Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Зависимость параметров Т-лимфоцитарного звена иммунной системы у ВИЧ-инфицированных пациентов от уровня Т-хелперов и вирусной нагрузки

На правах рукописи

МИ4601937 ШЕСТАКОВА Елена Владимировна

ЗАВИСИМОСТЬ ПАРАМЕТРОВ Т-ЛИМФОЦИТАРНОГО

ЗВЕНА ИММУННОЙ СИСТЕМЫ У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ ОТ УРОВНЯ Т-ХЕЛПЕРОВ И ВИРУСНОЙ НАГРУЗКИ

14.03.09 - «Клиническая иммунология, аллергология»

14.03.10 - «Клиническая лабораторная диагностика»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 3 МАЙ 2910

Челябинск 2010

004601937

Работа выполнена в научно-исследовательском институте иммунологии Госу дарственного образовательного учреждения высшего профессионального об разования «Челябинская государственная медицинская академия Федерально го агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Зурочка Александр Владимирович доктор медицинских наук Гаврилова Татьяна Валерьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор Ведущая организация:

Пищалышков Александр Юрьев № Базарный Владимир Викторович

Государственное учреждение «Институт экологии и генетики микроорганиз мов Уральского отделения Российской академии наук» г. Пермь.

Защита состоится «_» мая 2010 г. в_часов на заседании диссертацион

ного совета Д 208.117.03 при Государственном образовательном учреждени высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социал1 ному развитию» по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образов^ тельного учреждения высшего профессионального образования «Челябинска государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоо ранению и социальному развитию».

Автореферат разослан « _ » апреля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Телешева Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. уб-Т-лимфоциты впервые были описаны Brenner М. et al. (1986) как гетерогенная субпопуляция Т-клеток с, Т-клеточным рецептором, состоящим из у- и 5-цепей (ySTcR) (K.uziel W.A. et al, 1987; Buey P., et al. 1988; Hein W.R., Mackay C.R., 1991). У людей и многих животных большинство Т-клеток экспрессируют Т-клеточный рецептор, состоящий из а- и ß-цепей, и лишь небольшое количество Т-клеток несет Т-клеточный рецептор с у- и 5-цепями. В отличие от aß-T-клеток уб-Т-клетки напрямую распознают белковые и небелковые фосфолиганды без участия главного комплекса гистосов-местимости. у8-Т-клетки участвуют в антимикробном иммунитете и обладают эффекторными функциями.

Роль у8-Т-клеток в иммунных процессах при различных заболеваниях и их взаимодействие с другими клетками организма до сих пор остаются до конца невыясненными. Но уже накопилось достаточно информации, которая доказывает необходимость существования подобной популяции клеток (Сассато N., 2006; Girardi М, 2006; Kastuta М., 2006). Количественное содержание у5-Т-клеток в организме невелико и варьирует в зависимости от локализации. у8-Т-клетки редко обнаруживаются в селезенке, пейеровых бляшках и паренхиме лимфатических узлов и широко распространены среди клеток периферической крови и афферентных и эфферентных лимфатических сосудах. уб-Т-клетки являются главной популяцией Т-клеток в эпителии нелимфоидных тканей, включая кожу, кишечник, легкие, язык и органы репродуктивной системы. Их популяция в тимусе и периферической крови взрослого человека составляет всего 1—5% или 5—10% от всех Т-лимфоцитов, а 90—95% Т-клеток крови представляют собой aß-T-клетки (Itohara S. et al., 1990). Известно, что у5-Т-лимфоциты вовлечены в механизмы местной иммунной защиты при ВИЧ- и цитомегаловирусной (ЦМВ) инфекциях и при определенных бактериальных инфекциях, включая Лайм-боррелиоз (Dechanet J. et al, 1999). Так же оказалось, что у5-Т-клетки оказывают цитотоксическое действие с участием механизмов апоптоза (Pawelec G. et al, 1989; Boullier S. et al. 1997). Предполагается, что ци-тотоксическая активность у5-Т-клеток может быть стимулирована внутриклеточными патогенами, некоторыми бактериями и простейшими, включая М. tuberculosis, Y. enterocolitica, Т. gondii, а также некоторыми

вирусами (вирус простого герпеса, вирус Эпштейна—Барр, вирус иммунодефицита человека).

Существенную роль у5-Т-клетки играют в. противоинфекционном иммунитете. Высказано предположение, что они создают первую линию защиты в очаге бактериальной инфекции, сдерживая ее распространение до развития иммунного ответа, основанного на распознавании антигена сф-Т-клетками в комплексе с молекулами HLA, так как уб-Т-клетки распознают антигены без предварительного процессирования и участия молекул HLA комплекса, в отличие от сф-Т-лимфоцитов (Kozbor D. et al., 1989; Hayday A.C., 2000). Дальнейшие исследования выявили, что уб-Т-клетки высокочувствительны к фосфоантигенам (пирофосфатам и фос-фомоноэстерам, конъюгированным нуклеотидным остаткам), которые могут продуцировать микобактерии, грамотрицательные, грамположи-тельные кокки, токсоплазма и некоторые растения (Schoel В. et al., 1994; Fournie J.J., Bonneville M., 1996; Poquet Y. et al., 1998). Кроме того, уб-Т-клетки могут распознавать поверхностные антигены на определенных опухолевых клетках, таких как клетки лимфомы Беркитта.

- Приведенные выше факты свидетельствуют в пользу того, что для более полной характеристики Т-клеток пациента анализ следует проводить не только по таким специфическим и безусловно важным при ВИЧ-инфекции маркерам как CD3+, CD3+4+ и CD3+8+, но и по наличию субпопуляций оф-Т-клеток и уб-Т-клеток. Важность определения последних очевидна при ВИЧ-инфекции, сопровождающейся длительной персистенцией антигена в организме на фоне депрессии Т-клеточного звена иммунной системы, для уточнения стадии заболевания, контроля эффективности проводимой антиретровирусной терапии, прогноза развития и течения заболевания.

Цель исследования: изучить характер изменений как зависимого, так и независимого от главного комплекса гистосовместимости (МНС) Т-лимфоцитарного иммунного ответа у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня содержания в крови Т-хелперов (CD3+4+) и вирусной нагрузки на организм.

Задачи исследования:

1. Изучить изменения состояния Т-лимфоцитарного звена иммунитета у больных ВИЧ-инфекцией в зависимости от уровня содержания в крови Т-хелперов и вирусной нагрузки.

2. Оценить реакцию субпопуляций Т-лимфоЦитов, несущих TcR

ар и у8, на изменение вирусной нагрузки и уровня Т-хелперов.

3. Оценить взаимосвязь между основными показателями Т-лимфоцитарного звена иммунитета в зависимости от уровня антигенной нагрузки на организм.

Научная новизна. Впервые изучено состояние Т-лимфоцитарного звена иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц с определением характера изменений внутри субпопуляции Т-лимфоцитов в зависимости от наличия сф- или уб-ТсЯ. Определен характер изменений среди двойных негативных и позитивных субпопуляций Т-лимфоцитов в зависимости от уровня антигенной (вирусной) нагрузки на организм. Это позволило выяснить особенности реакции лимфоцитов на массированную антигенную агаку на организм и выявить значимость этих нарушений в формировании данной патологии. Помимо этого, изучено изменение данных показателей в зависимости от уровня содержания в крови ВИЧ-инфицированных Т-хелперов, как основных клеток-мишеней вируса иммунодефицита человека и важного критерия прогрессирования заболевания.

Впервые показано, что в ответ на рост антигенной нагрузки не происходит пролиферативной активности у8-Т-лимфоцитов, а, напротив, наблюдается их угнетение наряду с другими субпопуляциями Т-лимфоцитов, что ведет к истощению иммунной реактивности организма и, соответственно, прогрессированию заболевания.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость результатов исследования состоит в расширении знаний о характере иммунологических нарушений внутри Т-лимфоцитарного звена иммунитета у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня Т-хелперов и вирусной нагрузки.

