Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Анализ гликопротеидов вируса гриппа А птиц и усовершенствование средств диагностики

РГ5 ОД

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК (РАСХН)

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО- ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ (ВНИИВВиМ)

УДК 619:576.858:616.921. 5:616-079.4 :636.52.59

СУРГУЧЕВА Ирина Михайловна

АНАЛИЗ ГЛИКОПРОТЕИДОВ ВИРУСА ГРИППА А ПТИЦ И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология,

На правах рукописи

эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Покров — 1991

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник С. Ф. ЧЕВЕЛЕВ

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Н.А.ВЛАСОВ.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор ветеринарных наук, профессор ЛАГУТКИН Н. А. (ВНИИВВиМ).

кандидат ветеринарных наук СМОЛЕНСКИЙ > В. И. (ВГНИИКСС).

Ведущее учреждение: Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии.

Защита диссертации состоится « ¥ 1991 г.

в часов на заседании Специализировашюго Совета

Д 120.61.01. во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120, Владимирская обл., г. Покров-ВНИИВВиМ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВВиМ.

Автореферат разослан «1994 г.

Ученый секретарь '

Специализированного Совета

кандидат ветеринарных' наук Г.П.Федоров

ВВЕДЕНИЕ

А1туаяьпость тейв.

Ортомяссоварусы рвспространвны в природе чроавмт5»вароко« №« а плане географическом, т к а плане круга хвзев» паруса. Заявость их настолько велика дла гумаяптаряой о встсрчь^гой ио-1ддяни, а сама вирусы настолько ватар«сни своей! аяти-' ' япоЛ а гэ-аетвческоа структурой, «о вирус гриппа стал одиоЗ ;;э ввябояао засто пстрачавяахся моделей а псследованиях во егшувалогва. коло-гулярыоа биология я гдябтик^• Однако Лол&сшютбэ ео~

гучаагасс даявих в а настоящее ерокя стиосптся к агютсаа гравза 1еяовек&.

Млогочнслгшило псследопаяяя спадлтальствуз? о поойичаЛаоЛ :аособноста паруса вменять алтигепвуп структур? я бсодогзчесваа гэойстпа своях аоверхаоствнг гяякопротеияов а кроцосса цяреудя-1аа. Хар£ятеряо& чертой еовреневвгес эиялеатвЗ григгяз является эоэяозшость одповревевной циркуляция вп пготвзепяа одного а того 1а периода а одном я том яе ареала хоаяава квевольгзх аагяаятоа шруса гриппа, разянчаащяхея по аптигеипоа спеияФачаоств гяпаоа-мэтеидоп. Выделение парусов гриппа с наобычшаа алтвгопигка а 6л-»логачосяимя признаками■ выявление Езалмоспазз паяду апзусаап ио-юпядсмяческого периода с созбуяатсляма аоследуасзх впзяешга •рнпса придаст вааиость постоянному жонтролз за, цяргуляяаза вз->усоа н анализов изучения возбудителей гриппа А втая.

Изучение вярусов гриппа гапотпых я пгяц а согсостазяопио Полуниных данных между собой а с дайвымя во аврус а* гриппа человека

- г -

способствуем одаадеигв обачкдля ортомньсовирусов эаковоиервосте в вкест сшосштельвта цзяиость как научение эконсжическн ьааао болеалц втна, что в определило выбор темы и направление ясследо В8ЯЫ& • '

Цель работ: изучевиа гявковротендов вирусов гриппа А пткц в

разработка подходов для усовершенствования средств диагностики типироваиия варуса.

Два достваевая этой пели перед ванн биде поставлены еяекуг. задачи:

- изучать гетерогенность свойств глиеосротоидов вирусч грасва птиц о определить вогшогшость их использования в качестве варке] водтявовоЗ вривадлепиости;

- получить спедаФичесЕие поликлоналышв сыворотки с вару< rpssisa A eras с рагяишыгш актигенники йоркулаки и пркготоекть кх осисае сясfesar дяа кдевткЗякацви стаикоп во типу NA (иейракиш вы);

- совучить НА (ковокяовальгшв антитела) к глзеспратевдан dui са грслса в изучить ах свойства в серологических реакциях;

- провеет» отбор НА» срягодкю яяа подтипавой с с-гаммоспет «ескоЗ вдовтлбаквакв QA {гекаггдагеивие) вируса грипел птиц;

- научить а сравнительной асвектс быодогычеевца ейайстьа агак: вирусе грщии xrctosxt ииенящхсс В креее втааков ВШШВВиК;

- вэучкть автигеивув структуру НА в НА вируса гриппа пткц. Bayvsos воонэвь работи оаклачьется в ток, что. получены новые

д&вше со едткгенаов ' структуре вируса гриппа А птвц. Построй частичная апитовнао карта области НА НЗ я В6, непосредственно bp имагвюаеВ к сайтац соязывansa рецепторов эрвтроавтоа. Покизьио, ч 1 ва субиодоауддрвон уровне материальной основой подразделения НА

автигеввив подтипы ыовет быть КАК ВМШЧВ& об^КХ ftSTKFfiStOSC двтврих* вант, варяду с перекрестцореаги^уввдшв вяутря повтвпа. tsb в только нескольких перфкрестнореагврувяах детерионввт. Доказана аракеап-мость ДАС-ИФА яда тяпироцоива вярусов гриппа А сгия в» ге*аггл«тв-ннв&и.

Практическая ценность.

Получен диагностический вабор для идепти5якаяви IIA стакиоо вируса гриппа А птяц. Набор провея еоккссвовпуз вяробааиэ t соот-ветствупдие методические ргЕоиеияацип утперядева директории института

Разработан метод типнрсоаяиа птаинов вируса гриппа со геиагглз-тянннан на осяове НА я ДАС-ИФА.

Разработан кеъ-од типиоозяная специфических снаоротоБ х вирусам гриппа А в тип на ociiosu НА.

Разработан иетод обягруяякгя варусоп грияяа А птид а снесях, вклвчавцих различима во актигенвой структуре еггаякы aá оснопа НА.

Приготовлены IIA в Н1. ПЗ в П13 вируса гриппа А.

Пслозепил, тагпоевкыэ ва оакиту.

Даивав во «оучеяпя гзтерггеяпосгн а2?к?зкоств НА н SA й г.х *ег>-

НОСТвбвЯЬНОСТП, УСТОЙЧИВОСТИ С ЕЗЙСТВЯЭ ДСТСРГСЯТОЗ» £0Sb5«3f.«T tso-

боемовность использоиепия этих Фепотнвачссвсх иряпиагоа а вачесува яодтиповых KapsepoB вируса гряапа А птиц.

Материальной основой форкиропаквя антигенного яоитвса гемаггяя-тививов as индивидуальных форн ПА ¿трусов разлячних станков «окот быть как паличне обеих для acero водтива аятнгангшх детеркаяавт а большой докеие НА наряду с несксдькнна перекреетвореогарувкяки детерминантами, так и только нескольких перекрестаорсагпрувгих детер-

кияаат.

