Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Биологические свойства Staphylococcus hyicus и его роль в патологии свиней

ГНУ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО - ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ ИМЕНИ Я.Р. КОВАЛЕНКО

На правах рукописи

ВОЙТЕНКО АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА STAPHYLOCOCCUS HYICUS И ЕГО РОЛЬ В ПАТОЛОГИИ СВИНЕЙ

(16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Белгородском отделе Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, лаборатории стафилококковых инфекций ГУ Научно - исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, институте фармакологии и токсикологии и лаборатории бактериологии института гигиены и инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных Университета Юстуса Либига (г. Гиссен, Германия).

Научные руководители: доктор ветеринарных наук

Владимир Николаевич Скворцов

кандидат медицинских наук Ольга Александровна Дмитренко

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Валентин Александрович Бурлаков (МГАВМиБ им. К.И. Скрябина);

кандидат биологических наук Нина Аркадьевна Соколова (МГУПБ)

Ведущая организация - ГНУ Всероссийский НИИ патологии, фармаколог™ и

терапии

Защита диссертации состоится «27» сентября 2006 года в часов на заседании диссертационного совета Д 006.033.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при ГНУ Всероссийский научно - исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко по адресу: 109428, г. Москва, Рязанский проспект, 24/1, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко.

Автореферат разослан «23» августа 2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор ветеринарных наук, профессор —""" ~ Н.Г1. Овдиенко

I 1

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. В настоящее время повышение эффективности свиноводства сдерживается наличием инфекционных болезней, многие из которых являются ещё недостаточно изученными.

В свиноводческих хозяйствах не редко встречается заболевание с признаками экссудативного эпидермита (мокнущей экземы) - болезни, наносящей существенный экономический ущерб свиноводству из - за высокой летальности поросят, снижения прироста живой массы у переболевших животных, значительных затрат на лечебно - профилактические мероприятия. Заболевание протекает в генерализованной форме преимущественно в виде острой или подострой инфекции, чаще у поросят - сосунов или поросят - отъемышей; локализованная форма встречается реже и проявляется в основном у поросят более старшего возраста, а также у подсвинков и откормочных свиней (Sieverding Е., 1988; Гельвиг Э.-Г., 2003).

В Европе экссудативный эпидермит свиней ещё в 60-70-х г.г. прошлого века приводил к достаточно большим экономическим потерям в свиноводстве (Sieverding Е., 1988), хотя и сегодня проблема всё ещё является не решенной.

Возбудителем болезни является Staphylococcus hyicus, который впервые был выделен, описан и назван Sompolynsky D. в 1953 году как Micrococcus epidermidis, а в конце 70-х годов прошлого века стал официально признанным отдельным видом семейства стафилококков (Devriese L. et al., 1978).

Комплексное изучение биологических свойств стафилококков и продуцируемых ими биологически активных веществ лежит в основе представления о патогенезе вызываемых ими заболеваний и является базой, на которой в дальнейшем строится диагностика и разрабатываются схемы профилактики и терапии.

I! нашей стране исследования биологических свойств Staphylococcus hyicus в достаточной мере не проводились, а его роль в этиологии инфекционных заболеваний свиней полностью не изучена.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью нашей работы явилось изучение биологических свойств Staphylococcus hyicus и его роли в патологии свиней. Исходя из этого, перед нами были поставлены следующие задачи:

1. Изучить экологию, биологические свойства и чувствительность выделенных культур Staphylococcus hyicus к антимикробным препаратам.

2. Изучить факторы патогенности выделенных культур Staphylococcus hyicus.

3. Изучить патогенные свойства Staphylococcus hyicus для поросят.

4. Разработать метод идентификации Staphylococcus hylcus полимеразной цепной реакцией.

1.3. Научная новизна. Проведены исследования по выделению Staphylococcus hylcus из различных источников, в том числе с кожи здоровых и больных экссудативным эпидермитом поросят, а также от других видов животных и птиц.

Изучены биологические свойства и определена in vitro чувствительность 40 штаммов Staphylococcus hyicus к 17 антимикробным препаратам.

Изучены факторы патогепности данных бактерий.

Впервые в Российской Федерации проведено исследование выделенных изолятов S. hyicus на наличие генов, детерминирующих синтез эксфолиативных токсинов exhA, exhB, exhC и exhD полимеразной цепной реакцией. Обнаружено, что штаммы Staphylococcus hyicus, выделенные от свиней с признаками экссудативного эпидермита в свиноводческих хозяйствах Белгородской области, содержат ген exhD, детерминирующий синтез эксфолиагивного токсина D.

Разработан метод идентификации Staphylococcus hyicus по обнаружению гена sotlA виде - специфичной супероксиддисмутазы полимеразной цепной реакцией.

1.4. Практическая значимость работы. Показано носительство Staphylococcus hyicus несколькими видами сельскохозяйственных животных, а также птицей, доказана роль Staphylococcus hyicus в патологии свиней.

Разработан метод идентификации Staphylococcus hyicus по обнаружению гена sod К видо - специфичной супероксиддисмутазы полимеразной цепной реакцией.

По материалам работы разработаны «Методические рекомендации по идентификации и определению факторов натогениости Staphylococcus hyicus — возбудителя экссудативного эпидермита (мокнущей экземы) свиней», одобренные на заседании секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 30 марта 2006 г. протокол № 1).

1.5. Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты изучения экологии и биологических свойств S. hyicus;

- результаты изучения факторов патогепности S. hyicus;

- результаты изучения патогепности S. hyicus для лабораторных животных и поросят;

- метод идентификации S. hyicus по обнаружению гена sodA видо-специфичной супероксиддисмутазы полимеразной цепной реакцией.

1.6. Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на:

- IX и X Международной научно - производственной конференции «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения» (г. Белгород, 2005 г., 2006 г.);

- Международной научно - практической конференции «Повышение эффективности лечения и профилактики акушерско - гинекологических заболеваний и биотехники размножения животных» (г. Киров, 2005 г.);

- Международной научно - практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных» (г. Москва, 2006);

- XVill Международной межвузовской научно - практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (г. Санкт-Петербург, 2006 г.)

1.7. Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

1.8. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения и список литературы. Работа иллюстрирована одним графиком, одной де нтрограммой, четырьмя рисунками, 10 таблицами и восьми фотографиями. Список использованной литературы включает 175 иностранных и 18 отечественных источников.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в 2003 - 2006 г.г. в Белгородском отделе Всероссийского научно - исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, лаборатории стафилококковых инфекций ГУ Научно исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМП, институте фармакологии и токсикологии и лаборатории бактериологии института гигиены и инфекционных заболеваний Университета Юстуса Либига (г. Гиссен, Германия), а также в птицеводческих и животноводческих хозяйствах Белгородской области. Li лабораторных опытах использовано 18 поросят, 30 белых мышей и 5 щенков.