Выявленные нарушения внутри популяции Т-лимфоцитов, как основных клеток-мишеней при ВИЧ-инфекции, и оценка их патогенетического значения, позволят в дальнейшем более четко прогнозировать прогрессирование заболевания и оценивать эффективность проводимой антиретровирусной терапии в зависимости от уровня содержания Т-хелперов в крови, а также от антигенной нагрузки, от количества у5-Т клеток, двойной негативной и двойной позитивной субпопуляций Т-лимфоцитов как свидетелей дезорганизации работы иммунной системы при ВИЧ-инфекции.

Положения, выносимые на защиту:

1. У ВИЧ-инфицированных лиц при различной степени вирусемии

выявляются изменения параметров лимфоцитов, более выраженные у пациентов с высокой вирусной нагрузкой (более 100000 копий/мл), заключающиеся в падении общего числа Т-лимфоцитов, внутри популяции которых наблюдается снижение относительного уровня Т-хелперов и повышение относительного числа цитотоксических Т-лимфоцитов, сопровождающееся снижением соотношения CD3+4+/CD3+8+, а также падение относительного и абсолютного числа клеток двойной негативной субпопуляции Т-лимфоцитов.

2. У ВИЧ-инфицированных пациентов при снижении в крови уровня Т-хелперов наблюдается снижение абсолютного уровня цитотоксических Т-лимфоцитов и абсолютного количества двойной позитивной субпопуляции Т-лимфоцитов.

3. У ВИЧ-инфицированных лиц при снижении содержания в крови Т-хелперов и повышении вирусной нагрузки наблюдается падение абсолютных чисел Т-лимфоцитов, несущих как ар-, так и yS-TcR.

4. У ВИЧ-инфицированных пациентов формируются положительные корреляционные взаимосвязи между абсолютным количеством у5-Т-лимфоцитов и абсолютными уровнями Т-лимфоцитов, цитотоксических лимфоцитов и популяции двойных негативных Т-лимфоцитов. При высокой вирусной нагрузке (более 100000 копий/мл) у ВИЧ-инфицированных лиц формируется обратная корреляционная связь абсолютного уровня уб-ТгЛимфоцитов с уровнем виремии.

Внедрение результатов в практику. Результаты исследования внедрены в практику Центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями Клиники ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава, в учебный процесс самостоятельного курса клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на Всероссийском научном Форуме имени академика В.И. Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге «Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии» (г. Санкт-Петербург, 2008), I научно-практической конференции «Оптимизация высшего медицинского и фармацевтического образования: менеджмент качества и инноваций» (г. Челябинск, 2010), Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - практическому здравоохранению» (г. Москва, 2010), II Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва, 2010).

Апробация диссертации была проведена на совместном заседании НИИ иммунологии, кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии. самостоятельного курса клинической лабораторной диагностики, кафедры иммунологии и аллергологии, ЦНИИ ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 2 в научных журналах и изданиях, определенных ВАК.

Объем и струкгура диссертации. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, материалы и методы, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы. Указатель литературы включает 141 источник, из них 25 отечественных и 116 иностранных. Иллюстрации представлены 22 таблицами и 5 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В процессе работы проведено исследование иммунного статуса у 153 ВИЧ-инфицированных лиц, средний возраст которых составил 30,97±5,8 лет. Диагноз ВИЧ-инфекция был поставлен врачом-инфекционистом после проведенного лабораторного обследования (выявление антител к ВИЧ в сыворотке крови методами ИФА и иммунного блоттинга) в центре по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями Клиники ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава, где впоследствии все пациенты и находились на диспансерном учете. Среди обследованных нами пациентов согласно Российской классификации ВИЧ-инфекции 2,6% составили лица со IIA клинической стадией, 22,9% - с III стадией, 67,3% - с IVA стадией, среди которых 41,2% больных находились в фазе прогрессирования заболевания, 6,5% - со стадией IVB и 0,7% - со стадией IVB. Все пациенты IVB и IVB стадий находились в фазе прогрессирования заболевания. 35,9% всех обследованных больных получали высокоактивную антиретровирусную терапию (ВААРТ), 64,1% - ВААРТ не получали.

Среди сопутствующих заболеваний у 123 пациентов был выявлен хронический гепатит С.

Во все исследуемые группы вошли лица, проживающие и работающие на территории города Челябинска. Различие показателей в зависимости от пола в обследуемых группах не имело статистической

значимости, в связи с чем мы сочли возможным объединить пациентов без учета их половой принадлежности.

Для оценки иммунологических показателей в периферической крови определяли общее количество лейкоцитов, относительное и абсолютное содержание гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов с использованием одно-платформенной технологии с помощью гетерогенного гейтирования по панлейкоцитарному маркеру CD45+ и показателям светорассеяния с применением калибровочных частиц Flow-Count Fluorespheres фирмы Beckman Coulter, США.

Содержание различных субпопуляций лимфоцитов оценивали методом проточной цитометрии с использованием четырехпараметри-ческих реагентов CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5 и смеси монопараметрйческих реагентов CD45-PC5, TCR Pan aß-PE, TCR Рапуб-FITC фирмы Вескшап Coulter, США, линии IOTest на лазерном проточном цитометре Epics™ XL™ фирмы Beckman Coulter, США.

Определение вирусной нагрузки проводилось методом ПЦР на автоматизированной системе для анализа нуклеиновых кислот Abbott m2000rt, позволяющей осуществлять флуоресцентную детекцию результатов в реальном времени, имеющим 5 каналов детекции, автоматическую обработку данных и многоуровневый контроль качества результатов.

Исследования проводились в иммунологической лаборатории Центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями Клиники ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава, на учебной базе самостоятельного курса клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава, ПЦР - лаборатории МУЗ ГКБ №6 г. Челябинска.

Полученные результаты обрабатывались на компьютере под управлением операционной системы Windows ХР с применением пакета прикладных программ «Statistica for Windows 6.0» (Боровиков В., 2003). Статистическая обработка результатов исследований проводилась стандартными методами, с определением средней арифметической вариационного ряда (М) и ошибки средней арифметической (т). Достоверность отличия оценивалась по U критерию Mann-Whitney. Различия считали статистически значимыми при р<0,05 (Гланц С., 1999; Боровиков В, 2003). Корреляционный анализ был выполнен в рамках программы «STATISTICA for Windows 6.0.» с использованием модуля « Nonparametrics. Correlations Spearman» («Непараметрические. Корреляции Спирмена»), Для выделения статистически достоверных коэффи-

циентов корреляции принят уровень значимости г>0.29 .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе исследования мы распределили пациентов натри группы согласно классификации стадий ВИЧ-инфекции у взрослых и подростков в редакции CDC (США) по абсолютному числу Т-хелперов (CD3+4+)- В первую группу, принятую нами за контрольную, вошло 28 человек с абсолютным числом CD3+4+ лимфоцитов 500/мкл и более. Во вторую группу вошло 69 человек с уровнем CD3+4+ лимфоцитов от 499 до 200/мкл. Третью группу составили 53 человека с уровнем CD3^4+ лимфоцитов 199/мкл и менее.

Прежде чем оценивать изменение количественных параметров Т-клеток иммунной системы, мы определили показатели лейкоцитарной формулы у исследуемых групп пациентов в зависимости от уровня содержания Т-хелперов CD3+4+ (таблица 1). При этом нами установлено, что падение уровня Т-хелперов сопровождается снижением общего числа лейкоцитов, относительного и абсолютного уровней лимфоцитов, а также абсолютного числа моноцитов. При этом практически неизменным остается гранулоцитарный росток крови, что подтверждает тропность поражения к лимфоцитарному и моноцитарному росткам.