Гезульгйтивзучеиияаитигеняого родства исгду итак«айв вируса rpaana А птиц с лятигенншш форяулани Н6Ы2 и K31J3 в частячшмв эпа-^оппыв Еортыбольаога вовека НАЗ 8 HAG вокаа&ли иалачие как нивкмум пяти антигенных детернкнакт, антителе к которым активна в тормовя-внн геяагглитанзднн.

ДАС-ИФА на основе НА к НА применима для:

- подтиповой идентификации штаммоо Енруса гриппа А стнц по геиахг-л&тнвинам«

- Врооедениа диагностических исследований с цельв обнаружения спе-Янфнчшя s Подтип? аятител а сыворотках рахонпалесаентоо,

- еОкаруаемяя и идектяЗнкацни содтнпоа НА при пяркуляции штаммов, содср&шнх едянстианаий подтип НА» и снеяанцых пирусимк поауля-иип« вкдачдваах Еарааити с различными подтвпаин НА.

Ашюбацид работы. Предсаритель.чая ааробачия результатов эак-лзчалась. с из es ¿стачлеийв в пиде докладе ва конференциях БПШШВаМ в 1939 и 1902 г.. совещаниях сотрудников ВНИИВВиМ от 24.05.94

Пуйяикедза. Освоение материалы диссертации опубликованы в иа-до сон» oésanmx работ.

Ойъо* и структура диссортачаи.

Дяссертшхяя вкдвэает 108 страниц иояиноонсного текста, 21 таблиц?. 1 ркетвков« саксов цитированной литературы ва 254 источ-вгшов я српловевая se двух вистах. Диссертация оформлена по тра-

дишювпону плаву я содержит: Саасой сокращения,, Впсдеппо» Обаор литературы с заалэчеипеп, Собственные исследования»,еостояяяв вэ разделов Материала и метода и Результаты» ОЗсугдйапя. Выводов, Практических предлояений, Спасга цитированной ляторатури и Прпло-зенвя.

СОБСТВЕВШЕ ЙГСЛНДОВАШШ ИАТЕИШЦ И HKTtOJM Материалы

Вирусы гриппа А и парамаксовнрусы птяц: A/duck/Alberta/71/ (Н1Н1): A/duck/Ceraany/1215/73 {H2N3); А/утка/Усрагяа/1/еЗ НШГЗ): Л/dcck/ Czechoalovakia/56 <Н4Я8); A/tem/S<roth Afrika/60 (П5ПЗ); A/duoк/ Masaachuaeta/ßS Ш5Я2>; A/FPV/Dutch/27 (117117 Js A/turbiy/estario/ SU3/63 {ПЗГЖ; A/turboy/yiabonsln/6Q (ПСМ2>; A/fo»l/Ca!rssaal/H/43 (H10N7): A/duck/Ensland/56 СНПМЭ); A/duch/Albarta/ÖO/7tJ (Ш2П9): А/чарноголопий хохотуя/Астраданъ/1421/70 (¡I13li2); А/ауззда/Лгпзяа-бадскаа/77 (H1N1): А/курияа/ПролетарсспЯ/79 ШШ1); A/eyptisa/Seaa-вев/71 (H3N8); А/курйпа/Калн4орнпя/72 (НЗНЗ); А/курпя9/£&яэта/71 III6N2 5; А/курица/Квяяра/71 (I16JJ2); А/курияа/Озагюяал tSJA/71 (H8N21: А/курнпа/Брониппы 11ВА/71 (П6!Ш; А/вугзаа/Еропата» ГП2П/71 (CG.42); А/куриаа/ЗаоЕсяпО/71 (Ц6Л2); А/курач«г/Пп®аао/71 (QSH21; А/курица/Паякопо/71 (H6U2); А/куряаз/ОпсраяжО' ГП53/71 (ПСМЗ): PMV-1 /HDV/ "La Sota" niV-2 /Chich/California/Tncaipa/SS Куроны« эибрнови. Для освозенаа втйкноа еярус» грзлза птва я aa-«оплопал вяруссодерхаяел дллаигояспой аадкоств исподьвозад» 0-11 дневные курипыв элбрпоны.

Животные. В работе использовала кыяев ВАЬВ/с 3-4 недельного возраста; взрослых ропавянх самок киз«в лияив BALB/o; белых бесвород-

еда. юшев ««всоб 20-26 г: петухов кассой 2-3 кг; сролвсов кассой

3-4 кг. .■:■•/•■■■;■■■■■

Культуры «ютов. Яд* получения гвбрвдок нсаодьаовали культуру «теток «ведомы «паю 2/0 - Ак14 Л •. де+ектнув во геиу гвпо*сев-твв-гудаян~0оа4оркбоаилтрансферагы (ГТФРТ). Вял щюдедовк« ИЯФА ящюлмовшт всровмваемур культуру клеток ПСГК. повученнуе на лаборатории культкввровавка клеток к органов с куаеен клеточных атоккоа ВННИВВяН.

Методы

РТА и РТГА етааш» викронетодои с 0.5К сусоенвней куриных арвтропвтар. в шицщетах дая никротитровакия с У-образныия лункаки. ГТГА вщюпвши с 8 генаггдвтннврувжиия единицами (ГАК) антигена.

Вирусы накапливали а аллантоисной полости 10-дкевша куриных ВхбрВОВОЗ

• .днФФеревцн&лы»ых центрифугированием в

очвяадя р окве&вон градиенте 40-60* Сахаровы.

ТвРКостабмяьиость геиагглвтниина проверяли вослс врогреааидя варуссоаервавей аддантоисвой вадкости в водяной бане при 56°С в 60*С в течваке 30 иинут, 1 часа, 2> 3 я 4 часов. После прогреваем пробе аштсл тюпкммиж в ГГА.

Освобождаю* «ваорото* от нос&вияфяческях ингибиторов прово-дядв орогревзджвм сря 56° С в течение 30 кинут и обработкой #иль-траток вворамииидазы веходвриого вибриона (ВОЮ. ввготовлеииым Горьсоаосвк научно-исследовательским институток алждеииояогви к кикрсбиологив согласно прилагаемой инструкции.

Гивервюеуавые сшюроткв кроликов к »талонных вирусам гриппа впш дооучаш путей вмкувяаодяя кроликов очиееиным ковцеитриро-

"7 -

ваняиын вирусом грппва птиц.

Нейранннкдаонуо активность вируса гриппа определяли твабарби-туровым методой, постандартной методике Aninoff (1051), усовер-аеиствоваияой Ayaard-Henry H.et al. (1973) Я H«C.Парамоновой, Д.Б. Голубевых (1375), используя в качества субстрата овомупнн. который получали во методу A. Cotschalk and P.R.Lind (1949) пля фету-ин.

Избирательную адсорбции аятител осудествлялк со катоду, опнсанноку Б.Х. Кукатопой (1072) и ИЛЬ Исн&йловой (1S34).

Для нннунизации в получения асцитической андЕссти использовали иызой линии EALB/c 3-4 кедельлого возраста.

Клонирование гибридных клеток проводили а полуяидком агаре по методу J.V. CoodinE (1080).

Выделение MA проводили методой солэзой преципитации взсыиен-вык раствором сульфата натрия с последугяеа aii}iinnoft хроматогра-фйей на Trotein А - Sepharose 4В (Pharmacia, Швеция) по методике P.L. Еу et al.(1078).