Исследования методом полимеразной цепной реакции выполнены совместно с O.A. Дмитренко (ГУ ПИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН), К. Лэммлером, Й. Альбером и Т. Канбар (институт фармакологии и

токсикологии Университета Юстуса Либига, г. Гиссен, Германия), за что автор выражает им глубокую признательность.

Для выделения S. hyicus из различных образцов патологического материала в своей работе мы использовали питательные среды, применяемые в повседневной лабораторной практике для выделения микробов рода Staphylococcus'. ЭСА (элективный солевой агар), ЖСА (желточно - солевой агар), МПА (мясо -пептонный агар), МПГ> (мясо - пептонный бульон), кровяной агар.

После изучения морфологических свойств полученных чистых культур, отнесенных к бактериям роди Staphylococcus, проводили определение их видовой принадлежности с помощью набора «STAPHYtest 16» («PLIVA - Lachema a.s.», Brno, Чехия), представляющего собой микротитровапьные стриппированные пластинки, содержащие 16 биохимических тестов: уреаза, аргининдегидролаза, орнитин, р - гапактозидаза, ß - глюкоропидаза, нитраты, фосфатаза, пирролидонил -амилаза, эскулин, сахароза, трегалоза, маннит, ксилоза, мальтоза, манноза и тест глюкоза - новобиоцин.

Определение лецитиназной (лецитопителлазной) активности у исследуемых культур стафилококков проводили на желточно - солевом агаре (ЖСА) (A.M. Смирнова, 1977).

Определение фибринолитической активности (наличия фермента стафилокиназы) у исследуемых культур S. hyicus проводили на мясо - пегггонпом агаре с добавлением стерильной человеческой плазмы.

Определение продукции ацетоина (реакция Фогес - Нроскауера) проводили с помощью VP - теста («PLIVA - Lachema a. s.», Brno, Чехия), но описанной в инструкции методике. Использование теста позволяет значительно быстрее, по сравнению с другими традиционными методами, определить продукцию ацетоина микроорганизмами.

Определение наличия цитохромоксидазы (цитохрома С) у изучаемых бактерий проводили с помощью OXI - теста («PLIVA - Lachema a. s.», Brno, Чехия), представляющего собой полоски с зоной индикации, содержащей N, N-диметил-1,4-фенилепдиамин и а - нафтол, в присутствии цитохромоксидазы вступающие друг с другом в цветную реакцию с образованием индофенолового синего.

Пигментообразование у исследуемых культур стафилококков определяли на молочно - солевом агаре (Смирнова A.M., 1977).

Определение ДИК-азной активности (наличие фермента дезокси-рибонуклеазы) S. hyicus осуществляли пут£м посева чистой исследуемой культуры

стафилококка на ДИК - агар, для приготовления которого использовали готовую сухую питательную среду «DNAse test agar».

Определение гиалуронидазной активности (наличия фермента гиалуропидазы) у стафилококков осуществляли по методике Winkle (1979) путём посева чистой исследуемой культуры стафилококка на BHI - агар.

Плазмокоагулирующую активность S. hyicus проверяли с применением нитратной плазмы человека и нескольких видов животных - кролика, свиньи, лошади, барана и крупного рогатого скота, а также с куриной нитратной плазмой в разведении 1:5.

Определение хлопьеобразующего фактора производили с нитратной кроличьей плазмой, используемой нами при постановке реакции нлазмокоагуляции, в разведении 1:5.

Определение гемолитической активности исследуемых культур S. hyicus проводили по методике Skalka В. et al. (1979) на кровяном агаре с добавлением 5 % стерильной нитратной крови барана, а также 5 % стерильной нитратной крови человека.

Способность роста S. hyicus в анаэробных условиях проверяли на М11А. Чашки с исследуемой культурой помещали в цилиндрическую пластиковую колбу диаметром 12 см, после чего туда вкладывали пакет с увлажненным 35 мл дистиллированной воды реагентом «Anaerocult А» («Merck», Darmstadt, Германия), плотно закрывали колбу крышкой и помещали в термостат на 72 часа, после чего производили учет роста бактерий.

Чувствительность исследуемых культур S. hyicus к 17 антимикробным препаратам определяли дискодиффузионным методом, пользуясь методическими указаниями МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».

Постановку полимеразной ценной реакции для определения наличия у исследуемых культур S. hyicus генов, детерминирующих синтез эксфолиативных токсинов exhA, exhB, exhC и exhD проводили по методике P. Ahrens и L.O. Andresen (2004).

В качестве контролей были использованы референтные штаммы S. hyicus, содержащие гены, детерминирующие синтез эксфолиативных токсинов различных типов. Данные культуры были предоставлены нам коллегами из Дании и Германии.

Таблица 1

Олигонуклеогиды (праймеры), используемые для определения наличия генов, детерминирующих синтез эксфолиативных токсинов ехкА, ехЛВ, ехкС и ехкП у 51. кугсия полимеразной цепной реакцией

Целевой ген Название праймера 5' - 3' нуклеотвдная последовательность Автор(ы)

exhA MU4A МША G CT ACG GGT TTT GTA GTT TCA С GTA ACC TAC AAC TCT TAG AAC С P. Alli ens и L.O.Andresen (2002)

exhB F2EB MU3B AAC ACG CCA ATA GAG AAT GTA СТА С TAT CAA АТС TTA TAC CAG ITA GAA TAT CTCC Р. Ahrens и L.O.Andresen (2002)

exhC MU3C MU4C GAA TAA ATA TTA TGG AGT CTC TCC TGA TC CCA TAG TAT TTC AAT CCA AAA TCA GTA С Р. Ahrens и L.O.Andresen (2002)

exhD F2D MU3D GAA CAA ATA TAA TGG AAG AAA CCC AC GAT TTC CCT ACG TGA ATA CCT АСА ATA С Р. Ahrens и L.O.Andresen (2002)

Температурный режим ПЦР для обнаружения эксфолиативных токсинов у S. hyicus:

94 °С-3 мин., 1 цикл;

(94 °С - 1 мин.; 57 °С - 1 мин.; 72 "С-1 мин.) 31 цикл;

72 °С - 7 мин., 1 цикл

Ныделение ДНК проводили по методике, описанной Дмитренко O.A. с соавт. (2004).

Одной из задач наших исследований была разработка метода идентификации S. hyicits полимеразной цепной реакцией. В принцип идентификации мы заложили обнаружение гена sod/K видоспецифичной супероксиддисмутазы - фермента -металлоэнзима, который катализирует супероксид с образованием кислорода и перекиси водорода. Подобные ферменты обнаружены у большинства аэробных и анаэробных микроорганизмов и играют ключевую роль в защите клетки от окислительного стресса. Эти энзимы обычно классифицируют на основе ионов металла, выступающего в роли ко-фактора, и имеют у каждого вида микроорганизмов свою нуклеотидную последовательность.

