Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Зависимость цитохимических показателей лейкоцитов от их морфологических особенностей в сравнительном аспекте и при анафилаксии

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РЕГИОНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОМОРФОЛОГИИ

На правах рукописи

МИХЕЕВ Анатолий Георгиевич

ЗАВИСИМОСТЬ ЦИТОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЛЕЙКОЦИТОВ ОТ ИХ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ В СРАВНИТЕЛЬНОМ АСПЕКТЕ И ПРИ АНАФИЛАКСИИ

14.00.15 — патологическая анатомия 14.00.23 — гистология, цитология, эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

НОВОСИБИРСК 1996

Работа выполнена в Кемеровской государственной медицинской академии МЗМП РФ, Новосибирском медицинском институте МЗМП РФ и Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфолопш Сибирского отделения РАМН (Новосибирск)

Научные консультанты:

член-корреспондент АН ВШ,

доктор медицинских наук, профессор В.д. новиков

Заслуженный деятель науки РФ, академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор л.м. непомнящие

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор г.г.часовских доктор медицинских наук, профессор Б.с. аникин доктор медицинских наук с.в. Мичурина

Ведущая организация:

Российская медицинская академия последипломного образования МЗМП РФ

Защита диссертации состоится 1996:

в ¿О часов на заседании Диссертационного совета Д 001.40.0 в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМ) (630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тез 8-(383-2)-32-31-56, факс 8-(383-2)-32-43-39)

С диссертацией можно ознакомиться в научне медицинской библиотеке НИИ региональной патологи и патоморфологии СО РАМН

Автореферат диссертации разослан " " 996

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 001.40.01

доктор биологических наук е.л. лушников

>

{

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Морфологическое изучение клеток крови широко применяется в клинической лабораторной диагностике. Использование цитохимических методик позволяет проводить дифференциальную диагностику острых лейкозов и других заболеваний. К настоящему времени накоплен oipoM-ный фактический материал по морфологии и цитохимии лейкоцитов человека и животных в норме и при различных патологических состояниях (Кассирский И.А., Алексеев Г.А., 1970; Гольдберг Д.И. и др., 1973; Кисляк Н.С., Ленская Р.В., 1978; Зуфаров К.А. и др., 1979; Шубич М.Г., Нагоев Б.С., 1980; Ма-янский А.Н., Маянский Д.Н., 1983; Воробьев А.И., 1985; Сар-кисов Д.С., Пальцын A.A., 1992; Козинец Г.И. и др., 1993; Ва-inton, 1975; Takeshita et al., 1990; Denburg, 1991; Мацнер Я., 1993). При этом результаты цитохимических исследований до сих пор используются лишь как дополнительная информация к морфологическим данным. Не выяснено также, существует ли связь между цитохимическими показателями (ЦП) лейкоцитов и особенностями их морфологии.

Цитохимическая организация нейтрофильных и псевдоэо-зинофильных лейкоцитов у различных классов позвоночных остается недостаточно изученной, при этом имеющиеся литературные данные противоречивы (АкиловА.Т. и др., 1979; Campbell, 1972; Caxton-Martins, 1975; Sorrel, Weis, 1987; Wang, 1991; Zapata, 1994).Сравнение полученных разными авторами результатов цитохимического исследования лейкоцитов затруднено вследствие использования ими неодинаковых методик. Некоторые исследователи (Нишанбаев К.Н., 1971; Хамидов Д.Х. и др., 1978; Fey, Kunze, 1970; Zapata, 1994), проводя сравн ;гель-ное морфологическое и цитохимическое изучение клеток крови, не обнаружили каких-либо закономерностей в цитохимической организации нейтрофилов и псевдоэозинофилов.

Характерные для отечественной и зарубежной литературы противоречивые описания морфологии цитоплазмы нейтрофилов человека в норме обусловлены отсутствием унифицированных методов окраски гематологических препаратов. Остается не выясненным также вопрос о тинкториальных свойст-

вах и соотношении различных типов гранул в нейтрофилах, выявляемых на микроскопическом уровне. Сравнительное изучение морфологии цитоплазмы нейтрофилов человека и соответствующих клеток крови различных классов позвоночных могло бы внести ясность при непременном условии использования гематологических фиксаторов и красителей, обеспечивающих стабильность "эффекта Романовского". Однако, применяемые в гематологических исследованиях стандартные красители не позволяют выявлять многие структуры лейкоцитов: особенности морфологии различных типов гранул в нейтрофилах, наличие беззернистых участков цитоплазмы этих клеток, характер базофилии цитоплазмы лимфоцитов и моноцитов и др. Поэтому многие детали морфологии лейкоцитов не изучены как в норме, так и патологии, и не могут быть использованы в клинической лабораторной диагностике. Изменение структуры клеток при проведении цитохимических реакций под влиянием фиксации, промывки, инкубации и других операций делает невозможным исследование характера зависимости между цитохимическими свойствами лейкоцитов и особенностями их морфологии.

Морфологические изменения в лейкоцитах крови при сенсибилизации и анафилаксии изучены в многочисленных исследованиях (Адо А.Д., 1978; Гущин И.С., 1979; Скороход Н.И., 1980; Пыцкий В.И., 1984; Фрадкин В.А., 1985; Нестерова И.В. и др., 1989; Patterson, 1988; Huston et al., 1990; Marone, Stellato, 1992; Sato et al., 1992). При этом отмечается неоднозначность результатов, касающаяся степени количественных и качественных сдвигов в различных видах лейкоцитов. Цитохимические исследования лейкоцитов во время сенсибилизации и анафилактического шока часто бессистемны и отличаются противоречивостью полученных данных (Гусейнов И.А., 1970; Нарциссов Р.П. и др., 1984; Фрадкин В.А., 1985; Leiferman et al., 1991; Altenbuig et al, 1995). В доступной литературе отсутствуют сведения о морфологических изменениях при аллергической альтерации лейкоцитов in vivo, тогда как in vitro они описаны детально (Фрадкин В .А., 1985; Schwarz, 1990; Denburg, 1991; Sato et al., 1992). Нам не удалось также найти сведений о наличии и характере связей между цитохимическими показателями в раз-

личных видах лейкоцитов и их морфологией при сенсибилизации и анафилаксии.

Цель и задачи исследования. Цель работы — выявить характер зависимости цитохимических свойств лейкоцитов крови человека и животных от их цитоплазматических структур в сравнительном аспекте и при экспериментальной анафилаксии с помощью усовершенствованных методик для последующего их использования в клинико-лабораторной диагностике и научных исследованиях.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.

1. Изучить морфоцитохимические взаимосвязи в нейтро-фильных и псевдоэозинофильных гранулоцитах крови амфибий, рептилий, птиц и млекопитающих.

2. Выявить характер морфоцитохимических связей в лейкоцитах при экспериментальной сенсибилизации.

3. Определить динамику морфоцитохимических параллелей в лейкоцитах во время анафилактического шока.

При этом необходимо было выяснить условия, обеспечивающие стабильность "эффекта Романовского" в гематологических препаратах и парафиновых срезах, а также изыскать такие параметры проведения цитохимических реакций на неспецифические фосфатазы, которые не вызывали бы существенных изменений цитоплазматических структур лейкоцитов.

Научная новизна. Впервые с помощью усовершенствованных морфологических и цитохимических методик установлена зависимость цитохимических показателей лейкоцитов крови человека, нейтрофилов и псевдоэозинофилов амфибий, рептилий, птиц и млекопитающих от морфологических особенностей их цитоплазмы. Показано, что активность кислой фосфатазы (КФ) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в лимфоцитах связана с объемом и характером базофилии цитоплазмы. Интенсивность цитохимической реакции на катионные белки в не-йтрофилах и пссвдоэозинофилах крови всех исследованных видов определяется количеством и размерами их специфической зернистости.

Выявлены общие черты цитохимической организации не-йтрофильных и псевдоэозинофильных гранулоцитов амфибий,

рептилий, птиц и млекопитающих наряду с существенными отличиями.

Впервые доказано, что зрелые нейтрофилы и псевдоэози-нофмлы крови амфибий, рептилий, птиц и млекопитающих содержат в цитоплазме только специфические гранулы и не имеют азурофильных. Локализацией катион ных белков исключительно в нейтрофильной и псевдоэозинофильной зернистости объясняется ее окраска эозином, что позволяет судить о содержании этих веществ при использовании гематологических красителей (у большинства исследованных объектов).

Впервые выявлена подробная динамика количественных и качественных морфологических изменений в различных видах лейкоцитов при сенсибилизации, которые выражены неодинаково, но всегда тесно связаны с цитохимическими. При анафилактическом шоке очень быстро развиваются резкие морфологические и связанные с ними цитохимические сдвиги в лейкоцитах. Характер связей между цитохимическими свойствами лейкоцитов и особенностями морфологии их цитоплазмы при экспериментальной сенсибилизации и анафилаксии сохраняется, но становится гораздо более выраженным во время шока. Впервые описаны морфологические и цитохимические признаки аллергической альтерации псевдоэозинофилов и ба-зофилов крови in vivo, завершающиеся их внутрисосудистым разрушением.

Определены условия, обеспечивающие стабильность "эффекта Романовского" в гематологических препаратах, включающие комплекс факторов: строго определенные молярные соотношения основных и кислых красителей, виды и соотношения растворителей в маточных растворах красителей, составы буферных смесей. Впервые удалось четко дифференцировать в парафиновых срезах все типы тканевых гранулоцитов (вышедших из циркуляции) наряду с клетками крови и соединительной ткани и иммунокомпетентными клетками за счет использования нового фиксатора, включающего смесь метаноловых растворов основных тиазиновых красителей и эозина.

Практическая значимость. Установление зависимости цитохимических свойств лейкоцитов крови человека и животных от их цитоплазматических структур подтверждает гетерогенность

этих клеток и может служить базой для проведения исследований при различных патологических состояниях в эксперименте и клинике с перспективой создания новых диагностических тестов.

Результаты сравнительного изучения цитохимической организации нейтрофильных и псевдоэозинофильных грануло-цитов крови позвоночных могут быть использованы при планировании и проведении опытов на различных животных.

Динамика морфологических и тесно связанных с ними цитохимических изменений при сенсибилизации и анафилактическом шоке могут найти применение в клинических и аллер-голошческих лабораториях.

Использование комплекса факторов, обеспечивающих стабильность "эффекта Романовского" в гематологических препаратах, значительно повышает их информативность и может найти применение при проведении научных исследований и в практике клинических лабораторий медицинских учреждений.

Оптимальные параметры цитохимического изучения лейкоцитов могут быть использованы в научных экспериментальных и клинических исследованиях.

Новый способ изготовления гистологических препаратов, позволяющий четко дифференцировать все типы тканевых гра-нулоцитов, клеток крови и иммунокомпегентных клеток может найти применение в научных морфологических исследованиях и патологоанатомической практике.

