Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Бактериофаги Morganella ... и их применение при желудочно-кишечных заболеваниях поросят

ШШСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА*РОССИИ МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ВЕТЕРИНАРНАЯ АКАДЕМИЯ ш.нки К. И. СКРЯБИНА

На правая рукописи

'' ' ЗОЛОТУХИН СЕРГЕИ НИКОЛАЕВ!«

БАКТЕРИОФАГИ МогйапаПа поп' '111 1" 1С! ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ Г,ЕЛУЛЭ1{НО-кШЕЧНЫХ : :ЮЛЕВ/ШЯХ ПОРОСЯТ

16.00.03. - ветеринарная глкрсбиология, пгрусогогил, эпизоотология, экология и иммунология

■•АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соисканио ученой степени кандидата ветэринарнын наук

МОСКВА -

19&4

Работа выполнена в Ульяновском сельскохозяйственном институте, во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринаркой санитария, гигиены и экология

Научный руководитель1 - доктор ветеринарных наук, профессор В.Я. Гашдаш

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук профессор В.А.Бурлакон "

кацдддат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Л.С.Кавру!

Ведущая'организация:,

Всероссийский научно-исследовательский иясниуг контроля, стандартизации п сертификации ветеринарных препаратов.

Защита состоится " а 1994 г.

в чао на заседании специализированного совета К-120.36.05-по прасуаденшз ученой степени кандидата наук б Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии имени К.Й. Скрябина (109472, Москва, ул. Академика Скрябина. 23, тел.: 377 - 93 - 83). ;

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии.

Автореферат разослан " ¿(п ■ ХкА*М , 1994 г.

' Ученый секретарь специализированного совета Федосеева Т.Н.

1. ОВДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуапьнпгтъ трим. Одной из основных причин гибели поросят-сосунов в специализированных свиноводческих комплексах являются желудочно-кишечные заболевания. В настоящее время благодаря работам отечественных и зарубежных исследователей установлено, что наряду с общепризнанными возбудителями инфекционной диареи новорожденных животных (энтеропатогенные серовары зшерихий, сальмонеллы, клостридии перфрингенсЗ важную роль в возникновении кишечных инфекций играют и другие микроорганизмы, в частности представители семейства Enterobacteriaceae, относящиеся к роду . Morganella (вид Horganella mor£anll3, значение которых ,в инфекционной патологии сельскохозяйственных животных до последнего • времени оставалось не выясненным.

Исследованиями Л.С. Каврука С1988) было установлено, что данные бактерии способны самостоятельно или в ассоциации с другими видами эhtgробагстерий вызывать тяжело протекающую с летальным исходом диарею у поросят-сосунов и новорожденных телят.

О широте распространения кишечных инфекций у молодняка сельскохозяйственных животных, протекающих с участием И. morganll, статистические данные отсутствуют, поскольку до 1992 года ветери-. нарные диагностические лаборатории не проводили исследование патологического . материала на наличие морганелл ввиду отсутствия в стране руководящих методических указаний. Последние были утверждены лишь в ноябре 1991 года С Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишэчной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными знтеробактериямиЭ.

Соответственно слошвшейся ситуации биологическая промышленность страны не изготовляет .специфическим средств профилактики и терапии заболеваний тавотных, вызываемых морганеллами, что в определенной степени сни^тазт эффективность мероприятий по борьбе с ки-. щечными инфекциями молодняка. Применение антибиотикоа и нитрофура-ноаых препаратов для лечения и профилактики желудочно-кикачных заболеваний новорожденных животных,в ряде случаев оказывается нздос-- .таточно эффективным. Это связано с возрастанием уровня устойчивости условно-патогенных микроорганизмов к. антибиотикам и разной чувствительностью к ним возбудителей болезней СА-М. Домброаская и др., 1986. 1989: Е.С. Воронин и др. 19893.

В связи с указанным большое значение имеет проблема изыскания активных фагов, обладающих высокой специфичностью по отношению к бактериям вида М. morgan 11, с целью терапии и профилактики диарейньи заболеваний. Преимуществом этих .средств является их безвредность даже в больших дозах, отсутствие побочных дей-■{-30 ■ •

ствий на организм' животньи С дисбактериоза, аллергических реакция, угнетения естественной резистентности оргачнэма). Поэт:) «у а условиях обычных н в особенности крупных свиноводческих козяйств Фаготерапия и фагопрофилактика далудочно-кмэечныч эабсиовашй поросят-сосунов приобретает большую актуальность для практики.

Ирпь и^г.грппвания, в имещейся литературе отсутствуют данные о биологических свойствах морганеллезных бактериолиза и их • применении при клшечньк инфекциях животных, протекающей с участием ¡¿органелл.

В связи с этим перед нами была поставлена цель изыскать специфический бактериофаг М. morganil и изучить возможность применения его для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний поросят-сосунов.

Задачи гисг-лвлпваний.

1. Изучить эпизоотическую обстановку в крупных свиноводческих хозяйствах зоны Среднего Поволжья и этиологическую роль М. morganil при желудочно-кишечных заболеваниях поро-сят-сойунов.

2. Выделить из патологического материала от больных диарэей поросят-сосунов и объектов внешней средь несколько штаммов • фагов М. morganil и провести их селекцию.

3. Изыскать штамм бактериофага с наиболее широким диапазоном -литической активности по отношению к эпизоотическим штаммам «органе л л и изучить его биологические свойства.

4. Определить оптимальные условия изготовления моргаяеллезно-го бактериофага и получить лабораторную партию этого препарата.

5. Изучить возможность использования приготадленного бактериофага для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний поросят-сосунов, отработать наиболее эффективные дозы и схему его применения.