При изучении возможности применения ПЦР для идентификации S. hyicus по обнаружению гена socIA видо - специфичной супероксиддисмутазы, а также при постановке других реакций и определений, в качестве позитивного контроля мы использовали референтные штаммы S. hyicus А2869С/70 и S3588/70, предоставленные нам Ж. Роде (Центр инфекционной медицины Института

микробиологии Ветеринарного института г. Ганновер (Германия); референтные штаммы S. hyicits 1289-D и 842А-88, полученные от JI.O. Андресена (Датский институт кормовых и ветеринарных исследовании). Для контроля наших результатов мы также использовали 19 референтных культур коагулазоположительных и коагулазоотрицателышх стафилококков, не относящихся к виду S. hyicus, которые были получены нами из коллекции бактериальных культур Института фармакологии и токсикологии Университета Юстуса Либига (г. Гиссеп, Германия) и из Департамента патологии, бактериологии и болезней птиц, факультета ветеринарной медицины Университета Гейта (г. Мерельбек, Бельгия) от Б. де Граф и Л.А. Девриз. Автор выражает искреннюю признательность коллегам, предоставившим нам контрольные штаммы.

При разработке нуклеотидной последовательности специфичных гену sodА S. hyicus олигонуклеотидов (праймеров), а также дентрограммы, были использованы компьютерные программы ClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw'). Oligo 4.0 и Boxshade (www.ch.embnet.orgX

Для контроля наличия ДНК в реакционной смеси ПЦР применялись олигонуклеотиды (праймсры), специфичные участку 16S - 23S рибосомальной ДНК, универсальные для всех видов бактерий рода Staphylococcus.

Для выяснения этиологического значения в возникновении экссудагивного эпидермита у поросят в условиях Белгородского отдела ВИЭВ был проведен опыт по заражению поросят штаммами S. hyicus, содержащими гены, детерминирующие синтез эксфолиативных токсинов различных типов. В опыт было взято 18 поросят 6 - недельного возраста.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Выделение S. hyicus из различных источников

Бактериологическому исследованию на предмет выделения S. hyicus подвергли 371 пробу материала от различных животных, как с патологиями, так и без них, в том числе 328 проб от сельскохозяйственных животных (свиней, поросят и коров), 30 проб от птиц (30 куриц в возрасте 360 - 420 дней), 13 проб от собак.

На наличие Staphylococcus hyicus исследовали: соскобы с кожи поросят с признаками экссудативного эпидермита (78 проб) и здоровых поросят (56 проб), смывы с конъюнктивы глаз поросят (43 пробы), мазки из влагалищной полости свиноматок без признаков патологии (33 пробы), смывы с сосков вымени (33 пробы) от больных маститом коров, мазки слизистой носовой полости поросят (24

пробы), пробы из внутренних органов павших и вынужденно убитых поросят с признаками экссудативного энидермита (11 проб) и пневмонии (6 проб), пробы молока (9 проб) от больных маститом коров, а также пробы гноя (9 проб) от больных эндометритом коров.

Кроме того, были исследованы смывы конъюнктивы и мазки ротовой полости (30 проб) от куриц без патологии, гной раневого содержимого от собак (5 проб) и коров (11 проб), соскобы с кожи собак (8 проб) и коров (15 проб) без патологии.

В таблице 2 приведена характеристика исследованных нами штаммов по виду животных, от которых они выделены, источнику выделения и клиническим проявлениям, если таковыми данными мы обладали.

Как видно из таблицы, большинство исследованных нами штаммов (36, или 78 %) были выделены от поросят и свиней, из них от поросят с признаками экссудативного эпидермита - 18 штаммов (42 %). От коров с признаками субклинического и клинического мастита и эндометрита выделено 4 (8,6 %) культуры S. hyicus, от птиц без патологии - 1 (2,2 %), от собак без патологии - 1 штамм (2,2 %).

2.2.2. Биологические свойства S. hyicus 2.2.2.1. Морфологические свойства,?, hvicus

Изучение биолог ических свойств выделенных культур S. hyicus показало то, что они обладают многими свойствами, типичными для других представителей рода Staphylococcus,

В данной работе исследованы биологические свойства 43 культур S. hyicus, 26 из которых были выделены нами в различных животноводческих /25 штаммов/ и птицеводческом /1 штамм/ хозяйствах Белгородской области, а 17 получены из Лаборатории бактериологии Института гигиены и инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных Университета Юстуса Либига (г. Гиссен, Германия). Из 26 культур 18 (69 %) были изолированы от поросят, больных экссудативным эпидермитом, от поросят с признаками пневмонии - 2 культуры (7,7 %), от поросят и свиноматок без патологии - 3 культуры (11,5 %), от коров, больных клиническим и субклиническим маститом и эндометритом - 3 культуры (11,5 %) случаев, от птиц без патологии - 1 культура (3,8 %).

Кроме того, стоит отметить, что при отборе проб патматериала с кожи поросят, больных экссудативным эпидермитом, выделяемость данного стафилококка составляла 100%.

Патогенетическое значение штаммов, полученных нами для исследования из Германии, к сожалению, было не известно.

Таблица 2

Происхождение 43 штаммов $Шрку1ососс№ Ъуки$

Страна Вид Источник Клинические признаки Кол-во Шифр

животного выделения штаммов штамма (ов)

К-1.Р-1.Р-3, Р-4, Р-7,

кожа экссудативный эпидермит 13 Р-8, Р-9, Р-10, Р-11, Р-12, Р-13, Р-14, Б-1

кожа отсутствовали 1 01М

конъюнк-

Р тива экссудативный эпидермипг 1 Р-5

О поросята легкие пневмония 1 рд-2

С пневмония + экссудативный

С легкие эпидермит 1 р-б

и селезенка экссудативный эпидермит 2 К-5,Р-2

я почки экссудативный эпидермит 1 К-10

свиноматка влагалище отсутствов&ти 2 К-2;К-3

курица гортань отсутствовали 1 ЯВ-1

корова матка эндометрит 2 273/05; 278/05

корова молоко мастит 1 272/05

селезенка 1 2300/79

поросята почки 1 2706/78

г 6247/01, 6343/01, 6344/01, 6407/01,6393/01,6416/01

Е кожа 6

Р свинья почки 2 Р 5472,709/02

м легкие 1 6418/01

А кал не известны 1 5285/01

Н свиноматка влагачише 2 Р 8546/01, Р 8587/01

И корова вымя 2 5019/05,4811/05

Я собака спинномозговая жидкость 1 2941/78

Культуры S. hyieus, изолированные от различных животных и птиц, по культурально - морфологическим, биохимическим и патогенным свойствам соответствовали своему роду.