При оценке изменений субпопуляционного состава Т-лимфоцитов (таблица 2) мы выявили, что во всех исследуемых группах снижение уровня Т-хелперов сопровождается падением абсолютного уровня общего числа Т-лимфоцитов, абсолютного числа цитотоксических Т-лимфоцитов, повышением относительного количества CD3+8+ лимфоцитов, как следствие падением соотношения CD3+4+/CD3+8+, снижением абсолютного уровня двойной позитивной субпопуляции, т.е. истощением всех субпопуляций Т-лимфоцитов. Отсутствие снижения двойной негативной популяции Т-лимфоцитов объясняется CD4-тропностью вируса иммунодефицита человека.

Так как популяция Т-лимфоцитов характеризуется такими двумя вариантами в зависимости от вида TcR, как оф- и у5-Т клетки, то нами была поставлена задача более подробно изучить их изменения в зависимости от уровня Т-хелперов. При анализе оф- и уб-Т клеток (таблица 3) мы выявили статистически значимое снижение во всех группах относительного и абсолютного уровней сф-Т лимфоцитов, что связано также с

падением общего числа Т-лимфоцитов и значительное снижение абсолютного уровня у5-Т клеток в группах с уровнем CD3+4+ лимфоцитов 200-499/мкл и CD3+4+ лимфоцитов менее 200/мкл по сравнению с контрольной группой лиц (CD3+4+ лимфоцитов более 500/мкл). При этом мы наблюдаем рост уровня вирусной нагрузки (ВН), коррелирующий со снижением уровня Т-хелперов (CD3+4+). Все это также указывает на истощение резервов иммунной системы в ответ на длительно перси-стирующий в организме вирус.

Одной из поставленных нами задач было изучение изменений параметров Т-звена иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня антигенной (вирусной) нагрузки на организм. Для этого мы распределили больных на три группы. В первую, контрольную, группу вошло 66 пациентов с минимальной определяемой вирусной нагрузкой - менее 150 копий/мл. Во вторую группу вошли 58 человек'с вирусной нагрузкой менее 100000 копий/мл. В третью группу, с высокой вирусной нагрузкой более 100000 копий/мл, вошло 27 человек.

При оценке лейкограммы было выявлено, что нарастание вирусной нагрузки сопровождается снижением относительного и абсолютного уровней лимфоцитов, общего числа лейкоцитов, а также падением абсолютного количества гранулоцитов (таблица 4). Вероятно, снижение лимфоцитов связано с выраженным влиянием антигена (ВИЧ), а падение уровня гранулоцитов связано с хроническим течением вторичных бактериальных и грибковых заболеваний.

Таблица1.ПоказателилейкограммыВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня С1)3+4+ лимфоцитов

Показатели Стат. Группа 1 Группа 2 Группа 3

обследованных пока- (контрольная) (CD3+4+ (СОЗ+4+

лиц затели (CD3+4+ 500 200-499 199 и менее

клеток/мкл и клсток/мкл) клеток/мкл)

более)

п =28 п = 69 п = 53

Лейкоциты, М±т 6,07+1,72 5,14+1,6* 4,411,7*

х109/л **

Гранулоциты,% М+т 55,86+7,67 61,28111,0* 63,4113,9*

Гранулоииты, М±ш 3,45+1,3 3,2411,47 2,93+1,46

х107л

Моноциты,% М±ш 8,11±1,79 8,41±2,9 8,7+2,8

Моноциты, 107л М+т 0,49+0,16 0,4210,17* 0,3810,17*

Лимфоциты, % М±т 36,04±8,08 29,96+10,0* 25,119,9* **

Лимфоциты, М+т 2,14+0,57 1,4710,48* 1,0410,36*

х107л **

Примечание: * - достоверность различий показателей в группах 2 и 3 по сравнению с группой I по и-критерию Маниа-Уитни: р<0,05

** - достоверность различий показателей больных группы 3 по сравнению с группой 2 по и-критерию Манна-Уитни: р<0,05

Таблица 2. Показатели иммунофенотипирования лимфоцитов ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня СБЗ+4+ лимфоцитов

Показатели обследованных лиц Стат. показатели Группа 1 (контрольная) (CD3+4+ 500 клеток/мкл и более) Группа 2 (CD3+4+200-499 клеток/ мкл) Группа 3 | (CD3+4+ 199 и менее клеток/мкл)

п =28 п =69 п = 53

CD3+19-,% М±т 75,88x7,49 . 79,46+6,9* 75,5±7,1**

CD3+19-, абс М±т 165Ö,Ö±542,37 1164,4^406,7* 784,4+274,9* j ie ie *

CD3+4+,% М±т 31,83x6,2 25,88±8,8* 12,3±5,0* j * £ j

CD3+4+, абс М±т 668,54± 190,69 346,97+79,5* 120,2+48,6* ! ifk j

СШ+8+,% М±т 41,5±9,6 49,53±11,1* 57,3±9,ü* Лг "к

CD3+8+, абс М+т 908,79+384,03 756,01±382,6* 598,1±241,8* **

CD3+4+/ CD3+8+, у.е. М±ш 0,83±0.36 0,58±0,3- 0,2+0,1*

CD3+4+8+,% М±т 1,61±1,0 1,31±0,9 1,6+1,1

CD3+4+8+, абс М±т 24,93± 14,59 14,84±10,2* 17,2±17,6*

CD3+4-8-,% М±т 5,24+ 2,19 , 6,96±3,3* 9,6±6,1* **

CD3+4-8-, абс М+т 86,5+45,63 79,93+45,1 85,0+72,0

Примечание: * - достоверность различий показателей в группах 2 и 3 по сравнению с группой 1 по и-критерию Манна-Уитни: р<0,05

** - достоверность различий показателей больных группы 3 по сравнению с группой 2 по и-критерию Манна-Уитни: р<0,05

Таблица 3. Показатели ар-'Г-лимфоцитов и у5-Т-лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня СДЗ+4+ лимфоцитов

Показатели обследованных лиц Стат. пока-зате-ли Группа 1 (контрольная) (СБЗ+4+ 500 клеток/мкл и более) Группа 2 (СЭЗ+4+ 200499 клеток/ мкл) 1 руина 3 (СЭЗ+4+ 199 и менее клеток/мкл)

п =28 п = 69 п = 53

1 4 5

а|]-Т-лимфоциты, % М+т | 72,18±6,49 1 ! ; 1 74,39+6,9 69,7+8,7**

аВ-Т- I М+т ! лимфо- | циты,абс | 1553,04±505,5 1091,45+391,7* 723,8+269,4* АЛ

76-Т- 1 Мгш ! лимфо- 1 циты,% | ... ___________ ______ 3,24±1,8 3,4±1,9 4,5±3,7

у5-Т- ; М±т | 70,5+47,66 лимфо- [' [ циты, абс | ! 48,97±31,9* 41,3+30,2*

Вирусная нагрузка, копий/мл | 184,19+69,7 1 1 \ \ 2261,2±2064,5* 572376,6+437603,7* **

Примечание: * - достоверность различий показателен в группах 2 и 3 по сравнению с группой 1 по и-критерию Манна-Уитни: р<0,05

** - достоверность различий показателей больных группы 3 по сравнению с группой 2 по и-критерию Манна-Уитни: р<0,05

Таблица 4. Показатели лейкограммы ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня вирусной нагрузки ____

Показатели Стат. Группа 1 Группа 2 Группа 3

обследованных пока- (контрольная) (ВН менее (ВН более

лиц зате- (ВН менее 150 100000 100000 копий/

ли копий/мл) копий/мл) мл)

