Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Бактериофаги Morganella morganii и их применение при желудочных заболеваниях поросят

МИНИСТЕРСТВО СШЬСКОГО ХОЗШЮТВА'РОССИИ МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ Р§Ц^РИНЛ0$Я АКАДЕМИЯ имени К. И. СКРЯБИНА

На правах рукописи

' ЗОЛОТУХИН СЕРГЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

БАКТЕРИОФАГИ МогйапаПа йоге-«11 Н И>! ПРИМЕНЕНИЕ . ПРИ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧШХ З'ЗОЛЕВАШЯХ ТОРОСЯТ

16.00.03. - ветеринарная »микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

•■АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветаринарньи наук

МОСКВА - 1994

Работа выполнена в Ульяновском сельскохозяйственном института, во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии* гигиены и экология

Научный руководитель1 - доктор ветеринарных наук, профессор В.Я. Гаяшкин .

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук .профессор В.А.Бурлаков

кандидат ветеринарных паук. старший научный сотрудник Л.С.Кавк

Ведущая организация:.

Всероссийский научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.

Защита состоится 1994 г.

в час на заседании специализированного совета К-120.36.05• по прюуздению ученой степени кандидата наук в Московской ордена Трудового Красного Знамена ветеринарной ¡академии, имени К.й. Скрябина (109472. Москва, ул. Академика Скрябина, 23, тел.: 377 - 93 - 83). ; .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии.

Автореферат разослан " , 1994 г.

. Ученый секретарь специализированного совета Федосеева Т.Н.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуя.пьнпгть TP ММ, Одной из основных причин гибели поросят-сосунов в специализированным свиноводческих комплексах являются желудочно-кишечные заболевания. В настоящее время благодаря работам "отечественных и зарубежных исследователей Установлено, что наряду с общепризнанными возбудителями инфекционной диареи новорожденных животных С энтеропато генные серо ваш эшерихий, сальмонеллы, клостридии перФрингенс) важную роль в возникновении кишечных инфекций играют и другие микроорганизмы, в частности представители семейства Enterobacterlaceae. относящиеся к роду MorSanella С вид МогЙапеНа morganll), значение которых в инфекционной патологии сельскохозяйственных животных до последнего времени оставалось не выясненным.

Исследованиями J11C. Каврука (1986) было установлено, что данные бактерии способны самостоятельно или в ассоциации с другими видами знтеробйстерий вызывать тяжело протекающую с летальным исходом диарею у поросят-сосунов и новорожденных телят.

. О широте распространения кишечных инфекций у молодняка сельскохозяйственных животных, протекающих с участием М. morganll, статистические данные отсутствуют, поскольку до 1992 года ветеринарные диагностические лаборатории не проводили исследование патологического ,материала на наличие морганелл ввиду отсутствия в стране руководящих методических указаний. Последние были утверждены лишь в" ноябре 1991 года (Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными знтеробактериями).

Соответственно сложившейся ситуации биологическая промышленность страны не изготовляет.специфических средств профилактики и терапии заболеваний животных, вызываемых морганеллами, что в определенной степени снижает эффективность мероприятий по борьбе с кишечными инфекциями молодняка. Применение антибиотиков и нитрофура-нойых препаратов для лечения и профилактики желудочно-кипечных заболеваний новорожденных животных,в сяде случаев оказывается кеизе-.таточно эффективным. Это связано с возрастанием уровня устойчивое-" та условно-патогенных микроорганизмов к •гкп'йбиотакаы и разной чув-. ствительностью к ним возбудителей болезней СА.М.Домбровасая и др.. 1986, 1989; Е.С. Воронин и др. 1989). ••

В связи с указанным большое значение имеет проблема изыскания активных фагов, обладающих высокой специфичностью по отношению к бактериям вида М. morganll, с целью терапии и профилактики диарейных заболеваний. Преимуществом этих .средств является их безвредность даже в больших дозах, отсутствие побочных дей-■{-30

» • "

ствий на организм жизотнга iдксбактериоза, алдаргическш рчхшй, угнетения естественной резистентности организма). Позтсиу-в условия« обычных и в особенности крупных свиноводческих ко.? ¡йств фаготерапия и фагопрофилактика юлудочно-кишечных заболлзани*!.' иоро-сят-сосунов приобретет большую актуальность для прак.т- ¿и.

Цр.цъ кг;г-п?>лпиан»я. В имеющейся литературе отсутствуют данные о биологичэских свойствах морганеллезных бактериоОбгог и их применении при кмшечных инфекциях животных, протекахдая с участием корганелл.

В связи с этим перед нами была поставлена цель изыскать специфический бактериофаг М. morgan11 и изучить возможность применения его для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний поросят-сосунов.

Задачи ?исглвдпваний.

1. Изучить эпизоотическую обстановку в крупных свиноводческих хозяйствах зоны Среднего Поволжья и этиологическую роль М. morganll при желудочно-кишечных заболеваниях поро-сят-сойунов.

2. Выделить из патологического материала от больных диа^аес поросят-сосунов и объектов внешней среды несколько штаммов • фагог М. morgan 11 и провести их селекцию.

3. Изыскать штамм бактериофага с наиболее широким диапазоне! лирической активности по отношению к эпизоотическим штаммам морга-неля и изучить его биологические свойства.

4. Определить оптимальные условия изготовления ыорганеллезно-го бактериофага и получить лабораторную партию эти."« препарата.

5. Изучить возможность использования, приготовленного бактериофага для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболевания поросят-сосунов, отработать наиболее эффективные дозы и схему еп применения.