Они хорошо росли как на элективных (ЭСА, ЖСА), так и на простых питательных средах при температуре +37 "С в течение 18-24 часов. Па твердых питательных средах (МПА, ЭСА, ЖСА, кровяном агаре) росли в виде округлых, с ровными краями, слабовыпуклых, блестящих колоний, достигающих через 48 - 74 ч культивирования диаметра от 3 до 5 мм. Колонии в первые сутки роста были более крупными на обычных питательных средах - около 2 мм, и более мелкими на средах с содержанием NaCl - около 1 - 1,5 мм. Нередко обсемененность бактериями была очень высокой, то есть вся поверхность чашки со средой полностью покрывалась характерными колониями, особенно это касается посевов с кожи поросят, пораженных экссудативным эпидермитом. При культивировании S. hyieus па обычных жидких питательных средах при температуре + 37 °С уже через 4 часа в пробирках происходило равномерное помутнение среды, а через 12 -14 часов - выпадение небольшого, легко встряхиваемого белого осадка.

В основном они росли в виде чистых культур, особенно при первичном посеве исследуемого материала па элективные питательные среды (ЖСА, ЭСА), которые оказались более благоприятными, по сравнению с обычными (кровяной агар, МПА) питательными средами. Посевы на последних иногда сопровождались загрязнением и трудностью отвивки чистых культур стафилококков, иногда требовалась их дополнительная очистка на ЭСА или ЖСА.

По морфологическим свойствам в мазках, окрашенных по Грамму, S. hyieus представлял собой кокки (диаметром 0,6 - 1,2 мкм), располагавшиеся беспорядочными скоплениями, по форме чаще напоминающими гроздья винограда, реже попарно или тетрадами, неподвижные, спор и капсул не образовывали, хорошо красились анилиновыми красителями, грамположительные. Па морфологию S. hyieus количество пассажей на средах не влияло.

2.2.2.2. Культурально-биохимические свойства S. hyieus

В культуралыюй характеристике штаммов S. hyieus, выделенных из различных источников, особых отличий не выявлено. Стоит лишь отметить, что на агаре с содержанием 15 % NaCl рост либо отсутствовал вовсе, либо был еле заметным. Удовлетворительным можно было назвать рост только одного штамма (RB-1).

Культуры S. hyieus не были термофильными, то есть не росли при температуре +45 °С, слабо и медленно развивались при температуре +15 °С.

Все выделенные культуры S. hyieus обладали каталазной активностью.

При изучении биохимических свойств нами было установлено, что все культуры S. hyicus восстанавливали шпраты, интенсивно росли в аэробных условиях, в том числе на агаре с 7,5% NaCl, не образовывали пигмент, показали отрицательные реакции на продукцию ацетоина (реакция Фогес - Проскауера) и цитохромоксидазы (цитохрома С), положительные результаты по тесту «фосфатаза», ферментировали маннозу, трегалозу, сахарозу и не ферментировали маннит (кроме штамма 273/05), мальтозу и ксилозу. Следует отметить различные показатели по гидролизу мочевины (47 % культур дали положительную реакцию), а также то, что чаегь штаммов (51 %) дали положительный результат при определении Р - глюкоронидазы.

Пигментом исследуемые культуры не обладали.

2.2.2.3. Чувствительность S, hvicus к антимикробным препаратам.

Нами проведены исследования по определению дискодиффузиоиным методом чувствительности 40 штаммов S. hyicus к 17 антимикробным препаратам (таблица 3).

Результаты исследований показали, что все культуры S. hyicus, независимо от источника изоляции, были чувствительны к гентамицину, 97 % культур проявили чувствительность к препаратам пенициллинового ряда (пенициллин, ампициллин и оксациллин), 90 % - к рифампицину. Достаточно высокую эффективность показали также неомицин и фуразолидон (77,5 и 74 % штаммов соответственно оказались чувствительными к данным препаратам).

Менее чувствительными исследуемые культуры были к фторхинолонам (от 57 до 62 % чувствительных культур), клиндамицину, линкомицину, леном и пеги пу (от 47 до 60 % чувствительных культур), препаратам тетрациклинового ряда (37 % чувствительных культур). К эритромицину проявили чувствительность лишь 13 % штаммов.

2.2.2.4. Изучение факторов патогенности S. hyicus

При исследовании гемолитической активности выяснилось, что как при первичном посеве, так и при многократном пассировании исследованных культур на шаре с добавлением 5% стерильной дефибринированной или нитратной крови барана, самостоятельный гемолиз ни у одной из культур не проявлялся. Напротив, при исследовании гемолитической активности изучаемых бактерий по методике CAMP - теста (тест на синергетический гемолиз), описанном В. Skalka et al. (1979),

Таблица 3

Чувствительность $1ар11)>1осассих Ьучсш к антимикробным препаратам

Антимикробный препарат Чувствительных штаммов Промежуточно-чувствительных штаммов Резистентных штаммов

Кол-во % Кол-во % Кол-во %

Ампициллин 39 97 0 0 1 3

11енициллин 39 97 0 0 1 3

Оксациллин 39 97 0 0 1 3

Неомицин 31 77,5 5 12,5 4 10

Гентамицин 40 100 0 0 0 0

Доксициклин 15 37 5 13 20 50

Тетрациклин 15 37 0 0 26 63

Ципрофлоксацин 23 57 1 3 16 40

Офлоксацип 25 63 0 0 15 37

Пефлоксацин 25 62,5 1 2,5 14 35

Норфлоксацин 23 57 0 0 14 43

Линкомнцнн 19 47,5 2 5 19 47,5

Эритромицин 5 13 19 48 16 39

Клиндамицин 20 50 1 2,5 19 47,5

Левомицетин 24 60 0 0 16 40

Фуразолидон 30 74 3 8 7 18

Рифампицин 36 90 0 0 4 10

нами было выявлено наличие 5 - гемолизинов у большинства (82,5 %) исследованных культур.

Самостоятельный гемолиз большинство исследованных культур проявляли на агаре с добавлением 5 % крольчих и человеческих эритроцитов.

Рис. 1. СЛМР-like тест на кровяном агаре с бараньими эритроцитами, применяемый для определения гемолитической активности бактерий рода Staphylococcus: в центре - р-гемолиз S. intermedins, снизу - а-гемолиз S. aureus, наверху слева - а, р - гемолиз S. aureus, наверху справа — 8 - гемолиз S. hyicus.

В опыте по изучению плазмокоагулирующей активности находилось 26 штаммов S. hyicus. Выяснилось, что всего четыре штамма показали плазмокоагулирующую активность в отношении нитратной кроличьей плазмы в разведении 1:5.

% 70Г1 ш

во-'

60-'

40'

зо-'-

-'^¡иИ:

о У r^—d—у

вид плазмы

График 1. Плазмокоагулирующая а1стивность Staphylococcus hyicus в отношении некоторых видов нитратных плазм (в %).

Нитратную человеческую плазму коагулировало 18 культур S. hyicus, количество положительных реакций было 18 (разведение 1:5), а в отношении цитратной свиной плазмы - 12 положительных результатов.