п —66 п = 58 п = 27

Лейкоциты, М±т 5,11+1,89 5,63±1,95 4,3+2,1*

х 1О'/л **

Гранулоциты, % М±т 60,0+11,79 61,5±10,1 59,0+18,2

Грапулоциты, М±т 3,3+1,85 3,5+1,57 2,65±1,82*

х107л **

Моноциты, % М±т 8,15+13 8,36±2,63 9,5+3,5

Моноциты, й±т 0,4+0,15 0,46±0,17* 0,41+0,24

109/л

Лимфоциты, % Шт 29,5± 11,4 30,05+9,55 25,3±И,8* к •к

Лимфоциты, М±т 1,4+0,5 1,63+0,66* 1,01±0,55*

хШл **

Примечание: * - достоверность различий показателей в группах 2 и 3 по сравнению с группой 1 по 1)-критерию Манна-Уитни: р<0,05

** - достоверность различий показателей больных группы 3 по сравнению с группой 2 по Ъ*-критерию Манна-Уитни: р<0,05

При анализе Т-лимфоцитов при помощи метода иммунофенотипи-рования у пациентов с различной вирусной нагрузкой (таблица 5) мы выявили некоторые изменения параметров лимфоцитов, более выраженные у лиц с высокой вирусной нагрузкой. С повышением вирусной нагрузки прослеживается четкая тенденция к снижению абсолютного и относительного числа Т-хелперов и повышению относительного уровня цитотоксических лимфоцитов (СВЗ+8+), за счет чего происходит более чем двукратное снижение соотношения СОЗ+4+/СОЗ+8+

(что коррелирует с данными Gougeon M.L. et al., 1996; Хаигова P.M., Игнатьева Г.А., 1999; Покровского В.В. и др. 2000; Chouquet С. et al., 2002) и свидетельствует о формировании дисбаланса клеток иммунной системы с истощением пула эффскторных клеток при массивной антигенной атаке. Помимо этого, выявлено повышение абсолютного уровня цитотоксических Т-лимфоцитов в группе лиц с вирусной нагрузкой менее 100000 копий/мл по сравнению с пациентами контрольной группы (вирусная нагрузка менее 150 копий/мл) при последующем их снижении у ВИЧ-инфицированных с высокой вирусной нагрузкой (более 100000 копий/мл). Это свидетельствует о том, что на начальных этапах заболевания происходит более эффективное сдерживание репликации вируса за счет лизиса ВИЧ-инфицированных клеток цитотоксически-ми лимфоцитами, а также запуска ими процессов апоптоза. Также мы выявили, что с повышением вирусной нагрузки происходит падение относительного и абсолютного числа клеток двойной негативной суб-нопуляции Т-лимфоцитов, которые являются составной частью врожденного иммунитета, что свидетельствует о том, что на более поздних стадиях заболевания патологический процесс затрагивает филогенетически более древние ветви иммунной защиты организма и происходит более глубокий сбой в системе сдерживания инфекционного процесса.

С целью более полной характеристики Т-звснамы провели анализ оф- и у5-Т клеток (таблица 6). При этом выявилось снижение абсолютного уровня оф-Т-лимфоцитов в группе лиц с высокой вирусной нагрузкой (более 100000 копий/мл) как по сравнению с контрольной группой, так и по сравнению с группой лиц с вирусной нагрузкой менее 100000 копий/мл, за счет падения общего чиста Т-лимфоцитов. Также при высокой вирусной нагрузке выявлено статистически значимое снижение относительного и абсолютного уровней у5-'Г клеток, причем абсолютное число их падает практически в два раза. Это указывает на несостоятельность иммунной системы, заключающуюся в угнетении индукции специфического противоинфекционного иммунитета в ответ на активный рост антигенной нагрузки. Отсутствие изменений количества ар- и уб-Т-лимфоцитов при вирусной нагрузке менее 100000 копий/мл можно расценивать как один из механизмов развития ВИЧ-инфекции, когда отсутствует потребность в низкодифференцированных лимфоцитах и не накапливаются вирус-специфические Т-лимфоциты.

Таблица 5. Показатели иммунофенотипирования лимфоцитов ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня вирусной нагрузки

Показатели обследованных лиц Стат. показатели Группа 1 (контрольная) (ВН менее 150 копий/мл) Группа 2 (ВН менее 100000 копий/ мл) Группа 3 | (ВН более 100000 копий/ мл)

.1 1 п=66 п = 58 п = 27

CD3+19-,% j M±m 76,28±7,74 77,49±7,8 78,9+6,3

!CD3+19-,a6c ! M+m 1 ! 1074,55±3 88,6 1273,69±568,9* 822,0+508,3* •к йг

! CD3+4+,% М±т 24,64± 10,74 ! 23.69±9,45 ! ' i 12,2+3,1*

| CD3+4+, абс М+т 342,03±190,19 j 391,16+239,38 122,9+66,9* •А "к I

! CD3+8+,% М±т 47,09± 10,65 . 49,39+11,12 63,0x4,9* ! **

j CD3+S+, абс М±т 660,18+268,58 ; 813,12±405,98* 659,9+420,1**

j CD3+4+/ | CD3+8+, y.e. М+т 0,59±0,4 j 0,53±0,3 1 1 0,2+0,1*

| CD3+4+8+,% М±т 1,47+0,98 j 1,38+0,92 1,7±1,1

; CD3+4+8+, ! абс М±т 18,0+14,95 i 17,14±12,95 j 13,0±8,3

CD3+4-8-,% М±ш 9,04+5^05 6,9±4,46^ 5,9+2,2*'

CD3+4-8-, абс М+т 97,03±55,79 82,78+59,0 1 50,5±36,8* **

Примечание: * - достоверность различий показателей в группах 2 и 3 по сравнению с группой 1 по О'-критерию Манна-Уитни: р<0,05

** - достоверность различий показателей больных группы 3 по сравнению с группой 2 по и-критерию Манна-Уитни: р<0,05

Таблица 6. Показатели оф-Т-лимфоцитов и уб-Т-лимфоцитов ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровни вирусной нагрузки

| Показатели ' обследованных j лиц 1 j i Стат. показатели Группа 1 (контрольная) (ВН менее 150 копий/мл) Группа 2 (ВН менее 100000 копий/ мл) Группа 3 (ВН более | 100000 | копий/мл) !

п-66 п = 58 п = 27 j

1 af3-l- | лимфоциты, % М±ш 71,32±8,12 71,86+8,08 74,9±6,8 |

1 ap-T- ! лимфоциты, абс М±ш 1010,13+385,49 1180,59±539,6 779,3+479,2* ; ** 1 i

i yd-1 - ' лимфоциты,% М±ш • 4,4+2,94 3,64+2,64 2,6±1,7* !

| уб-Т- i лимфоциты, абс М+т 1 56,78±36,99 1 56,05x37.45 25,5+23,8* ! | ;

Примечание: * - достоверность различий показателей в группах 2 и 3 по сравнению с группой 1 по У-критерию Манна-Уитни: р<0,05

** - достоверность различий показателей больных группы 3 по сравнению с группой 2 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05

Таким образом, у ВИЧ-инфицированных пациентов прогрессиро-вание заболевания, а именно падение абсолютных чисел Т-хелперов CD3+4+, как основных клеток-мишеней ВИЧ, и нарастание вирусной нагрузки, сопровождается падением общего числа лейкоцитов, абсолютных уровней лимфоцитов и моноцитов, соотношения CD3+4+/ CD3+8+, снижением уровня двойной позитивной и негативной субпопуляций лимфоцитов, особо значимые при высокой вирусной нагрузке. При этом абсолютные числа цитотоксических Т-лимфоцитов по мере нарастания вирусной нагрузки повышаются, но при достижении антигенной нагрузки высоких показателей (более 100000 копий/мл) происходит истощение данной субпопуляции Т-лимфоцитов. Со стороны оф-и у5-субпопуляций Т-лимфоцитов выявлено значительное снижение их абсолютных уровней. Полученные нами результаты подтверждаются данными литературных источников о том, что уровень у5-Т-клеток, составляющий у здоровых лиц 3-6 % всех CD3+ клеток крови, при ВИЧ-инфекции падает (Poles М.А, Barsoum S, Yu W, 2003; Martini

F., Urso R., Gioia C., 2000). По всей видимости, это играет немаловажную роль в снижении силы иммунного ответа вплоть до его полного отсутствия против целого ряда микроорганизмов и приводит у ВИЧ-инфицированных к развитию оппортунистических инфекций.