Апробация диссертации. Результаты работы доложены и обсуждены на Всесоюзной гистологической конференции "Реактивность и пластичность эпителия и соединительной ткани в нормальных, экстремальных и патологических условиях" (Тюмень, 1974); I Всесоюзной конференции по нейроэндокрино-логии (Ленинград, 1974), VIII Всесоюзном съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Ташкент, 1974); Всесоюзном симпозиуме "Нейро-гуморальная и фармакологическая коррекция иммунологических реакций в эксперименте и клинике" (Ленинград, 1975); IV Северо-Кавказской научной конференции "Цитохимические и биохимические исследования в эксперименте и клинике" (Нальчик, 1979); научных и научно-практических конференциях (Кемерово 1978, 1986, 1988), IX Всесо-

юзном съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Минск, 1981); Всероссийской гистологической конференции "Гистогенез и регенерация тканей" (Санкт-Петербург, 1995); 3-й Всероссийской научной конференции "Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования клеток, тканей и органов человека и животных" (Волгоград, 1995); I международном конгрессе по интегративной антропологии (Тернополь, 1995); Проблемной комиссии "Морфология" (Новосибирск, 1995), Международной конференции "Актуальные вопросы морфологии" (Тернополь, 1996), III конгрессе международной ассоциации морфологов (Тверь, 1996). Обсуждение всех аспектов работы проведено на заседании Кемеровского отделения ВРНОАГЭ с участием сотрудников кафедр гистологии, патологической анатомии, биологии, нормальной физиологии и ЦНИЛ Кемеровской медицинской академии и Кемеровского областного патологоанатомического бюро (июнь 1996 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 31 работа, из них 7 статей в центральных журналах. Получено 3 авторских свидетельства на изобретения, 7 удостоверений на рацпредложения отраслевого значения, принятых к внедрению МЗМП РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из 7 глав, включающих обзор литературы, описание материла и методов исследования, собственные результаты, обсуждение полученных данных, общее заключение, выводы и список литературы из 211 отечественных и 162 зарубежных источников. Материалы диссертации изложены на 266 стр. машинописного текста. Работа иллюстрирована 35 таблицами, 98 микрофотографиями и рисунками. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован автором лично.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы мазки периферической крови, полученные от здоровых людей (250) и интакгных животных (кролики — 100, белые крысы — 40, морские свинки — 40, белые мыши — 40, собаки — 20, кошки — 20, черепахи — 20, куры —

40, голуби — 20, лягушки — 50).

Взятие крови для морфологического и цитохимического изучения проводили у лиц мужского пола в возрасте от 18 до 35 лет. Для забора материала у животных были отобраны только самцы, за исключением черепах, голубей и лягушек, у которых не проводилась половая идентификация. Все животные содержались в стандартных условиях вивария. Набор исследуемого материала осуществляли осенью (сентябрь, октябрь) в утренние часы. Опыты по сенсибилизации и анафилаксии проведены на 190 кроликах-самцах породы Шиншилла массой 2,5 — 3,5 кг. Животных сенсибилизировали противокоревым человеческим гамма-глобулином внутривенно трехкратно в дозе 0,1 мл на кг веса. Выбор этого антигенного препарата сделан в связи с тем, что белки крови, в особенности глобулины, обладают наиболее высокой анафилактогенной активностью (Адо А.Д., 1978).

Кровь для исследования брали дважды до начала эксперимента, через 10, 60 мин и 1 сут после первой сенсибилизирующей инъекции, через 2 сут после второго введения антигена, через 10 и 60 мин после третьей инъекции, на 5-е, 7-е, 11-е, 18-е и 25-е сутки сенсибилизации. Анафилактический шок вызывали на 25-е сутки эксперимента внутривенным введением того же антигена в дозе 4,5 — 5,5 мл на кг веса животного. Кровь для приготовления мазков брали в следующие сроки: непосредственно перед введением разрешающей дозы антигена, через 2, 5, 10, 20, 30 и 60 мин после введения. Взятие крови у экспериментальных кроликов проводили утром натощак из краевой вены уха. Количество лейкоцитов определяли мелан-жерным методом с помощью камеры Горяева. Для цитоморфо-логического исследования гематологических препаратов, полученных как от экспериментальных кроликов, так и интакгных объектов, применяли усовершенствованные фиксаторы и красители. Щелочную фосфатазу (ЩФ) (КФ 3.1.3.1.) выявляли методом одновременного азосочетания в собственной модификации (Михеев А.Г., 1985).

Цитохимическое исследование КФ (КФ 3.1.3.2.) проводили модифицированным методом азосочетания (МюИееу, ¿исЬапоу, 1972). СДГ (КФ 1.3.99.1) выявляли с помощью нитросинего тет-

разолия (Берстон М., 1965) и по методу Р.П.Нарциссова (1969). Для изучения НАД-диафоразы (КФ 1.6.99.1.) использовали модификацию способа Н.Т.Райхлина (Суханов А.Ф., Михеев А.Г., 1970), а пероксидазы (КФ 11.1.1.) — бензидиновый метод (Берстон М., 1965).

Выявление гликогена проводили с помощью ШИК-реакции, а липидов — Суданом черным В. Для цитохимического изучения катионных белков применяли модифицированный метод с прочным зеленым (Михеев А.Г., Павлова Г.Г., 1978).

Выбор цитохимических методик связан с участием ферментов и других веществ в осуществлении основных функций лейкоцитов. Катионные белки и пероксидаза обеспечивают бактерицидные свойства нейтрофилов и псевдоэозинофилов. КФ, как и другие лизосомальные ферменты, участвует в переваривании фагоцитированного материала. Гликоген является основным энергетическим материалом для нейтрофилов. Липиды играют важную роль в процессе фагоцитоза нейтрофилами и служат субстратом для синтеза простагландинов и тромбокса-нов при их активации. СДГ и НАД-диафораза являются ключевыми энзимами цикла Кребса и цепи переноса электронов.

Изучение и микрофотосъемку препаратов проводили на микроскопе МБИ-6 с масляной иммерсией при суммарных увеличениях 1575 и 2250 раз. Содержание ферментов и других веществ в лейкоцитах определяли полуколичественным методом, который адекватен для оценки многих цитохимических реакций (Хейхоу Ф., Кваглино Д., 1983). Кроме определения цитохимического показателя (ЦП) содержания веществ в лейкоцитах, при экспериментальной анафилаксии проводили вычисление индекса общей активности ЩФ и пероксидазы по методу М.Г.Шубича (1965), показывающего общую энзимати-ческую активность всех псевдоэозинофилов, содержащихся в стандартном объеме крови. Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами, определяя среднюю арифметическую, среднее квадратическое отклонение, ошибку средней арифметической, коэффициент вариации, коэффициент корреляции (Лакин K.M., 1990). Достоверность сравниваемых величин определяли по критерию Стьюдента. Обработку полученного цифрового материала производили с исполь-

зованием пакета программ "Statgraf" на ЭВМ IBM.

У лабораторных животных брали образцы красного костного мозга из диафизов бедренных костей, прилегающих к эпифизам. Из них готовили мазки и отпечатки. Для получения гистологических препаратов костного мозга применяли 2 типа фиксаторов: стандартный (Ценкер-формол) и оригинальный фиксатор-краситель, разработанный на базе изобретения (Ми-кеев А.Г., 1986). Материал после фиксации Ценкер-формолом проводили по известной схеме, заливали в парафин, срезы окрашивали по Нохту-Максммову (Афанасьев Ю.И. и др., 1967). При погружении образцов костного мозга в фиксатор-краси-гель, представляющий собой смесь метаноловых растворов основных тиазиновых гасителей, эозина и параформальдегида, одновременно с фиксацией происходит окрашивание всех струк-гур, что значительно упрощает дальнейшую обработку. После фиксации окрашенный материал пропитывали хлороформом или другим растворителем парафина, хлороформ-парафином, расплавленным парафином и заливали. Монтированные в предметные стекла парафиновые срезы заключали в полистирол.

С целью гистохимического изучения неспецифических фосфатов образцы костного мозга кроликов, крыс и морских сви-*ок фиксировали холодным абсолютным этанолом и заливали з легкоплавкий парафин (Михеев А.Г., Демко П.С., 1973; Ми-сеев А. Г., 1986).

Образцы красного костного мозга (объемом не более 1 мм3) сроликов, крыс и морских свинок фиксировали 4 ч в 2,5% растворе глутаральдегида на ОД М фосфатном буфере (рН 7,4), фомывали 0,1 М фосфатным буфером с 0,2 М сахарозой, до-[шксировали 1 ч в 1% растворе четырехокиси осмия, обезво-швали и заливали в эпон-аралдит. Ультратонкие срезы окра-иивали уран и лацетато м и свинцом по Рейнольдсу (Уикли Б., .975). Просмотр препаратов и их фотосъемку проводили в элек-ронном микроскопе JEM 100 В (Япония).

Для установления факторов, обеспечивающих стабильность 'эффекта Романовского" в гематологических препаратах, изу-[али влияние всех известных фиксаторов и красителей на вы-[вляемость оксифильных, базофильных, полихроматофильных [ метахроматических структур лейкоцитов в мазках крови и

костного мозга. Исследовали значение концентраций основных и кислых 1фасителей в гематологических фиксаторах и красителях и соотношений их молярных концентраций, видов и соотношений растворителей в маточных растворах красителей. Была изучена роль различных видов буферных смесей и их концентраций в рабочих растворах красителей.

Выполнение задачи определения оптимальных параметров цитохимического выявления неспецифических фосфатаз в лейкоцитах, которые бы не вызывали существенных изменений цитоплазматических структур лейкоцитов, требовало проведения ряда специальных исследований. Поэтому изучали влияние на интенсивность цитохимической реакции многих факторов: видов и концентраций субстратов, видов и концентрации солей диазония, видов буферных смесей, способов фиксации, рН инкубационных сред, времени и условий инкубации, способов до1фаски.

Сравнение результатов проводили на мазках крови, полученных от одних и тех же людей и животных, взятых в определенное время. Поэтому определение достоверности различий в этих исследованиях проводили непараметрическими методами статистики, вычисляя критерий Т — парный критерий Вилкок-сона (Гублер Е.В., Генкин А.А., 1973). Для изучения цитохимических свойств ЩФ нейтрофилов человека с высотам уровнем ее активности использовали мазки крови 20 больных бактериальной пневмонией, взятые в остром периоде.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Факторы стабильности "эффекта Романовского" в гематологических препаратах и парафиновых срезах. Способы окраски мазков крови и рецепты выпускаемых промышленностью гематологических фиксаторов и красителей за последние 80 лет практически не изменились. Это объясняется отсутствием исследований о влиянии состава гематологических реагентов на тинкториальные свойства клеточных структур. Нами проведено комплексное изучение разнообразных факторов, оказывающих влияние на окрашиваемость цитоплазматических и ядер-

ных компонентов лейкоцитов. Сравнительное изучение всех известных гематологических фиксаторов показало, что даже метанол, признанный во всем мире наилучшим реагентом, имеет ряд существенных недостатков: при последующей окраске по Романовскому или Нохту-Максимову очень слабо выявляется специфическая зернистость нейтрофилов и базофилов человека и животных, полностью растворяется зернистость базофилов кролика.

Гораздо хуже окрашиваются цитоплазматические и ядерные структуры после фиксации этанолом, хотя на практике этот фиксатор нередко используется при исследовании мазков крови и других цитологических препаратов (пунктатов, отпечатков различных органов). При фиксации 96" этанолом невозможно идентифицировать в препаратах базофильные гра-нулоциты, тучные клетки, изучить специфическую зернистость нейтрофилов.

Нами разработан новый фиксатор на базе этанола, которых! имеет ряд преимуществ перед метанолом: прекрасно сохраняет специфическую зернистость базофилов человека, кролика и других животных. Он готовится путем растворения в 96° этаноле параформальдегида, ацетата натрия и сульфосалици-ловой кислоты в строго определенных соотношениях.