В отношении цитратной бараньей и коровьей плазмы положительных результатов получено не было.

□ Кроличья плазма

■ коровья ПЛКШ1

■ баранья плазма

■ свиная плазма

■ человеческая плазма_

Кроме того, все исследованные культуры S. hyicus продуцировали ферменты гиалуронидазу (рис. 2) и ДНК - азу.

Часть исследованных культур (65 %) обладало фибринолитической активностью. Ни один из исследованных штаммов не дал положительных результатов при определении наличия фактора хлопьеобразования (Clumping -фактора) и фермента лецитиназы.

Рис. 2. Положительная реакция при определении гиалуронидазной активности S. hyicus на BHI - агаре (а - зона капсулированного роста S. equi subsp. equi; b — зона некапсулированного роста S. equi subsp. equi вследствие действия гиалуронидазы S. hyicus; с - зона роста S. hyicus).

В результате исследований наличия генов, детерминирующих синтез зксфолиативных токсинов различных типов у 40 исследуемых штаммов S. hyicus, мы получили следующие данные: у 21 штамма (52,5 %) выявлено наличие гена exhD и у 1 штамма (2,5 %) - гена exhC. Наличие генов exhA и ел/гВ у исследованных нами штаммов обнаружено не было.

Таким образом, вышеизложенные результаты по определению факторов патогашоети изученных культур S. hyicus свидетельствуют о том, что большинство штаммов показали плазмокоагулирующую активность в отношении нитратной свиной и человеческой плазмы, все культуры обладают ферментами ДНК-азой и гиалуроиидазой и 65 % - фибринолитической активностью.

Самостоятельный гемолиз на агаре с бараньими эритроцитами изученные бактерии не проявляют. Напротив, при изучении гемолитической активности по методике CAMP - теста (теста на синергетический гемолиз) у большинства штаммов обнаружено наличие 5 - гемолизинов.

НИ

1000

100

200 300

588

и

1 234 5 6 7 8М9 10 11

Рис. 3. Типичные ампликоны гена exliG (величина генного продукта 588 нуклеотидных пар), детерминирующего синтез эксфолиативного токсина D у S. hyicus: 1 - позитивный контроль, штамм S. hyicus А2869С/70; 2 - штамм S. hyicus К-1; 3 - штамм S. hyicus К-10; 4 - штамм S. hyicus Р-1; 5 - штамм S. hyicus Р-2; б - штамм S. hyicus Р-3; 7 - штамм S. hyicus Р-4; 8 - штамм S. hyicus Р-5; 9 - штамм S. hyicus Р-11; 10 - штамм S. hyicus Р-13; 11 - негативный контроль: S. aureus-, М - маркер молекулярной массы ДНК (Serva, Heidelberg, Германия).

2.2.2.5. Изучение патогенных свойств Staphylococcus hvicus для поросят и лабораторных животных

Латогенность S. hyicus обусловлена, в первую очередь, их эксфолиативными токсинами.

Экспериментальное заражение поросят. Для исследования взяли 18 поросят в возрасте шести недель, разбили на шесть групп (четыре опытных и две контрольных), по три поросенка в каждой.

Поросят заражали суточными культурами S. hvicus: первую группу -референтным штаммом DSM 20459 (АТСС 11249, NCTC 10350), с наличием гена exhA; вторую группу - референтным штаммом 1289D - 88, с наличием гена етЛВ; третью группу - штаммом 6407/01, с наличием гена exhC; четвертую группу -штаммом К - 10, с наличием гена exhD.

Таблица 4

Основные факторы патогенпостп 40 исследованных штаммов $1арку1ососсия

1 Штамм [ ДНКаза 1 я § ш «8-в ч 8 ть а а: о & й Фактор хлорье-образования 5 - гемолиз ехкА 1 я) ехкС ехЬО

1 К-1 + + + - + - - - +

2 К-2 + + + - - - - - -

3 К-3 + + + - + - - - -

4 К-5 + + + - - - - - +

5 К-10 + + + - + - - - +

6 Р-1 + - + - - - - - +

7 РО-2 + - + - + - - - +

8 СК-1 + - + - + - - - -

9 Р-1 + - + - + - - - +

10 Р-2 + + + - + - - - +

И Р-3 ( + + - + - - - +

12 Р-4 + - + - + - - - +

13 Р-5 + + + - + - - - +

14 Р-6 + - + - - - - +

15 Р-7 + - + - + - - - +

16 Р-8 + - + - + - - - +

17 Р-9 + ■+ - - - - - +

18 Р-10 + - + - - - - - 4

19 Р-11 + - + - + - - - +

20 Р-12 + - 4 - + - - - +

21 Р-13 + - + - + - - - +

22 Р-14 + - + - + - - - +

23 ШЗ-1 + + + - + - . - - -

24 2300/79 + + + - + - - - +

25 2941/78 + + + - + - - - -

26 2706/78 + + + - - - - - -

27 5019/05 1 + + - + - - - -

28 4811/05 + + + - + - - - -

29 5285/05 + + + - + - - - -

30 Р5472 + + + - + - - - -

31 709/02 + + + - + - - - -

32 6247/01 + + + - + - - - -

33 Р8546/01 + + + - + - - - -

34 Р8587/01 + + + - + - - - -

35 6344/01 + + + - + - - - -

36 6343/01 + + + - + - - -

37 6407/01 + + + - + - ■ - + -

38 6393/01 + + + - + - - - -

39 6416/01 + + + - + - - - -

40 6418/01 + + + - . + - - - -

Все указанные культуры микроорганизмов были изолированы в разное время от поросят, больных экссудативнмм эпидермитом. За зараженными поросятами наблюдали в течение двух недель.

Подопытных поросят заражали подкожно в области уха в дозе 10 млрд. микробных тел в объеме 1,0 мл суточной культурой, выращенной па плотной питательной среде (МПА) при обычных условиях культивирования (+37 °С) с доступом воздуха и суспендированной в стерильном физиологическом растворе.

Первую контрольную группу поросят (группа № 5) заражали штаммом 5. Ау/епл' К - 2, не обладающим генами, детерминирующими синтез каких - либо эксфолиативных токсинов.

Вторую контрольную группу (группа № 6) не заражали.

Клинические признаки заболевания начали проявляться у всех зараженных поросят одновременно, независимо от типа эксфолиативного токсина. Первые симптомы появились на второй день. У поросят наблюдалась сильная гиперемия в месте введения суспензии.

На третий день после введения инокулята началась эксфолиация эпителия, у поросенка, зараженного штаммом с наличием гена едгЛВ на внутренней поверхности левого бедра начали проявляться поражения в виде пустул, заполненных экссудатом.

На 5 день появились обширные некротические поражения кожного покрова у всех зараженных животных практически на всех участках тела, но больше всего в области живота и головы.

Животные контрольных групп, которым не вводилась суспензия стафилококка и вводилась суспензия штамма, не обладающего эксфолиативными токсинами, не заболели.