Няучняя нпиичня Влервыэ в свиноводческих хозяйствах Ульяновской и Самарской областей проведены диагностические исследования с целью изучения этиологического значения М. morganil в инфекционной диареи поросят-сосунов. Получены новые данные о серологических группах морганелл, циркулируют.':: в обследуемых хозяйствах. Изучены биологические свойства выделенных штаммов морганелл.

Получен новый специфический лечебно-профилактический препарат - бактериофаг морганеллезный, изучены его свойства, оптимальные условия приготовления и разработана эффективная схема его применения.

Впервые в ветеринарной практике эффективно использовался бактериофаг И. morganil для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний у поросят-сссунав.

Пряктмчр^кяя чняииупг;-^ работ». На основании полученных экспериментальны« данных подтверждены сведения зарубежным и отечественный ученых об этиологической роли М. тогйапИ в инфекционной диареи поросят-сосунов. Установлена циркуляция .патогенных штаммов иорганелл в некоторых хозяйствах Ульяновской и Самарской областей при массовых желудочно-кишечных заболеваниях новорожденных поросят. Определена их чувствительность к антибиотикам и гомологичному бактериофагу. Предложен специфический лечебно-проймлактический препарат против желудочно-кишечных заболевания поросят-сосунов -бактериофаг моргаиеллезный. Разработана технология изготовления на опытную партию препарата и эффективные схемы его применения.

^прпрапия работу. Материалы диссертации представлялись:

- на научных конференциях профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов УСХИ СУльяновск, 1989, 1990. 1391. 1992. 1993 гг. 5:

_ на научно-техническом совете ветеринарного отдела областного управления сельского хозяйства Ульяновской области (Ульяновск, 19923: '

- на XII научно-практической конференции молодых ученых и специалистов С Оренбург, 1993).

Пу^пик-япии. По материалам диссертационной работы опубликовано 4 статьи.

ГУуурн и гтаук-тупя паР)птн- Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсувдения результатов, вызодов, практических предложений, списка литературы и приложения.

Работа иллюстрирована 16 таблицами и двумя схемами. Список использованной литературы включаот 159 источников, из них 46 иностранных авторов.

2. сое£твенше исследования

2.1 Материалы и методы

Работа выполнялась в период с 1987-1993 гг. на кафедре эпизоотологии, микробиологии и ветсанэкспвртизы Ульяновского сельско-' хозяйственного института, в лаборатории санитарноЯ микробиологии Всероссийского научно-исследовательского института ветсанитарии, гигиены и экологии, а также в свиноводческих комплексах Ульяновской и Самарской областей, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям поросят-сосунов.

Для исследований использовали питательный среды: мясо-пептон-

ный бульон, мясо-пептонньй» егар, бульон Хоттингера: cret1--: с мочевиной по Преусу, Фенилапанином, Симмонса, Плоски рева. Зядо. Клиг-лера, Кларка, Гисса с индикатором б ромкре эоловым пурпур: :ым С глюкоза. лактоза, мальтоза, сахароза, маннит, дульцит, салицин, сорбит), полужидкий агар, кровяной агар, содержащий 52 кэЗибрини-рованной крови барана,,мясо-пептонная желатина, пептонняя вода.

Реактивы: глицерин нейтральный, натрий хлористый, пара-дида-тиламинобензальдегид, соляная кислота, спирт этиловый 96*., . орто-ФосФорнэя кислота, мэтидрот.¿-нафтол, калия гидроокись, вазелиновое масло, физиологический раствор СрН 7,0-7,2), геншанвиолет, хинозол, фенол.

Набор нативных морганеллезнын егглютинирупаих серогрупповым сывороток С опытно-промшленная партия N1-8, изготовлены Грузинским биокомбинатом 4.08.89г.Э.

Оборудование: термостаты TC-80W-2: микроскопы НБИ-3: лупа Ом-нокулярная МБС-9: ультратермостаты УТ-15У4.2 и KL-4 СВенгрия): вакуумный" насос Mezmolnlce С Чехословакия): фильтры Зейта: егерида-зукшие пластины ССФ); центрифуга лабораторная 0ПН-8-4.2: холодильники бытовые: колбы мерные: пипетки пастеровские: пипетки мерные на 1,0, 2,0. 5:0 см : флаконы емкостью 50. 100, 200 см3: бутыли емкостьи 10 дмЗ. колбы Бунзена: стекла покровньн: стекла предметные: чашки ГТатри: пробирки: стандарты мутности на 0.5, 1.0 млрд. микробных клеток в 1 см*: шприцы: пинцеты: скальпели: ножницы: стекляные ампулы.

Животные: новорожденные поросята массой 1.0-1,5 кг в количестве 261 головы: белые мыши массой 15-16 Г в количестве 43 головы: кролики массой 2,5-3,0 кг в количестве 9 голов. , .

В качестве индикаторной культуры для выделения морганеллеэ-ных Фагов и изучения их свойств использовали штамм М. morßanli N 36/82 серологической группы 033, который был выделен старшим научным сотрудником ВНИЗСГЗ Л.С. Кавруком из Фекалий больного диареей поросенка и любезно нам предоставлен.

Для изучения диапазона литической активности и специфичности морганеллезных бактериофагов использовали 84 штамма морганелл, . из них 45 эталонных, разных серологических групп, 10 штаммов сальмонелл, 20 штаммов бактерий рода Proteus, 50 штаммов Е. coli и один штамм Pseudomonas aeruginosa. .

Ввиду отсутствия в период проведения работы руководящих методических указаний по диагностике М. norganli в патологическом материале от больных и павших животных бактериологические исследования фекалий больных диареей поросят-сосунов проводили согласно методике, предложенной JLC. Казруком С19863. Трупы поросят-сосунов, погибших от диареи, исследовали в соответствии с .яопствуишыи тог-

да методическими указаниями по бактериологической диагностике ко-либактериоза С эшерихоза) и сальмонеллеза сельскохозяйственных животных.