Научная нпиизна. Впервые в свиноводческих хозяйствах Ульяновской и Самарской областей проведены диагностические исследования < целью изучения этиологического значения М. morganll в инфекционной диареи поросят-сосунов. Получены новые данные о сероло гических группах морганелл, циркулируют« в обследуемых хозяйства Изучены биологические свойства выделенных штаммов морганелл.

Получен новый спаш$ический лечебно-профилактический препа рат - бактериофаг морганеллезный, изучены его свойства, опти мальныа условия приготовления и разработана эффективная схема ег применения.

Впервые в ветеринарной практике эффективно использовался баи териоФаг М. morgan!1 для профилактики и лечения »злудач-но-кишечных заболеваний у поросят-сосунов.

Пряктушяркяя значимость работы, На основании подученных экспериментальных данных подтверждены сведения зарубежных и отечественных ученых об этиологической роли М. тогйапП в инфекционной диареи поросят-сосунов. Установлена циркуляция.патогенных штаммов ыорганелл в некоторых хозяйствах Ульяновской и Самарской областей при массовых желудочно-кишечных заболеваниях новорожденных поросят. Определена их чувствительность к антибиотикам и гомологичному бактериофагу. Предложен специфический лечебно-профилактический препарат против желудочно-кишечных заболеваний поросят-сосунов -бактериофаг морганеллезный. Разработана технология изготовления на опытную партии препарата и эффективные схемы его применения.

Апробация ря^пты. Материалы диссертации представлялись:

- на научных конференциях профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов УСХИ СУльяновск, 1989, 1990, 1991. 1992. 1993 гг.У.

на научно-техническом совете ветеринарного отдела областного управления сельского хозяйства Ульяновской области (Ульяновск, 1992): •

- на XII научно-практической конференции молодых ученых и специалистов С Оренбург, 1993).

рубликвчуш- По материалам диссертационной работы опубликовано 4 статьи.

Об-ут« и г-тцк-тцпд пябптн. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения.

Работа иллюстрирована 16 таблицами и двумя схемами. Список использованной литература включаэт 159 источников, из них 46 иностранных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы и методы

Работа выполнялась в период с 1987-1893 гг. на кафедре эпизоотологии. микробиологии и ветсанэкспертизы Ульяновского сельскохозяйственного института, в лаборатории санитасмой микробиологии Всероссийского научно-исследовательского института ветсанитарии. гигиены и экологии, а также в свиноводческих комплексах Ульяновской и Самарской областей, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям поросят-сосунов.

Для исследований использовали питательные среды: мясо-пептон-

ный бульон, мясо-пептонный агар, бульон Хотгингера: срегы: с шче-виной по Преусу, Фенилаланином. Симмонса, Плоскиреаа, Эшр, Клиг-лера, Кларка. Гисса с индикатором бромкрезоловым пурпурным С глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза, маннит, дулъцит, салицин, сорбит), полужидкий агар, кровяной агар, содержащий 5Х дафибрини-рованной крови барана,, мясо-пептонная желатина, пептоннгя вода.

йэ активы: глицерин нейтральный, натрий хлористый, пара-диые-тилашнобензальдегид, соляная кислота, спирт этиловый 96*, . орто-ФосФорная кислота. метапрот.в1-наФгол, калия гидроокись, вазелиновое масло. Физиологический раствор СрН 7,0-7.2), генцианвиолет» хинозол. фенол.

Набор нативных морганеллезных агглютинирующих серогрупповык сывороток Сопытно-промышленная партия N1-8, изготовлены Грузинским биокомбинатом 4.08.89г.). ,

Оборудование: термостата ТС-80К-2: микроскопы МБИ-3: лупа бинокулярная МБС-9; ультратермостаты УТ-15У4.2 и KL-4 СВенгрия): са-куумный* насос Me2molnlce С Чехословакия): Фильтры Зейтиа: стерилизующие пластины СО®): центрифуга лабораторная ОГТН-8-4.2: холодильники бытовые: колбы мерные: пипетки пастеровские: пипетки мерные на 1,0, 2,0. 5;О см i флаконы емкостью 50. 100. 200 см'': бутыли емкостью 10 nvß, колбы Бунзена: стекла покровные: стекла предметные: чашки Петри: пробирки: стандарта мутности на 0.5. 1,0 млрд. микробных клеток в 1 cufl шприцы: пинцеты: скальпели: ножницы: стекляныэ ампулы.

Животные: новорожденные поросята массой 1,0-1,5 кг в количестве 261 головы: бель» мыши массой 15-16 г в количестве 43; головы; кролики массой 2.5-3,0 кг в количестве 9 голов. .,

В качестве индикаторной культуры для выделения ыорганеллеэ-ных Фагов и изучения их свойств использовали штамм М. morganll N 36/82 серологической группы 033. который был выделен старшим научным сотрудником ВНИВСГЗ Л. С. Кавруком из Фекалий больного диареей поросенка и любезно нам предоставлен.

Для изучения диапазона литической аставности и специфичности морганеллезных бактериофагов использовали 84 аггамма морганелл, из них 45 эталонных, разный серологических групп, 10 штаммов сальмонелл. 20 штаммов бактерий рода Proteus, 50 штаммов Е coli и один штамм Pseudomonas aeruginosa.

Ввиду отсутствия в период проведения работы руководящих методических указаний по диагностика М. morganll в патологическом материале от больных и павших животных бактериологические исследования Фекалий больных диареей поросят-сосунов проводили согласно методике, предложенной Л. С. Кавруком C1S863. Трупы Лоросят-сосунов. погибших от диареи, исследовали в соответствии с Еёйстзуехшш то г-

да методическими указаниями по бактериологической диагностике ко-либактериоза Сзиерихоза) и саяьыонеллеза сельскохозяйственных животных.