. Еонькгация !1А с пероксидазоЯ хрена осуществляли иетодоч перя-йодатаого окисления по Г*. Ti.jssen (1Й35).

Еопцевтрациа белка определяли иикронетодом по bovry (1951).

Рпбридокн яояугагп по катоду C.Kohler, C.Hilstein Î1975) В ио-двфикааив Fazekas de St.С.S., ScheideKKer D.(10S0).

Ннкунойеркгнтньй» акалзз. При проведения зкссеркцеатоа использовали непрямой, "оавдв1г»" я ковяуревтяо-ивгибяввовний варианты CÎ&A.

V"-' 8 - : ■ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Излечи«? твт.вмгвпткяи,. Фнаико-хииичсскяж—в—Зи<?л<?пт<;кяк свойств гликопротеядов вируса гриппа дтид .

МШВ I. t«ua«l» »Яаауапв »а ПШГМПШШ • щЦмчц». yuiulnuom. Kanamiimrt a ulpaa «nao* «ñauare« • ла*епаа <»w»nt, чютютм еяоеобеееть а мпфнлпм аатмпш —«рамшм юани «amaпчи» » vmta. ..■,■..

émrea» ГРИ0С1М мллосп. ТпоАчааосгь m j

аа* ' " ала т ai " " M стма Aatapram

Втааш »»pyta Tfama topara» W*C 60°C mu. so n TOBA * щи M>a<l

яет? . 58.010.« <4) 3S.5U.2 <5) 100.0 (3) 10/7/8 ' »/7/ 7

А/едаяа/Хааара/71' : 8СЯ2 Н: .:'■•'»-" ... 57.011.S («) 4X.0A1.S (4) 100.0 (3) a.a. a.a.

А/КГИта/Гдцраааа КЩП . «в »4 «0.5 2Г.7Л.2 (41 40.311.3 (3> 25.Э (2) 10/6/5 9/3/ 7 j

ktxnmmlSpomiMa» квдfit. аюв >4 «0.5 57.7Al.1 (3) 40.512.в (4) 50.0 (2) a.a. a.a. ;

д/слта/Ерсмшци ГНш/71 шип >4 V «o.s 56.SU,в (4) 36.411.2 (5) 100.0 (3) 10/7/5 9/7/ t 1

А/яэфпи/ЭаедавФ/?! ; ■ вдо - .■' а ■ KB.S 57.UJ.3 (31 40.310.1 (5) 12.5 (3) a.a. a.a. ¡

Чжпюлшяяввш вев i ■ «0.S (4) 40.811.6 («) 100.0 (3) 10/7/5 9/8/ 7 !

A/npmjímaan^flí ВИЗ 0.S CO.JiO.S (4) 40.710.9 (С) 12.5(3) Ы/ili 8/7/ S j

д/слюм/отдот» 1ВИ/71 дав «o.s«o.t K.zia.l <4> 30*311.4 (4) SO.O (2) a.a. 'a.a.

Юяд,' «o.s tí.мл <4J 39.011.4 (í) 25.0 (4) 10/7/7 I 8/а/ a i

A/*yx*n»/í»«»a«Mcnil/77 »ни : ■ i '• O.S» 55.010.5 (4] 38.712.« (4) 2S.0 (3) 9/4/5 ío/ie/io!

*l*n*ioJ¡imm*tr-inititi «ш «o.s «a.i Í5.410.4 (3) 39.211.7 (3) «.0 (2) 7/6/5 10/10/10;

Ораамшки: ТЗЯА Sfr taattpttna opa atnopot * <па М-шютм* аапгбшна ОДмататвашщ наш аавмамиш» »итмм «ОН! ЯШ • мамппр» шяшш* MlgunMuaii адгемюсти; a.a. . ■w4e*WMB¡ * * ммотсОааыивп, гамггатахю) ар«дс*ааааа* » мд* аааачая, ajuatmapi coMé i «WWtiHni ate уааммюЕ к ПМ* ширпя»! » тчмпц КОТОРОГО татр ааюрса а ГТА тнпша а 2 ца > (варана: ~ яаапааа MMfittft - гатр , «яруса a ÍTi» вмм« -* noca* ищшвв «аааицароцмпД нт оганапш» а «рапгтстаа» 0»Я twao-ДО, *ра*м «osaa мшА аа «брело**» Тратоиоа 1.100, афтам а ; »** * аарааа цюапвл <- шсжоюп& ТЖф ааруеа а ГОДА* порая - амаа аапхаяаа Кашатапрааааой aavi сусшгаавд a cs*drTC*»a» е. Я T*»«e»W, TPtnva ooaaa tato* a« oCgaooraa Траками X-100, амраашяа a . i - пшпталмш ш«иж» там А/цгрш»/1«ижм*6*лс*жА/«7 а»я»а«м«т ш «аиамааг «брааоа: fifl^-C аа ад» чае ом najuu» а 2 Вааа, a aavaa actaaaiaca аааааатшД а «ачаааа 4 часоа <срок aafiaaaa-nal< щ СС-градусах ом шмаа а 2 (ш м атмчмИ срок вайаадеяаа (И шп), aataa астма чг» ШМцав* а сачат* t «км носа« atoro аа ктакп «мора уит ичо до аоааого асчаааоааша аа 4 ч< сибик ушио «Сш поащвосгаА опрадавиой; паама taüaaoa. вдадегаааааныа а «spaaia и±а, прадс« собо* средам вв»чмив мааФПш мао-ааяге срадашадра*ачас«оа опамиааа. а «ютах сягчааа арааалаа »шшшппшкп«- ' /

- Изучал»: Териоетабильность генагглвтннннов и иейрамивидаэ, устойчивость гемаггдвтвнирувяей ниейраиинидазной активности к Лввствшв Детергевтов.элвционнув способность и температурные оп-T»ky»ta не й ранщшдаэ. Для»того определяли: динамику териоинакти-вааиИ геиагглвтинннои прн 56"С и 60"С в течение 4 часов, отбирая ВРоСы для титрования в РГА через O.S. 1,2,3,4 часа: зависимость уровня теркоиаахтввацяи нейраминидазы от температуры в диа-оаэоае ЗТ»С - 68*С с интервалом 2"С путем прогревания Вируса в течение 30 княут < охлаждения проб на льду и последувадго определения иейраиннидааной активности при 37"С; зависимость Фермента-

- О -

тианой активности нейраняяидазы от температуры роахяяоиаоЗ снося: динамику элввнв в ходе пяти-- часовой ннкубаапя яря 37"С, отбярад пробы для титрования гемагглвтянируояей активности по спдзаяпоЗ с эритроцитами, вируса, сорбированного па эритроцитах путем инкубации вируса с твтраня в РГА от 1:1024 до 1:258 прв 4"С а течеппе 18 часов с избытком эритроцитов кур. Даивнз преастаяланм я таблице 1. Из представленных в таблица 1 данных видео, что все угаданные свойства являэтся итаммоспеанфпчесванв а во могут бить использованы а качестве маркеров подтиповой прнпадлеавостн птам-нов вируса.