Видовую принадлежность микроорганизмов определяли в соответствии с рекомендациями, изложенными в IX издании Определителя бактерия Bergey's (1984) и руководстве "Знтеробактерии" (В.И.Покровский, . 1985). используя 20 биохимических тестов.

Серогрупповую принадлежность штаммов морганалл определяли в реакциях агглютинации с агглютинирующими моргаяеллезньми О-сыво-ротками согласно "Временного наставления по применению сывороток нативньи морганеллезных серогрупповых" (19883. Гемолитические свойства выделенных штаммов изучали на 5Х-ом кровяном МПБ с глюкозой.

Патогё'нные свойства определяли у штаммов М. morganll нетипи-руеиик'имешимсА набором агглютинирушин сывороток методом внут-рибрялинно го заражения белых мышей взвесью агаровых 18-ти часовых культур морганелл в дозе 500 млн. м. к.

Заршкение новорожденных поросят проводили взвесью 18-ти часовых культур И-morganll через рот в дозе 5 и 10 млрд. м. к. клеток.

Выделение, селокшю и изучение биологических свойств бактериофагов М. morSanll проводили по классическим методикам, описанным Dulbeeco. Vogt (1954), J. Craigle и A. Felix (1944), М. Ада,кои (1961). Д.М. Гольдфарбом (1961), В.И. Ганюшкиным (1988).

Серологические свойства морганеллезного £яга изучали в сравнении со стандартным Фагом Т2 E.coll В1255. !

Рехиш центрифугирования рассчитывали по методика Б.Ульяыса и К.Уилсона (1978). Все полученный цифровые данные обрабатывали иа-тематически по Г. Ф. Лакину (1980) с применением ьикро калькулятора "Электроника БЗ-34" и прикладных прографи к нему (А.Н. Шатков,

В. А. Епанечников, 1984). '

»

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Распространенность Moräanella norganll в неблагополучных по диарейным заболеваниям поросят свиноводческим хозяйствен и свойства выделенных шталмо.» морганелл

Игупйппяянкр пятпяпгичргк-пгп материяпя пт finльных—ГТИЯПЯЯЯ—U погибшим ппгтпгят-спсинпи на няпииия М. япг^япП. За период работы нами были проведены бактериологические исследования 58 проб Фекалий больных диареей, а также 176 проб внутренних органов и тканей от 22 трупов поросят-сосунов из 7 свиноводческих ферм и промывлеи-

Z-30

• ;¡

ных комплексов УльяновскЬп и Самарской областей. В гагл'льтатэ исследований в трек хозяйствах С 422) обнаружены морга Частота их выделения из проб фекалий больных животных данных хозяйств составляла 20-402 случаев. При бактериологическом исследовании 12 трупов поросят, принадлежавших одному из хозяйств, гда циркулировали шрганеллы, культуры этих бактерий были выделены из внутренних органов 9 поросят С752 случаев). Наиболее часто культуры мор-' ганелл приходилось выделять из пораженных участков толстого отдела кишечника - в б случаях С66,72), реже из тонкого отдела кишечника - в 3 случаях (33,32). Из крови сердца и печени культуры мор-ганелл были выделены от двух поросят (11,112). При исследовании патологического материала от 10 трупов поросят других хозяйств, морганеллы не были обнаружены как в фекалиях больных диареей, так и во внутренних органах и тканях погибших поросят.

У всех выделенных культур М. morganll изучали серогрупповую принадлежность, гемолитические свойства, патогенность, чувствительность к антибиотикам.

Г-рпо-ппгчиегкпй илрцтшЬикгапии подвергали культуры М. morganll. относящиеся по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам к роду Morganella. Из 19 культур было ти-пировано с помощью набора сывороток восьми серологических 0-групп (01. 016. 026. 029, 033. 045. 049. "13") 8 штаммов М. morganll. т."е. 42 2 культур- Из них три штамма принадлежали к серогруппе 01, три штамма - к 026. два штамма - к 016. Остальные одиннадцать штаммов, типированью широким набором агглютинирукцих морганеллез-ных сывороток в Московском научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова, были отнесены к серогруппам 09 - один штамм, 034, 024, 025, 041. 046 - по два штамма.

Изучений грцп-пмткиргким гипп^тв мппганелл показало, что 12 штаммов из 19 обладали гемолитическими свойствами (63,2 2), вызывая ярко выраженный бета-гемолиз эритроцитов барана.

Riinnrafiy на белых мышах проводили с 11-ю штаммами морганелл отнесенными наш к серогруппам 09. 024, 025. 034. 046, 041. Все изученные культуры обладали патогенными свойствами, вызывая гибель животных в течаняе 24-48 часов.

При иэуцрнии цудггтитр-.пънпгуш ппржрр.ыпр прнныу ттаммпд М. mnrganlt к 1А яцтипиптикям: пенициллину, тетрациклину, неомиимну, оксациялину, мономицину, полимексину. канймицину. ристомицину, ле-вшщщвтмну, гентамицину, ампициллину, стрептомицину, зритсошцину, линкомицину установлено, все 19 штаммов проявляли устойчивость к тетрациклину, оксашллину, полимексину, Ристомицийу, строптамици-ну, эритромицину, линкошиину. Восемь изолятов (42,1%) бмлл устойчивы ко всем 14 антибиотикам. К лавоыяцитину были чувствительны -

4, устойчивы 15 штаммов: к гентамицину - чувствительны 3 штампа, устойчивы - 16 и к: ампициллин/ устойчивы 15 штаммов, чувствительными оказались два штамма и два - умерешюустойчивыми. Из полученных результатов исследований видно, что ни один из изученных антибиотиков не обладал ингибирушхм действием по отношению к 5ольшинству штаммам названных микроорганизмов, ввиду чего, применение выше перечисленных препаратов в терапевтических дозах не ложет 'давать желаемого эффекта при желудочно-кишечных заболеваниях поросят, вызываемых моргалеллами или с их участием.