Видовую принадлежность микроорганизмов определяли в соответствии с рекомендациями, изложенными в IX издании Определителя бактерий Bergey's С1984) и руководстве "Знтеробактерии" СВ.И.Покровский, . 1985), используя 20 биохимических тестов.

Серогрупповую принадлежность игаммов »¿органе л л определяли в реакциях агглютинации с агглютинирующими морганеллезными 0-сыво-ротками согласно "Временного наставления по применению сывороток нативных морганеллезн'ых . серогрупповых" С1988). Гемолитические свойства выделенных штаммов изучали на 52~ом кровяном МПБ с глюкозой.

Патогенные свойства определяли у штаммов М. morganИ нетипи-руемы5{ имешимсЯ набором агглютинируших сывороток методом внут-рибршинного заражения белых мышей взвесью агаровых 18-ти часовын культур морганелл в дозе 500 млн. м. к.

Заражение новорожденных поросят проводили взвесью 18-ти часовых культур М. morganll через рот в доза 5 и 10 млрд. и. к. клеток.

Выделение, селекцию и изучение биологических свойств бактериофагов М. morganll проводили по классическим методикам, описанным Dulbeeco, Vogt С1954). J. Cralgle и A. Felix C1944), M. Адамсом (1961), Д.М. Гольдфарбом С1961), В.И. Ганюшкиным (1988).

Серологические свойства иорганеллезного фага изучали в сравнении со стандартным Фагом Т2 E.coll В1255.

Режимы центрифугирования рассчитывали по методике Б.Ульямса и К. Уилсона (1978). Все полученные цифровые данные обрабатывали математически па Г. Ф. Лакину С1980) с прмюнениеы микрокалькулятора "Электроника БЗ-34" и прикладных прогреми к нему (А.Н. Цветков, В.А.Епанечников, 1984).

г

2.2. Результата исследований

2.2.1. Распространенность Morßanella raorganll а неблагополучных по диарейньм заболеваниям поросят свиноводческии хозяйствах и свойства выделенных штаммов морганелл

Иг^яйпгтянир патплпгичррк-лm мятопцяпа от больных—mtflPRBft—И погибшим пптгдт-спсунпд ня няпичир М гапгряпП . За Период ребОТЫ нами были проведены бактериологические исследования 58 проб ФзкА-лий больных диареей, а также 176 проб внутренних органов и тканей от 22 трупов поросят-сосунов из 7 свиноводческих ферм и промьшлен-Z-50

- б -

• if

ных комплексов Ульяновский и Самарской областей. В результате исследований в трех хозяйствам (42Z) обнаружены мрргш'вхяы. Частота их выделения из проб Фекалий больных животных данных хозяйств составляла 20-4ОХ случаев. При бактериологическом исследовании 12 трупов поросят, принадлежавших одному из хозяйств, где циркулировали хаэрганеллы. культуры этих бактерия были выделены из внутренних органов 9 поросят (75Х случаев). Наиболее часто культуры mod-ганелл приходилось выделять из пораженных участков толстого отдела кишечника - в б случаях (66,7X3, реже из тонкого отдела кишечника - в 3 случаях (33.323. Из крови сердца и печени культуры мор-ганелл были выделены от двух поросят СИ, ИХ), При исследовании патологического материала от 10 трупов поросят других хозяйств, морганеллы не были обнаружены как в Фекалиях больных диареей, так и во внутренних органах и тканях погибших поросят.

У всех выделенных культур М. morganli изучали серогрупповую принадлежность, гемолитические свойства, патогенность. чувствительность к антибиотикам.

СпвплпгичЕашй илр.нтийикяпии подвергали культуры М.morganli. относящиеся по морфологическим, тинкториальным, культуралькым и 5mDX«íK'4S0Kíím СВОяСТйам к роду Morganella. Из Í9 культур было ти-пировано с помощью набора сывороток восьми серологических О-групп (01. 0Í6, 026, 029, 033, 045, 049, "13") 8 штаммов М. morfianl 1, т.'е. 42 X культур. Из них три штамма принадлежали к серогруппе 01, три штамма - к 026, два штамма - к 016. Остальные одиннадцать штаммов, типированые широким набором агглкггинируших морганеллез-ньк сывороток в Московском научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова, были отнесены к серогруппам OS - один штамм, 034, 024, 025, 041, 046 - по два штамма.

Илуцрнир» гамгупитииргк-иу гйпйстй ыпрганрлл показало, ЧТО 1Í штаммов мэ 19 обладала Гбмслйткчгскимй свойствами (63,2 %), вызывая ярко выраженный бета-гемолиз эритроцитов барана.

Кипптбу на белых мышах проводили с 11-ю штаммами морганел. отнесенными нами к серогруппам 09, 024, 025, 034, 046, 041. Все изученные культуры обладали патогенными свойствами, вызывая гибель животных в тачание 24-48 часов.

Пг>ы мчуцрнии иург-гяитрл>.нпг-ти ГР^ЖРЙЫПРЛРННЫК_штаммов_И

рргдап 11 ic 14 антмЯиптмк-пу: пенициллину, тетрациклину, неомишну •аксвдиашину, мономицину, полимексину. кан&мицину. ристомицмну. ле воминетану, гентамицину, ампициллину, стрептомицину, эритромицину линкомицину установлено, все 19 штаммов проявляли устойчивость тетрациклину, оксациллину. полимексину, шстоыицийу, стрептоми№ ну, эритромицину. линк0ш4шну. Восе*я> изолятов (42,150 были ycroí чивы ко всем 14 антибиотикам. К левомиштину были чувствительны

4, устойчивы 15 штаммов: к гентамииину - чувствительны 3 штамма, устойчивы - 16 и к ампициллину устойчивы 15 итацдав. чувствительными оказались два штамма и два - умеренноустойчивыми. Из полученных результатов исследований видно, что ни один из изученных антибиотиков не обладал ингибируюдим действием по отношению к большинству штаммам названных микроорганизмов, ввиду чего, применение выша перечисленных препаратов в терапевтических дозах не может'давать желаемого эффекта при желудочно-кишечных заболеваниях поросят, вызываемых морганеллами или с их участием.