Взаимосвязь между yS-T-клетками, CD4+ Т-клетками и вирусной нагрузкой остается противоречивой (Nunnari G., 2008). Поскольку у8-Т-лимфоциты не могут быть непосредственным объектом ВИЧ-инфекции вследствие отсутствия у них рецептора CD4, была выдвинута гипотеза косвенных механизмов их участия в процессе прогрессирования заболевания (Li П., 2008).

Т-хелперы CD3+4+, безусловно, играют важную роль в заболевании ВИЧ, и их количественное и функциональное истощение, наряду с угнетением Thl иммунного ответа, могут быть возможными косвенными причинами угнетения у8-Т-клеток. С другой стороны, существенная и непрерывная антигенная стимуляция ВИЧ может также нести ответственность за нарушения данной субпопуляции Т-лимфоцитов. Тем не менее, эти механизмы не являются взаимоисключающими и могут сосуществовать и иметь синергичный эффект.

Так как одной из задач нашего исследования было выявление основных направлений взаимодействия между собой Т-лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня антигенной нагрузки на организм, на следующем этапе мы провели корреляционый анализ между основными показателями Т-лимфоцитарного звена иммунитета в группах пациентов в зависимости от уровня вирусной нагрузки.

При исследовании корреляционных взаимосвязей между уровнем виремии и субпопуляциями Т-лимфоцитов у пациентов с вирусной нагрузкой менее 150 копий/мл нами было выявлено, что уровень виремии имеет статистически значимые отрицательные связи с относительным числом Т-хелперов, положительные - с относительным уровнем цито-токсических Т-лимфоцитов. При анализе связей уровня вирусной нагрузки с показателями лейкограммы прослеживаются отрицательные связи с общим количеством лейкоцитов и относительным уровнем гра-нулоцитов, а также положительная - с относительным уровнем лимфоцитов. Таким образом, повышение вирусной нагрузки сопровождается падением числа лейкоцитов, относительного уровня гранулоцитов и Т-хелперов при росте относительных уровней цитотоксических лим-

фоцитов и лимфоцитов.

В группе пациентов с вирусной нагрузкой до 100000 копий/мл, в отличие от группы контроля (вирусная нагрузка менее 150 копий/мл), уровень виремии положительно коррелирует только с относительным уровнем цитотоксических лимфоцитов, что свидетельствует о том, что отсутствие активной репликации вируса вероятно связано с активацией цитотоксических клеток. В группе с высокой вирусной нагрузкой выявлены положительные взаимосвязи ее уровня с относительным и абсолютным уровнями двойной позитивной субпопуляции Т-лимфоцитов CD3+4+8+, абсолютным числом двойной негативной CD3+4-8-, а также отрицательная связь с абсолютным уровнем у5-Т-лимфоцитов, чего не наблюдалось ни в одной из групп сравнения. Это свидетельствует о том, что при высокой репликации вируса в организме наблюдается активация иммунной системы, и в иммунологическую реакцию активно, вовлекаются все ее компоненты.

На следующем этапе мы исследовали взаимосвязь между собой субпопуляций Т-лимфоцитов. В контрольной группе (вирусная нагрузка менее 150 копий/мл) прослеживаются положительные статистически значимые связи между абсолютным уровнем CD3+ и абсолютными числами CD3+4+, CD3+8+ и CD3+4-8- лимфоцитов, а также отрицательная связь абсолютных уровней CD3+4+ и CD3+8+ лимфоцитов. Со стороны двойных позитивных субпопуляций CD3+4+8+ Т-лимфоцитов выявлены отрицательные связи между абсолютным их уровнем и относительным числом Т-лимфоцитов и Т-хелперов, а также положительные связи с абсолютным уровнем цитотоксических Т-лимфоцитов. Таким образом, в группе с минимальной антигенной нагрузкой падение уровня Т-хелперов сопровождается снижением абсолютного числа Т-лимфоцигов, повышением абсолютного уровня цитотоксических лимфоцитов, снижением индекса соотношения CD3+4+/CD3+8+ и повышением числа клеток двойной негативной субпопуляции CD3+4-8-лимфоцитов.

При исследовании корреляционных взаимосвязей между субпопуляциями лимфоцитов в группе ВИЧ-инфицированных с уровнем вирусной нагрузки до 100000 копий/мл, в сравнении с контрольной группой (вирусная нагрузка менее 150 копий/мл), выявлено появление новой связи абсолютного числа СЭЗ+4+8+клеток с абсолютным уровнем Т-лимфоцитов CD3+. Исчезает взаимосвязь абсолютного количества

двойной позитивной субпопуляции лимфоцитов CD3-r4+8+ с относительным уровнем Т-хелперов, при этом она появляется с абсолютным уровнем Т-хелперов CD3-r4-r. Все остальные взаимосвязи аналогичны таковым в группе контроля. Таким образом, при снижении абсолютного числа Т-лимфоцитов наблюдается падение абсолютного уровня всех исследуемых субпопуляций лимфоцитов, а снижение абсолютного числа Т-хелперов сопровождается, закономерным снижением соотношения CL)3+4-r/CD3+8+ и повышением уровня двойной негативной субпопуляции Т-лимфоцитов, а также снижением абсолютных чисел клеток, несущих и CD4+ и CD8+ рецепторы.

При фенотипировании лимфоцитов в группе пациентов с высокой вирусной нагрузкой (более 100000 копий/мл) мы наблюдали появление положительной корреляционной связи относительного числа Т-лимфоцитов с абсолютным количеством Т-хелперов, а также увеличение количества и усиление связей первых с цитотоксическими лимфоцитами CD3+8+. Также появляются новые положительные корреляционные связи между относительным числом Т-лимфоцитов и абсолютным уровнем двойной негативной субпопуляции лимфоцитов, в сравнении с группой с низкой вирусной нагрузкой (менее 100000 копий/ мл), и наблюдается усиление этих связей относительно контрольной группы. Таким образом, при увеличении вирусной нагрузки выявлена более выраженная дезорганизация в составе субпопуляций лимфоцитов по сравнению с другими группами обследованных лиц.

Так как большинство Т-лимфоцитов в зависимости от вида TcR подразделяются на две субпопуляции (ар- и уб-Т-лимфоциты), то следующим этапом мы оценили корреляционные взаимодействия между показателями Т-звена иммунной системы и уб-Т-, а также а|3-Т-лимфоцитами.

При анализе корреляционных взаимосвязей ар-Т-лимфоцитов в контрольной группе (вирусная нагрузка менее 150 копий/мл) прослеживается сильная положительная связь абсолютного их уровня с абсолютными числами лимфоцитов, несущими рецепторы CD3+-, CD3+4+, CD3+8+, а также положительная связь с абсолютным уровнем уб-Т-лифоцитов.