2.2.2. Экспериментальное заражение поросят-сосунов полевым штаммом Morganella womanll

Для изучения патогенное™ бактерий М. morganll и подтверждена их зтиопатогенегическоя роли при желудочно-кишечных заболева-|иях порссят-сосунов нами был проведен опыт экспериментального зажжения новорожденных поросят полевым штаммом М. morganll N5/1 К ■ерологическоп группы 024. Названный исолят выделен из тонкого отела кишечника поросенка, павшего с признаками диареи в возрасте i-x суток.

В опыте использовали 22 новорожденных поросенка от трех сви-оматок, которые были разделены на три группы. Поросят первой пытной группы С8 гол. от двух свиноматок) заражали через рот пустя 20 - 30 минут.посла рождения до приема молозива взвесью гаровой культуры М. morfianl 1 в дозе 10 млрд. м. к. Взвесь икроорганизмов готовили путем сшва 18-ти часовой культуры цорга-злл, со скошенного МПА стерильным физиологическим раствором. По-осят второп контрольной группы С 4 гол. от двух свиноматок) не заахали и содержали совнестно с -опытными животными. Животные ретьей группы в количестве 10 голов такта,были контрольными и со-зряались изолированно под одной свиноматкой.

Заболевание и гйбель 4 квотных С5СЮ первой группы наступи-D .yiaa в пераке два часа посла заражения с признаками отека легки. Оставшиеся в живых поросята опытной группы заболели на вто-да сутки с клиническими признака.») диареи и гибель их произегаяа-а 3-4 сутки после заражения.

Поросята второй группы, не зараиоинш, но содержавшиеся сов-" зстно с больными, заболели с признаками диареи.и погибли спустя -4 суток после проявления клинических признаков.

При бактериологическом исследовании всех певших животных из (утренних органов и тканей трупов выделены исходные культуру morganll серологической группы 024,

Результаты этих исследований свидетельствуют о том, .что в- не-

a Ss

ч.'

- у -

< ;>

которых неблагополучных то кглудочно-киизчнш заболездаг.ям, поросят хозяйствах циркулируют патогенные шта^гмы морганех/. способные вызывать у поросят тяжело протекашую кишечную инФекцил

2.2.3. Выдэление и изучение свойств морганеллезньп* Сагов

Выделение фагов .M.norffanli нами проводилось на культуре • М. morganli N 36/82, серологической группы 033. Материалом исследований являлись Фекальные массы от больных диареей поро-сят-сссунов и сточные воды канализации свинарников. Всего было выделено б штаммов Фагов, лизируших индикаторную культуру, которые мы условно обозначили Ml, М2, МЗ, М4. М5, Кб.

Для получения "чистых линий" Фагов и повышения их. литической активности выделенные Фаги пассировали на индикаторной культуре М. morganli 10-16 раз с периодичной отвивкой типичной для рассы негативной колонии. Все было селекционировано 5 линия фэ-гов М1, М4» М5, Мб, М7. '

ФаЬ Н7 был селекционирован путем клонирования из нетипичной, округлой и прозрачной колонии фага М5, диаметром 1 мм.

Селекционированные фаги М1, М4, Н5. Кб имели однородные ■ негативные колонии с небольшим различием в диаметре: М1 - 2-3 мм, М4 -1,5-2 мы, М5 - 1,5-2 мм, Мб - 1,5-2 мм. К? - 1 мм. Колонии округлые, прозрачные, без вторичного роста Фагорезистектных клеток индикаторной культуры.

Активность селекционированных Фагов М1, М4. Н5, Кб на плотной питательной среде по методу Грациа выражалась в пределах 8 « 108 - 2,3 * 109 корпускул в 1 см3, а по методу Аппелъивна 10-6 _ 1Q-8.

Гпрпцйиингцггт. и ^иягтлчпн лггниягк-пго лайптаия—ИППГЯНйЛЛРЯНКК fimrrpnunitemR- в результате изучения специфичности пята морганел-лезнш бактериофагов (М1, М4, М5, Мб, М7) по отношению ¡к 10 штаммам сальмонелл, 20 штаммам рода Proteus, 50 штаммам Е.со11 и одному ютамму Pseudomonas aeruginosa, ни один перечисленных фагов не лизировал культуры микроорганизмов гетерологичных родов.

При изучении диапазона литической активности 5 селекционированных фагов (Ml, М4, М5. Mo. М7) мы использовали восемь штаммов' М. irarßanll серологических групп 01, 016, 026. 033, 045, 049 и "13", которые в настоящее время признаны патогенными и используются для производства корганеллезных диагностических препаратов, Результаты опыта показали, что наиболее широким диапазоном ттичэо-кого действия по отношению к изучаешь культурам рбладаэт штамм Фага Мб. Из восьми штаммов М Eörgajiil ом .лиаировад'' семь. Vers:- Ml, М4, К5 проявляли одинаковую'литачаску» активность, 'шаг лизигяБали

по 6 штаммов морганелл. Наиболее узкий спектр литической активности был у Фага М7, который лиэировал только два штамма морганелл серогруп'п 033 и 026.

Из полученных результатов исследования видно, что селекционированные нами Фаги Mi, М4, М5, Кб, М7 обладают выраженной специфичностью по отношению к микроорганизмам рода Morganella и не активны к представителям других родов энтеробактерий, а также к роду Pseudomonas.