Изучение антигенной структуры глнкодротендоп с пспольорлзтнт»« поликлоиальиих антител

Изучали: антигенные характеристика генагглятиаиноо аюусоз о антигенными Формулами НЗН8, Н1Н1 я П6Н2 во данпыя определения в ГТГА перекрестной реактивности сывороток, полу-геппкя па пТаннн подтипа, ях перекрестного ясточеиия антигенами различных втааиоо подтипа, остаточной активности во отвоаеивв к этви стенная а антигенные характеристики цейраиивидаз во дайны1.! определенна п ГШ1Л этих ав параметров. Для этого были прпготоолеаи саворотпа кроликов против всех имевшихся подтипов вируса гриппа А птиц. Получеп-ные сыворотки титровали а ГТГА и РПНА я готовила аз нпх оресара-ты. истоценяые очидеинымя вирусами различных зтамкоа того за подтипа, инкунизацией история была получеза сиворотка. Результаты определения активностей сывороток а кх истоееапых препарате^ о РТГА и РПНА с различными атаммаия подтипов НЗГШ а 1Ш11 продстаэ-леяы в таблице 2.

Из данных, представленных а таблацв 2 следует, что, для втм-иоз с антигенной формулой НЗМ8, ПА инепт аитигевпыа детеркаоапты: обяне для всех птляпов, перекрестнореагнрувипе а птаимоспошк5ач-ные; верекрестнореагнруаанх детерминант как мпнимуи две; всего выявлено четыре аатягеиные детерминанты в составе НА, а непосредственной близости к сайту, ответственному за саяаыэаяяе рецептора на воверхяоетв эритроцитов. ЯА птаимов вируса грявпа А

Таблица 2. Антигенные взаимоотношения между штаммами НЗЫ8 вируса грввоа Автип во данный перекрестного истоцения специфических сывороток. (3<в<8)

Антпсьшо ротки чек адсорбированы Антигены

Кишинев/71 РПНА РТГА Украина/63 РПНА РТГА Калиф./72 РПНА РТГА

А/курица/Еввипес/71 А/сурипа/Кивинев/71 А/утка/Украина/1/СЗ А/утка/£алиФоряиа/72 320 1280. 160 160 10 80 160 20 - 640 40

А/утка/Украина/1/63 А/курнпа/Кнвннев/71 А/утка/Украина/1/63 А/ггка/КаяаФорння/7г 160 320 160 2560 40 160 40 40 1280 80

А/утка/Кадифорния/72 А/вурнца/Кввннев/71 А/утка/У*равда/1/63 А/утка/Кадвфорния/72 320 320 640 80 320 640 640 20 20 40

А/ЕУРиап/Леаа«абадский/77 А/курапа/Пролетарский/79 А/курида/Ленияабадсхий/77 А/йиск/А1Ъег1а/35/7 С Ленин./77 Пролет./79 А1Ь./35/7С

640 6120 20 320 40 1280 640 640 80 160 -

А/курваа/Продетарский/79 А/курица/Пролетарскнй/79 А/курвва/Левивабадский/77 А/йивк/А1ЬегЪа/35/76 320 640 80 320 640 160 10 160 80 -

А/<*аск/А1ЬегЬа/35/76 А/курвца/Пролетарский/79 А/сурваа/Ленинабадс кий/77 А/йисЬ/А1Ье гЬа/35/76 1280 80 160 80 в.в. - 1280 80 320 80 и.и. 2560 10240 160 2560 320 2560 н. и.

Яремечаяин: данные в таблице представляет собой величины .обратные модальному вваченив титра антител в задержке гемагглвтинации или в РОНА, н.н.-ве исследовали; - - подвое отсутствие задержки гемагг-лвтинадии.

втсддретервела антигенные изменения дрейфового характера; ЫА в своем составе имеет гак минимум четыре антигенные детерминанты. Одва ка вих имеется у всох исследованньсх вариантов вируса с антигенное формулой В3№. две групповые антигенные детерминанты, четвертая детерминанта является птаммоспецифнчиой. Для ятаммов с ан-тигевной формулой В 1т, НА исследованных вирусов имеют антигенные детерминанты: перекрестиореагирупаие а итакмоспециФичные; перек-рестнореагврувонх детерминант как ииникум три; всего выявлено четыре антигенные детерминанты в составе НА, в непосредственной бди-воств к сайту, ответственному аа связывание рецептора ва поверх-

вости эритроцитов. IIA штаммов вирусов II1N1 претерпела антигенные изменения дрейфового характера; NA в своем составе имеет четьгрз антигенные детерминанты. Одна из них имеется у всех исследованных вариантов вируса подтипа, две групповые антигенные детерминанты, четвертая детерминанта является ттамносвецифвчной.

При сопоставлении данных во обеим группам- птайнов видно, что все заклвчепня, сделанные ори изучении NA вирусов с антигенной формулой Н1К1 приловимы и для вирусов с формулой I13N8, т.е. можно полегать, что материальная основа объединения втаммов, нневщнх ту или инув антигеину» формулу, в влаие антигенного родства NA идентична и сводится к наличии как минимум одной обвей детерминанты и нескольких верекрестнореагируваих в непосредственной близости к сайту связывания субстрата. Однако, это не вывод, а именно предположение, т.к. при проведении дальнейоих экспериментов в этом направлении могут быть обнаружены подтипы для которых это ааклв-чение окаается не верный. В то яе время, в случае с вирусными ге-нагглвтиниванн показано, что группирование отаммоя в подтипы но-вет производятся как на основе наличия обвей и перекрестнореаги-рувщнх антигенных детерминант, так и только на осноье перекрест-нореагнрувцнх детерминант в отсутсэие обцнх. Настояний вывод, однако так ве нуждается в дополнительном подтверждении на уровне

изучения антигенной структуры с использованием коноклональных ан-

• i

тител и изучения гораздо больвего количества вирусных втамнов.

.При изучении перекрестной активности всех приготовленных сывороток в ГШ!А с птаииакм всех пнеегшх подтипов вируса устаяозле-но, что в этой реакции сыворотки водтнвосвецифичны. IIa основе этих сывороток изготовлен Набор для тивированпя вирусов грквпа А птив в РТША, проведан» усвевно конкссиовнув авробацив, подготовлена и утверждена директором института соответственная ПТД.

ваниен моноклональных антител

Всего било проведено б серий экспериментов по волучеввя гибрд-

дом - по две серна на НЗ, HI и Н13. Иммуннзацив мыаеВ проводили очииенаьоа вирусом гриппа соответствувщего подтипа во двум схемам, средставляввяк собой соответственно длигельвуа иммунизации и корот-ку» с применение» вяутряселезеночногс введения антигена.

Таблица 3. Слецифичность и активность моноклональных антител в Тв-ИФА.

Активность Спе- Титры антител

Иэотип ИФА РПНА РТГА ИБл. цнфн при концентрации

Антитела ИА 3 H чно- IK 1 мг/мл

сть РТГА ТФ-ИФА Т/Т

2D2 СЗ + _ + _ HI 5565 3 16

ЗЕ10 С2а + - + - HI 441 7 156

3F6 С2а : + - - - - - НЗ н.о. 6 и.о.