Не удалось выявить патогенное влияние штаммов йугскх, обладающих генами, детерминирующими синтез эксфолиативных токсинов, для мышей и щенков, у которых не наблюдалось никаких признаков экспериметапыюго стафилококкоза. Это, по нашему мнению, говорит о видоспецифичности токсинов ех//А, е.хЛВ, ехЛС и ехкО для свиней.

2.2.3. Результаты полимеразной цепной реакции при разработке метода идентификации S. hvictis по обнаружению гена sodA видо - ешмифичной супероксиддисмутазы

Изучение возможности видовой диагностики S. hyicus по обнаружению гена sod А. мы провели на 43 штаммах S. hyicus и 19 референтных штаммах других видов стафилококков.

В качестве контроля наличия в реакционной смеси ДНК стафилококков использовали специфичные для всех видов бактерий рода Staphylococcus праймеры участка 16S - 23 S рДШС.

Определение видовон специфичности гена sod A S. hyicus

IIII IIII

2176

Ml 2 3 4 5 6 M

Рис. 4. Типичные ампликоны sod A - гена (1,2) и участка 16S - 23 S рибосомальной ДНК (4,5) S. hyicus. Негативный контроль: S. aureus (3,6). M - маркер молекулярной массы ДНК.

Специфические ампликоны были получены только с ДНК S. hyicus (размер ампликона - 205 п.н.) (фотография 1, дорожки 1, 2).

. 5.Лоттй-АЛ43911

1 5.аг1еНао-М343894 ■ 8,со(т/«и343902

■С

£

$.даЯпап1т-АЯ43909 5./с|Ьм»А^43915 £1исс;тиз-АУ845222 Э.аарпэрМ'сиз-АЛ343925

5.аилш/аш-АЛ343938

Б.Лаето/^хп/з-А^ЗЭбО

& Л|дЛтвл5й7из43951

5.аигвш-г49245

Б.ра$1еигьЫ343920

3.и'ателА$43958

5.сар/(/з-Аи343В96

£саргае-АиЭ43943

5.врк*егт/сАз-АЛ343940

5.засс/1аго^ки5-^343923

ав/пш/апа^и343930

5.сэтозиз-АУ795886

&асНЫША1343955 5.Ъ1гае-Аи343918 &«1в0)М»1«Ш439О5 & |Ь1егтес/ш5-АЛ343914 £/№>11343908

5.ти5саэ-Аи343919 5.«вп|1к7и34Э916 В.риЬвгегь АЛ43922 5.5С/игМи343929

Дентрограмма 1. Анализ близости пуклеотндных последовательностей генов х1к!А видо-специфичной супероксиддисмутазы различных видов стафилококков (анализ проводился с помочило компьютерной программы Ск^аЫ').

При изучении 45 культур 5. hyicus специфические для S. hyicus ампликоны sodA - гена размером 205 п.п. получены в 45 случаях, то есть исследуемые культуры 5. hyicus были правильно идентифицированы в 100 % случаев.

При исследовании остальных 19 культур стафилококков 19 различных видов, ампиликонов размером 205 н.п. (S. hyicus) не были обнаружены ни в одном случае.

Специфические для всех бактерий рода Staphylococcus ампликоны размером 250 н.п. (16S - 23S рДПК) получены в 62 случаях, что говорит о том, что во всех случаях в реакционной смсси содержалась ДНК стафилококков.

Полученные результаты исследований позволяют полагать, что по гену sod А видо - специфичной супероксиддисмутазы, S. hyicus можно дифференцировать от других видов стафилококков (дснтрограмма 1).

Все вышеуказанное говорит о том, что данную методику целесообразно применять при необходимости дифференциации S, hyicus от других видов стафилококков, как современный экспресс - метод лабораторной диагностики, особенно в случаях, когда обычные лабораторные методики не дают 100 % точного результата.

3. ВЫВОДЫ

1. При исследовании 371 пробы материала из различных источников S. hyicus был выделен в 26 случаях (7 %). Из 26 культур 18 (69 %) были изолированы от поросят, больных экссудативным эпидермитом, от поросят с признаками пневмонии - 2 культуры (7,7 %), от поросят и свиноматок без патологии - 3 культуры (11,5 %), от коров, больных клиническим и субклиническим маститом и эндометритом - 3 культуры (11,5 % случаев), от птиц без патологии - 1 культура (3,8 %). При этом, от поросят, больных экссудативным эпидермитом, от свиноматок и птиц без патологии, а также коров, больных клиническим маститом и эндометритом, S, hyicus выделен и идентифицирован в нашей стране впервые.

2. Изоляцию S. hyicus следует проводить в обычном термостате при температуре +37 °С как на элективных для рода Staphylococcus питательных средах с содержанием 7,5 % хлорида натрия (ЭСА, ЖСА), так и на простых питательных средах (МПА, кровяной ш ар).

3. При исследовании методом ПЦР культур S. hyicus, выделенных от поросят, больных экссудативным эпидермитом, у 100 % штаммов обнаружено наличие гена exhV, детерминирующего синтез эксфолиативного токсина D, что и обуславливает появление кожных поражении у поросят при экссудативпом эпидермите.

4. Экспериментальное заражение поросят штаммами & кучси.ч, обладающих генами, детерминирующими синтез эксфолиативных токсинов различных типов, доказывает этиологическое значение токсин-продуцирующих штаммов Ьучси.ч в возникновении экссудативного эпидермита у поросят. Напротив, штаммы 5. ¡¡у¡сиг,, не обладающие генами, детерминирующими синтез эксфолиатииных токсинов, инфекцию у поросят не вызывают.

5. Большинство исследованных культур £ Ьучси.ч показали плазмо-коагулирующую активность в отношении нитратной свиной и человеческой плазмы в разведении 1:5 и, напротив, не показали таковой активности а отношении нитратной плазмы барана и коровы. В отношении нитратной кроличьей плазмы положительные результаты были получены в 15,3 % случаев.

6. При определении хлопьеобразующего фактора с применением нитратной кроличьей плазмы положительных результатов получено не было. Все штаммы 5. 11)пси.ч продуцируют ферменты гиалуронндазу и ДНК - азу, 65 % штаммов обладают фибринолитической активностью.

7. Гемолитическая активность /¡ута проявляется при постановке САМР-теста (теста на синергетический гемолиз) па агаре с добавлением дефибринированной или нитратной крови барана. Самостоятельный гемолиз на указанном агаре не проявляется. Это говорит о наличии у 51. Ьуч'сиз 5 - гемолизинов и отсутствии и - и |3 - гемолизинов.

8. Большинство штаммов Я. кучсч.ч коагулируют человеческую нитратную плазму, гемолизируют человеческие эритроциты и проявляют фибринолитическую активность на агаре с добавлением человеческой плазмы, что говорит о потенциальной опасности данного микроба для человека.