2.2.2. Экспериментальное заражение поросят-сосунов полевым штаммом Morganella morganil

Для изучения патогенности бактерий М. morganil и подтверждения их эткопатогенетической роли при желудочно-кишечных заболеваниях поросят-сосунов нами был проведен опыт экспериментального за-■ ражения новорожденных поросят полевым штаммом М. morganil N5/1 К серологической группы 024. Названный иэолят выделен из тонкого отдела кишечника поросенка, павшего с признаками диареи в возрасте 3-х суток.

В опыте использовали 22 новорожденных поросенка от трех свиноматок, которые были разделены на три группы. Поросят первой опытной группы С 8 гол. от двух свиноматок) заражали через рот спустя 20 -'30 минут,после рождения до приема молозива взвесью агаровой культуры М. morganil в дозе 10 млрд. и.к. Взвесь микроорганизмов готовили путем смыва 18-ти часовой культуры цорга-налл, со скошенного МПА стерильным физиологическим раствором. Поросят второй контрольной группы С 4 гол. от двух свиноматок) не за- . ражали и содержали совместно с -опытными животными. Животные третьей группы в количества '10 голов такие,были контрольными и содержались изолированно под одной свиноматкой.

Заболевание и гйбель 4 животных (50Х) первой группы наступило .ужа в пераьн два часа посла заражения с признаками отека лег-•ких. Оставшиеся в живых поросята опытной группы заболели на вто. рыа сутки с клиническими признаками диареи и гибель ш прокапала на 3-4 сутки после заражения.

Поросята второй группы, нэ заражать«- но сояержезжеет coa-" место с больными, заболели с признаками «ларей ,ц погибли спустя 1-4 суток после проявления клинических признаков.

Пси бактериологическом исследовании всех павших животных из внутренних органов и тканей трупов выделены исходные культуру М. morganil серологической группы 024.

Результаты этих исследований свидетельствуют о том, .что в- не-

которых неблагополучных по жлудочно-кмлечным заболеьи,'--яу. 'поросят хозяйствах циркулируют патогенные штаммы морганелл» способные вызывать у поросят тяжело протекающую кишечную инфекша.

2.2.3. Выделение и изучение свойств морганеллезных Сигов

Выделение фагов . М. morßanil нами проводилось на культуре -М. morganli N 36/82, серологической группы 033. Материалом исследований являлись Фекальные массы от больных диареей поросят-сосунов и сточные воды канализации свинарников. Всего было выделено 6 штаммов Фагов, лизируюшх индикаторную культуру, которые мы условно обозначили Ml, М2, МЗ, М4, М5, MS.

Для получения "чистых линий" фагов и повышения их . литической активности выделенные фаги пассировали на индикаторной культуре М. morßanil 10-16 раз с периодичной отвивкой типичной для рассы негативной колонии. Все было селекционировано 5 линий Фагов М1, М4. М5. Мб. М7. '

Фа?* М7 был селекционирован путем клонирования из нетипичной округлой и прозрачной колонии Фага М5. диаметром 1 мм.

Селекционированные фаги Mi, М4, М5. Мб имели однородные негативные колонии с небольшим различием в диаметре: М1 - 2-3 мм, М4 -1,5-2 мм, М5 - 1,5-2 мм, М8 - 1,5-2 мм. К? - 1 мм. Колонии округлые, прозрачные, без вторичного роста фагорезистентных клеток индикаторной культуры.

Активность селекционированных фагов М1. М4, М5, Ко на плотной питательной среде по методу Грация выражалась в пределах 8 * 108 - 2,3 * 109 корпускул в 1 cvß. а по методу Аппельмана 10-6 _ 10-8.

ГпрписЬццнпрть и пиагмяпн литичягупгп действия_t^praHfiJlJR.lHlXi

бяктепигиТяггт в результате изучения специфичности пяти морганел-лезных бактериофагов (М1, М4, М5. Мб, М7) по отношению ,к 10 штаммам сальмонелл, 20 штаммам рода Proteus, 50 штаммам Е.coli и одному штамму Pseudomonas aeruginosa, ни один из перечисленных фагов не лизировал культуры микроорганизмов гетерологичных родов.

При изучении диапазона литаческоа активности 5 селекционированных фагов С Mi, М4, М5, Мб, М?) мы использовали восемь штаммов' М. morßanil серологических групп 01, 016. 026. 033, 045. 049 и "13", которые а настоящее время признаны патогенными и используются для производства морганеллезных диагностических препаратов. Результата опыта показали, что наиболее широким диапазоном литачес-кого действия по отношению к изучаемой культурам ¡эбладаот штамм Фага MS. Из восьми штаммов М. mörganll он'.визировал1 семь. Фггм М1, М4. М5 проявляли одинаковую'литачвск.ую'а;ст<!зкость, "оия ижи-сь&ля

по б штаммов морганелл. Наиболее узкий спектр литической активности был у Фага М7, который лизировал только два штамма морганелл серогрупп 033 и 026.

Из полученных результатов исследования видно, что селекционированные нами Фаги Ml. М4. М5, N6, М7 облапают выраженной специфичностью по отношению к микроорганизмам рода Morgänella и не активны к представителям других родов энтеробактерий. а также к роду Pseudomonas.