ЗС4 С2а + - - + - НЗ 52 13 2500

3114 0« + - - + - НЗ 250 31 1250

308 с* t - - + - НЗ 542 И 200

All С» + - - + - НЗ 410 13 320

2В10 С* ♦ - : - + - НЗ 137 38 1950

ЗЕВ н * + - - и.о. КБ н.о. н.о. н.о.

202 и ♦ ♦ - - и.о. КБ и.о. н.о. н.о.

im С1 t - - - - Н6 н.о. 103 н.о.

ЗРЗ с* + - - ♦ - 116 1016 448 2300

208 С2а * г. - * - Нб 337 526 15600

хвз С* ♦ - - t -. Нб 12 25 20000

2И11 С* f - - - - ' - Нб н.о. 1000 я.о.

Ш1 С* ■ * - - - Н6 н.о. 3 н.о.

4F0 СЗ + г ♦ - Н12 222 1 62

зсю С2Ь * - ' - - Н13 и.о. 43 н.о.

4С4 С» ■f - - + Н13 12135 24 20

G2 С* * - + - и.о. N2 и.о. и.о. и.о.

F2 С* + - + - н.о* N2 н.о. н.о. н.о.

3G1 с» + - + - и.о. N2 н.о. н.о. н.о.

303 * т t - н.о. N2 н.о. и.о. и.о.

Примечания:3-в колонке приведено наличие активности в непрямой методе флворесцируввдх антител с ПСГК, зараженной тек хе втакмом вируса, «который использован для иммунизации донора лимфоцитов; Н-в колонке 1 приведено наличие активности в непрямом методе Флворесци-рувщвх антител с незараяенной ПСГК; ИБл.-иммуноблотинг; »-субизо-тнвирэв&н&е вровсств ве удалось в виду отсутствия наборов для су-бизотнпарованая; ы.о.- не определяли; данные ' в восьмой колонке Првдставяйат собой обратные величины титра антител в РТГА; данные в девятой колонке представляет собой обратные величины титра антител В Т4>-В4А деление иа'10000; Т/Т-отвошение тира антител в ТФ-ИФА В тв*ру 8 РТГА.

В результате было приготовлено 6 стабильных гибридом против 133 (3F6. ЗП4, ЗС4, ЗГ8. All, 2Б10), 2 против Н13 (ЗС10, 4С4) и 2 против H1(2D2, 3810).

Наряду с няни, для изучения ВА вируса гриппа птиц различных

типов были исподьаоваяы гибридом» я ИА, первично аттестованные

авторани в качества специфичных к вирусным гекагглитяниион я яя-безно предоставленные нан С.А.Иалоголовкннын (4РЭ, Р2, С2). А.А.Черных (ЗИЗ и ЗС1>, П.Н.Лазаревой (1Р12, 2В8, ЗРЗ, 1В11, 1ВЗ. 1Н11).

Изучение специфичности моноклоиальных антител проводили в ННФА с зарааенной раэлячкыпи атвммамн вируса и незарааоаяой 0СГК, ТФ-ИФА. РТГА, ГГО1А, иммуаоблотннге после ДСП-ПААГ-электроФорсва.

Активность культуральных в асдитнчаскнх препаратов мспояло-нальных антител к вирусным гемагглвтннииам проползли путем ах титрования в ТФ-ИФА н РТГА. Данные представлены в табляяе 3.

Из данных, представленных в таблице 3 видно в результата научения свойств ионоклоналытх антител был составлен их набор» позволявший провести тестирование степени специфичности вяднсядуаяь-ных антигенных детерминант для различных ятаммов» групп цтгагпоо внутри подтипов и подтипов вируса, провести эксперименты по коя-курантному анализу наборов моноклональних антител % даун тпяап гемагглвтинина, определить вознокпость создавая свстевы типлрева-ния вирусных атаммов и азолятов 8 ИФА с использованная яояодло-нальных антител.

'аблива 4. Конкурентна епаяаз мсногслояолыапс оэтител к генагглэтЕняяу 13 в ДАС-ИФА.

Зонд 308 3!i4 m Ш Sí 3043

Конк. ЗН4 3D3 All 2В10 ЗС4 3F8 ж 303 Alt 2B10 3C4 373 3C4

1 * 33 70 60 70 15 0 08 63 55 53 0 37 50

5 100 82 77 72 15 0 33 so 63 72 3 33 61

10 100 83 85 74 15 0 100 85 33 80 1 '5 1 100 65

50 100 38 38 78 15 0 100 37 37 83 7 100 84

100 ICO 100 100 83 16 з 100 юз 100 91 12 ICQ 92

300 100 100 100 85 17 12 100 100 100 32 55 100 37

римечания: Зонд - НА, меченное вероксиавзой; Конх. - немеченлое алтотгло конкурент; {- НА клонов ЗН4, 3D8, All, 2В10, 3FS пе блокдаовм* свггз-шшя зснда: ff- НА клошв ЗП4, 303, All. 2310 не блокировала свкяквгкяя ювда; fit- MA клонов ЗС4 н 3FS не блокировали связиваняя зонда; * - в вафе представлена концентрации ыжхурярувмего неиеченвого ьитатела а кг/мл; данныэ в таблице представляет уровень связывания зонда в ввоцея-ах от уровня его связывания в отсутствие конкурентов.

Эватопное картирования проводили по данным конкурентного анализа в ЯАС-ИФА с наборами мояоклоналышх антител к геиагглэтяав-нам НЗ и Нб. Данные конкурентного анализа на примере группы анти-

- 14 -

тел К КЗ представлены в таблице 4.

lis Wis видно. что антитела к НЗ составляют три конкурентные группы. Свянь кокду первой группой и двумя другими отсутствует. Свавь ке«ду группами второй и третьей имеет несимметричный характер. Это указывает на то, что на молекуле НА вируса гриппа втиц 133 выявлены три антигенных района. Первый из них включает четыре порекрдаакдиеся детерминанты, второй и третий, в составе которых обнаружено по одной детерминанте, конформапиоано сопряжены.

Аналогичными опытами по антителам к Н6 показано, что MA 2D8, 3F3 одинаково нвгибнровали связывание меченых антител с НА Но, т.е. конкурировали ее один к тот ке эпитоп в« антигене, и отличалась ОТ автвтед 1011 , ZH11 и, в кеиьсей степени, от антител 1ВЗ и 1F12, прачек антитела 2Н11 не конкурировали с другими. Таким обра-SOM, методом конкурентного анализа на молекуле гемагглягинина вируса грвова птиа Нб обнаружено два антигенных района. Первый из авх вклвчает четыре сильно перекрывавшихся месду собой антигенных детерминанты, а второй - одну детерминанту.

' Еаврвбат&а ся<асоб<?в .иринснеиич иауэеняьяс нрвоуяриадьл'нх, йртц.г уел для выявления итерирования вируса гриппа птид

Па даввои этапе работ предметом исследований был отбор НА, пригодных доя использования в дифференциальной диагностике вирусов гриппа птвп. Эти исследования проводили с использованием двойного евтвтйльиого "сандвич"- ДАС-ИФА. Результаты испытаний с вссоаьаованвси гомологичного штамма представлены в табл 5.