9. Культуры 5. Ау1сги проявляли высокую чувствительность к препаратам пенициллипового ряда (ампициллин, пенициллин, оксациллин), к неомицину, фуразолидону и гептамицину. Указанные препараты могут быть эффективными при лечении заболеваний, вызываемых Л'. Иучси.ч.

10. Апробированная нами методика определения наличия у 5. Ьуки.ч генов, детерминирующих синтез эксфолиативных токсинов ехкА, ехкВ, ехИС, сх!/Г) методом ПЦР может быть рекомендована при диагностике экссудативного эпидермита свиней.

11. Разработанная и апробированная нами идентификация 51. ¡¡угсич по обнаружению гена хос1А видо - специфичной супероксиддисмутазы может быть рекомендована для практического использования при идентификации 5. Ьучси.ч полимеразной цепной реакцией.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

По результатам исследований разработаны «Методические рекомендации по идентификации и определению факторов патогенпости Staphylococcus hyicus - возбудителя экссудативного эпидермита (мокнущей экземы) свиней», рассмотренные и одобренные на заседании секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины PACXII 30 марта 2006 г. протокол № 1.

5. СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Войтенко А.В. Биологические свойства Staphylococcus hyicus, выделенных от свиней / А.В. Войтенко // Материалы Международной научно-практической конференции «Повышение эффективности лечения и профилактики акушерско-гинекологических заболеваний и биотехники размножения животных», 8-9 июля, 2005 г. Киров. - С. 37.

2. Войтенко А.В. Экссудативный эпидермит свиней / А.В. Войгепко, В.И. Скворцов // Материалы IX Международной научно-производственной конференции «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения». - 12-14 мая, 2005 г., Белгород. - С. 86.

3. Войтенко А.В. Изучение пагогенности Staphylococcus hyicus для поросят / В.Н. Скворцов, А.В. Войтенко, А.А. Балбуцкая // Материалы X Международной научно-производственной конференции «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения». Том II. — 15-19 мая, 2006 г., Белгород. - С. 52.

4. Войтенко А.В. Биохимические свойства коагулазоположительных стафилококков, выделенных от больных маститом и эндометритом коров / А.В. Войтенко, В.Н. Скворцов, Н. Образцова // Материалы X Международной научно-производственной конференции «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения». - 15-19 мая 2006 г., Белгород. - С. 53.

5. Войтенко А.В. Плазмокоагулирующая активность Staphylococcus hyicus -возбудителя экссудативно] о эпидермита свиней / А.В. Войтенко, В.Н. Скворцов, Е. Щепкина // Материалы X Международной научно-производственной конференции «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения». - 15-19 мая 2006 г., Белгород. - С. 6.

6. Войтенко А.В. Чувствительность Staphylococcus hyicus к антимикробным препаратам / В.Н. Скворцов, А.В. Войтенко, А.А. Титов, О.В. Папчук, А.А.

Балбуцкая // Материалы XVIII Международной научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии». - 16-19 мая 2006 г., Санкт-Петербург. - С. 69.

7. Войтенко А.В. Идентификация Staphylococcus hyicus методом полимераэпой цепной реакции по обнаружению гена супероксиддисмутазы sod А / А.В. Войгенко, В.Н. Скворцов, К. Лэммлер и др. // Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных». - 16-17 мая 2006 г., Москва. - С. 452-456.

8. Войтенко А.В. Экспериментальное заражение поросят токсин-продуци-рующими штаммами Staphylococcus hyicus / А.В. Войтенко, В.Н. Скворцов, А.А. Балбуцкая // Ветеринарная патология. - № 3. - 2006. - С. 80-83.

9. Voytenko A.V. Identification of Staphylococcus hyicus by polymerase chain reaction mediated amplification of species specific sequences of superoxide dismutase A encoding gene sodA / A.V. Voytenko, T. Kanbar, J. Alber, C. Laemmler et al. // Vet. Microbiol. - 2006. - Aug. 25. - 116 (1-3). - P. 211-216.

АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ ВОЙТЕНКО

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА STAPHYLOCOCCUS HYICUS И ЕГО РОЛЬ В ПАТОЛОГИИ СВИНЕЙ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 17.08.06 г. Усл.п.д. 1,5 Заказ Ш 286. Тираж 120

ООО ИПЦ «ПОЛИТЕРРА» 308002, г. Белгород, ул. Курская, 4, офис 5. Тел/факс (0722) 26-26-82 Тел. 8-9103601499

1.1. Актуальность темы. В настоящее время повышение эффективности свиноводства сдерживается наличием инфекционных болезней, многие из которых являются ещё недостаточно изученными.

В свиноводческих хозяйствах не редко встречается заболевание с признаками экссудативного эпидермита (мокнущей экземы) - болезни, Г наносящей существенный экономический ущерб отрасли из - за высокой летальности поросят, снижения прироста массы тела у переболевших животных, значительных затрат на лечебно - профилактические мероприятия. Заболевание протекает в генерализованной форме преимущественно в виде острой или подострой инфекции, чаще у поросят - сосунов или поросят -отъемышей; локализованная форма встречается реже и проявляется в основном у поросят более старшего возраста, а также у подсвинков и откормочных свиней (Э. - Г. Гельвиг, 2003; Е. Sieverding, 1988).

В Европе экссудативный эпидермит свиней ещё в 60 - 70 - х г.г. прошлого века приводил к достаточно большим экономическим потерям в свиноводстве (Е. Sieverding, 1988), хотя и сегодня проблема всё ещё является не решенной.

Возбудителем болезни является Staphylococcus hyicus, который впервые был выделен, описан и назван D. Sompolynsky в 1953 году как Micrococcus epidermidis, а в конце 70-х годов прошлого века стал официально признанным отдельным видом семейства стафилококков (L. Devriese et al., 1978).

Комплексное изучение биологических свойств стафилококков и продуцируемых ими биологически активных веществ лежит в основе представления о патогенезе вызываемых ими заболеваний и является базой, на которой в дальнейшем строится диагностика и разрабатываются схемы профилактики и терапии.

В Определителе бактерий Берджи 1974 года упомянуты только три вида стафилококков: Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus и Staphylococcus epidermidis. С развитием микробиологии, усовершенствованием традиционных методик лабораторных исследований, появлением иммуно - ферментного анализа и полимеразной цепной реакции в издании того же Определителя 1986 года были описаны 19 видов (W. Kloos и К. Schleifer, 1986), а в издании 1997 года - 23 вида в семействе Staphylococcus. В генном банке NCBI (www.ncbi.nih.gov) и Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ GmbH, www.dsmz.de) на сегодняшний день представлены 50 видов и подвидов стафилококков.

В нашей стране исследования биологических свойств Staphylococcus hyicus в достаточной мере не проводились, а его роль в этиологии инфекционных заболеваний свиней полностью не изучена.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью нашей работы явилось изучение биологических свойств Staphylococcus hyicus и его роли в патологии свиней. Исходя из этого, перед нами были поставлены следующие задачи:

1. Изучить экологию, биологические свойства и чувствительность выделенных культур Staphylococcus hyicus к антимикробным препаратам.

