНК по принципу комплементарности (К. Mullis, 1987; Е. Chargaff, 1951; F.

Jacob, J. Monod, 1961; C. Bellis et al., 2003; T.M. Powledge, 2004). Установлено, что метод ПЦР позволяет получить положительный результат исследований при наличии в исследуемом материале единичных клеток возбудителя.

В дальнейшем, в зарубежной и отечественной литературе появились сообщения об успешном применении ПЦР при диагностике многих инфекционных болезней. В нашей стране успешно испытаны тест-системы для ПЦР-диагностики сибирской язвы, лептоспироза, бруцеллёза, хламидиоза, микоплазмоза, вирусных болезней свиней, гриппа птиц и других болезней.

В последние годы продолжаются исследования по изучению возможности применения ПЦР при диагностике туберкулёза животных (И.Л.Обухов с соавт., 1995, 1997; И.П.Суханов, 1999; А.Н.Шаров, 1998, 2000, 2003; Т.В.Гребенникова с соавт., 1999, 2004; И.В.Ефимычев, 2002; Б.И.Антонов, 2002; А.Х.Найманов с соавт., 2004, 2005; Е.П.Осипова, 2004; Т.А. Борисова с соавт., 2004; Т.И. Алипер с соавт., 2006).

В нашей стране, в соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулёза животных» (2002), ПЦР рекомендована только как дополнительный метод лабораторного исследования биоматериала от убитых животных и идентификации культур микобактерий.

В настоящее время в ветеринарных лабораториях России для диагностики туберкулёза методом ПЦР применяют четыре тест-системы, в том числе три комплексные для выявления ДНК M.bovis и M.tuberculosis производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (ЦНИИЭ), ЗАО «ЛАГИС», ООО «Компания «БИОКОМ» и одну дифференцирующую возбудителей туберкулёза M.bovis от M.tuberculosis производства НПО «НАРВАК». Кроме того, для выявления ДНК Mycobacterium avium используют тест-систему «АВИУМ» производства ЦНИИЭ.

Тест-системы указанных производителей отличаются праймерами, фланкирующими разные участки генома возбудителя, техническими приёмами постановки реакции, компоновкой наборов и др.

В доступной литературе имеются сообщения об испытании различных ПЦР-тест-систем при диагностике туберкулёза человека и крупного рогатого скота. Так, некоторые исследователи испытали ПЦР-тест-систему одного конкретного производителя и рекомендуют её для лабораторной диагностики туберкулёза (А.Н. Шаров с соавт., 2000, 2002; Е.Б. Вишневская, 1998, 2002; Т.В. Гребенникова с соавт., 2004; Е.П. Осипова, 2004; М.В. Альварес Фигероа с соавт., 2003; JI.B. Клочкова с соавт., 2004; А.Х. Найманов с соавт., 2005), другие использовали тест-системы нескольких производителей и определили обладающую наибольшей чувствительностью и специфичностью (И.П. Суханов, 1999; Е.Е. Ларионова, 2005; О.И. Скотникова, 2005), или установили необходимость одновременного использования тест-систем разных производителей (Т.А. Борисова с соавт., 2004).

Анализ представленных в доступной литературе результатов исследований показывает, что при применении ПЦР-тест-систем разных производителей получены существенные отличия и неоднозначные результаты. Поэтому, до настоящего времени единого мнения о диагностической значимости и возможности применения ПЦР-тест-систем разных производителей при диагностике туберкулёза животных нет, и этот метод не нашёл широкого применения в ветеринарной практике. Главной причиной этого является получение при диагностике туберкулёзе крупного рогатого скота значительного количества ложноположительных и ложноотрицательных результатов ПЦР-исследования

В последние годы разработан гибридизационно-флуоресцентный метод детекции продуктов ПНР, получивший название «Real-time PCR». Модифицированный метод, в отличие от классической ПЦР, имеет ряд преимуществ: количественное определение ДНК/РНК инфекционных агентов в исследуемом материале, определение двух и более видов возбудителя в ходе одной реакции, более высокая чувствительность, автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов, отсутствие стадии электрофореза, менее строгие требования к организации ПЦР-лаборатории. Отсутствие стадии электрофореза позволяет минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР и, таким образом, уменьшить число ложноположительных результатов (Т.И. Алипер, Н.И. Потапова, Е.А. Непоклонов, А.Д. Забережный, Т.В. Гребенникова, 2006; М.В. Альварес Фигероа, Е.А. Ященко А.А. Неверов, Г.А. Шипулин, 2006; J. Lachnik, В. Ackermann, A. Bohrssen, S. Maass, С. Diephaus, A. Puncken, М. Stermann, F. С. Bange, 2002; U. Reischl, C.T. Wittwer, F. Cockerill, 2002; M. J. Espy et al., 2006).