В» данных, представленных в табаиае, видно:

- что обнаружение антигена вируса гриппа птиц возможно при разном сочетании НА, во аф^ективность его сильно различается;

- что лись в редких случаях оптимально использование одного я того ке антитела для сенсибилизации в приготовления копьвгата ХЗН4, 3F3 и 1F12);

- что критически важны« является подбор антитела для сенсибнли-аааии поджсткрола. При использовании для этой цели антител 2В10 и

1ВЗ, а так яе, - в меньвей степени - Allí 2Н11 а 1В11, практа-

Таблица 5. Чувствительность ДАС-ИФА ври выявлении антигенов вирусов гриппа птиц с использованием разлитых сочетаний пар НА для сенсибилизации полистирола и приготовления кояыагатов.

1 ■ - ----------------- МА для сенсибялнэапин Антиген МА для приготовления конъвгата

А/утка/ Украина /1/63 /H3N8/ * 3F6 ЗН4 ЗС4 3D8 А11 2В10

3F6 ЗН4 ЗС4 308 А11 2В10 108 1000 108 36 36 36 Í08 36 12 4 12 324 1000 ЗС 36 36 12 36 108 36 4 4 12 108 108 12 4 36 12 12 12 12

А/курица/Чех-ов/72 /Н6Н2/ ** 3F3 1F12 2D8 1В11 2HU 1ВЗ

3F3 1F12 2D8 1В11 2Н11 1ВЗ 10800 10800 3600 3600 10800 403 3600 3600 1200 1200 1200 32400 37200 10800 32400 37200 1200 3600 1200 3600 400 97200 1200 1200 400 1200 1200 1200 400

Примечание: цифровые данные в таблице представлюлт собой величины обратные модальным значениям титров антигенов, число определений во всех случаях равно трем; в качестве антигена использовали: ** - очишснный вирус гриппа птиц; ? - внруссо-дер&ааая аллаятоисная жидкость.

чески ие удалось достичь иеобходияой чувствительности реакции■

г

коньвгат каких-бы антител ни бил использоиап для выявления автн-гена;

- что существенное значение имеет а скбор аатитела для приготовления ковьагата: в отдельных случаях равлягня а собственно

■ »у'

чувствительности теста прв использовании последках различалась пррнерио в 100 раз.

Более высокая чуястоательиость П5А иеблвдалась прз сочетания НА к анткгениа различным эпптопам молекулы НА.

Лучшим сочетанием при выявлении вируса гриппа птвп с антагев-нык профилем НЗКЗ оказалась сочетания НА ЗР8/ЗВ4 < ЗКб/ЗРВ.

Следуяяая серия экспериментов была направлена на то, что бы установить выявляется лн при различных сочетаниях антител все втамкы данного подтипа. Результаты представлены в табл. б. Эта данные показываят, Что линь сочетания НА ЗРО-яа твердой Фазе + ЗГб-кояьага? я ЗС4-на твердой фазе + ЗРб-вовьвгат позволяет вы-

яалять в ДАС-ИФА все три взятые в опыт вируса гриппа с гемаглятм-

Тоблиаа 6. Обнаружение антигенов ЕГП в ДАС-ИФА с использование« нонокяонвдьвых антител к гекагглвтнкину НЗ.

ИА для ИА хонъвгнров&икние

Итамны вируса гривна сенсиби- с верокендаэой хрена

лизации ЗР6 ЗС4 3114 31)8 АН

А/утка/Украниа/1/БЗ ЗР6 128 256 32 32 128

ЗС4 128 32 16 16 16

А/курица/Кишинев/71 35?6 128 32 - - -

ЗС4 - - - -

А/утка/КалиФорнич/72 ЗРб 32 - - 16 4

ЗС4 16 - - - ■ -

Примечание: данные о таблице врсдставлявт величины обратные модальным значениям титров антигенов, число определений во всех случаев равно трон. Титры в ГГА всех использованных антигенов были равны и составляли 1:256; - - отсутствие в пробах окрашивания более интенсивного, чем у пробы аллантоисной жидкости не-зараженного куриного эмбриона.

никои НЗ. причем иаялучвая чувствительность отмечена при сочетании ЗК6 иа полистироле а коньвгата ЗРй. По-внднному, такие результаты связаны с относительной консервативность« и широкой распросграненкосгьв среди штаммов с гемагглятнввном 113 детерминанты к которой специфичны антитела ЗР6.

При использовании антител ЗС4 для сенсибилизации полистирола выявлено, что антиген гомологичного штамма выявляется достаточно эффективно пра использовании всех испытанных коньвгатов, тогда как антигены гетерологичнык втаммов не выявляется за исключением того случая когда используется коньюгат ЗР6. По-видимому, это говорит о том» что в структуре соответствушщих эпнтопов гетерологичнык втаммов ввевтся суиествениые отлична от таковой гомологичного. Эти отличия ве столь велики, чтобы аре дотвратить во л нос.т ь» сорбшш гетерологичного антигена на полистироле, сенсибилнаиро-ванном этими антителами, но сникает чувствительность реакции настолько, что выявление той части антигена, которая связалась с твердой Фазой становится проблематичным.

С другой стороны, сочетание ИА ЗРб/ЗОЗ и ЗК6/А11 позволяет выявлять антиген одного на гетерологнчных штаммов и не позволяет выявлять антиген другого атония. Вероятно эти данные свидетельствует о более тесном сходстве в антигенной структуре гомологичного

- 17 - ■ ■

отаина А/утка/Укранна/1/33 в таковой гатерологачаого итаана А/ут~

ка/Халяфорявя/72. чей со стайном А/куРИца/&гапае1)/71.

Подбирать сочетания МЛ для оыяялевяа 11А НВ по потребовалось, т.к. почти все антитела к нему вдоаяаго все вяетшева в вами ' ; распоряжении вирусы гриппа А птиц с такай генпгглатпяяяои» Прячем | даже в том варианте. когда одно я то ае антитело использовала в ! для сенсибмлизацяя я для приготовления коаьвгата. Это. вгвоятяо» свидетедьствувт о более блнаком антигенном родство твшхса о нашем распоряженииштаммов вируса гриппа птид о НА Нб.ОО сравнения со штакмани, обладавшими НА ПЗ.

Цельа следуашего раздела работы было определению оозмсзнастп использования имевшихся а нааен распоряжения МЛ к НА вирусов грая па А птид в ИФА для типиропавпя птаимов шгруса "Триала птиц по га-нагглатияипу. Результаты экспериментов сумжарояай*» п тй5л.7.

Таблица 7. Взаимодействие в ДАС-ИФА иопохлопалыпдпптптел а го-магглвтияив&м со втаннакн вируса гриппа А птиц» {шевдшкх геиагг-лвтинины различных подтипов.