Лиапачпн литкчвруоП яктиднпстч бак-ляпмщТягя MR, В связи ' с тем, что для производства лечебно-профилактического препарата штамм Фага должен обладать широким диапазоном литической активности, нами были проведены дополнительные исследования на большем количестве штаммов морганелл. Для это'го мы использовали в опыте 84 полевых и эталонных штамма fL morgan И. Из сорока пяти эталонных штаммов 45 серологических.групп, лизировались фагом М5 двадцать шесть штампов С57,8 Z). Из 39 полевых штаммов фагочувствительныыи были 30 (75,9 Z).

Аналю результатов исследований показал, что бактериофаг М. RorSaníl Кб обладает широким диапазоном литической активности в отношении зпизоот г" ". '';' •. «о ¡.¡органе лл различных серологических групп, коте:;::' ¡стеаляи-т 7С.82. Корреляция между' принадлежностью иорганелл к йрологичосклй 0-rpyniie и чувствительностью к бактериофагу но проявлялась.

• Иммунпгрц№я pp.nftfTP"! 6n»rrpni<nifeara_Mnrganp. I i a_шпТапН МП.

Для изучения антигенных свойств бактериофага М. morgan 11 Мб нами было получено 180 см3 антифаговой сыворотки Фага Мб и 120 см3 Фага Т2 Е. coll . У полученных сывороток изучали .нейтрализуицую активность. для чего была определена константа скорости нейтрализации при взаимодействии антифаговой сыворотки с гомологичным и ге-терологичным бактериофагами. ,

Полученные наш антифаговые сыворотки фагов Мб и Т2 имели' следующую нейтрализующую активность с гомологичными Фагами: константу скорости нейтрализации СЮ у антисыворотки Фага Мб -24.67*2,5 мин-1, у антисыворотки фага Т2 - 29,02*1,55 мин-1. Антифаговая сыворотка Фага Мб проявляла выраженную нейтрализующую активность в титре 1:800, а сыворотка фага Т2 - в титра 1:1600. Реакция нейтрализации «Jaros Мб и Т2 с г^терологичными антисыворот-каш была отрицательна.

AnrnnfiimnHMvri гпптГшпсть itera Mfi на 6яктрпмяпт,нь!х_к.ПпТкак

■ятямцп изучали при взаимодействии - бактериофага с клетками М.тогйапП Ñ 36/82 серогруппы 033. Результату опытов показали, что поело 5-8 минут взаимодействия Фага с бактериями вырастало 13*1.45 негативн'»'^-ко-"они!*. что соответствовало адсорбции 74, ÍX, корпускул

фага. ГТо истечении 6-7 минут проведения опыта выросло 2+0,53 негативных колоний*.фага, то есть адсорбировалось 94,8 - 96,22 корпускул. В течении времени 7-12 минут фаг полностью адсорбировался на бактериальных клетках. В контрольных чашках находилось 54±1.76 негативных колоний фага. Константа скорости адсорбции фага Мб на бактериальных клетках штамма М. шогйапП М 36/82 находилась 6 пределах К = 0,9-1,2» 10-9 смЗ/мин-1.

.Латентный пяриол внутришеточнпгп развития и. урожайность мпр^ тнрп пяпирт Дигя Ш нами изучались в стандартных условиях при температуре 37- С в МПБ на индикаторной культуре М. тогЕатП N 36/82 серологической группы 033.

Латентный период развития фага И. шогйапП N3 при взаимодействии с гомологичными бактериями в мясо-пептонном бульона при 37-С был равен 21-22 минут, а период роста продолжался 9-10 минут. Уро- • жадность морганеллезного фага Мб на клетках И. тог2ы:и1 ЫЗо/82 230 корпускул на одну инфицированную бактериальную клетку.

Таким образом селекционированный нами фаг Мб М. гсогСапП ¡¿а- . растеризуется выраженными показателями взаимодействия фага с клеткой : активной адсорбцией; коротким • латентным периодом, высокой урожайностью. .

Трпмпрегистрнтнпгтъ бактяпцгнГигя МЯ и ияуцянип_ОПЗ_ЛЙТИЧЙС-

кпй ак-тцрнп^ти при Для изучения устойчивости бактериофа-

га к прогреванию мы исследовали Фаг с титром 2*109 корпускул/с)Р, который прогревали в ультратермост^те при разных температурных режимах от 59 до 82" С с интервалом 2-3- С.

Получении данные о выраженной устойчивости бактериофага Кб к воздействию высокой температуры. При нагревании фага от 59 до 65" С снижение титра последнего не происходило. Нижний порог териоинакти-ваши морганеллезного Фага Мб составил 66-67"С. При последу идем повышении температуры среды титр фага заметно понижался. В одном см фага было 5-8 бляшкообразуших корпускул. При температуре 76"С и выше негативные колонии Фага не обнаруживались, 11о нашим данным, верхний порог термоинактивации бактериофага Мб выражался в пределах 75-76-С.

Изменение литической активности селекционированного бактериофага Мб М. тогйапП нами изучалось при хранении препарата в течении 14 месяцев в условиях холодильника при 2-4*С. Литичаския титр фага определяли по методу Граша после приготовления, через шесть месяцев, через год и по истечении 14 месяцев. В наших исследованиях литический титр свежеприготовленного Фага был равен 8x103 ко-рускул фага в 1 см3. По истечении восьми месяцев он составил 3*10?. по истечении 12 месяцев -9м 108, по истечении 14 месяцев - 2«108 корпускул Фага/см3. Таким образом, результаты наших иссле-

дований позволяют использовать Фаг Мб для работы в течение 12 месяцев при условии хранения при 2-А- С.

Совокупность полученных результатов при изучении биологических свойств морганеллезного бактериофага Мб позволяет использовать названный штамм Фага для производства лечебно-профнлактичпе-кого препарата.