Со стороны уб-Т-лимфоцитов прослеживается стойкая взаимная положительная корреляционная связь как относительных, так и абсолютных их чисел с уровнем двойной негативной субпопуляции лимфо-

цитов, что укладывается в литературные данные о том, что большинство циркулирующих в периферической крови yS-Т-лимфоцитов не экспрессируют ни CD4, ни CD8 рецепторы (Battistini L. et. al., 1997; Хайдуков C.B., Зурочка А.В., 2008). Помимо этого, существует положительная связь между абсолютными числами у5-Т лимфоцитов и CD3+, CD3+8+. Таким образом, снижение абсолютного числа Т-лимфоцитов сопровождается падением абсолютных чисел Т-хелперов, цитотоксиче-ских Т-лимфоцитов, снижением абсолютного уровня сф-Т-лимфоцитов и yS-T-лимфоцитов. Полученные данные свидетельствуют о том, что при минимальной антигенной нагрузке не наблюдается пролифератив-ной активности уй-Т-лимфоцитов в ответ на вирус и, соответственно, не идет наработка антиген-специфических у5-'Г-лимфоцитов.

На следующем этапе нашего исследования мы проанализировали корреляционные взаимодействия клеток Т-звена иммунной системы с оф- и у5-Т-лимфоцитами в группе лиц с вирусной нагрузкой менее 100000 копий/мл.

Со стороны оф- Т-клеток характер корреляционных взаимосвязей аналогичен таковым в контрольной группе, за исключением появления одной новой положительной связи абсолютного их уровня с абсолютным числом двойной позитивной субпопуляции лимфоцитов. Со стороны уб-Т-лимфоцитов по сравнению с контрольной группой характер взаимосвязей остается неизменным. Таким образом, прослеживается стойкая положительная связь абсолютного уровня у§ -Т-лимфоцитов с абсолютными уровнями лимфоцитов, Т-лимфоцитов, цитотоксических лимфоцитов, а также с абсолютным числом двойной негативной субпопуляции Т-лимфоцитов.

Таблица 7. Корреляционные связи между ар- и уб-Т-лимфоцитами и показателями Т-звена иммунной системы у лиц с вирусной нагрузкой более 100000 копий/мл

Сравниваемые показатели Коэффициент

корреляции, г

сф-Т- лимфоциты (%) Лимфоциты (х107л) 0,54

СОЗ+(%) 0,9

СОЗ+ (абс) 0,59

СОЗ+4+ (%) 0,39

СОЗ+4+ (абс) 0,4

СОЗ+8+ (%) 0,5

СОЗ+8+ (абс) 0,6

СБЗ+4+8+ (%) -0,39

СОЗ+4-8- (абс) 0,45

а(1-Т-лимфоциты (абс) Лейкоциты (х107л) 0,63

Лимфоциты (%) 0,51

Лимфоциты (х109/л) 0,99

Моноциты (х109/л) 0,76

Гранулоциты (х109/л) 0,42

СОЗ+ (%) 0,69

СОЗ+ (абс) 1,0

! С 03+4+ (абс) 0,76

СОЗ+8+ (абс) 0,98 1

; сф-Т-лимфоциты (абс) СОЗ+4+8+ (абс) 0,59

1 СОЗ+4-8- (абс) ! 0,68

1 у5-Т-лимфоциты (абс) 0,48 :

у5-Т-лимфоциты(%) Лимфоциты (%) | -0,54

СОЗ+4-8- (%) 1 0,53 1

уй-Т-лимфоциты (абс) Лейкоциты (х 107л) ; 0,84

Лимфоциты (хЮ'/л) | 0,52

Моноциты (х109/л) ! 0,6

Гранулоциты (х 105/л) ! 0,74

СОЗ+ (%) 1 0,4

СОЗ+ (абс) 1 0,52

СОЗ+8+ (абс) ! 0,52

СОЗ+4+8+ (абс) { 0,44

СОЗ+4-8- (абс) 1 0,84

Вирусная нагрузка | -0,52

Примечание: указаны только статистически значимые показатели

При исследовании корреляционных связей ар- и у8-Т-лимфоцитов с клетками иммунной системы в группе лиц с высокой вирусной нагрузкой (более 100000 копий/мл) (Таблица 7) наблюдается некоторое усиление взаимосвязей абсолютного уровня а|3-Т-лимфоцигов с обшим количеством Т-лимфоцитов, с абсолютными числами Т-хслперов, ци-тотоксических Т-лимфоцитов и с двойной негативной субпопуляцией Т-лимфоцитов по сравнению с другими группами пациентов. Со стороны у8-Т-лимфоцитов выявлено появление положительной связи их абсолютного уровня с общим количеством лейкоцитов, а также с абсолютным уровнем двойной позитивной субпопуляции лимфоцитов при отсутствии таковых в группах сравнения. Таким образом, как мы видим, нарастаег число популяций Т-клеток с нарушенной дифференцировкой.

На завершающем этапе нашего исследования мы провели исследование корреляционных взаимодействий между показателями лейко-граммы. При этом в контрольной группе лиц (вирусная нагрузка менее 150 копий/мл) абсолютный уровень лимфоцитов связан отрицательной корреляционной связью только с относительным уровнем гранулоцитов. При анализе лейкограммы у лиц с низкой вирусной нагрузкой (менее 100000 копий/мл) выявлено, что она не имеет существенных отличий по корреляционным взаимодействиям от таковой в контрольной группе, за исключением положительной связи абсолютного уровня лимфоцитов и абсолютного числа моноцитов. В группе пациентов с высокой вирусной нагрузкой (более 100000 копий/мл) прослеживается незначительное ослабление корреляционных взаимосвязей между лимфоцитами и гранулоцитами, а также уменьшение количества связей между моноцитами и гранулоцитами по сравнению с контрольной группой и лицами с вирусной нагрузкой менее 100000 копий/мл. По остальным параметрам взаимосвязи между компонентами лейкограммы в группе с высокой вирусной нагрузкой аналогичны таковым в контрольной группе.

Проведенный корреляционный анализ показал, что существуют тесные взаимодействия между абсолютными числами Т-лимфоцитов, а в частности Т-хелперами, как наиболее значимыми показателями при оценке степени тяжести заболевания и в прогнозировании течения патологического процесса, и всеми субпопуляциями Т-лимфоцитов, количество которых растет по мере роста виремии. Помимо этого, при высокой вирусной нагрузке (более 100000 копий/мл) выявляется значительный рост количества взаимосвязей ее уровня с клетками Т-звена иммуните-

та и не только с Т-хелперами и цитотоксическими Т-лимфоцитами, но и с двойными позитивными и негативными субпопуляциями, а также с лимфоцитами, несущими уб-ТсЯ и участвующими в МНС-независимом типе иммунного ответа.

Также по мере роста антигенной нагрузки увеличивается количество и сила положительных корреляционных взаимодействий между абсолютными показателями всех клеток Т-звена. Все эти изменения в лимфоцитарном звене иммунной системы, происходящие вследствие замещения лимфоидной ткани по мере прогрессирования заболевания фиброзом, приводят к нарушению процессов распознавания и презентации антигенов, массивному высвобождению вируса в кровоток и истощению ответной реакции иммунной системы на антиген вплоть до полной неспособности осуществлять основную функцию - защиту организма от чужеродной генетической информации, т.е. развитию оппортунистических инфекций.

Полученные нами в результате исследования данные разъясняют причину дисфункции уб-Т-лимфоцитов и ту роль, которую они играют в течение патологического процесса и ясно показывают, что про-грессирование ВИЧ-инфекции как на иммунологическом, так и на вирусологическом уровне тесно связано с количественными и, как следствие, качественными нарушениями не только Т-хелперов, но и у5-Т-лимфоцитов.