Щтакны вируса гриппа Аптиген-ная Формул» . Ноаоклопадьаые аятатеда

3S10 3F8 тг 4V0 4С4

A/duck/Alberta/71/ Н1Л1 1024

А/утка/Украия&/1/63 H3N8 - - 256 - - -

A/turkey/Massachusets/eS H6N2 - . и ' - —

A/duck/Alberta/60/76 Н12Н5 - - ' -:. 25В -

А/чх/Астрахань/1421/73 813Я2 - - - . 1034

А/курнца/Кипинев/71 НЗН8 - «4 . — - : ■

А/утка/КадиФорняЯ/72 B3II8 - 298 -

Примечание: цифровые данные » таблице представляет собой величины обратные модальным значениям титров аатпгевов о ДАС-ЙФЛ. число определений во все* случаях равно трем: - - отсутствие реакция; со штаммами вируса гриппа A: A/duck/Corm&ny/l215/73 Ш2МЗ), A/duck/Czechoslovakia/Se (K4N61, A/tern/South Afrika/53 (H5H3Í. A/FTV/Dutch/27 (H7N7), A/turkey/0ntarlo/«¡U8/Q8 (ШИШ. А/turkey/Wi аЬопз in/66 (H3M2), A/f/Ceraany/R/43 (В10Й7). A/duck/England/56 (H11ND), А/Ленннград/385/80 (H3N2), А/Сан гг-Па-теРбург/40/Э2 (83ÍT2 J. А/ Ввльнас/2в/90 (H3N2), и атаянама NDV/'La-Sota" парамнксовнруса-1 я Chick/CaHfornia/Jucaipa/58 да-рамиксоваруса-2 все испытанные антитела не взаимодействовала.

Перекрестные реакции пспытанных МА с антигенами п&раиахсозн-русов, вярусоа гриппа человека, а тенге антигепаки гриппа птпа гетерологичных подтипов отсутствовала. Антитела выявляли тольво вирусы гриппа птиц и лишь соответствуваего подтипа.

Однако, налое количество штаммов ВГП. которое было доступно в

ваекхиг-следоввввих несколько ограккчивает значимость второй стороны сяедаяаого овблвчении: показано, что МЛ взаимодействуй! только с НА рс^ерснс-втодков соо*гветствувшего подтипа, во, за Таблица С. Выявяовие сарусов с различными гемагглвтянипами t

сыеси с иовокловаяьиыки в воликлональными антителами.

Состав проб d ГАЕ ВГП Титр антигена в ДАС-НФА* с МА: Титр в РГА после добавления водтииоспецифичес кой Сыворотки «*

3510 3FG 4С4

В1 НЗ В13 В1 НЗ ВХЗ HI НЗ Н13

128 64 32 512 612 612 нв нв ев 612 256 128 256 512 512 ■ ■ 64 64 32 32 256 256 -

to »а со со 256 128 вв йв 512 612 64 32 . - 128 128 32 16 -

128 64 32 нв вв ев 1024 1024 1024 512 266 256 512 1024 1024 64 32 32 ' - 32 64 64

128 128 вв вв 256 128 1024 1024 ' - ' 256 128 128 256 - 64 32

88 вс вв 5X2 512 612; 612 256 128 64 256 512 512 612 256 - 1024 1024 1024 512 256 125

вв в8 612 12S 1024 1024 - 512 128 1024 1024 256 128 1024 1024

Прзги5«й2кя;снесн вируоов готовклн ва аалаятонских сидь'остсй sapa-Кбшагх Eypumis онСрцоиов, даилиов таблица лредставлевы в велвчи-абж обратных тигруалтигека (вируса) в соответствуй:«« реакциях, все опрелеяевня вроведекы вдвухповгарцостяк различий в титрах кеету eotoiiatt» се бнйог в»- ос Сносили; пластины сексибклваи-РовалиИАсрабоченразаедапви.ааткгеи, связавсийся с нини выяв-ласв вброрсидазиым коаыыатом ив основе -¿тих jps iiA; - к смеси вирусов добавляли водтядосдеаиеичаскио кроличьи сыворотки в.. кон-квятраадя аолвосгь» бдокврузваей гемагглаткнадив вируса соот-вететвдгеэввгр - полтина, -

волытевдек случая с аятнтеяом 3FG и итаннов, обладав?»» НА НЗ, ее доказано, «го все »тамкы, обладаедае НА конкретного подтипа, взаимодействуют с ИД.

Тьеии обрааом.вае эшзевздоагевкые результаты поваолявг сделать вывод о вовмовиоотв орвмевевия HA к НА ВГП для вкдикадии ВГП, аиркудвруаких среда птвц.

Вввество, что а погулялаях втвч, в том числе и в оргоййвйе

■ 10 -

иннствевной оообя, яогут циркулировать одновременно внруси гряп-1 атвц. отяосякмеся в равны* антигенпыя в&ряаят&м в пределах эдтвпа. А поскольку индикация вирусов гриппа в смесях является гсьна актуальной проблемой и эпиэоотологического, и клинического upактера» в следуяяея разделе работы била сделана попытка применяя разрабатываемых систем для исследования смесей чирусов с ».зличнынв ВА. Даквие сравнительной оценка использования НА а 1С-ВФА я РТГА приведены 8 табл. б.

Иэ данных таблицы 8 видно что* при проведьяии индикация пи— гсра гриппа в смесях, содеряавих раалвчные его подтипы, в ГГА п >ясутствии поликлональиых сывороток при соответствуете« состава [вся вирусов кояет иметь место "маскирование" одного подтипа ПА >угим. Многочисленные свидетельства этого имеется в ранее опуб-1Коаанншс работах других авторов. 8 ваших экспериментах такое глекке было обнаружено для снеся HI и ИЗ. При тапорованяи этой ■еси по НЗ и сыворотки к нему, которая не задерживала гехаггла-(напиш, вызваннув U3, тнтр ПЗ Сил не 1:512(истняяыа), а 1:321ка-чшйсл). Обратного эффекта не откечаро, как по отмечев» а авале-[чного влияния о системах к 83 я p3tH13fc^iBfl-

1ткя к Я13. Легяо представить сатг^дн» а еотороа и сходный •ли строка 1 таблицы) вяруса о ИЗ был бц не 1;613, а 1:IS. Цр<<->сь »того вяруса п систеяе ГГА выявить ко удалось быг . тогда как ЯАС-ЙФА она была вы ошв лева.

Такик образом, применение НА поваодяет выявлять ВГЯ ара еяе-,няых ивФекцяях. соотватствувинкя подткпахя й ДАС-ИМ, что суяяст-яко отляпает ДАС-И*А от ГТГА. где ароикуцеетвеввв выявяяетсд до-аирувпий вирус. Йде более оосоиыхн преямуивства системы ДАС-И5А НА, естественно, скаиутся При анализе состава белее словных

смесей вирусов, .

Основной задачей завервавщзго раздела исследований являлась оптимизация параметров постановки непрямого ДАС-ИФА, которая была начата с определения рабочего разведения антигена« В результате проведенных исследований было установлено! что оптимальной является концентрация антигена 32-64 антигенные единицы. 32 антигенные едяпиды - 100 мкл разведения антнгеиа в 32 раза более ков-пеитрироваииого, чей максимальное разведение антигена, давшего положнтельнув реахцнв о ДАС-ИФА.

Была определена оптниальнал концентрация антител для сенсибилизации твердой Фазы - полистироловой пластины. Она составила 0,3-1*0 нкг антител на луику Об-луыочной пластины при сорбции из 0,05 М карбонатио-бикарбонатиого буфера (КББ) рН 9.8 в течение 1 часа при 37"С. а затем - 12 часов при +4аС.