2. Изучить патогенные свойства Staphylococcus hyicus для поросят.

3. Изучить факторы патогенности выделенных культур Staphylococcus hyicus.

4. Разработать метод идентификации Staphylococcus hyicus полимеразной цепной реакцией.

1.3. Научная новизна. Проведены исследования по выделению Staphylococcus hyicus из различных источников, в том числе с кожи здоровых и больных экссудативным эпидермитом поросят, а также от других видов животных.

Изучены биологические свойства и определена in vitro чувствительность 40 штаммов Staphylococcus hyicus к 17 антимикробным препаратам.

Изучены факторы патогенности данных бактерий.

Впервые в Российской Федерации проведено исследование выделенных изолятов S. hyicus полимеразной цепной реакцией на наличие генов, детерминирующих синтез эксфолиативных токсинов exhA, exhB, exhC и exhD.

Обнаружили, что штаммы Staphylococcus hyicus, выделенные от свиней с признаками экссудативного эпидермита в хозяйствах Белгородской области, содержат ген exhD, детерминирующий синтез эксфолиативного токсина D,

Разработан метод идентификации Staphylococcus hyicus по обнаружению полимеразной цепной реакцией гена sodA видоспецифичной супероксиддисмутазы.

1.4. Практическая ценность работы. Показано носительство Staphylococcus hyicus несколькими видами сельскохозяйственных животных (свиньи, крупный рогатый скот, а также птицей), доказана роль Staphylococcus hyicus в патологии свиней.

Разработан метод идентификации Staphylococcus hyicus по обнаружению полимеразной цепной реакцией гена sodA видоспецифичной супероксиддисмутазы.

По материалам работы разработаны «Методические рекомендации по идентификации и определению факторов патогенности Staphylococcus hyicus - возбудителя экссудативного эпидермита (мокнущей экземы) свиней», рассмотренные и одобренные на заседании секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 30 марта 2006 г. протокол № 1.

1.5. Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на:

- IX и X Международной научно - производственной конференции «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения» (г. Белгород, 2005 г., 2006 г.);

- Международной научно - практической конференции «Повышение эффективности лечения и профилактики акушерско - гинекологических заболеваний и биотехники размножения животных» (г. Киров, 2005 г.);

- Международной научно - практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных» (г. Москва, 2006);

- XVIII Международной межвузовской научно - практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (Санкт-Петербург, 2006 г.).

1.6. Публикация. По проведенным исследованиям и материалам настоящей диссертации опубликовано 8 научных статей.

1.7. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения и список литературы. Работа иллюстрирована одним графиком, одной дентрограммой, четырьмя рисунками, 10 таблицами и 8 фотографиями. Список использованной литературы включает 193 источника, из которых 175 иностранных.

V. выводы

1. При исследовании 371 пробы материала из различных источников S. hyicus был выделен в 26 случаях (7 %). Из 26 культур 18 (69 %) были изолированы от поросят, больных экссудативным эпидермитом, от поросят с признаками пневмонии - 2 культуры (7,7 %), от поросят и свиноматок без патологии - 3 культуры (11,5 %), от коров, больных клиническим и субклиническим маститом и эндометритом - 3 культуры (11,5 % случаев), от птиц без патологии - 1 культура (3,8 %). При этом, от поросят, больных экссудативным эпидермитом, от свиноматок и птиц без патологии, а также коров, больных клиническим маститом и эндометритом, S. hyicus выделен и идентифицирован в нашей стране впервые.

2. Изоляцию S. hyicus следует проводить в обычном термостате при температуре +37 °С как на элективных для рода Staphylococcus питательных средах с содержанием 7,5 % хлорида натрия (ЭСА, ЖСА), так и на простых питательных средах (МПА, кровяной агар).

3. При исследовании методом ПЦР культур S. hyicus, выделенных от поросят, больных экссудативным эпидермитом, у 100 % штаммов обнаружено наличие гена exhD, детерминирующего синтез эксфолиативного токсина D, что и обуславливает появление кожных поражений у поросят при экссудативном эпидермите.

4. Экспериментальное заражение поросят штаммами S. hyicus, обладающих генами, детерминирующими синтез эксфолиативных токсинов различных типов, доказывает этиологическое значение токсин-продуцирующих штаммов S. hyicus в возникновении экссудативного эпидермита у поросят. Напротив, штаммы S. hyicus, не обладающие генами, детерминирующими синтез эксфолиативных токсинов, инфекцию у поросят не вызывают.

5. Большинство исследованных культур S. hyicus показали плазмо-коагулирующую активность в отношении цитратной свиной и человеческой плазмы в разведении 1:5 и, напротив, не показали таковой активности в отношении цитратной плазмы барана и коровы. В отношении цитратной кроличьей плазмы положительные результаты были получены в 15,3 % случаев.

6. При определении хлопьеобразующего фактора с применением цитратной кроличьей плазмы положительных результатов получено не было. Все штаммы 51 кукш продуцируют ферменты гиалуронидазу и ДНК - азу, 65 % штаммов обладают фибринолитической активностью.

7. Гемолитическая активность 5". куюш проявляется при постановке САМР-теста (теста на синергетический гемолиз) на агаре с добавлением дефибринированной или цитратной крови барана. Самостоятельный гемолиз на указанном агаре не проявляется. Это говорит о наличии у & кукш 8- гемолизинов и отсутствии а - и (3 - гемолизинов.

8. Большинство штаммов & кукт коагулируют человеческую цитратную плазму, гемолизируют человеческие эритроциты и проявляют фибринолитическую активность на агаре с добавлением человеческой плазмы, что говорит о потенциальной опасности данного микроба для человека.

9. Культуры & \iyicus проявляли высокую чувствительность к препаратам пенициллинового ряда (ампициллин, пенициллин, оксациллин), к неомицину, фуразолидону и гентамицину. Указанные препараты могут быть эффективными при лечении заболеваний, вызываемых Б. кукт.

10. Апробированная нами методика определения наличия у & куют генов, детерминирующих синтез эксфолиативных токсинов ехкА, ехкВ, ехкС, ехЮ методом ПЦР может быть рекомендована при диагностике экссудативного эпидермита свиней.

11. Разработанная и апробированная нами идентификация & кукт по обнаружению гена хойА видо - специфичной супероксиддисмутазы может быть рекомендована для практического использования при идентификации & кукш полимеразной цепной реакцией.

VI. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

По результатам исследований разработаны «Методические рекомендации по идентификации и определению факторов патогенности Staphylococcus hyicus - возбудителя экссудативного эпидермита (мокнущей экземы) свиней», рассмотренные и одобренные на заседании секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 30 марта 2006 г. протокол № 1.