Выводы

1. У ВИЧ-инфицированных лиц формируется дисбаланс клеток Т-звена иммунной системы с истощением их резерва, что проявляется изменением параметров Т-лимфоцитов, более выраженным у лиц с высокой вирусной нагрузкой (более 100000 копий/мл), заключающихся в падении общего числа Т-лимфоцитов, внутри популяции которых наблюдается снижение относительного уровня Т-хелперов и повышение относительного числа цитотоксических Т-лимфоцитов, снижение соотношения СОЗ+4+/СОЗ+8+, а также падение относительного и абсолютного числа клеток двойной негативной субпопуляции Т-лимфоцитов.

2. На поздних стадиях ВИЧ-инфекции (при уровне Т-хелперов ниже 500 клеток/мкл) не происходит достаточной наработки Т-цитотоксических клеток, что выражается в снижении в крови абсолютною уровня цитотоксических Т-лимфоцитов при падении уровня Т-хелперов.

3. У ВИЧ-инфицированных лиц в ответ на активный рост антигенной (вирусной) нагрузки происходит угнетение индукторных клеток, что проявляется падением абсолютных чисел Т-лимфоцитов, несущих aß- и yS-TcR.

4. У ВИЧ-инфицированных пациентов формируются положительные корреляционные взаимосвязи между абсолютным количеством у8-Т-лимфоцитов и абсолютными уровнями Т-лимфоцитов, цитотокси-ческих лимфоцитов и популяции двойных негативных Т-лимфоцитов. При высокой вирусной нагрузке (более 100000 копий/мл) у ВИЧ-инфицированных лиц формируется обратная корреляционная связь абсолютного уровня у5-Т-лимфоцитов с уровнем виремии.

Практические рекомендации

При снижении уровня Т-хелперов CD3+4+ ниже 500 клеток/ мкл помимо стандартного определения количества Т-хелперов рекомендуется расширенное исследование субпопуляционного состава Т-звена иммунной системы, включающее дополнительное определение количества цитотоксических Т-лимфоцитов, aß- и yô-T-лимфоиитов. Снижение их уровня является дополнительным критерием ухудшения прогноза развития заболевания и необходимости назначения высокоактивной антиретровирусной терапии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шестакова, Е.В. Анализ контрольных показателей «репли-каты Т-клеток» и «сумма Т-клегок» при исследовании иммунного статуса у ВИЧ-инфицированных больных и выявление дубль-негативных субпопуляций Т-лимфоцитов (CD3+CD4-CD8-) / Е.В. Шестакова, A.B. Зурочка, C.B. Квятковская, С.Г. Бецков, В.В. Ду-кардт, C.B. Хайдуков // Медицинская иммунология. - 2008. - Т. 10, № 4-5. - С. 463-466.

2. Зурочка, A.B. Оценка уровня yÔ-T-лнмфоцитов у больных ВИЧ-инфекцией в зависимости от уровня вирусной нагрузки / A.B. Зурочка, Е.В. Шестакова, Т.В. Гаврилова, C.B. Квятковская, И.В. Распонина, В.А. Черешнев II Российский иммунологический журнал. - 2010. - Т.4(13), №1. - С. 77-82.

3. Шестакова, Е.В. Изменение параметров Т-лимфоцитарного звена иммунитета при ВИЧ-инфекции / Е.В. Шестакова, A.B. Зурочка, Т.В.

Гаврилова// Российский аллергологический журнал. - 2010. - № 1, вып. 1. - С. 215-216.

4. Шестакова, Е.В. Формирование новых инновационных технологий на основе изучения yS-T-лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц с использованием метода проточной цитометрии / Е.В. Шестакова, A.B. Зурочка, Т.В. Гаврилова // «Оптимизация высшего медицинского и фармацевтического образования: менеджмент качества и инноваций». Материалы I научно-практической конференции. - Челябинск, 2010. -С. 142-143.

5. Шестакова, Е.В. Определение aß- и у8-Т лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц / Е.В. Шестакова, A.B. Зурочка, Т.В. Гаврилова, C.B. Хайдуков // Материалы II ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням. - Москва, 2010. - С. 372-373.

Отпечатано в издательстве « ГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия».

Лицензия № 01906. Подписано в печать 16.04.10 г. Объем 1 п.л. Формагг 64x84. ГарнитураTimes New Roman Суг". Бумага для офисной техники, 80 мг/м 2 . Тираж 100 экз.

Актуальность проблемы у5-Т-лимфоциты впервые были описаны Brenner М. et al. (1986) как гетерогенная субпопуляция Т-клеток с Т-клеточным рецептором, состоящим из у- и S-цепей (ySTcR) (Kuziel W.A. et al., 1987; Bucy P., et al. 1988; Hein W.R., Mackay C.R., 1991). У людей и многих животных большинство Т-клеток экспрессируют Т-клеточный рецептор, состоящий из а- и Р-цепей, и лишь небольшое количество Т-клеток несет Т-клеточный рецептор с у- и 8-цепями. В отличие от ар-Т-клеток, у8-Т-клетки напрямую распознают белковые и небелковые фосфолиганды без участия главного комплекса гистосовместимости. у8-Т-клетки участвуют в антимикробном иммунитете и обладают эффекторными функциями.

Роль yS-T-клеток в иммунных процессах при различных заболеваниях и их взаимодействие с другими клетками организма до сих пор остаются до конца невыясненными. Но уже накопилось достаточно информации, которая доказывает необходимость существования подобной популяции клеток (Caccamo N., 2006; Girardi М., 2006; Kastuta М., 2006). Количественное содержание у8-Т-клеток в организме невелико и варьирует в зависимости от локализации. у8-Т-клетки редко обнаруживаются в селезенке, пейеровых бляшках и паренхиме лимфатических узлов и широко распространены среди клеток периферической крови и афферентных и эфферентных лимфатических сосудах. у8-Т-клетки являются главной популяцией Т-клеток в эпителии нелимфоидных тканей, включая кожу, кишечник, легкие, язык и органы репродуктивной системы. Их популяция в тимусе и периферической крови взрослого человека составляет всего 1—5% или 5—10% от всех Т-лимфоцитов, а 90—95% Т-клеток крови представляют собой ар-Тклетки (Itohara S. et al., 1990). Известно, что уб-Т-лимфоциты вовлечены в механизмы местной иммунной защиты при ВИЧ- и цитомегаловирусной (ЦМВ) инфекции и при определенных бактериальных инфекциях, включая Лайм-боррелиоз (Dechanet J. et al., 1999). Так же оказалось, что у5-Т-клетки оказывают цитотоксическое действие с участием механизмов апоптоза (Pawelec G. et al., 1989; Boullier S. et al. 1997). Предполагается, что цитотоксическая активность у8-Т-клеток может быть стимулирована внутриклеточными патогенами, некоторыми бактериями и простейшими, включая М. tuberculosis, У. enterocolitica, Т. gondii, а также некоторыми вирусами (вирус простого герпеса, вирус Эпштейна—Барр, вирус иммунодефицита человека).

Существенную роль yS-T-клетки играют в противоинфекционном иммунитете. Высказано предположение, что они создают первую линию защиты в очаге бактериальной инфекции, сдерживая ее распространение до развития иммунного ответа, основанного на распознавании антигена сф-Т-клеток в комплексе с молекулами HLA, так как у5-Т-клетки распознают антигены без предварительного процессирования и участия молекул HLA комплекса, в отличие от оф-Т-лимфоцитов (Kozbor D. et al., 1989; Hayday A.C., 2000). Дальнейшие исследования выявили, что у8-Т-клетки высокочувствительны к фосфоантигенам (пирофосфатам и фосфомоноэстерам, конъюгированным нуклеотидным остаткам), которые могут продуцировать микобактерии, грамотрицательные, грамположительные кокки, токсоплазма и некоторые растения (Schoel В. et al., 1994; Fournie J.J., Bonneville M., 1996; Poquet Y. et al., 1998). Кроме того, у5-Т-клетки могут распознавать поверхностные антигены на определенных опухолевых клетках, таких как клетки лимфомы Беркитта.