Отечественной промышленностью выпускается только один вид концентрированных гематологических красителей — азур 2-эозин по Романовскому в растворе (ТУ 6 — 09 — 349 — 75). В указанном документе приведен его состав: 0,5% раствор смеси сухих красителей азур 2-эозина по Романовскому и азура 2 в глицерине и метаноле (1:19). Однако в ТУ 6-09-349-75 нет сведений о том, в каком соотношении берут 2 вида сухих красителей. По нашему мнению, в этом заключается причина непостоянства красящих свойств, а зачастую и непригодность различных партий поступающего в продажу раствора красителя Романовского.

Нами были испытаны 3 типа новых концентрированных (маточных) растворов гематологических красителей. Первый из них готовили на основе сухих красителей азура 2 и азур 2-эози-на по Романовскому в конечной концентрации 0,8% растворенных в смеси равных объемов метанола и глицерина. После

апробации многочисленных вариантов с различными молярными соотношениями основных и кислых красителей были установлены оптимальные значения 1,25:1. Второй тип экспериментальных маточных растворов красителей был приготовлен из смеси сухих красителей эозина-метиленового синего по Маю-Грюнвальду, азура 2 и эозина К. В качестве растворителей использовали смесь равных объемов метанола и глицерина. После испытания различных вариантов были подобраны наилучшие молярные соотношения основных тиазиновых красителей и эозина 1,2:1. Третий тип новых концентрированных красителей получали путем растворения сухих красителей эозин-метиленового синего типа Лейшмана, азура 2 и эозина К в смеси глицерина, метанола и этиленгликоля в объемных соотношениях 5:4:4. Найдено, что наилучшая окраска цитоплазма-тических и ядерных структур обеспечивается при следующем молярном соотношении основных тиазиновых красителей и эозина 1,1 : 1.

Мы обнаружили зависимость тинкториальных свойств лейкоцитов от вида и концентрации буферных смесей, используемых для приготовления рабочих растворов красителей. Распространенный фосфатный буфер имеет ряд недостатков, таких как необходимость хранения в холодильнике, нестойкость и др. Нами предложены оригинальные буферные системы: ацетатная, ацетатно-цитратная и фосфатно-цитратная. Найдено, что оптимальными конечными концентрациями всех буферных смесей в рабочих растворах красителей являются 0,01 — 0,005 М. При использовании концентрированных красителей 1-го и 2-го типов целесообразно употреблять ацетатно-цитратный и фосфатно-цитратный буферы, а маточного красителя 3-го типа — ацетат], -ш буфер. Предложенные буферные системы повышают устойчивость рабочих растворов красителей до 1 — 4 нед с момента приготовления.

Нами установлено, что наилучшее качество фиксации ци-топлазматических и ядерных структур обеспечивают растворы метанола, содержащие основные тиазиновые красители и эозин в определенных соотношениях. При использовании концентрированного красителя 1-го типа оптимальные результаты получены фиксацией препаратов метаноловым раствором смеси

азура 2 и азур 2-эозина по Романовскому при молярных соотношениях основных и кислых красителей 1,25:1. Для маточных растворов красителей 2-го и 3-го типов наиболее подходящими оказались метаноловые растворы тех же комплексов красителей при соответствующих молярных соотношениях.

Таким образом, главными факторами стабильности "эффекта Романовского" в гематологических препаратах являются оптимальные молярные соотношения основных тиазиновых красителей и эозина в фиксаторах и красителях, рН фиксаторов, виды и соотношение растворителей в маточных растворах красителей, виды, концентрация и рН буферных смесей.

На основе проведенных исследований разработаны 3 набора гематологических реагентов для фиксации и окрашивания мазков крови, костного мозга, пунктатов и отпечатков различных органов. Каждый набор (ФКБМ) включает модифицированные фиксатор, краситель и концентрированный буфер, изготавливаемые из химреактивов отечественного производства. Указанные наборы обеспечивают высокое качество окраски цитоплазматических и ядерных структур, быстроту приготовления препаратов (от б до 15 мин), многократное использование рабочих растворов красителей (до 1 — 4 нед с момента приготовления). Наборы ФКБМ прошли успешные испытания во многих крупных клинических лабораториях Кемерова, Новосибирска, Томска, Волгограда и используются в практической работе.

Известно, что ни одна из существующих гистологических методик не позволяет выявлять в парафиновых срезах базо-фильные гранулоциты, нейтрофильную и азурофильную зернистость лейкоцитов. Мы нашли объяснение этому факту: окраске срезов предшествует большое количество операций (фиксация, промывка, обезвоживание и др.), что приводит к разрушению и экстракции многих веществ из указанных структур. Нами разработан новый способ изготовления гистологических препаратов, обеспечивающий изучение базофильных грануло-цитов, тучных клеток, всех видов лейкоцитов, иммунокомпе-тентных клеток наряду со структурными элементами эпителиальной, мышечной и нервной тканей.

Сущность метода заключается в том, что материал фикси-

руют в смеси метаноловых растворов основных тиазиновых красителей и эозина в определенных соотношениях, затем окрашенные кусочки заливают в парафин. Депарафинированные срезы дифференцируют в смеси абсолютного спирта и ксилола (1:1) или ацетона и ксилола и заключают в полистирол. Процесс окрашивания осуществляется одновременно с фиксацией материала, что и обеспечивает дифференцированное выявление цитоплазматических и ядерных структур. В связи с тем, что в каждой клетке имеются мощные буферные системы, ок-рашиваемость структур определяется значениями рН в момент фиксации. Таким образом, основными факторами стабильности "эффекта Романовского" в гистологических препаратах являются совмещение во времени процесса окраски с фиксацией материала и строго определенное молярное соотношение основных и кислых красителей в метаноловом растворе фиксатора.

В срезах красного костного мозга кроликов специфическая зернистость базофильных гранулоцитов окрашивается в различные оттенки от сине-фиолетового до вишневого цвета. При этом по форме и структуре ядра легко идентифицировать зрелые базофилы, базофильные метамиелоциты, миелоциты и про-миелоциты. Псевдоэозинофильная зернистость имеет крупные размеры и ярко-красную окраску. Эозинофильныс гранулы отличаются от псевдоэозинофильных большим диаметром, круглой формой с ровными контурами и менее интенсивной окси-филией. В препаратах хорошо выявляются эритробластические элементы, лимфоциты, макрофаги, плазматические клетки, фибробласты, все виды клеток сосудистой стенки и др.

Новый способ гистологической обработки открывает реальные возможности для изучения в срезах различных органов всех типов 1ранулоцитов, как внутрисосудистых, так и тканевых (вышедших из циркуляции). Известно, что гранулоциты циркулируют в крови всего несколько часов, а затем выходят в ткани, превращаясь в тканевые базофилы, тканевые нейтрофилы и тканевые эозинофилы. Мы считаем неправомочным один из последних терминов для обозначения тучной клетки "тканевый базофил", т.к. единственно правильная расшифровка этого названия — базофильный гранулоцит, вышедший из крови

в соединительную ткань.

Зависимость результатов цитохимического исследования неспецифических фосфатаз лейкоцитов от условий проведения реакций. Учитывая мнение многих авторов (Шубич М.Г., Нагоев B.C., 1980; Хейхоу Ф., Кваглино Д., 1983) о влиянии параметров проведения цитохимических реакций на получаемые результаты, мы решили детально изучить этот вопрос. Все многообразие используемых в настоящее время модификаций исследования КФ в лейкоцитах можно свести к нескольким вариантам, включающим комплекс существенных признаков (Jos-hi, Andleigh, 1967). Проведенное нами тщательное сравнение вышеуказанных методик с использованием полного набора контрольных реакций показало, что только модификация Goldberg, Barca (1962) обеспечивает выявление КФ, тогда как остальные давали ложную положительную реакцию. Мы нашли причину неудовлетворительных результатов при использовании методик Suzuki (1965) и Joshi, Andleigh (1967): в состав инкубационных сред входят стабильные диазотаты (прочный гранатовый GBC, прочный синий ВВ), которые содержат ионы фтора, являющиеся сильными ингибиторами КФ. Следует заметить, что в процессе производства для стабилизации солей диазония применяют либо борфторид, либо соли цинка, а в магазины "Химреактивы" нашей страны поступали только соли диазония с борфторидом.

Методика Goldberg, Barca (1962) имеет ряд недостатков, отмечаемых ее авторами: низкий контраст реакции и выраженное изменение морфологии клеток. Поэтому предпринято изучение влияния самых различных факторов на интенсивность отложений азокрасителя в местах ферментативной активности. При использовании различных субстратов выяснилось, что наиболее высокие ЦП обеспечивает фосфат нафтола AS-BS, средние значения дают фосфаты нафтолов AS-MX, AS-BI, AS-TR, AS-OL и а-нафтилфосфат, а самые низкие — фосфаты нафтолов AS-D и AS-E. Указанная зависимость выявлена в нейтро-филах и лимфоцитах человека и соответствующих лейкоцитах кролика, причем результаты, полученные с фосфатом нафтола AS-BS, достоверно отличаются (Р<0,001) от всех остальных субстратов. При повышении концентрации фосфата нафтола AS-

BS с 0,05 до 0,1 мг/мл обнаружено значительное (Р<0,01) повышение ЦП КФ в лейкоцитах, которые, однако, существенно не изменялись при дальнейшем увеличении количества субстрата в инкубационной среде. Повышение концентрации а-нафтилфосфата с 1 до 4 мг/мл приводило к достоверному увеличению ЦП КФ в лейкоцитах человека и кролика (Р<0,01). Выявлена противоположная зависимость интенсивности цитохимической реакции от концентрации гексаазотированного па-ророзанилина при использовании в качестве субстратов фосфатов азотолов и а-нафтилфосфата. Так, если с фосфатом нафтола AS-BS при снижении концентрации нестабильной соли диазония с 0,0048 М до 0,0012 М ЦП КФ в лейкоцитах достоверно увеличивались, то с а-нафтилфосфатом, наоборот, снижались. Испытания известных способов фиксации показали, что большинство из них в значительной степени подавляет активность КФ, остальные, хотя и дают довольно высокие ЦП, приводят к выраженным морфологическим изменениям в клетках. Только предложенная нами кратковременная фиксация в парах формалина (20 сск) обеспечивает сочетание высоких ЦП КФ в лейкоцитах с наилучшей сохранностью клеточных структур. Полученные результаты позволили обосновать оптимальные параметры цитохимического выявления КФ в лейкоцитах.

Общеизвестно, что ионы магния являются активаторами ЩФ, однако они не входят в состав известных инкубационных сред при использовании методов азосочетания (Шубич М.Г, 1965; Rutenburg et al., 1965; Хейхоу Ф., Кваглино Д., 1983). Поэтому мы решили выяснить, какое влияние оказывает присутствие ионов магния в инкубационной среде на интенсивность цитохимической реакции. Используя среды с фосфатом нафтола AS-D в качестве субстрата и стабильными солями диазония (прочным гранатовым GBC и ВВ), нашли, что наличие ионов магния вызывает выраженное (на 25-40%) повышение ЦП ЩФ как в псевдоэозинофилах кролика, так и нейтро-филах человека. Применение различных субстратов показало, что наиболее интенсивную цитохимическую реакцию обеспечивает фосфат нафтола AS-D, интенсивную — фосфаты на-фтолов AS-MX, AS-OL и AS-E, а самую слабую — фосфаты нафтолов AS-BS, AS-BL и AS-TR.