2.2.4. Изготовление морганеллезного лечебно-профилактического бактериофага

Морганелезный бактериофаг для проведения опытов изготовляли в бутылях емкостью 10 литров в МТБ (pH 7,4-7.6). куда засевали маточный бактериофаг и индикаторную культуру М.morganll. Засеянную среду инкубировали при 36-37" С в течение 5-6 часов. Через 3-4 часа наступало помутнение КГБ, а через 5-6 часов лизис бактерий. В качества кореэнвантов использовали 2-Х раствор хинозола С 5 см^ на 1 литр среды) и 5-Х раствор Фенола С50 сир на 1 литр Фага). Удаление нелизированнык бактерия проводили путем фильтрования Фаголиза-та через сторилмзупцие п."-:станн Зеятил. Приготовленный бактериофаг проверяли на стерильж б?:* ~чд:;оеть и литическую активность.

Всего наш было пригсшалено две серии фага по ' 10 литров. Препарат был соломенно-телтого цвета, прозрачный, стерильный и безвредный. Литмческий татр по Аппельману составлял 10-'<\

Результаты контроля двух серий Фага позволили применять его для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний поросят, вызванных морганеллами.

2.2. 5. Результаты опытов по Фаготерапии и фагопрофилактике желудочно-кишечных заболеваний поросят-сосунов

Для изучения возможности использования селекционированного нами изолята морганеллезного Фага Мб для лечения и профилактики диареи у новорожденных поросят нами были проведены следукшие опыты: чистый опыт по изучению профилактического действия морганеллезного бактериофага при экспериментальной инфекции поросят, вызванной полевым штаммом М. morganll N 5/1: опыт по изучению профилактического действия морганеллезного бактериофага в хозяйственных условиях: опыт по изучению лечебного действия бактериофага М.morganll в условиях хозяйства при естественном заболевании, поросят диареей. »

При постановке опытов в условиях производства мы руководствовались литературными данными и результатами собственных исследова-

ний, свидетельствующих о том. что морганелли способны вызывать же-^З/дочно-кишзчнш заболевания как самостоятельно, так и в ассоциации с другими патогенными энтеробактериями. Поэтому, кроме гомологичного морганеллезного Фага, нами были использованы протейный, клебсиеллезный и колибактериозный бактериофаги. Морганеллезный фаг бьш получен нами в лаборатории кафедры; протейный н клеосиеллеэ-Ный бактериофаги были изготовлены на Омутинской опытно-производственной базе ПО "Восток": бактериофаг против колибактериоза изготовлен на Приволжской биофабрике.

ПтйшактичЕСкая ■чДйРггипнпгтг)_щрганпллпзнпгп бактериофага

при зкгпявиыпнтапьнсш яапажянии лпрпсят-уостнпв. В опыте использовали три группы поросят в количестве 31 гол. от трех свиноматок. Поросятам первой группы, в количестве 11 гол., черзз час после •рождения выпаивали морганеллезный бактериофаг в доза 5 см3, а через 12 час. повторно вводили его в той же дозе. Спустя сутки после рождения проводили заражение животньи 18-ти часовой озьесыо культуры М. morganll в дозе 5 млрд. ы.к. Заражнным поросятам вводили тот ш Фаг в течение. 3 суток.

• Поросят второй группы в количестве' 10 гол. заражали по вышеописанной методике, но бактериофаг ш не применяли.

' Животные третьей группы в количестве 10 поросят ' были, контрольными Снезараженными) и бактериофаг но получали. Опытные и контрольные животные содержались изолированно под ежедневным наблюдением .в течение 14 сут. ,

В нашем опыте у животных первой и третьей группы заболевание не отмечалось и сохранность их к 14-му дню жизни составляла 100%. Из 10 поросят второй группы заболело с признаками диареи 7, из них пало 3 гол.

Из крови сердца, образцов легких, печени, селезенки, а У од- • ного поросенка еще из головного мозга погибших животных были выделены чистые культуры исходного штамма И. morganll серологической' группы 024. ,

. R ппьгто itinmnrirnTiH.nflK-THKU мялуппинп-КИЦ-ячн»^ -заболеваний ГЮСй-

рят R ус ПППИЯУ ипчдагткя использовали пять •групп поросят в коли- , чэстве 148 голов в возрасте двух суток. Животным первой- С опытной) группы, в количестве 33 гол. выпаивали моновалентный шрганвллеэ-ньй бактериофаг на 2, 3, 4, 9, 10 и 11 дни после рождения в дозе 5 сма один раз в сутки. Через пять суток после последней дачи бактериофага у 20 поросят исследовали Фекалии на наличие М. morganll. Поросята второй группы в количестве 35 гол., получали по аналогичной методике трехвалентный бактериофаг Сморганеллезный. протейный, клебсиеллезный). который готовили путем смешивания моновалентных фагов в равной пропорции и выпаивали животным в дозе 15 cvß. Жи-

: вотным третьей группы С33 гол.О выпаивали двухвалентный бактериофаг Спротейный и клебсиеллезный) в дозе 10 см . Поросят четвертой группы (20. гол.) обрабатывали Трехвалентным бактериофагом Сморга-неллезным. протейным и колибактериозным), 30 поросят пятой группы были контрольные и бактериофаг не получали. В результате опыта из 33-х поросят первой группы заболело 7 (23,3%). пало два поросенка: один с признаками гастроэнтероколита, другой - с травматическими повреждениями головы. При бактериологическом исследовании органов и тканей погибших поросят культура N. тогеапИ не была выделена. Не удалось также выделить культуры этих бактерий из 20 проб Фекалий животных, получавших фаг. Из 35 поросят второй группы заболе- ' ло 6 (17,IX) и пал один поросенок, у которого при бактериологическом исследовании патматериалов культуру М. шогбапП не выделяли. • Из числа животных третьей группы в количестве 33 поросят заболело 12 С38,1%) и пало 6. При бактериологическом исследовании трупов этих поросят из внутренних органов были, выделены культуры М. тогеап11. Из 20 животных четвертой группы заболел в легкой Форме один поросенок, у которого чср?з сутки признаки расстройства желудочно-кишечного траста'прекратились. 'Лз 30 поросят пятой контрольной группы заболело 13 : ",32) пало 5 гол. Из. внутренних органов и , тканей трен тг; ..о в нами были выделены культуры М. тогйапП. При бактериологических исследованиях 20 проб фекалий животных этой группы культуры М. шо'гйап11 удалось выделить у 4 поросят (202).