Лияпязпы литичргн-па ак-тиингк-ти бнктрпипгТягп MR В СВЯЗИ ' с тем, что для производства лечебно-профилактического препарата штамм Фага должен обладать широким диапазоном литической активности, нами были проведены дополнительные исследования на большем количестве штаммов морганелл. Для этого мы использовали в опыте 84 полевых и эталонных штамма М. morganll. Из сорока пяти эталонным штаммов 45 серологических.групп, лизировались Фагом Кб двадцать шесть штаммов С 57,8 X). Из 39 полевых штаммов Фагочувствительными были 30 ( 78.9 X).

Анализ результатов исследований показал, что бактериофаг М. morganll Мб обладает ширским диапазоном литической истинности в отношении эпизоот г- -v.m морганелл различных серологических групп, которь... .стаздя^т 76.92. Корреляция мекду' принадлежностью морганелл к жрологичзасоп О-группа -и чувствительностью к бактериофагу из проявлялась.

• 1ДШ1УНЛГРННМР ranfloraa бвстргмп&ага МпгйапяПа_ГСПГВЯПП .' МН.

Для изучения антигенных свойств бактериофага М. isorganll Кб нами было получено 180 см^ антифаговой сыворотки Фага Мб и 120 см3 Фага Т2 Е. coll . У полученных сывороток изучали нейтрализующую активность. для чего была определена константа скорости нейтрализации при взаимодействии антифаговой сыворотки с гомологичным и ге-терологичным бактериофагами. ^

Полученные нами антифаговке сыворотки Фагов Мб и Т2 имели следующую нейтрализующую активность с гомологичными Фагами: константу скорости нейтрализации (КЗ у антисыворотки фага Мб -24.67*2.5 мин-1, у антисыворопси Фага Т2 - 29,02*1,55 мин-1. Антифаговая сыворотка Фага MS проявляла выраженную нейтрализующую активность в титре 1:800. а сыворотка фага Т2 - в титре 1:1600. Реакция нейтрализации Фагов MS и 12 с г^терологичными антисыворотками была отрицательна.

Алшрбттнну.и атомность. dtora Мб на . бактериальных_клетках

«п^ямня изучали при взаимодействии бактериофага с клетками М.morganll N 36/82 серогруппы 033. Результату опытов показали, что после 5-6 минут взаимодействия фага с бактериями вырастало 13*1.45 негативна- колони^, что аоатадтетеаещдй едсорйцим 74,корпускул

£wra. Г)о истечении 6-7 минут проведения опыта выросло 2+0,58 негативных колоний*.фага, то есть адсорбировалось 94,8 - 96,22 корпускул- В течение времени 7-12 минут Фаг полностью адсорбировался на бактериальных клетках. В контрольных чашках находилось 54±1,76 негативных колоний Фага. Константа скорости адсорбции фага Мб. на бактериальных клетках штамма М. morganll N 36/82 находилась й пределах К = 0.9 - 1,2 * 10-9 сыЗ/мин-1.

■Патентный период внутриклеточного развития и. урожайность щр^ тир л лр-iupm фага Мб нами изучались в стандартных условиях при температуре 37* С в МПБ на индикаторной культуре М.morganll N 36/82 серологической группы 033.

Латентный период развития Фага М. morganll Мб при взаимодействии с гомологичными бактериями в мясо-пептонном бульоне при 3?-'с был равен 21-22 минут, а период роста продолжался 9-10 минут. Уро- • жайность морганеллезного фага Мб на клетках М. morganll №36/82 230 корпускул на одну инфицированную бактериальную клетку.

Таким образом селекционированный нами Фаг Мб М. morganll характеризуется выраженными показателями взаимодействия фага с клеткой: активной адсорбцией; . коротким латентным периодом, высокой урожайностью.

ТпрмлкАаистпнтнпггн. пактр.шпй&гаш и.изучяния—его. .лйтичес-кяй.активности,ппи хранении. Для изучения устойчивости бактериофага к прогреванию мы исследовали Фаг с титром 2*109 корпускул/см3, который прогревали в ультратермост^те при разных температурных режимам от 59 до 82" С с интервалом 2-3* С.

Получении данные о выраженной устойчивости бактериофага Мб к воздействию высокой температуры. При* нагревании Фага от 59 до 65-С снижение титра последнего не происходило." Нижний порог термоинакти-вашш иорганеллезного фага Мб составил 66-67* С. При последующем повышении температуры среды титр фага заметно понижался. В одном см фага было 5-8 бляипсообразуюцих корпускул. При температуре 76* С и выше негативные колонии Фага не обнаруживались. По нашим данным, верхний порог термоинастивашш бактериофага МБ вырашлся в пределах 75-76'С. . ,

Изменение литической активности селекционированного бактериофага Мб.М.morganll нами изучалось при хранении препарата в течении 14 месяцев в условиях холодильника при 2-4*С. Литический титр фага определяли по методу Грациа после приготовления, через шесть месяцев, через год и по истечении 14 месяцев. В наших исследованиях литический титр свежеприготовленного Фага бьш равен 8*10® ко-рускул фага в 1 см3. По истечении восьми месяцев он составил 3*109. по истечении 12 месяцев -9м 10®, по истечении 14 мвсяцев - 2*1О8 корпускул Фага/см3. Таким образом, результаты наших иссле-

дований позволяют использовать Фаг Мб для работы в течение 12 месяцев при условии хранения при 2-4* С.

Совокупность полученных результатов при изучении биологических свойств морганеллезного бактериофага Мб позволяет использовать названный штамм фага для производства лечебно-профилактического препарата.