Получаемые результаты зависят также от вида соли диазо-ния. Так, инкубационные среды с прочным гранатовым GBC, прочным синим ВВ и прочным красным TR давали высокие ЦП в лейкоцитах, тогда как с прочным красным В, прочным синим В и прочным черным К оказались непригодными, очень быстро разлагаясь в щелочной среде. Если в псевдоэозинофи-лах кролика все три соли диазония обеспечивали практически одинаковые ЦП, то в нейтрофилах человека с прочным синим ВВ получались более высокие результаты (в 1,5 — 2 раза по сравнению с прочным гранатовым GBC и прочным красным TR). Варьируя величины рН инкубационных сред, нашли различия в зависимости от типа использования субстрата. Если с фосфатами азотолов наиболее интенсивная реакция соответствует рН 8,3, то с а-нафтилфосфатом — 9,0. Проведенное сравнение б известных и 4 оригинальных способов фиксации препаратов показало, что сочетание наиболее интенсивной цитохимической реакции с хорошей сохранностью клеточных структур обеспечивает 1% раствор параформальдегида в смеси этанола, ацетона и дистиллированной воды (4:3:3) при 0-4° С и пары формалина в течение 20 сек.

Биохимическими исследованиями доказано, что ЩФ проявляет активность не только в щелочных, но и нейтральных и даже кислых средах (Schofield et al., 1977; Шубич М.Г., Нагоев Б.С., 1980). Активность КФ также может проявляться в широком диапазоне рН от 3,4 до 6,5 (Берстон М., 1965). Однако до сих пор неизвестно, в каких интервалах рН выявляются цитохимическими методами ЩФ и КФ лейкоцитов. Для решения этих вопросов использовали инкубационные среды с рН от 10,0 до 4,0 с фосфатами нафтолов AS-D и AS-BS. Для подавления активности КФ в среды добавляли фторид натрия в конечной концентрации 0,01 М, а ЩФ ингибировали разработанным нами способом предварительной обработки мазков 0,1 М раствором этилендиаминтетраацетата натрия при рН 6,2 или 0,03 М раствором нитрата алюминия при рН 4,2.

Мы установили, что ЩФ лейкоцитов кролика, белой крысы и морской свинки выявляется цитохимически не только в щелочных средах, но в нейтральной (рН 7,0) и при меньших значениях рН (6,5; 6,0; 5,5 и 5,0). Безусловно, что при рН 5,5 и

особенно 5,0 количество отложений азокрасителя резко снижалось. КФ лейкоцитов вышеуказанных животных обнаруживается в узком диапазоне pH от 4,0 до 6,0 с максимальными ЦП при pH 5,0. Полученные данные позволяют утверждать, что при использовании стандартных инкубационных сред с pH 5,0 в псевдоэозинофилах кролика, морской свинки и крысы определяются завышенные ЦП КФ за счет дополнительной остаточной активности ЩФ. Поэтому для выявления истинной активности КФ в лейкоцитах у этих животных необходимо предварительно обрабатывать мазки ингибиторами ЩФ.

Различные исследователи, занимавшиеся сравнительным изучением ЩФ лейкоцитов (Шубич М.Г., Нагоев B.C., 1980; ХейхоуФ., КваглиноД., 1983), высказывают единодушное мнение о принципиальных отличиях ЦП ЩФ человека от других животных. При изучении ЩФ нейтрофилов здоровых людей мы обнаружили широкие диапазоны pH, в которых цитохими-чески выявляется данный фермент и такую же зависимость от вида использованного субстрата у кролика, крысы и морской свинки.

Представлялось интересным выяснить, отличаются ли свойства ЩФ лейкоцитов у больных с высоким уровнем ее активности. Для этой цели использовали мазки крови больных бактериальной пневмонией, полученные в остром периоде заболевания. Оказалось, что ЩФ нейтрофилов указанных больных быстро расщепляет фосфат нафтола AS-D и очень медленно фосфаты нафтолов AS-BS, AS-BI и AS-TR, т.е. степень расщепления различных субстратов аналогична таковой здоровых лиц и интактных животных (кроликов, крыс, морских свинок). Если ЩФ лейкоцитов здоровых лиц отличается от аналогичного фермента вышеперечисленных животных гораздо меньшей активностью и сужением диапазона выявляемости в кислых средах (до 5,5), то у больных указанных различий не отмечается. Мы установили, что при цитохимическом исследовании КФ лейкоцитов у больных пневмонией при pH 5,0 получаются завышенные ЦП за счет дополнительной остаточной активности ЩФ.

Таким образом, проведенные исследования позволили обосновать оптимальные параметры цитохимического выявления

неспецифических фосфатаз, не вызывающие существенных морфологических изменений в клетках. Выявленные зависимости интенсивности реакции на неспецифические фосфатазы от вида субстрата, типа соли диазония, способа фиксации позволяют объективнее разобраться в результатах многочисленных исследований, проводившихся при неодинаковых параметрах. Установленная способность ЩФ лейкоцитов человека и животных давать положительную цитохимическую реакцию в кислых средах позволила обосновать необходимость дополнительной контрольной реакции при исследовании КФ нейтро-филов: обработки мазков перед инкубацией ингибиторами ЩФ. Выявлена общность ряда свойств ЩФ здоровых лиц с таковой кролика, крысы, морской свинки (степень расщепления различных субстратов и др.). ЩФ больных бактериальной пневмонией цитохимически выявляется в более широком диапазоне pH (вплоть до 5,0), который аналогичен таковому у кролика, крысы и морской свинки.

Сравнительные аспекты морфоцитохимических связей в нейтро-фильных и псевдоэозинофильных лейкоцитах. Для изучения связей между цитохимией и морфологией лейкоцитов использовали усовершенствованные гематологические фиксаторы и красители, обеспечивающие стабильность "эффекта Романовского" и модифицированные цитохимические методы, не вызывающие изменений цитоплазмагических и ядерных структур в процессе проведения реакций. В сегментоядерных нейтрофи-лах лягушки на фоне базофильно-полихроматофильной цитоплазмы выявлены очень мелкие специфические гранулы, слабо окрашивающиеся эозином. По сведениям одних авторов (За-варзин A.A., 1953; Макаров М.С., 1975), цитоплазма указанных клеток амфофильна и не содержит зернистости, другие (Гольд-берг Д.И. и др., 1973; Павлова Т.Г., 1982) отмечают сродство гранул к основным красителям.

Противоречивость литературных данных объясняется как различиями способов фиксации и окраски препаратов, так и обнаруженным нами изменением тинкториальных свойств специфической зернистости нейтрофилов лягушки в процессе хранения неокрашенных препаратов. Оксифилия гранул определяется только при окраске мазков в течение первых 2 сут после

их приготовления, а в более поздние сроки они становятся полихроматофильными. Катионные белки обнаружены в цитоплазме нейтрофилов в виде очень мелких гранул круглой или слегка вытянутой формы, которые по количеству, размерам, форме и характеру расположения в клетке полностью соответствуют специфической зернистости. Описанную отрицательную реакцию на катионные белки в нейтрофилах лягушки (Шубин М.Г., Славянский А.А., 1977) мы объясняем недостаточной чувствительностью использованной ими цитохимической методики. При выявлении пероксидазы наблюдается очень высокая ферментативная активность в нейтрофилах (рис. 1). Обильные отложения окисленного бензидина заполняют всю цитоплазму, причем на интенсивно окрашенном фоне выделяются многочисленные очень мелкие зерна резко насыщенного цвета, по количеству и характеру распределения соответствующие нейтрофильной зернистости. Указанный характер реакции свидетельствует о локализации пероксидазы в специфических гранулах, а окрашивание окружающей цитоплазмы связано с диффузией продуктов реакции.

Применяя комплекс контрольных реакций на неспецифические фосфатазы, мы доказали отсутствие ЩФ в нейтрофилах лягушки. Описанную многими авторами (Нишанбаев К.Н., 1971; Гильдива Б.С., Рахимов Д.Р., 1979; Fey, 1966; Curtis et al., 1979) слабую активность ЩФ в нейтрофилах лягушки следует расценивать как артефакт, связанный с остаточной активностью КФ. При выявлении КФ более половины нейтрофилов лягушки дают очень интенсивную реакцию. Наличие очень мелких светлых участков на интенсивно окрашенном фоне диффузного характера свидетельствует об отсутствии фермента в специфических гранулах и локализации КФ в окружающих участках цитоплазмы. Нейтрофилы дают очень интенсивную ШИК-реакцию (см. рис. 1), которая носит диффузно-гранулярный характер.

Следует отметить, что гранулярные отложения красителя не связаны со специфической зернистостью. Липиды выявляются в виде очень мелких иеинтенсивно окрашенных гранул, полностью соответствующих специфической зернистости. Таким образом, для нейтрофилов лягушки характерно отсутствие азурофильных гранул, наличие очень мелкой специфической

Рис 1. Цитохимические показатели нейтрофильных и псевдоэозинофильных

гранулоцитов крови

По оси ординат- цитохимические показатели (в условных единицах)

□ катонные белки !3 кислая фосфатаза ипероксцдаза

■ щелочная фосфатаза а гликоген о л ил иды

По оси абсцисс - виды исследованных объектов

зернистости, слабо воспринимающей эозин и содержащей пе-роксидазу, катионные белки и липиды. Очень высокие ЦП гликогена и КФ, как и отсутствие ЩФ, являются отличительными чертами данных видов лейкоцитов.

В псевдоэозинофильных гранулоцитах черепах специфическая зернистость многочисленная, имеет очень крупные размеры, овальную, ромбовидную, треугольную или трапециевидную форму и интенсивно окрашивается эозином. Изучение внутриклеточного распределения продуктов цитохимических реакций показало, что катионные белки находятся исключительно в составе псевдоэозинофильной зернистости, а пероксидаза, ЩФ, КФ и гликоген — в межгранулярных участках цитоплазмы. Обнаружены высокие ЦП катионных белков, довольно высокий уровень активности ЩФ и перокевдазы и средние значения ЦП КФ (см. рис. 1). Таким образом, псевдоэозино-фильные гранулоциты черепах характеризуются отсутствием азу-рофильных гранул, наличием очень крупной специфической зернистости, интенсивно окрашивающейся кислыми красителями и содержащей катионные белки. Особенностью псевдоэ-озинофилов черепах является локализация пероксидазы и ЩФ не в специфических гранулах, а окружающей их цитоплазме.

Псевдоэозинофилы кур и голубей содержат многочисленную крупную специфическую зернистость, которая интенсивно окрашивается эозином и имеет палочковидную форму с заостренными концами или вид уплощенного ромба. Характер распределения продуктов цитохимических реакций свидетельствует о локализации катионных белков исключительно в псевдоэозинофильных гранулах, а КФ и гликогена — в цитоплазме между ними. Полученная нами отрицательная реакция на пе-роксидазу находится в соответствии с литературными данными (Нишанбаев К.Н., 1971; Rausch et al., 1975; Wang, 1991). С помощью комплекса контрольных реакций нами доказано отсутствие ЩФ в лейкоцитах кур и голубей. Описанную локализацию ЩФ в псевдоэозинофилах птиц (Нишанбаев К.Н., 1971) можно объяснить отложениями продуктов реакции за счет остаточной активности КФ. Псевдоэозинофильные гранулоциты кур и голубей имеют очень близкие цитохимические свойства, включающие высокие ЦП катионных белков, тогда как содер-

жание КФ и гликогена чуть ниже среднего уровня (см. рис. 1).