Как из пествс, саашюде&стпае некоторых пар аитаген-антатело чувствительно к (¡пиеиеиияи рН< концентрации солей. В связи с этих было проведено изучение влияния концентрации МаС1 на уровень неспецифячессого связывания. которое наблвдается при использовании поликлоналышх с&ацяфическнх сывороток. Обнаружено, что значительное снижение фона о случае кроличих сывороток достигалось примененной 0,8-1,0 И раствора КаС1. В то же время на чувствительность и специфичность реакции с куриными сыворотками увеличение «оацентралкн хлорида натрия в реакционной смеси влияния не оказывало.

Несомненный интерес для дальнейших исследований представляло определение влияния ПЭГ-6000 и» чувствительность ДАС-ИФА. Установлено что добавление ПЭГ-ЧООО-вООО к раствору аероксидазного конъвгата до конечной концентрации 4% позволяет в случях применения полнлональных амтвмдашх конъягатов сократить время инкуба-

и:и с ковьвгатлмя до 20-30 яянут. При этах усяошмх аепболгч гзз-■енсивкое гтсяспяепне субстрата происходит з тачонио 15-ЗС .

Талии образом» установлено, что оятямаяыгыа паргкотпи гл^ ювки ДАС-ИФА могут значительно варьировать а засиспмостя осой принадлежности сывороточных антител«

Миник&лыше затраты времена при обнаруаеина ■ аз-

ител в сыворотках з случае использования предиаратзльцо сеясябз-нзированных МА аланветов составляат 3-4 часа.

'вывода

1. У вирусов грнааа А атпд чувствительность гсквгтяатляарзтяза а ейранниядазной активностей х дейстпиз догергеатоя« териоюгактива-ни, а также элапионная способность я твкяоратурвкй оптйяуя аейра-яиядаэы являятся ¡гган»осаец»$ячесгякя ярвэяаяаиа ж по б:ггь спольэовапи а качестве маркбрякх прязпавов подтяаео вяруса.

2. Получе» набор сывороток саепиЗячесгнх но всея подтипам аояра-ииидаз вируса гряпаа А птия. На его осевка создала тест-спстеяа ля тноироаанкя итамнов вируса по иеПракзтмдаэйн с нспольасшшяем еста ингабяпии нейраминидазной активяо«тз.

3. Получено 10 гибридом, продуаарусвдх аппсглональпио аятятола к гнагглотннняаи вяруса граппа А атиц, в тон числе - 2 спосяЗзчп&эс

Н1, 6 к ИЗ я 2 ж Н13, я иаучекы свойства этих гябрздси я вроду-ируеиих яма монокяояальннх аятитол.

4. Все НА, полученные к аатягепнмм доторяяаоятоа гемаггяхативяаов ахтиаяыа в РТГА, строго тяпосяецяЗзтш* я яв снгкбпрузт геиаггла-

!напвэ атамиоа вируса с гамагглэтпцяиема других подтипов.

5. Основой для группирования вирусов гриппа А птип а подтипы по »магглятияилая ва уровне аятягояных деторнанапт иояот являться « наличие обаях я перекрестнореагирусадх оиутря подтипа детврна-

вант« что показало для гекыглвтяниноа НЗ, тек я наличие только пвр«креств0реагеру»в«х детериинакт яря отсутствии обцих, что пока-вало для гекдгглвтввияа Н1.

6. Построены частичные зпнтопные карты гемагглвтяяияов ВЗ я Нб вирусов гриппа А птиц.

7. Гоаработанные еарваиты ТФ-ИФА на основе МА позволяет проводить: бея предварительного вирусовыделеияя идентификации штаммов вирусе гриппа по геиагглвтниикак; типироваиия специфических сывороток, в той числе сибваиных а типовом отношении; анализ состава сиесей, вклвчааних различные по антигенной структуре варианты вируса.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Диагностический набор для типнрованяя втаммов вируса гриппа А птня в рсакдва подавления небрдоннядаяной активности рекомендуется для нсвольаовання в диагностических исследованиях. Набор провел кохиссвовну» апробация, кетодкческяе указания по тидкрояа-вяв станков вируса Гриппа А птиц в реакции подавление иейраиини-дазвоВ активности утвервдеиы директором института.

Pasработаявне «етода: типврововия ктамиов вируса гриппа по ге-кигглэтнивнан на основе IIA в ДАС-КФА; типвроа&яяя специфических сывороток с вирусам гриппа А птиц па основе НА; обнаружения вирусов гриппе А птиц в смесях, .вялвчавцих различные по антигенной структуре станки яа основе МА рекомендуются для использования в научных учреждениях при проведении диагностических и научных исследований.

- 23 -

Список работ» опубликованных по теие диссертация

1. Черных a.A.. Сгргучов» H.H. Использование «ояоклонзльккх антител для идентификации атамкоз вируса гриппа дтаа с всйракавада-зой И2 //Материалы научной конференция ЕШИВЙкМ. 13-13 апреля 1332 г.- Покров» 1302. - С.323-330.

2. Сургучева H.H.. Налоголовкига С.А., Соловквяа H.H., Лазарева Л.Н. Моноклояальные антитела к гемагглатипинам вируса гриппа А птиц // Материалы научной конференции ШКЯВВпМ. 13-18 апреля 1332 г.- Покров, 1332. - С.330-331.

3. Реутова 2.Г., Сургучева И.Н., Хихияская Т.П., Солопсяна H.H., Стрпгакоп A.B., Лыска В.М. Сравнительнаяоценкаразличных методов ияниуниаашш при получения гнбрчдои ияоноклональшгж антител к антигенам вирусов возбудителей сельскохозяйственных животных // Материалы научной конференции ВНШШВиН. : 13-13 апреля 1332 Г.- Покров, 1332. - С.344-345.

4. М&соголовккн С.Л., Сургучева И.М., Соловкана U.M., Члркых A.A. Эффективность различных нетодов нкнуниа&цка при получений гибридои и моноклонплышх в.итктел к »круезг гриппа птиц //Материалы научной конференции ВШШВВиМ. 13-18 апреля 1332 г.- ПокроВц 1332. - С.345-346.

5. Сургучева H.H. Антигеншго в ёпо.тогаческаа.свойства.,ятайяоа вируса гриппа Л птип с антигенной xapSJiiepacTiiXoS lilttl //Тез«с'г докладов научяоЗ аондереяцип ЕИПЙВЁМИ ЗЗ-ЗО'йойЗрз 1330 Р. - Пох-

ров* юзо. - с.Ш-iäöt

Öi бургучеса Й.И. Лп'тс.геиная зшрьк'тёряствка гскагглвтяавиа. вируса гриппа А птиц //ГознсЫ докладов ввзг?1«с8 конференций ¡СЯШШВкМ 28-30 ноября 1330 г. - Покров, 1330. - С.130-133.

7. Сургучева U.M. Антигенные детермннаяти яейранявидаэ ларусд гриппа А птиц //Тезиск докладов научной конференции ВШШВВпН 28-30 ноября 1330 г. - Покров, 1300. - C.13S-139.