2.2. 4. Изготовление морганеллезного лечебно-профилактического бактериофага

Морганелезный бактериофаг для проведения опытов изготовляли в бутылях емкостью 10 литров в МПБ (рН 7,4-7,6). куда засевали маточный бактериофаг и индикаторную культуру М.morganil. Засеянную среду инкубировали при 36-37*С в течение 5-6 часов. Через 3-4 часа наступало помутнение МПБ, а через 5-6 часов лизис бактерий. В качестве корсенвантов использовали 2-Х раствор хинозола С 5 см^ на 1 литр среды) и 5-% раствор Фенола С50 см^ на 1 литр Фага). Удаление нелизированным бактерий проводили путем Фильтрования Фаголиза-та через стерилизущие плаетинн Зейтца. Приготовленный бактериофаг проверяли на стерильнс"-.'.. б~ : :гэдность и литическую активность.

Всего нами было приго.озлено две серии Фага по 10 литров. Препарат был соломенно-жлтого цвета, прозрачный, стерильный и безвредный. Литический титр по Аппельману составлял 10-"'.

Результаты контроля двух серий фага позволили применять его для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний поросят, вызванных морганеллами.

2.2.5. Результаты опытов по фаготерапии и фагопрофилактике желудочно-кишечных заболеваний поросят-сосунов

Для изучения возможности использования селекционированного нами изолята морганеллезного фага Мб для лечения и профилактики диареи у новорожденных поросят нами были проведены следушие опыты: чистый опьгг по изучению профилактического действия морганеллезного бактериофага при экспериментальной инфекции поросят, вызванной полевым штаммом М. morganil N 5/1: опыт по изучению профилактического действия морганеллезного бактериофага в хозяйственных условиях: опыт по изучению лечебного действия бактериофага М.morganil в условиях хозяйства при естественном заболевании, поросят диареей. '

- При постановке опытов в условиях производства мы руководство-, валис! литературными данными и результатами собственных исследова-

ний, свидетельствующих о том, что морганеллы способны вызывать жа-»•.удочно-кииечныэ заболевания как самостоятельно, так и в ассоциации с другими патогенными энтеробактериями. Поэтому, кроме гомологичного морганеллезного фага, нами были использованы протейный, клебсиеллезный и колибактериозный бактериофаги. Морганеллезный Фаг был получен нами в лаборатории кафедры: протейный и клебсиеллезный бактериофаги были изготовлены на Омутинской опытно-производственной базе ПО "Восток": бактериофаг против колибактериоза изготовлен на Приволжской биофабрике.

ПРгаЬилактичрекая ^[Ьтик'тутнпгтъ мпргянрлпр^нппп баюВШОйага при акспякиирнта.пт<нпм чяпяжр^ми ппрлгя'р-гпсуноР- В опыте использовали три группы поросят в количестве 31 гол. от трех свиноматок. Поросятам первой группы, в количестве 11 гол., через . час после -рождения выпаивали морганеллезный бактериофаг в дозе 5 см3, а через 12 час. повторно вводили его в той же дозе. Спустя сутки после рождения проводили заражение животных 18-ти часовой взвесью культуры М. иогбап11 в дозе 5 млрд. -м. к. Зарагйнньш поросята« вио-дили тот же Фаг в течение. 3 суток.

• Поросят второй группы в количестве' 10 гол. заражали по вышао-нисанной методике, но бактериофаг им не применяли.

' Животные третьей группы в количестве 10 поросят ' были, контрольными Снезаражеяньаш) и бактериофаг не получали- Опытныэ и контрольные животные содержались изолированно под ежедневным наблюдением в течение 14 сут.

В нашем опыте у животных первой и третьей группы заболевание не отмечалось и сохранность их к 14-му дню жизни составляла 100%. Из 10 поросят второй группы заболело с признаками диареи 7, из них пало 3 гол.

Из крови сердца, образцов легких, печени, селезенки, а у од- • нога поросенка еще из головного мозга погибших животных были выделены чистые культуры исходного штамма М. тогйап11 серологической группы 024. !.

. В ппыт-р |Т1ЯРппрр|Т1млактики «ялуппчнп-кииичныч яябплявяний ппсо-гят и уг.япамям-»рдяйстиа использовали пять-групп поросят в количестве 148 голов в возрасте двух суток. Животным первой- С опытной] группы, в количестве 33 гол. выпаивали моновалентный морганеллезный бактериофаг на 2, 3, 4, 9. 10 и 11 дни после рождения в доза 5 сма один раз в сутки. Через пять суток после последней дачи бактериофага у 20 поросят исследовали Фекалии на наличие М. пошГапИ. Поросята второй группы в количестве 35 гол., получали по аналогичной методике трехвалентный бактериофаг Сморганеллезный, протейный, клебсиеллезный), который готовили путем смешивания моновалентных Фагов в равной пропорции и выпаивали животным в дозе 15 см3. Жи-

вотным третьей группы С33 гол.) выпаивали двухвалентный бактериофаг С протейный и клебсиеллезный) в дозе 10 см . Поросят четвертой группы (20.гол.) обрабатывали трехвалентным бактериофагом (морга-неллезным, протейным и колибактериозным), 30 поросят пятой группы были контрольные и бактериофаг не получали. В результате опыта из 33-х поросят первой группы заболело 7 С23.3Х). пало два поросенка: один с признаками гастроэнтероколита, другой - с травматическими повреждениями головы. При бактериологическом исследовании органов и тканей погибших поросят культура М. шогеап11 не была выделена. Не удалось также выделить культуры этих бактерий из 20 проб Фекалий животных, получавших Фаг. Из 35 поросят второй группы заболе- ' ло 6 (17, IX) и пал один поросенок, у которого при бактериологическом исследовании патматериапов культуру М. гаогВапП не выделяли. • Из числа животных третьей группы в количестве 33 поросят заболело 12 С36.1%) и пало 6. При бактериологическом исследовании трупов этих поросят из внутренних органов были выделены культуры М. таогйапИ. Из 20 животных четвертой группы заболел в легкой форме один поросенок, у которого сутки признаки расстройства желу-

дочно-кишечного тракта пре*;г^и."ись., 11з 30 поросят пятой контрольной группы заболело 13 ... ЗХ) а пало 5 гол: Из. внутренних органов и тканей трех т^' ^в нами были выделены культуры М. люгйапШ ГЫ бактериологических исследованиях 20 проб фекалий животных этой группы культуры М. гаогйап11 удалось выделить у 4 поросят (202).