Нами установлено, что тинкториальные свойства цитоплаз-матических структур нейтрофилов человека зависят как от составов фиксирующих и красящих растворов, так и значений их рН. Использование усовершенствованных гематологических фиксаторов и красителей позволило выявить обилие зернистости и выделить 2 типа гранул. В цитоплазме нейтрофилов здоровых лиц преобладают гранулы I типа, очень мелкие, окрашивающиеся эозином и имеющие круглую (чаще) или вытянутую форму. Во всех нейтрофилах имеются гранулы И типа, окрашивающиеся метахроматическй в различные цвета от вишневого до сине-фиолетового. Большинство из них такие же мелкие, как и гранулы I типа, хотя некоторые бывают крупнее. Количество гранул II типа в нейтрофилах варьирует очень сильно: от единичных до двух-трех десятков.

На периферии отдельных клеток имеются слабо базофиль-ные участки треугольной, овальной или иной формы, не содержащие зернистости. Размеры беззернистых участков цитоплазмы бывают различными: от еле заметных до значительных. Количество указанных базофильных участков цитоплазмы в одном нейтрофиле может быть от 1 до 2-3, которые располагаются на противоположных концах клетки. Необходимо отметить, что при использовании стандартных гематологических фиксаторов и красителей беззернистые участки цитоплазмы в нейтрофилах не выявляются. Мы полагаем, что их наличие свидетельствует об активности нейтрофилов.

Не вызывает сомнений, что описанные гранулы I типа являются типичными специфическими (вторичными). Гранулы II типа резко отличаются от азурофильных (первичных) гранул промиелоцитов и миелоцитов костного мозга человека мелкими размерами, слабой окраской и менее выраженной метахро-мазией. Указанные отличительные признаки не позволяют нам причислить гранулы II типа к категории первичных. Вероятно, они являются разновидностью специфических гранул, представляя собой их более зрелые формы.

Катионные белки обнаруживаются в нейтрофилах человека как мелкие образования зеленого цвета, равномерно расположенные в цитоплазме. Подсчет показал, что их количество в

одной клетке колеблется от 90 до 200 и соответствует числу 1ранул, выявляемых при усовершенствованной гематологической окраске. Определяя парный критерий Вилкоксона для сравнения количества окрашенных прочным зеленым гранул с числом нейтрофильной зернистости в препаратах, полученных от одних и тех же лиц, нашли очень высокие значения критерия Т, подтверждающие несущественность различий между ними. Приведенные данные служат подтверждением локализации катионных белков в нейтрофильной зернистости. Для нейтро-филов человека характерны довольно высокие ЦП катионных белков (см. рис. 1).

Гранулярный характер цитохимических реакций на перок-сидазу и липиды в нейтрофилах человека, их внутриклеточное распределение свидетельствуют о локализации данных веществ в специфических гранулах. Однако активность ЩФ не связана с нейтрофильной зернистостью: до 40% клеток дают отрицательную реакцию, в преобладающем большинстве нсйтрофи-лов гранулы азокрасителя обнаруживаются лишь в отдельных участках цитоплазмы. Для нейтрофилов здоровых лиц характерны низкие ЦП ЩФ (см. рис. 1). Мы обнаружили КФ в 100% нейтрофилов, причем отложения азокрасителя диффузного характера заполняют всю цитоплазму. Полученные нами ЦП КФ (см. рис. 1), как правило, в 2 — 3 раза превышают литературные данные (Михеева А.И. и др., 1970; Нагоев B.C., 1976; Нестерова И.В. и др., 1989). Указанные расхождения объясняются использованием нами оптимальных параметров цитохимического выявления КФ. Описанный многими исследователями 1ранулярный характер реакции (Joshy, Andleigh, 1967; Хейхоу Ф., Кваглино Д., 1983) зависит от применения прочных диазо-татов, образующих только дискретные осадки азокрасителя.

Специфическая зернистость нейтрофилов млекопитающих отличается выраженными видовыми особенностями, причем литературные данные по этому вопросу носят противоречивый характер (ГольдбертД.И. и др., 1973; Кудрявцева A.A., Кудрявцева Л.А., 1974). С помощью усовершенствованных фиксаторов и красителей нам удалось охарактеризовать тинкториаль-ные свойства специфических гранул нейтрофилов кошки, собаки, крысы и мыши, у которых, по мнению А.А.Заварзина

(1953) и Д.И.Гольдберга и соавт. (1973), зернистость выражена очень слабо или вовсе не выявляется. В нейтрофилах собак мы наблюдали мелкие 1ранулы круглой или овальной формы, заполняющие всю цитоплазм и окрашивающиеся эозином в бледно-розовый цвет. Специфическая зернистость нейтрофилов кошки также проявляет оксифильные свойства, хотя по размерам мельче, чем у собаки. У крысы многочисленные цитоплаз-матические гранулы интенсивно окрашиваются эозином. Зернистость нейтрофилов мыши очень мелкая, проявляет сродство к эозину, но имеет бледную окраску. Для морской свинки характерна мелкая зернистость интенсивно красного цвета, редко расположенная в слабо-базофильной цитоплазме. Псев-доэозинофилы кролика содержат крупные гранулы круглой формы, ярко окрашивающиеся кислыми красителями.

Детальное изучение нейтрофилов и псевдоэозинофилов крови различных видов млекопитающих и отдельных представителей птиц, рептилий и амфибий позволило выявить общность тинкториальных свойств специфических гранул: сродство к эозину. Нами обнаружены также общие признаю! морфологической организации зрелых нейтрофилов и псевдоэозинофилов крови всех исследованных объектов: наличие в цитоплазме специфических гранул и отсутствие азурофильных (первичных).

Во многих руководствах приводятся неточные описания тинкториальных свойств специфической зернистости нейтрофилов человека: сродство к кислым и основным красителям. Если бы это соответствовало действительности, их следовало бы назвать полихроматофильными гранулоцитами. В последние 30 лет в зарубежной литературе стали широко применять термин "полиморфноядерный лейкоцит" для обозначения нейтрофилов и псевдоэозинофилов. С нашей точки зрения, указанный термин является неудачным, т.к. не отражает тинкто-риальные свойства цитоплазматических структур. Что же касается ядра, то другие типы гранулоцигов (эозинофильный и ба-зофильный) также обладают выраженным разнообразием формы и структуры ядерных компонентов.

Псевдоэозинофилы рептилий и птиц нередко называют ге-терофилами (Заварзин АА., 1953; Sorrel, Weiss, 1980; Wang, 1991). В связи с тем, что указанное название не раскрывает ни мор-

фологических, ни функциональных особенностей клетки, его нельзя считать приемлемым. А.А.Максимов (1927) предложил термин "специальный лейкоцит" для нейтрофилов и псевдоэ-озинофилов всех классов позвоночных на основании их способности к фагоцитозу. Данное название отражает функциональные свойства клетки, поэтому, по нашему мнению, оно предпочтительнее других (нейтрофил, полиморфноядерный лейкоцит).

Обнаруженное нами сродство к эозину специфической зернистости нейтрофилов и псевдоэозинофилов всех исследованных объектов можно рассматривать как аргумент для обоснования единого термина для этой категории гранулоцитов: "псев-доэозинофил". Как правило, псевдоэозинофилами называют клетки с крупной специфической зернистостью (у рептилий, птиц и некоторых видов млекопитающих — кролика, лошади). Хотя у морской свинки, крысы, собаки специфическая зернистость мелкая, но окрашивается исключительно эозином, поэтому название "псевдоэозинофил" соответствует тинкториаль-ным свойствам их гранул, тогда как "нейтрофил" — противоречит.

Цитохимическая реакция на катионные белки в лейкоцитах млекопитающих является гранулярной, соответствует специфической зернистости, причем наиболее высокие ЦП обнаружены у кролика, довольно высокие у человека, а самые низкие у кошки и мыши (см. рис. 1). Выявленная локализация катион-ных белков в специфической зернистости нейтрофилов и псевдоэозинофилов всех исследованных нами объектов свидетельствует об общности их цитохимической организации. Наличием катионных белков в специфических гранулах объясняются их тинкториальные свойства — сродство к эозину. Степень окраски указанных гранул эозином определяется количеством содержащихся катионных белков.

Видовые особенности цитохимии лейкоцитов млекопитающих отличаются чрезвычайным разнообразием (см. рис. 1). Выявленные различия можно рассматривать как компенсаторное перераспределение различных компонентов микробоцидных систем, необходимых для выполнения их основной функции — фагоцитоза. Так, отсутствие ЩФ и низкий уровень актив-

ности КФ в нейтрофилах собаки сочетаются с очень высокими ЦП пероксидазы и гликогена и средними значениями содержания катионных белков. Для крысы характерны средние величины (около 200) ЦП катионных белков, гликогена, липи-дов, довольно высокая активность ЩФ и более низкий уровень КФ (см. рис. 1).

В нейтрофилах и псевдоэозинофилах крови представителей млекопитающих, птиц, рептилий и амфибий выявлена КФ, причем характер цитохимической реакции одинаков — диффузный. Наиболее высокий уровень активности КФ определяется у лягушки, что можно объяснить принадлежностью к пой-килотермным животным: при снижении температуры сохраняется остаточная ферментативная активность. Характер распределения азокрасителя свидетельствует об отсутствии КФ в специфической зернистости нейтрофилов и псевдоэозинофилов у всех изученных объектов. По данным большинства авторов, КФ локализуется в первичных гранулах (Хейхоу Ф., Кваглино Д., 1983; Krause et al., 1990). Однако в большинстве работ исследовали не лейкоциты периферической крови, а созревающие клетки костного мозга. Кроме того, многие исследователи отмечают низкую воспроизводимость результатов электронно-цитохимического выявления КФ, что ставит под сомнение данные, полученные с помощью свинцового метода. Нами было обнаружено, что при добавлении в инкубационную среду солей свинца в концентрации, используемой в указанном методе, происходит полное подавление активности КФ в лейкоцитах человека и кролика. Мы считаем, что следует подходить с большой осторожностью к оценке результатов, полученных с использованием свинцового метода.

Несмотря на то, что большинство исследователей признает наличие двух типов гранул в цитоплазме нейтрофилов человека и животных, описания их ультраструктуры являются противоречивыми (Bainton, 1975; ХэмА., КормакД., 1983; Афанасьев Ю.И. и др., 1989; Borregaard et al., 1995). Даже для такого хорошо изученного объекта, как нейтрофил человека, значительно отличаются приводимые различными авторами размеры, форма, электронная плотность и внутренняя структура первичных и вторичных гранул. О низкой информативности су-

ществующих электронно-микроскопических методов исследования клеток крови свидетельствует факт отсутствия четких ультраструктурных отличий токсикогенной зернистости нейтро-филов больных с тяжелыми инфекциями от гранул клеток здоровых лиц (Мс Call et al., 1969; Takeshita et al., 1990). Известно, что морфологические особенности токсикогенной зернистости выявляются очень четко на микроскопическом уровне и широко используются в клинической лабораторной диагностике.

Некоторые авторы с помощью особой фиксации материала наряду с первичными и вторичными описали третичные гранулы, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (Scott, Horn, 1970; Kimata, 1987; Lollike et al., 1992). В третичных гранулах обнаружены КФ и сульфатированные гликозаминогликаны. Используя стандартную фиксацию костного мозга (глутаральдегидом и осмием), мы изучали ультраструкгуру 1ранул в сегментоядерных псев-доэозинофилах кролика, морской свинки и белой крысы.