Игттльзпвянцр илпгянрппрчнпт йяга НЯ пля_тйпяпим жрлупоч-■

нп-кипк>цныч дяЯп.пряяниа ппрпрят, в производственном опыте по испытанию бактериофага с терапевтической целью мы использовали три группы поросят больных диареей в возрасте 2-3 сут. по 20 голов, в каждой. У всех животных в первый день опыта отмечалось расстройство ¡яелудочно-кишечного тракта. Испра-^нения были жидкие со слизью, водянистой консистенции, аппетит сохранен, животные сохраняли подвижность. Температура тела в пределах 39,5*0,6* С. Животным первой группы выпаивали;моновалентный морганеллезньШ бактериог фаг в доза 5.0 см11 два раза в сутки ежедневно на протяжении 3-6 дней до исчезновения клинических признаков болезни.: Животных второй группы обрабатывали смесью морганеллезного, протейного и коли-бактериозного бактериофагов. Фаги смешивали в равных пропорциях и выпаивали поросятам два раза в,сутки по 15 см смеси в течение 3-6 суток. Поросят третьей группы лечили по бхеме, применяемой . в' хозяйстве с помощью антибиотика стрептонамида. выпускаемого Буин- " ской производствейной лабораторией 7АССР.

-'*' Из 20 нивотнкх первой группы'пало 5 поросят (25%). Средняя . продолжительность болезни составляла 4,3 суток. Из . 20-ти поросят -

второй группы, для лечения который применяли трехвалентный (закте-(руофаг, пало два поросенка (10%) на второй и четвертый день проведения опыта. Продолжительность болезни в среднем составила 2,9 суток. Из 20 животных третьей группы (контрольной) пало 8 гол. (40%). Средняя продолжительность болезни равнялась 5 с у т.

Результаты проведенных опытов показали, что наибольшей эффективностью обладал трехвалентный бактериофаг, который мы рекомендуем применять для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний поросят-сосунов.

'вывода

1. Результаты исследований по изучении распростаренности >f. morßanli в неблагополучных, по желудочно-кишечным • заболеваниям поросят-сосунов свиноводческих хозяйствах Ульяновской и Самарской■ областей, свидетельствуют о циркуляции в некоторых из них патогенных штаммов моргзнелл. Из семи обследованных хозяйств М.morganll

• были"обнаружены в трех..Частота обнаружения названных бактерий в Фекалиях больных диареей поросят была в.пределах 20-40%. Из патологического материала погибших в неблагополучных хозяйствах поросят бактерии рода Marganella выделяли в 75Х случаев.

2. Получены данные о серологических группах шрганелл,' циркулирующих в обследованных хозяйствах. 8 штаммов Morganella morganll из 19 (43%) были типированы с помощью набора диагностических мор-■ ганеллезных сывороток, применяемых, для идентификации, возбудителей смешанной кишечной инфекции молодняка сельскохозяйственных хсивот-ных и были отнесены |с серо группам 01, 016 и 026. 11 штаммов принадлежали к серогруппам 09, 024. 025,'034. 041, 046 и обладали па-то генными свойствами, вызывая гибель белых мышей при внутрибршин-ном заражении в дозе 500 млн.м. к.. Большинство изученных штаммов (63,2%) вырабатывали гемотоксин и вызывали геыолиз эритроцитов барана.

3. Подтверждена зтиопатогенетическая роль ыорганелл при желудочно-кишечных заболеваниях поросят-сосунов. Экспериментальное заражение поросят до приема молозива взвесью агаровой культуры шрганелл в дозе 10 млрд. м. к. вызывало заболевание и гибель 100 X опытных, животных. Установлена возможность естественного заражения и заболевания новорожденных поросят диареей с летальным исходом при контакте их с больными искуственно зараженными животными. При бактериологическом исследовании из ■патологического материала у всех трупов погибших животных выделяли Morganella morganll в чистой культуре или в ассоциации с E.coli. Proteus vulgaris и Proteus mlr^bllls.

Л. Низкая эффективность аятибиотакотерапии яси смэшанной' кишечной инфекции поросят, протекающей с участием М.тогКапЦ. обусловлена .резистентностью преобладавшего числа штаммов мсрганелл ко многим антибиотикам. При изучении чувствительности 19 полевых шта-агав морганелл к 14 антибиотикам выраженной активностью обладали девомицитин - в отношении четырех штаммов С 212), гентамишн

в отношении трех штаммов С15.8%) и ампициллин - в отношении двух штаммов С10,5%). Все штаммы были умеренно устойчивы или устойчивы к другим антибиотикам С пенициллину, тетрациклину, оксацилину, по-лимексину, стрептомицину-, эритромицину, линкомииину, ристомицинуЗ. '

5. Изучение литической активности „ специфичности и спектра литической активности семи выделенных морганеллезных бактериофагов позволило отобрать активный клон фага Мб, который пригоден для производства лечебно-проФилактического препарата и отвечает требованиям. предъявляемым к производственным штампам. Он имеет выра-. женную скорость адсорбции К » 0.9 - 1,2 * 10 а/ /мин"' . короткий латентный период внутриклеточного развития - 21-22 минуты, высокую урожайность - 230 Фаговых частиц из одной микробной клетки, широкий спектр литической активности в отношении многих патогенных штатов морганелл (7в,4Ю и выразкзнную специфичность. Фаг устойчив к прогреванию при СО" С и сохраняет логическую активность в течение 12 месяцев.