Однако, несмотря на то, что метод ПНР известен с 1983 года, т.е. более 20 лет, совершенствование и модификацию этого метода, значительное количество публикаций по изучению диагностической ценности ПЦР при туберкулёзе крупного рогатого скота - единого мнения о диагностической значимости и возможности применения ПЦР при диагностике туберкулёза крупного рогатого скота нет. За рубежом метод ПЦР-диагностики также не нашёл широкого практического применения при диагностике туберкулёза крупного рогатого скота.

Кроме того, имеются не изученные и недостаточно изученные вопросы о возможностях применения метода ПЦР при диагностике туберкулёза животных. Так, в доступной литературе мы не нашли сообщений о возможности применения полимеразной цепной реакции при диагностике туберкулёза у других видов животных (коз, кроликов, морских свинок, кур).

Поэтому, учитывая сложную эпидемическую и эпизоотическую ситуации по туберкулёзу в нашей стране, недостаточную изученность некоторых важных вопросов диагностики, длительность, трудоёмкость и сравнительно низкую эффективность классических методов прижизненной и лабораторной диагностики этой хронической инфекции, дальнейшее совершенствование и изучение возможности применения метода ПЦР при диагностике туберкулёза у крупного рогатого скота и других видов животных является своевременным и актуальным.

2. Цель исследований. Изучение диагностической ценности коммерческих тест-систем для диагностики туберкулёза животных методом ПЦР, используемых в ветеринарных лабораториях Российской Федерации

3. Основные задачи исследований:

1. Провести культуральное и ПЦР-исследование «Туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих» производства ФГУП «Курская биофабрика» - фирма БИОК с целью определения возможности выделения из туберкулина возбудителя M.bovis и ДНК M.bovis.

2. Провести сравнительное изучение диагностической ценности ПЦР-тест-систем четырёх производителей: ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, НПО «НАРВАК», ЗАО «ЛАГИС», ООО «Компания «БИОКОМ».

3. Провести сравнительное изучение ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» и детекцией методом электрофореза.

4. Изучить диагностическую ценность ПЦР при диагностике туберкулёза крупного рогатого скота, а также экспериментально заражённых разными видами микобактерий коз, морских свинок, кроликов и кур.

5. Установить возможность выделения ДНК возбудителей туберкулёза из объектов внешней среды методом ПЦР.

4. Научная новизна.

Впервые проведено культуральное и ПЦР-исследование ППД-туберкулина для млекопитающих и установлено, что ППД-туберкулин для млекопитающих не содержит возбудителя M.bovis и ДНК M.bovis.

Установлено преимущество гибридизационно-флуоресцентной детекции результатов ПЦР в режиме «реального времени» и возможность применения метода ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» для диагностики туберкулёза у разных видов животных.

Показано, что метод ПЦР недостаточно эффективен для прижизненной диагностики туберкулёза у экспериментально заражённых разными видами микобактерий коз, но обладает 100% эффективностью при исследовании послеубойного патологического материала от этих животных.

Установлено, что экспериментально заражённые туберкулёзом козы выделяют возбудителя во внешнюю среду. Метод ПЦР выявляет ДНК возбудителей туберкулёза из патматериала от лабораторных животных и объектов внешней среды.

Впервые предложено использовать метод ПЦР для лабораторного контроля качества текущей и заключительной дезинфекции помещений ферм и прифермских территорий.

5. Практическая ценность.

Результаты исследований включены в «Методические рекомендации по диагностике микобактериальных инфекций животных», утверждённых директором ГНУ ВИЭВ, академиком Россельхозакадемии М.И. Гулюкиным 22 марта 2007 г.

6. Основные положения, выносимые на защиту. Полученные результаты исследований позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

1.Результаты культурального и ПЦР-исследования «Туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих» производства ФГУП «Курская биофабрика» не содержит ДНК M.bovis.

2.Результаты сравнительного изучения диагностической ценности ПЦР-тест-систем четырёх производителей с детекцией методом электрофореза и гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

3.Результаты изучения диагностической ценности ПЦР-тест-систем разных производителей при исследовании биоматериала от крупного рогатого скота с неспецифическими реакциями и экспериментально заражённых разными видами микобактерий коз, морских свинок, кроликов и кур.

4.Результаты исследования ПЦР-тест-системами разных производителей объектов внешней среды.

5.0пределение роли и места ПЦР в общем комплексе профилактических и оздоровительных мероприятий на современном этапе борьбы с туберкулёзом животных.

7. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на:

• Международной научно-практической конференции «Эпизоотология и профилактика инфекционных болезней крупного рогатого скота» (Киев, 2006).

• Международной юбилейной научно-практической конференции, посвящённой 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России (Курск, 2006).

• Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», посвящённой 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР, доктора ветеринарных наук, профессора, академика ВАСХНИЛ Я.Р.Коваленко (Москва, 2006).

• Межлабораторном совещание сотрудников ВИЭВ, Москва, 2007;

• Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы молекулярной диагностики в ветеринарной медицине» (Феодосия, 2007).

• Материалы диссертации используются при чтении цикла лекций врачам - бактериологам ветеринарных лабораторий субъектов РФ на курсах повышения квалификации ветеринарных врачей в ФГУ Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория.

8. Публикации результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано шесть статей.

9. Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 155 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений и списка литературы. Список цитируемой литературы содержит 383 источника, из них 140 зарубежных. Работа иллюстрирована 11 таблицами, 6 фотографиями и 8 графиками.

выводы

1. «Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих» производства ФГУП «Курская биофабрика» - фирма БИОК не содержит возбудителя туберкулёза M.bovis и ДНК M.bovis.

2. Тест-системы I, II, IV, V обладают одинаково высокой чувствительностью - 10 клеток M.bovis в 0,1 мл пробы (минимально взятая концентрация), тест-система III имеет более низкую чувствительность- 1000 клеток M.bovis в 0,1 мл пробы.

3. Специфичность тест-систем III, IV, V составляет 100% к M.bovis, M.tuberculosis, M.avium, M.paratuberculosis, M.phlei, M.smegmatis, M.fortuitum, M.xenopy и M.scrofiilaceum. Специфичность тест-системы I к M.tuberculosis и M.bovis составляет 87,5%, к M.avium, M.paratuberculosis, M.phlei, M.smegmatis, M.fortuitum, M.xenopy и M.scrofiilaceum - 80%. Специфичность тест-системы II к M.bovis и M.tuberculosis составляет 100%, к M.avium, M.paratuberculosis, M.phlei, M.smegmatis, M.fortuitum, M.xenopy и M.scrofiilaceum - 93,3%.

4. При исследовании биоматериалов (носовой слизи, мочи и фекалий) от реагирующих на туберкулин коров с неспецифическими реакциями получены ложноположительные результаты тест-системами: I - в носовой слизи (13,3%) и фекалиях (6,7%); II - в носовой слизи и фекалиях (по 6,7%); IV и V - в носовой слизи (13,3%) и моче (6,7%). При исследовании проб крови тест-системами I, IV и V получены отрицательные результаты; тест-системой II получены ложноположительные результаты (13,3%).

При исследовании тест-системой VI биоматериалов и патматериала от этих животных в 100% случаев получены отрицательные результаты.

5. При послеубойном исследовании патматериала от реагировавших на туберкулин коров с неспецифическими реакциями получены отрицательные результаты тест-системами И, IV и V; тест-системой I в 33,3% случаев получены ложноположительные результаты.

6. Метод ПЦР обладает незначительной эффективностью при исследовании биологических материалов (кровь, носовая слизь, фекалии) в целях прижизненной диагностики туберкулёза экспериментально заражённых разными видами микобактерий коз.

7. Метод ПЦР обладает высокой эффективностью при исследовании патологического материала от экспериментально заражённых разными видами микобактерий коз. ПЦР выявляет в 100% случаев ДНК исходной культуры возбудителей туберкулёза M.bovis, M.tuberculosis и M.avium из патматериала убитых животных. Эффективность культурального исследования этого патматериала составляет 35,0%.

8. Гибридизационно-флуоресцентная детекция результатов ПЦР в режиме «реального времени» обладает более высокой чувствительностью и специфичностью, чем детекция методом электрофореза.

9. Результаты ПЦР-исследования патологического материала от заражённых разными видами микобактерий морских свинок, кроликов и кур коррелируют с результатами биологического исследования этих животных.

10. Экспериментально заражённые разными видами микобактерий козы выделяют возбудителя туберкулёза во внешнюю среду, что подтверждается положительными результатами ПЦР-исследования объектов внешней среды из боксов с заражёнными животными и патматериала от лабораторных животных, содержащихся в этих боксах.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. При лабораторной диагностике туберкулёза крупного рогатого скота для исследования патматериала от убитых животных следует применять биологическую пробу и метод ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

2. При проведении оздоровительных и профилактических мероприятий в неблагополучных по туберкулёзу хозяйствах для лабораторной проверки контроля качества проведённой текущей и заключительной дезинфекции помещений ферм и прифермских территорий объекты внешней среды исследовать методом ПЦР на наличие ДНК возбудителей туберкулёза.

Результаты исследований включены в «Методические рекомендации по диагностике микобактериальных инфекций животных», утверждённых директором ГНУ ВИЭВ, академиком Россельхозакадемии М.И. Гулюкиным 22 марта 2007 г.