Нам не удалось найти надежных критериев, которые позволяли бы дифференцировать различные типы гранул. Существующие электронно-микроскопические методы фиксации и окраски препаратов не позволяют получить объективную информацию о морфологии лейкоцитов. Общеизвестно, что для изучения клеток крови и соединительной ткани на микроскопическом уровне обычные способы гистологической обработки (фиксация формалином и окраска гематоксилин-эозином) также являются неприемлемыми. По нашему мнению, для изучения ультраструктуры лейкоцитов необходимы особые способы фиксации материала.

Учитывая диффузный характер отложений азокрасителя при выявлении КФ в нейтрофилах человека и псевдоэозинофилах кролика, ультраструкгура которых изучена наиболее полно, мы полагаем, что ферментативная активность связана с третичными гранулами. Диффузный характер цитохимической реакции на КФ можно объяснить очень мелкими размерами третичных 1ранул, лежащих за пределами разрешающей способности светового микроскопа. Полученные результаты сравнительного изучения КФ позволяют предположить, что у всех видов животных фермент локализуется в третичных гранулах.

Таким образом, морфоцитохимическое изучение зрелых нешрофилов и пеевдоэозинофилов крови у представителей различных классов позвоночных позволило выявить зависимость цитохимических свойств лейкоцитов от их морфологии. Связь цитохимии и морфологии наиболее ярко выражена в отношении катионных белков. В нейтрофилах и псевдоэозинофилах у всех исследованных объектов наблюдалось полное соответствие окрашенных прочным зеленым гранул их специфической зернистости. Установленная зависимость позволяет судить о содержании катионных белков по морфологическим препаратам, для фиксации и окраски которых использованы реагенты, обеспечивающие стабильность "эффекта Романовского". Специфическая зернистость человека и гомологичных лейкоцитов млекопитающих отражает уровень пероксидазы и липидов, а у кролика, крысы и морской свинки также и ЩФ. Имеющиеся в отдельных нейтрофилах и псевдоэозинофилах базофильные беззернистые участки цитоплазмы не содержат катионных белков, пероксидазы, липидов, ЩФ и КФ.

Морфоцитохимнческие изменения в лейкоцитах при белковой сенсибилизации. Взятие крови для морфологического и цитохимического исследования у каждого экспериментального животного дважды до начала эксперимента обеспечивало надежный индивидуальный контроль. В самые ранние сроки наблюдений (через 10, 60 мин и 1 сут после 1-й инъекции антигена) нам не удалось обнаружить существенных изменений в лейкоцитах. Этот факт свидетельствует, что при первом контакте различных видов лейкоцитов кролика с антигеном не происходит существенных морфологических и цитохимических сдвигов, которые выявлялись бы на микроскопическом уровне.

Через 2 сут после 2-го введения антигена (или 4 сут с начала сенсибилизации) наблюдается статистически достоверное увеличение относительного и абсолютного содержания эози-нофилов, пеевдоэозинофилов, мезоформ средних лимфоцитов, моноцитов и гипербазофильных лимфоцитов (рис. 2, 3). Гораздо более выраженные изменения выявлены после 3-й сенсибилизирующей инъекции. Так, уже через 10 мин развивается значительная лейкопения, псевдоэозинопения, базопения и относительный лимфоцитоз (см. рис. 2, 3). При этом в базофилах

Контроль 2 суток 10 минут ЕОмжуг сутки 7-е сутки 11-е сутки 18-е сутки 25-есутхи

после 2-й после 3-й после 3-й инъекции инъекции инъекции

Рис.2 Абсолютное содержание гранулоцитов в крови при сенсибилизации

По оси ординат- содерхание лейкоцитов в 1 литре крови (х107)

-Эоэшофилы - у - Баэофигы

Пала-коадереые эоэинофипы ~«--Сегменгоэдер«>Епсевдоэозлофиты

По оси абсцисс - сроки эксперимента

Контроль 2 суток 10 минут 60 минут 5-е сутки 7-есутки 11-е сутки 18-е сутки 25-е сутки

после 2-й после 3-й после 3-й инъекции инъекции инъекции

Рис.3 Абсолютное содержание агранулоцитов в крови при сенсибилизации

По оси ординат- содержание лейкоцитов в 1 литре крови (х107) —Общее количество лимфоцитов —микроформы мальк лимфоцпов

- * - Мезоформысредних лимфоцитов Гипербазофильные лимфоцтты

-х—Моноцггы

По оси абсцисс - сроки эксперимента

наблюдаются морфологические изменения: дегрануляция той или иной степени, появление псевдоподий, лишенных гранул. К концу первого часа отмечается лейкоцитоз, псевдоэозино-филия, моноцитоз, увеличение содержания гипербазофильных лимфоцитов. Для большинства базофилов характерна дегрануляция.

В мазках крови встречаются большие скопления лейкоцитов, насчитывающие 15-25 клеток, вплотную прилежащих друг к другу. Эти скопления состоят из морфологически неизмененных клеток, представленных псевдоэозинофилами и отдельными базофилами. Полученные данные свидетельствуют об изменении свойств лейкоцитов уже на 4-е сутки сенсибилизации. Дегрануляцию базофилов в течение 60 мин после 3-й сенсибилизирующей инъекции можно объяснить появлением молекул иммуноглобулина Е на поверхности указанных клеток. Наблюдаемая в течение 1-го часа лейкэргия подтверждает изменение реакции псевдоэозинофилов при контакте с антигеном на 4-е сутки эксперимента.

В последующие сроки (5 — 25-е сутки сенсибилизации) лейкоцитоз сохраняется, причем максимальные цифры приходятся на 18-е сутки. Одновременно повышается абсолютное содержание базофильных и псевдоэозинофильных гранулоци-тов, наиболее выраженное также на 18-й день эксперимента (см. рис. 2). Однако максимальная эозинофилия отмечается на 5-е сутки сенсибилизации, а в дальнейшем абсолютное содержание эозино филов существенно не отличается от контроля.

Наши данные, в основном, согласуются с литературными сведениями, характеризующими преимущественно поздние сроки сенсибилизации (Адо А.Д., 1978; Hutson et al., 1990; Sato et al., 1992). Однако Е.П.Сомова (1965) описывает максимальный лейкоцитоз и сдвиг формулы влево до миелоцитов на 25-й день сенсибилизации. По нашему мнению, причиной резко выраженного лейкоцитоза и появления в периферической крови метамиелоцитов и миелоцитов явилась не сенсибилизация лошадиной сывороткой, а многократная пункция костного мозга, приводящая к травматизации тканей и возможному проникновению инфекции. Многие исследователи наблюдали эози-нофилию в поздние сроки сенсибилизации (Hutson et al., 1990;

Leiferman et al., 1990). Анализ литературных данных подтверждает наше наблюдение, что в отличие от собак, для сенсибилизированных кроликов эозинофилия не характерна (Прегер О.М., 1960, 1965; Sato et al., 1992).

Цитохимическими исследованиями обнаружены значительные изменения в псевдоэозинофилах (рис. 4). С 4-х по 18-е сутки определяется достоверное повышение активности КФ (Р<0,001), которое становится менее выраженным на 25-е сутки (Р<0,05). Максимальные значения ЦП КФ приходятся на 5-е сутки, когда в периферической крови увеличивается количество клеток III типа и появляются клетки IV типа с очень интенсивной цитохимической реакцией, отсутствующие у контрольных животных. Значительное статистически достоверное увеличение активности ЩФ и пероксидазы в псевдоэозинофилах выявляется с 7-го по 25-й день эксперимента, причем максимальные величины определяются на 18-й день (см. рис. 4). В более ранние сроки изменения ЦП ЩФ и пероксидазы по сравнению с контролем выражены слабо и неодинаково: на 4-е сутки повышены для первого фермента и понижены для второго. Определение индексов общей активности ЩФ и пероксидазы показало, что на 18-е сутки сенсибилизации они превышают почти в 3 раза соответствующие цифры в контроле (см. рис. 4). Выявленные морфоцитохимические изменения псевдоэозино-филов крови свидетельствуют о влиянии антигена на красный костный мозг. Многие авторы находили увеличение элементов гранулоцитопоэза в мислограмме в поздние сроки сенсибилизации (Huston et al., 1990; Sato et al., 1992).

В связи с тем, что лимфоциты крови кролика в норме значительно отличаются размерами, структурой ядра и величиной цитоплазмы, среди малых и средних лимфоцитов мы выделили 2 подгруппы: микро- и мезоформы. Дифференцированный подсчет различных вариантов лимфоцитов позволил провести статистическую обработку и объективно оценить морфологические изменения в лимфоцитах в ходе эксперимента. Наибольшие изменения процентного соотношения различных морфо-гсогических вариантов лимфоцитов характерны для 7-х суток :енсибилизации: снижение микроформ малых лимфоцитов, повышение обеих подгрупп средних и гипербазофильных лим-

инъекции инъекции инъекции

Рис.4 Активность ферментов в лейкоцитах крови при сенсибилизации

По оси ординат- цитохимические параметры (в условных единицах)

—♦— ЦП КФ пеевдоэозинофилов -в— ЦП КФ лимфоцитов

- 4 - ЦП НАД-диафораз лимфоцтгов - л— Индекс общей активности ЩФ пеевдоэозинофилов

—*— Индекс общей активности пероксидазы пеевдоэозинофилов

По оси абсцисс - сроки эксперимента

фоцитов (см. рис. 3). Но максимальные сдвиги абсолютного содержания агранулоцитов приходятся на 11-й и 18-й дни эксперимента: лимфоцитоз, моноцитоз, повышение мсзоформ средних лимфоцитов и гипербазофильных лимфоцитов (см. рис. 3). В период с 7-х по 18-е сутки среди малых и средних лимфоцитов появляются атипичные формы, отличающиеся неровными контурами ядра. В цитоплазме средних лимфоцитов нередко обнаруживаются многочисленные вакуоли различной величины. В атипичных лимфоцитах выявляется высокая активность КФ. Достоверное повышение активности КФ в лимфоцитах определяется с 4-х по 25-е сутки эксперимента.

Повышение ферментативной активности зависит от увеличения содержания мезоформ средних лимфоцитов, дающих интенсивную цитохимическую реакцию и снижение микроформ малых лимфоцитов, в которых выявляется слабая активность КФ или наблюдается отрицательная реакция. При сенсибилизации сохраняется такая же зависимость ЦП КФ от морфологии лимфоцита, как и в контроле: чем больше размер клетки и количество цитоплазмы, тем выше их величины. Исключение доставляют гипербазофильные лимфоциты, в которых, как и в норме, наблюдается очень слабая реакция на КФ. На 7-е сутки :енсибилизации определяется наиболее выраженное повышение активности НАД-диафоразы и СДГ в лимфоцитах (см. рис. 1), хотя в остальные сроки с 4-х по 25-е сутки соответствую-цие ЦП ниже, но достоверно превышают исходный уровень.

Описанные нами морфологические и цитохимические изменения в лимфоцитах согласуются с литературными данными Huston et al., 1990; Chatham et al., 1995), в которых, однако, триводятся сведения лишь в отношении единичных сроков {аблюдений. Выявленные морфоцитохимические изменения в шмфоцитах периферической крови отражают происходящие в гимфоидных органах процессы пролиферации, дифферент*->овки, миграции иммунокомпетентных клеток под влиянием 1нтигена (Труфакин В.А., Робинсон М.В., 1989; Робинсон М.В., .994).