Исппль-япиаш/я мпрганеддй^нпгп Фага МР> пля терапии_кёЛУДОЧ- •

нп-к-ишричму ^ябппопяний ппппрят. в производственном опыте по испытанию бактериофага с терапевтической целью мы использовали три группы поросят больных диареей в возрасте 2-3 сут. по 20 голов. в каждой. У всех животных в первый день опыта отмечалось расстройство >яэлудочно-ки щечного тракта. Испрахыения были жидкие со слизыэ, водянистой консистенции, аппетит сохранен, животные сохраняли подвижность. Температура тела в пределах 39.5» 0.6'С. Животным первой группы выпаивали моновалентный морганеллезный бактериофаг в доза 5.0 см11 два раза в сутки ежедневно на протяжении 3-6 дней до исчезновения клинических признаков болезни.: Животных второй группы обрабатывали смесью морганеллезного, протейного и коли-бактериозного бактериофагов. Фаги смешивали в равных пропорциях и выпаивали поросятам два раза в,сутки по 15 см смеси в течение 3-6 суток. Поросят третьей группы лечили по бхеме. применяемой в' хозяйства с помошыо антибиотика стрептонамияа, выпускаемого Буин-" ской производственной лабораторией ТАОСР.

Из 20-яиаотнкх первой группы'пало .5 поросят (25%). Средняя продолжительность болезни составляла Я.З суток. Из: 20-ти поросят

второй группы, для лечения которых применяли трехвалентный ракте-^мофаг, пало два поросенка (10%) на второй и четвертый день проведения опыта. Продолжительность болезни в среднем составила 2,9 суток. Из 20 животных третьей группы С контрольной) пало 8 гол. (40%). Средняя продолжительность болезни равнялась 5 сут.

Результаты проведенных опытов показали, что наибольшей эффективностью обладал трехвалентный бактериофаг, который мы рекомендуем применять для лечения и профилактики желудочно-кишочньк заболеваний поросят-сосунов.

' вывода '

1. Результаты исследований по изучению распростаренности morganli в неблагополучных, по Желудочно-кишечный • заболеваниям

поросят-сосунов свиноводческих хозяйствах Ульяновской и Самарской' областей, свидетельствуют о циркуляции в некоторых из них патогенных штаммов морганелл. Из семи обследованных хозяйств М. rsorganli были'обнаружены в трех..Частота обнаружения названных бактерий в фекалиях больных диареей поросят была в.пределах 20-402. Из патологического материала погибших в неблагополучных хозяйствах поросят бактерии рода Morganella выделяли в 75Х случаев. •

2. Получены данные о серологических группах морганелл,' циркулирующих в обследованных хозяйствах. 8 штаммов Morganella morganli из 19 (43%) были типированы с помощью набора диагностических морганеллезных сывороток, применяемых, для идентификации- возбудителей смешанной кишечной инфекции молодняка сельскохозяйственных животных и были отнесены |с серо группам 01, 016 и 026. 11 штаммов принадлежали к серогруппам 09, 024, 025, '034. 041. 046 и обладали патогенными свойствами, вызывая гибель белых мышей при внутрибршин-ном заражении в дозе 500 млн. м. к.. Большинство изученных штаммов С 63,2%) вырабатывали гемотоксин и вызывали геюлиз эритроцитов барана.

3. Подтверждена этиопатогенетическая роль морганелл при желудочно-кишечных заболеваниях поросят-сосунов. Экспериментальное заражение поросят до приема молозива взвесью агаровой культуры isop-ганелл в дозе 10 млрд. м. к. вызывало заболевание и гибель 10О X опытных, животных. Установлена возможность естественного заражения и заболевания новорожденных поросят диареей с летальным исходом при контакта их с больными искуственно зараженными животными. При бактериологическом исследовании из •патологического материала у всех трупов погибших животных выделяли Morganella morganli в чистой культуре или в ассоциации с E.coll, Proteus vulgaris и Proteus mir^llls. .

-5. Низкая эФФэктчвность антибйотикотерапии г-гч смешанной' кишечной инфекции поросят, протекающей с участием М. raorganl.l, обусловлена .резистентностью преобладаюцего числа штаммов морганелл ко многим антибиотикам. При изучении чувствительности 19 полевых штакшв морганелл к 14 антибиотикам выраженной активностью обладали :,свошштин - в отношении четырех штаммов (21%) . гентамицин

в отношении трех штаммов (15.821) и ампициллин - в отношении двух штаммов (10,52). Все штаммы были умеренно устойчивы или устойчивы к другим антибиотикам (пенициллину, тетрациклину, оксацилину, цо-лимексину. стрептомицину, эритромицину, линкомицину, ристомицину).