Приведенные выше факты свидетельствуют в пользу того, что для более полной характеристики Т-клеток пациента анализ следует проводить не только по таким специфическим и безусловно важным при ВИЧ-инфекции маркерам как CD3+, CD3+4+ и CD3+8+, но и по наличию субпопуляций сф-Т-клеток и у5-Т-клеток. Важность определения последних очевидна при ВИЧ-инфекции, сопровождающейся длительной персистенцией антигена в организме на фоне депрессии Т-клеточного звена иммунной системы, для уточнения стадии заболевания, контроля эффективности проводимой антиретровирусной терапии, прогноза развития и течения заболевания.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилось изучение характера изменений как зависимого, так и независимого от главного комплекса гистосовместимости (МНС) Т-лимфоцитарного иммунного ответа у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня содержания в крови Т-хелперов (CD3+4+) и вирусной нагрузки (ВН) на организм.

Для достижения этой цели нами были поставлены следующие задачи:

1. Изучить изменения состояния Т-лимфоцитарного звена иммунитета у больных ВИЧ-инфекцией в зависимости от уровня содержания в крови Т-хелперов и вирусной нагрузки.

2. Оценить реакцию субпопуляций Т-лимфоцитов, несущих TcR а(3 и у8, на изменение вирусной нагрузки и уровня Т-хелперов.

3. Оценить взаимосвязь между основными показателями Т-лимфоцитарного звена иммунитета в зависимости от уровня антигенной нагрузки на организм.

Положения, выносимые на защиту

1. У ВИЧ-инфицированных лиц при различной степени вирусемии выявляются изменения параметров лимфоцитов, более выраженные у пациентов с высокой вирусной нагрузкой (более 100000 копий/мл), заключающиеся в падении общего числа Т-лимфоцитов, внутри популяции которых наблюдается снижение относительного уровня Т-хелперов и повышение относительного числа цитотоксических Т-лимфоцитов, сопровождающееся снижением соотношения CD3+4+/CD3+8+, а также падение относительного и абсолютного числа клеток двойной негативной субпопуляции Т-лимфоцитов.

2. У ВИЧ-инфицированных пациентов при снижении в крови уровня Т-хелперов наблюдается снижение абсолютного уровня цитотоксических Т-лимфоцитов и абсолютного количества двойной позитивной субпопуляции Т-лимфоцитов.

3. У ВИЧ-инфицированных лиц при снижении содержания в крови Т-хелперов и повышении вирусной нагрузки наблюдается падение абсолютных чисел Т-лимфоцитов, несущих как оф-, так и уб-TcR.

4. У ВИЧ-инфицированных пациентов формируются положительные корреляционные взаимосвязи между абсолютным количеством уб-Т-лимфоцитов и абсолютными уровнями Т-лимфоцитов, цитотоксических лимфоцитов и популяции двойных негативных Т-лимфоцитов. При высокой вирусной нагрузке (более 100000 копий/мл) у ВИЧ-инфицированных лиц формируется обратная корреляционная связь абсолютного уровня уб-Т-лимфоцитов с уровнем виремии.

Научная новизна

Впервые изучено состояние Т-лимфоцитарного звена иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц с определением характера изменений внутри субпопуляции Т-лимфоцитов в зависимости от наличия сф- или y8-TcR. Определен характер изменений среди двойных негативных и позитивных субпопуляций Т-лимфоцитов в зависимости от уровня антигенной (вирусной) нагрузки на организм. Это позволило выяснить особенности реакции лимфоцитов на массированную антигенную атаку на организм и выявить значимость этих нарушений в формировании данной патологии. Помимо этого, изучено изменение данных показателей в зависимости от уровня содержания в крови ВИЧI инфицированных Т-хелперов, как основных клеток-мишеней вируса иммунодефицита человека и важного критерия прогрессирования заболевания.

Впервые показано, что в ответ на рост антигенной нагрузки не происходит пролиферативной активности уб-Т-лимфоцитов, а, напротив, наблюдается их угнетение наряду с другими субпопуляциями Т-лимфоцитов, что ведет к истощению иммунной реактивности организма и, соответственно, прогрессированию заболевания.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость результатов исследования состоит в расширении знаний о характере иммунологических нарушений внутри Т-лимфоцитарного звена иммунитета у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня Т-хелперов и ВН.

Выявленные нарушения внутри популяции Т-лимфоцитов, как основных клеток-мишеней при ВИЧ-инфекции, и оценка их патогенетического значения, позволят в дальнейшем более четко прогнозировать прогрессирование заболевания и оценивать эффективность проводимой антиретровирусной терапии в зависимости от уровня содержания Т-хелперов в крови, а также от антигенной нагрузки, от количества у5-Т клеток, двойной негативной и двойной позитивной субпопуляций Т-лимфоцитов как свидетелей дезорганизации работы иммунной системы при ВИЧ-инфекции.

Апробация работы

Результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на Всероссийском научном Форуме имени академика В.И. Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге «Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии» (г. Санкт-Петербург, 2008), I научно-практической конференции «Оптимизация высшего медицинского и фармацевтического образования: менеджмент качества и инноваций» (г. Челябинск, 2010), Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология — практическому здравоохранению» (г. Москва, 2010), II Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва, 2010).

Апробация диссертации была проведена на совместном заседании НИИ иммунологии, кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии, самостоятельного курса клинической лабораторной диагностики, кафедры иммунологии и аллергологии, ДНИЛ ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 2 в научных журналах и изданиях, определенных ВАК.

Объем и структура диссертации

ВЫВОДЫ

1. У ВИЧ-инфицированных лиц формируется дисбаланс клеток Т-звена иммунной системы с истощением их резерва, что проявляется изменением параметров Т-лимфоцитов, более выраженным у лиц с высокой вирусной нагрузкой (более 100000 копий/мл), заключающихся в падении общего числа Т-лимфоцитов, внутри популяции которых наблюдается снижение относительного уровня Т-хелперов и повышение относительного числа цитотоксических Т-лимфоцитов, снижение соотношения CD3+4+/CD3+8+, а также падение относительного и абсолютного числа клеток двойной негативной субпопуляции Т-лимфоцитов.

2. На поздних стадиях ВИЧ-инфекции (при уровне Т-хелперов ниже 500 клеток/мкл) не происходит достаточной наработки Т-цитотоксических клеток, что выражается в снижении в крови абсолютного уровня цитотоксических Т-лимфоцитов при падении уровня Т-хелперов.

3. У ВИЧ-инфицированных лиц в ответ на активный рост антигенной (вирусной) нагрузки происходит угнетение индукторных клеток, что проявляется падением абсолютных чисел Т-лимфоцитов, несущих ар-и уб-TcR.

4. У ВИЧ-инфицированных пациентов формируются положительные корреляционные взаимосвязи между абсолютным количеством уб-Т-лимфоцитов и абсолютными уровнями Т-лимфоцитов, цитотоксических лимфоцитов и популяции двойных негативных Т-лимфоцитов. При высокой вирусной нагрузке (более 100000 копий/мл) у ВИЧ-инфицированных лиц формируется обратная корреляционная связь абсолютного уровня у8-Т-лимфоцитов с уровнем виремии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При снижении уровня Т-хелперов CD3+4+ ниже 500 клеток/ мкл помимо стандартного определения количества Т-хелперов рекомендуется расширенное исследование субпопуляционного состава Т-звена иммунной системы, включающее дополнительное определение количества цитотоксических Т-лимфоцитов, оф- и у5-Т-лимфоцитов. Снижение их уровня является дополнительным критерием ухудшения прогноза развития заболевания и необходимости назначения высокоактивной антиретровирусной терапии.