Морфоцитохимические параллели в лейкоцитах при анафи-[актическом шоке. Уже через 2 мин после введения разрешаю-цей дозы антигена наблюдается выраженная лейкопения, эози-

но-; базо- и псевдоэозинопения, лимфоцитопения и моноци-топения (рис. 5). На 5-й и 10-й минутах анафилактическою шока описанные изменения усиливаются, особенно базопения, но резко повышается количество микроформ малых лимфоцитов с пикнотическим ядром. На 30-й и 60-й минутах значительно повышается содержание псевдоэозинофилов по сравнению с предыдущими сроками, однако только количество палочкоядерных форм достоверно превышает исходный уровень (до шока), а сегментоядерных — не достигает значений у контрольных кроликов. При этом продолжает сохраняться эози-но-, базо- и моноцитопения и значительно повышается содержание широкоплазменных и гипербазофильных лимфоцитов.

Наряду с количественными выявляются выраженные морфологические и цитохимические изменения в различных видах лейкоцитов. Начиная с 2-й минуты, в псевдоэозинофилах уменьшается количество специфической зернистости и снижается степень окраски ее эозином, нередко появляются псевдоподии, не содержащие гранул. С указанными морфологическими изменениями связаны цитохимические: значительное снижение интенсивности реакций на пероксидазу, ЩФ и КФ, неравномерность распределения окисленного бензидина и азок-расителей в цитоплазме псевдоэозинофилов.

Описанные морфологические и цитохимические сдвига мы расцениваем как начальные проявления аллергической альтерации псевдоэозинофилов in vivo. В крови встречаются клетки с более выраженными морфоцитохимическими нарушениями: резкое уменьшение псевдоэозинофильных гранул, вакуолизация цитоплазмы, хроматинолиз отдельных или всех сегментов ядра, сильное уменьшение продуктов реакций на пероксидазу, ЩФ и КФ. Несомненно, что эти морфоцитохимические изменения отражают протекающий в сосудистом русле процесс аллергической альтерации псевдоэозинофилов, начинающийся с первых минут шока и усиливающийся до 10-20-й минут. Повреждение клеток завершается их разрушением в периферической крови: наблюдается нарушение целостности псевдоэози-нофила, лизис ядерных сегментов, сохранение незначительного количества гранул и изменение их структуры, локализация единичных отложений окисленного бензидина и азокрасите-

Ы

.. ч

400 350 300 250 200 150 100 50 0

25-е сутки сенсибил

V-—

2-ая минута шока

/

/

/

/

/

/

/

/

------------- ----£--------- ------- —Я _______А-"""""'

^

5-ая 10-ая 20-ая 30-ая

минута минута минута минута

шока шока шока шока

—»

60-ая минута шока

Рис.5 Абсолютное содержание гранулоцитов в крови кролика

анафилактическом шоке По оси ординат - количество лейкоцитов в 1 литре крови (107)

при

Эозинофилы - Палочкоядерные псевдоэозинофилы

—в»— Базофилы

Сегментоядерные псевдоэозинофилы

По оси абсцисс - сроки эксперимента

лей рядом с остатками ядра.

Нами получены экспериментальные доказательства, что псевдоэозинофил кролика служит клеткой-мишенью при аллергических реакциях немедленного типа. В литературе имеются сведения об отсутствии подобных экспериментальных подтверждений (Rubin et al., 1978; Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1983).

Для диагностики сенсибилизации к различным возбудителям инфекционных заболеваний и неинфекционным агентам широко применяется реакция нейтрофилов крови (тест ППН), при которой регистрируются только хемокинетические изменения после двухчасовой инкубации с высокой дозой аллергена (Фрадкин В.А., 1985; Sato et al., 1992). Доказано, что при постановке теста ППН не происходит необратимых изменений и гибели нейтрофилов.

Описанные нами морфологические и цитохимические критерии аллергической альтерации псевдоэозинофилов во время анафилактического шока отличаются от наблюдаемых in vitro при постановке теста ППН. В течение первых 10 мин анафилактического шока обнаружены изменения структуры базофиль-ных гранулоцитов, свидетельствующие об их аллергической альтерации in vivo: дегрануляция, вакуолизация цитоплазмы, хроматинолиз ядерных сегментов, кариолиз, разрушение клетки. В более поздние сроки базофилы в крови встречаются очень редко и представлены дегранулированными или разрушенными формами. Полученные нами доказательства лизиса базофи-лов в кровяном русле противоречат существующим представлениям, что феномен дегрануляпии тучных клеток и базофи-лов при аллергических реакциях отражает усиление их функции и не приводит к разрушению (Адо А.Д., 1978; Фрадкин В .А., 1985; Marone, Stellato, 1992).

Во время анафилактического шока у кроликов резко снижено содержание эозинофильных гранулоцитов, в мазках встречаются лишь единичные клетки без каких-либо морфологических и цитохимических изменений. Однако Е.П.Сомова (1965) отмечала относительную эозинофилию у собак. Причиной отличий динамики эозинофилов у собак во время анафилактического шока, по нашему мнению, являются их видовые осо-

бенности: в норме содержание эозинофилов у собак в 7 раз выше, чем у кроликов. Известно, что эозинофилы способны фагоцитировать комплекс антиген-антитело с последующим разрушением специфических гранул (Адо А.Д., 1978; Оштвал, 1983; Ье1Гегшап е1 а1., 1990). Отсутствие морфоцитохимических изменений в эозинофилах при шоке можно объяснить тем, что функцию фагоцитоза иммунных комплексов они выполняют не в крови, а в тканях.

В течение первых 10 мин шока одновременно с резким повышением содержания в крови малых лимфоцитов отмечается уплотнение структуры ядра и уменьшение цитоплазмы, в результате чего они приобретают вид "голых" пикнотических ядер.Эти изменения свидетельствуют об аллергической альтерации мальве лимфоцитов под влиянием комплекса антиген-антитело. С 20-й до 60-й минуты обнаружено значительное повышение содержания широкоплазменных лимфоцитов, которые, возможно, образуются в результате повреждения средних лимфоцитов. Во время анафилактического шока определяется достоверное снижение ЦП КФ, СДГ и НАД-диафоразы в лимфоцитах, наиболее выраженное на 10-й минуте (рис. 6).

В работе П.С.Демко (1995) показаны принципиальные различия морфофункциональных сдвигов в системе гипоталамус — гипофиз — периферические эндокринные железы при различной степени тяжести анафилактического шока. Наши данные свидетельствуют, что при любой форме шока в лейкоцитах обнаруживаются однотипные морфоцитохимические изменения, различия касаются лишь степени их выраженности. Так, при тяжелом шоке гораздо интенсивнее выражены морфологические и цитохимические признаки аллергической альтерации псевдоэозинофилов и базофилов, гораздо больше встречается в крови разрушенных псевдоэозинофильных и базофиль-ных гранулоцитов, значительнее снижены ЦП пероксидазы, ЩФ и КФ в псевдоэозинофилах, гораздо выше содержание микроформ малых лимфоцитов с очень плотным ядром и почти "голых" пикнотических ядер, чем при легкой форме шока. Неодинакова и длительность периода, в течение которого в псевдоэозинофилах обнаруживаются признаки аллергической альтерации: 10 мин при легком шоке и 60 мин при тяжелом.

шока шока шока шока шока шока

Рис.6 Активность пероксидазы и щелочной фосфатазы в псевдоэозинофилах при

анафилактическом шоке

По оси ординат- цитохимические параметры (в условных единицах)

—•— ЦП ЩФ -в— Индекс общей активности Щф

- А - ЦП пероксцдазы ~х—Индекс общей активности пероксидазы

По оси абсцисс - сроки эксперимента

Полученные данные свидетельствуют, что существует лишь количественная зависимость между степенью морфодитохими-ческих изменений в лейкоцитах и тяжестью анафилактического шока у кроликов. Неизвестно, существует ли подобная зависимость у человека и других животных. В связи с тем, что при вскрытии умерших от анафилактического шока наблюдается полнокровие внутренних органов, проведение морфоцитохи-мического изучения лейкоцитов не представляет большого труда. Мы полагаем, что подобные исследования могли бы привести к созданию новых тестов для диагностики смерти от анафи-тактического шока.

ВЫВОДЫ

1. Интенсивность различных цитохимических реакций (на •сатионные белки, пероксидазу, кислую и щелочную фосфата-?ы, гликоген, липиды, сукцинатдегидрогеназу, НАД-диафора-¡у), внутриклеточное расположение и способ отложений про-1уктов реакций определяются морфологическими особенностями лейкоцитов. Размеры специфических гранул в нейтро-|шльных и псевдоэозинофильных гранулоцитах, а также сте-тень их окраски эозином зависят от содержания катионных зелков.

2. Характер морфоцитохимических связей неодинаков в зазличных видах форменных элементов крови. Активность кис-юй фосфатазы, сукцинатдетидрогеназы и НАД-диафоразы в шмфоцитах находятся в прямой зависимости от диаметра клетки I объема цитоплазмы. Внутриклеточная локализация продук-ов реакций на пероксидазу и липиды, а у кроликов, крыс и морских свинок и на щелочную фосфатазу, связана с нейтро-[>ильной и псевдоэзинофильной зернистостью.

3. Псевдоподии и беззернистые участки цитоплазмы нейтро-[зилов и псевдоэозинофилов, наблюдаемые в норме лишь в сдельных клетках и свидетельствующие об их активации, не ¡одержат катионных белков, пероксидазы, липидов, кислой и целочной фосфатаз.

4. Установлены общие черты цитохимической организации

нейтрофильных и псевдоэозинофильных гранулоцитов у амфибий, рептилий, птиц и млекопитающих. В цитоплазме зрелых нейтрофилов и псевдоэозинофилов крови всех исследованных объектов содержатся лишь специфические (вторичные) гранулы, что противоречит общепринятым представлениям. Маркером специфических гранул являются неферментные ка-тионные белки, которые и определяют тинкгориальные свойства последних.

5. Видовые особенности морфологии и цитохимии лейкоцитов среди млекопитающих отличаются чрезвычайным разнообразием. Наибольшая степень окраски эозином специфических гранул нейтрофилов и псевдоэозинофилов наблюдается у кролика, морской свинки и белой крысы, средняя — у человека и собаки и наименьшая — у кошки и белой мыши.

Цитохимический статус нейтрофилов и псевдоэозинофилов млекопитающих отличается от такового рептилий и птиц более сложным составом специфических гранул, содержащих наряду с катионными белками липиды и пероксидазу, а у кролика, крысы и морской свинки также и щелочную фосфатазу.

6. Внутривенная белковая сенсибилизация роликов сопровождается количественными и качественными морфологическими и тесно связанными с ними цитохимическими изменениями, свидетельствующими о повышении микробоцидньи свойств псевдоэозинофилов и увеличении функциональной активности лимфоцитов. При этом не изменяется характер зависимости цитохимических свойств лейкоцитов от их морфологии.

7. Для анафилактического шока характерна тесная связ! морфологических изменений в лейкоцитах (лейкопения, агра-нулоцитоз, моноцитопения) с цитохимическими (снижение активности пероксидазы, кислой и щелочной фосфатазы — i псевдоэозинофилах; кислой фосфатазы, сукцинатдегидрогена-зы и НАД-диафоразы — в лимфоцитах).