5. Изучение литической активности , специфичности и спектра литической активности семи выделенных морганеллезных бактериофагов позволило отобрать активный клон фага Мб, который пригоден для производства лечебно-профилактического препарата и отвечает требованиям, предъявляемым к производственным штангам. Он имеет выра-. женную скорость адсорбции К 0.9 - 1,2 * 10" сМ* /мин"' . короткий латентный период внутриклеточного развития - 21-22 минуты, высокую урожайность - 230 Фаговых частиц из одной микробной клетки, широкий спектр литической активности в отношении многих патогенных штамшв морганелл (76.4%) и выраженную специфичность. Фаг устойчив к прогреванию при (С*С и сохраняет литическую активность в течение 12 месяцев. . •

6. Бактериофаг Morgans' .о;\: 1 ?!6 обладает антигенной активностью и по серологическ свойстеет из гомологичен стандартному Фагу, Т2 Ecoll, скотсрм) не дает перекрестной реакции. Константа скорости нейтрализации антифаговой сыворотки гомологичной Фагу выражалась в пределах 24+2,98 шг1.

7. Установлена высокая профилактичзская эффективность бактериофаг а при экспериментальной морганеллезной инфекции поросят. Двукратная обработка новЬрожденных животных бактериофагом до заражения и последующее выпаивание его'в течение трех дней предохранят ло поросят от заболевания на 100%, тогда как в контрольной группе заболело семь поросят из числа десяти (70%) и погибло три (30%).

8. Применение морганеллезного бактериофага в производственных условиях с профилактической целью снижало заболеваемость поросят диареей на 22,IX по сравнению с контрольными животными, не получавших фаг.' Лечебная эффективность Фага составляла 75Х,. тогда как эффект антибиотикотерапии не превышал 60 %. Применение морга-неллезного бактериофага в сочетании с коли-протейным Фагом повышало профилактическую эффективность на 38,3%, а лечебную - на 30% по сравнена с животными контрольных групп. У обработанных -фагом больных поросят продолжительность болезни ро¡создалась в два . раза. • Профилактическая обработка здоровых новорожденных поросят специфи-

ческим морганеллезным бактериофагом предотвращало носштельство мор-ганеад в кишечнике животных. .

Сведения о практическом использовании получениях автором научных ' выводив: 1.Для изготовления специфического лечебно-профилактического ; препарата против диарейных заболеваний поросят-сосунов предложен штамм бактериофага Мб, получение которого проводят согласно "Временной инструкции по изготовлению и контролю опытной серии моргайеллез-ного лечебно-профилактического бактериофага дротив желудочно-кишечных, заболеваний поросят"( утверадеяа ректором Ульяновского сальскохозяй-ственного института, I5.07.IS92). '

■ 2.Предложено использовать для лечения и профилактики гелудочно-кишечных заболеваний поросят, вызываемых морганеллада или протекающих с их участием, морганвллезный лечебно-профилактическла бактерко- ; фаг' в сочетании с коли-протейными бактериофагам, который следует применять.согласно "Временного наставленйя по применению морганел-лезлого лечебно-профилактического бактериофага против желудочно-кишечных за'болеваний поро сят"Суте ервдсно Научно-техническим советом ветеринаррого отдела Ульяновской-области 6.07.1992),

З.Результаты диагностических исследований, а такге опытов по фаготерапии и фагопрофилактике желудочно-кишечных заболваний поросят, полученные в работе, используются в процессе обучения студентов ветеринарных факультетов Ульяновского и Оренбургского сальско-хозяйственных институтов.

Рекомендации по использованию научных выводов. При проведении лабораторной диагностики -патологического материала на кишечные инфекции поросят-сосунов необходимо у^нташать помимо' * известных серогруш Л1. гтюг^аг^-Ь . вызывающих заболевания у сельскохозяйственных животных, патогенные штаммы морганелл, относящиеся к другим серогруппаы- 09, 024', 034, Ъ41, 046, ко торн о циркулируют на свиноводческих фермах, . . ,

Список работ, опубликованных по теме диссертации. I.Золотухин С.Н. Выделение бактериофага Л4. тег^&ы* а изучение его литической активности// Вопросы ветеринарной шкробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Ульяновск, 1990, с.67-70. '

2. Ганшкин В.Я., Золотухин С.Н. Выделение фагов макроорганизма ЦЫ. .. из биоматериала от больных диареей по-■ росят, субстратов окружающей среды и их. литическая акливяость// Аграрная цаука в условиях многообразия форм общественнрй собственности и регионального хозрасчета/ Тезисы, докладов научной конферен-

ции профессорско-преподавательского состава,.научных сотрудников ' и аспирантов УСХИ. Ульяновск. 1990, с.37-38.

З.Золтухин С.Н., Гаяшкин В.Я. Лечебно-профилактическое действие бактериофага при экспериментальном'заражении поросят МсгдцтЦа ■Могрия/иХ. //Экологические проблемы сельскохозяйственного про- • , азводства/ Тезисы докладов научной конференции профоссорско-препо-дааательского состава, научных сотрудников и аспирантов УСХИ, Ульяновск. 1992. с.31-32.

4.Золотухин С.Н. Сравнительная профилактическая эффективность морганеялезного я поливаленного бактериофагов при яелудочно-кишечных ' заболеваниях поросят//Иутя повышения производства и резервы повышения качества сельскохозяйственной продукции// Тезисы докладов III паучпо-прадтической конференции молодых ученых и специалистов (экономна, механизация, агрономия, ветеринария). Оренбург, -1993, с. 116-117. ■ •

Ротапринт 24.01,94 г. Подписано в печать 21.01.94 г. ■Форма* бумаги 60х90*/1б Объем I п.л. Тирах 100 Заказ 30

Типография Московской ветеркяаргга?? академии имени К.И.Скрябияа ^

109472, Москва,: ул.Академика Скрябина, 23