6. Бактериофаг Могбаче* * .пог^. КЗ обладает антигенной активностью и по серологичвскл свойстес:,! из гомологичен стандартному фагу, Т2 E-coll. с котором не дает перекрестной реакции. Константа скорости нейтрализации антифаговой сыворотки гомологичной Фагу выражалась в пределах 24+2,98 мин-1.

7. Установлена высокая профилактическая эффективность бактериофага при экспериментальной морганеллезной инфекции поросят. Двукратная обработка новорожденных животных бактериофагом до заражения и последующее выпаивание его- в течение трех дней предохранят ло поросят от заболевания на 100%, тогда как в контрольной группе заболело семь поросят из числа десяти (70%) и погибло три (30%).

8. Применение морганеллезного бактериофага в производственных условиях с профилактической целью снижало заболеваемость поросят диареей на 22, IX по сравнению с контрольными животными, не получавших фаг.' Лечебная эффективность Фага составляла 75%,. тогда как эФФект антибиотикотерапии не превышал 60 %. Применение морганеллезного бактериофага в сочетании с коли-протейным фагом повышало профилактическую эффективность на 38.3%, а лечебную - на 30% по сравненю с животными контрольных групп. У обработанных -фагом больных поросят продолжительность болезни сокращалась в два ,раза. • Профилактическая обработка здоровых новорожденных поросят специфи-

рганеллезнш бактериофагом предотвращало носятельство мор- . г.~ г кишечнике животных. .

■ Сведения: о практическом использовании получениях автором научных внводов: 1.Ддя изготовления специфического лечебно-профилактического . препарата против даарейных заболеваний; поросят-оосуно? предлокен штамм бактериофага Уб, получение которого проводят согласно "Временной инструкции по изготовлекию и контролю опытной серии морганеллез-ного лечебно-профилактического бактериофага против желудочно-кишечных-заболеваний поросят"( утвервдена ректором Ульяновского сельскохозяйственного института, 15.07:1992). •

2.Предлояено использовать дал лечения и профилактики лелудочно- , кишечных заболеваний поросят, вызываемых морганеллами ила протекающих с их участием, юрганеллезный лечебно-профилактически.^ бактериофаг' в сочетании с коли-лрогейнши бактериофагами, которш следует применять.согласно "Временного наставления по применению моргаяел-лезного лечебно-профилактического бактериофага прошв яаяудочно-ка-шечных заболеваний поросят"(утварвдгяо Научно-техническим советом ветеринаррого отдела Ульяновской-области б;07.1992).

3.Результаты диагностических исследований, а такае опытов по фаготерапии и фагопрофилактике желудочно-кишечных заболваний поросят, полученные в работе, используются в процессе обучения студентов ветеринарных факультетов Ульяновского и Оренбургского сельскохозяйственных институтов.

Рекомендашш по использованию научных, выводов. '

При проведении лабораторной диагностики -патологического материала на кишечные инфекции поросят-сосунов необходимо учитывать помимо' известных серогрупп М. тсг^яыС . вызывающих заболевания у сельскохозяйственных животных, патогенные штамма морганелл, относящиеся к другим серогруплам- 09, 024, 034. Ъ41, 046, которае циркулируют на свиноводческих фермах. ...

Список работ, опубликованных до теме диссертации.

I.Золотухин С.Н. Выделение бактериофага 1А/. тег^а^и а изучение его литической активности// Вопросы ветеринарной микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Ульяновск. 1990,. с.67-70.

., 2. Ганшкин В.Я., Золотухин С.Н. Выделение фагов микроорганизма Л!, ыог-^айъ . аз бяомагериала от больных диареей поросят, субстратов окружающей средь и их. литическая акаивность// Аграрная наука в условиях многообразия форм общественной собственности и регионального хозрасчета/ Тезисы, докладов научной конферен-

цин профессорско-преподавательского состава,.научных сотрудников и аспирантов 7СХИ. Ульяновск, 1990, с.37-38.

З.Золтухна С.Н.\ Ганкшин В.Я. Лечабно-профалактаческоо действие бактериофага пра экспериментальном'заражении поросят ЛЛсгс/сщеВЬ Шог^апЦ. //Экояогнчзскне проблемы сельскохозяйственного про- • , нэводства/.Тезясы докладов научной конференции профоссорско-препо-далательского состава, научных сотрудников и аспирантов УСХИ, Ульяновск, 1992, с.31-32. •

. 4.Золотухин С.Н. Сравнительная профалактачэская эффективность моргай аялеэного я.поливаленного бактериофагов при яалудочно-кшпечяшс '• заболеваниях лоросят//Нута повшенпя нртазгодстаа и резерзы повше-ш качества сельскохозяйственной продукций// Тезисы докладов XII научно-пракгаческоЭ конференция молодых ученых а специалистов (экономка, механизация, агроногая, вэтергаарзя). Оренбург, -1993, с. 116-117.

• ■ - I

Ротапринт 24.01.94 г. Подписано в печаль 2I.QI.94 г. •Формат бумаги бОхЭО1/^ Объем I п. л.- Хирал 100 Заказ 30

. Типография Московской ветеринарной академии имени К.И.Скрябина ^

109472, Москва,: ул.Академика Скрябина, 23