8. Установлены морфологические и цитохимические признаки аллергической альтерации in vivo псевдоэозинофильньн и базофильных 1ранулоцитов крови во время анафилактического шока, приводящей к внутрисосудистому разрушению этил видов клеток.

9. Установлены факторы, определяющие стабильность "эффекта Романовского" в цитологических препаратах: строго оп-)еделенные молярные соотношения основных тиазиновых кра-:ителей и эозина в фиксирующих и красящих растворах, виды I соотношение растворителей в концентрированных растворах фасителей, составы буферных смесей. Использование модифицированных гематологических фиксаторов-красителей поз-юляет выявлять новые детали морфологии лейкоцитов челове-са (различные типы гранул в нейтрофилах, слабо базофильные 5еззернистые участки цитоплазмы нейтрофилов, структуры аг->анулоцитов и др.), что повышает структурно-функциональ-1ую информативность цитологических препаратов.

10. Совмещение во времени процессов окраски и фиксации истологического материала с помощью смеси метаноловых ¡астворов основных и кислых красителей позволяет четко дифференцировать в парафиновых срезах все типы тканевых гра-{улоцитов наряду с гемопоэтическими, иммунокомпетентны-«I клетками и другими элементами эпителиальной, соедини-ельной, мышечной и нервной тканей.

11. Всестороннее изучение влияния способов фиксации, ви-[ов и концентраций субстратов, солей диазония, интервалов >Н инкубационных сред на интенсивность цитохимических юакций позволило изыскать оптимальные параметры выявле-шя кислой и щелочной фосфатаз, сочетающие высокую чув-твительность и контраст реакций с отсутствием морфологи-юских изменений в лейкоцитах.

12. Выявление морфоцитохимических взаимосвязей в лей-:оцитах человека и животных в сравнительном аспекте и при кспериментальной анафилаксии дает основание для прогно-ирования ряда цитохимических свойств данных клеток крови ю их морфологии. Исследование деталей цитоплазматических труктур лейкоцитов с помощью усовершенствованных мето-ов окраски у больных с различной патологией открывает пер-пективы для создания новых диагностических тестов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Обнаруженные при экспериментальном анафилактическом шоке морфологические и цитохимические признаки аллергической альтерации лейкоцитов планируется выяснить при вскрытии умерших от анафилактического шока. Довольно простые в техническом исполнении исследования помогут в па-тологоанатомической диагностике смерти от анафилактического шока.

2. Выявленные закономерности морфоцитохимических изменений в различных видах лейкоцитов при экспериментальной анафилаксии целесообразно проверить дальнейшими исследованиями на клиническом материале. Возможно создание новых диагностических тестов.

3. Разработанные на основе изучения факторов стабильности "эффекта Романовского" усовершенствованные гематологические фиксаторы и красители, позволяющие значительно повысить информативность препаратов (мазков крови, костного мозга, пункгатов и отпечатков различных органов) целесообразно использовать в научных исследованиях, практической работе клинических лабораторий, патологоанатомических отделениях и бюро, онкологических диспансерах.

4. Использование в научных исследованиях и клинических лабораториях модифицированных способов выявления неспецифических фосфатаз, не вызывающих морфологических изменений в клетках, открывает возможности для изучения зависимости цитохимических свойств лейкоцитов от их морфологических особенностей при различных патологических процессах.

5. Разработанный способ изготовления гистологических препаратов с одновременной фиксацией и окраской рекомендуется использовать в научных исследованиях и патологоана-томической практике. В отличие от существующих, новый метод позволяет выявлять в парафиновых срезах все типы тканевых и циркулирующих гранулоцитов, иммунокомпетентные клетки наряду со структурными элементами всех типов тканей.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Цитоморфологические изменения лейкоцитов периферической крови при сенсибилизации // Вопросы морфологии. — Томск-Кемерово, 1972. — С. 83 — 87.

2. К вопросу об аллергической альтерации лейкоцитов // Там же. — С. 64 — 71 (соавт. А.Ф.Суханов).

3. Цитологические и цитохимические изменения в условиях антигенного раздражения // Материалы научной гистологической конференции, посвященной 50-летию образования СССР. — Л., 1972. — С. 231 — 233 (соавт. А.Ф.Суханов, В.А.По-понников).

4. Модификация методов окраски мазков крови и костного мозга Ц Лабораторное дело. — 1972. — № 7. — С. 445 — 446.

5. К цитохимическому механизму сенсибилизации и анафилаксии Ц Арх. анат., гист. и эмбриол. — 1972. — № 5. — С. 82 — 85 (соавт. А.Ф.Суханов, В.А.Попонников).

6. Zytochemische Untersuchungen der sauren Leukozytenphos-phatase. 1. Mitteilung: Vergleichende Bewertung verschiederen met-hodiescher Varianten der einzeitigen Azokupplung zur Darstellung der sauren Phosphatase // Folia Haematol.— Leipzig, 1972.— Vol. 98. — № 2. — S. 147 — 162 (соавт. А.Ф.Суханов).

7. Zytochemische Untersuchungen der sauren Leukozytenphos-phatase. 2. Mitteilung: Die saure Leukozytenphosphatase bei Menschen und Laboratoriumstieren // Folia Haematol.— Leipzig, 1972. — Vol. 98. — № 2. — S. 163 — 174 (соавт. А.Ф.Суханов).

8. Удобный вариант гистохимического выявления кислой фосфатазы в крупноклеточных ядрах гипоталамуса // Арх. анат., гист. и эмбриол. — 1973. — № 12. — С. 82 — 85 (соавт. П.С.Дем-ко).

9. Рациональный метод гистологической обработки для одновременного выявления гепариноцитов и клеток крови в различных органах // Арх.патол. — 1973. — № 10. — С. 76 — 77 (соавт. А.Ф.Суханов).

10. Цитоморфологические и цитоэнзиматические изменения лейкоцитов крови в послешоковом периоде // Реактивность и пластичность эпителия и соединительной ткани в нор-

мальных, экстремальных и патологических условиях. — Свердловск, 1974. — С. 85 — 87 (соавт. А.Ф.Суханов).

11. Морфологические и гистохимические закономерности развития и регуляции реакций организма на антигенный раздражитель // Тез. докл. 8 Всесоюзн. съезда АГЭ. — Ташкент, 1974. — С. 365 (соавт. А.Ф.Суханов, В.А.Попонников, П.С.Дем-ко, Г.И.Борисова).

12. Морфофулкциональные корреляции между гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системой и иммунокомпетен-тными клетками в условиях сенсибилизации и анафилаксии // Материалы I Всесоюз.конф. по нейроэндокринолоши. — Л., 1974. — С. 170 — 171 (соавт. А.Ф.Суханов, В.А.Попонников, П.СДемко).

13. Изменение метаболизма лейкоцитов при сенсибилизации и анафилактическом шоке // Нарушения метаболизма: Тр. I науч. конф. мед. ин-тов Западной Сибири. — Красноярск, 1974. — С. 225 — 228.

14. Клеточные и цитохимические изменения при антигенном раздражении // Нейрогуморальная и фармакологическая коррекция иммуноаллергических реакций в эксперименте и клинике: Тез. докл. к I Всесоюз. симп. — Л., 1975. — С. 63 — 64 (соавт. А.Ф.Суханов, В.А.Попонников, П.С.Демко).

15. Модификация кальций-кобальтового метода выявления щелочной фосфатазы // Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. — М., 1975. — С. 175.

16. Модификация цитохимического выявления катионных белков в мазках крови, костного мозга и отпечатках различных органов //Тез. докл. и сообщений к научно-практической конф. изобретателей и рационализаторов Кузбасса. — Кемерово, 1978. — С. 96 — 97 (соавт. Т.Г.Павлова).

17. Катионные белки и миелопероксидаза гранулоцитов крови в сравнительно гистологическом аспекте // Цитохимические и биохимические исследования в эксперименте и клинике. — Нальчик, 1979. — С. 96 — 97 (соавт. А.Ф.Суханов, Т.Г.Павлова).

18. Цитохимия гранулоцитов крови позвоночных животных // Тез. докл. 9 Всесоюзн. съезда АГЭ. — М., 1981. — Т. 2. — С. 295 (соавт. Т.Г.Павлова).

19. Способ окраски гематологических препаратов // А.с. № 119286, МКИ в 01N 011/30, А 61 В 10/00, заявка № 3581068, заявлено 15.04.83, опубл. 15.07.85.

20. Состав для фиксации цитологических препаратов // А.с. № 1200659, МКИ О 01N 011/30 А 61 В 10/00, заявка № 3641058, заявлено 25.07.83, опубл. 22.08.85.

21. Фиксатор для гематологических препаратов // Изобретения и рационализация в медицине. — М., 1986. — С. 14 — 15.

22. Способ гистологической обработки // Опыт развития новаторства, изобретательства, рационализации медицинских работников в творческом содружестве с инженерно-технической общественностью Кузбасса. — Кемерово, 1988. — Т. 2. — С. 9 — И (соавт. Г.И Лукьянова).

23. Способ гистологической обработки кроветворных органов // Там же. — С. 7 — 9 (соавт. Г.ИЛукьянова).

24. Влияние атмосферных загрязнений на цитоморфологию и цитоэнзиматические показатели лейкоцитов крови // Гигиена окружающей среды. — Новокузнецк, 1991. — С. 71 — 73 (соавт. Т.Г.Павлова, Л.В.Барков).

25. Способ подготовки парафиновых срезов для гистологического выявления клеток крови и соединительной ткани // А.с. № 1807400, МКИ й 01 N 01 33/48.

26. Морфоцитохимические корреляции в лейкоцитах крови при антигенной стимуляции // Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования клеток, тканей и органов человека и животных: Матер. 3 Всерос. научн. конф. (27 — 29 июня 1995 г.). — Волгоград, 1995. — С. 89 (соавт. Т.Г.Павлова).

27. Морфоцитохимические корреляции в нейтрофильных гранулоцитах крови человека и животных // Материалы I Международного конгресса по интегративной антропологии: Сб. науч. работ. — Тернополь, 1995. — С. 241 — 242 (соавт. Т.Г.Павлова).

28. Морфоцитохимические аспекты физиологической регенерации лейкоцитов // Гистогенез и регенерация тканей: Матер. науч. конф., посвящ. памяти проф. А.А.Клишова. — СПб. - 1995. - С. 93 - 94.

29. Связь цитохимической характеристики лейкоцитов с их

структурой // Морфология. — 1996. — № 2. — С. 72 — 73 (со-авт. В.Д.Новиков).

30. Сопоставление цитохимических и морфологических изменений в лейкоцитах крови при экспериментальной анафилаксии // Материалы Международной конф. "Актуальные вопросы морфологии, посвящ. памяти проф. С.А.Сморщка": Сб. научн. работ. — Тернополь, 1996. — Т. 2. — С. 437 — 438 (соавт. Т.Г.Павлова).

31. Особенности морфологии нейтрофильных гранулоцитов человека с токсикогенной зернистостью // Там же. — С. 439 — 440 (соавт. С.С.Иванова, Ю.В.Цветова).

Соискатель . / А. Г.Михеев

Подписано в печать 14.06.96. Формат бумага 60x84/16. Усл. печ. л: 2,0. Заказ N2 77. Тираж 100 экз. Оригинал-макет подготовлен в редакци-онно-издательском отделе НИИ региональной патологии и пато-морфологии СО РАМН. Редактор-корректор М.Бакарев,

Типография СО РАМН, 1996 г.

630117 Новосибирск, ул. Акад. Тимакова, 2