Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Закономерности регуляции метаболизма лимфоцитов крови у женщин в патогенезе аутоиммунных заболеваний щитовидной железы

п •• ■•;.'■ т и . . . -.

На правах рукописи

КАДРИЧЕВА СВЕТЛАНА ГЕННАДЬЕВНА

ЗАКОНОМЕРНОСТИ РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ У ЖЕНЩИН В ПАТОГЕНЕЗЕ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.00.16. - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2002

Работа выполнена на кафедре биохимии и физиологии человека и животных Красноярского государственного университета и в научно-исследовательском институте медицинских проблем Севера СО РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Савченко А.А.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Явербаум П.М. доктор биологических наук Скворцова Р.Г.

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лим-фологии СО РАМН, г. Новосибирск

Защита состоится «_»_2002 г. в_часов на заседании диссертационного совета Д.001.054.01. в ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН» (664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения РАМН».

Автореферат разослан «_»_

2002 г.

г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Шолохов Л.Ф.

/V/'Г ~ < О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: Диффузный токсический зоб (ДТЗ) и аутоиммунный тиреоидит (АИТ) являются наиболее распространенными органоспе-цифическими аутоиммунными заболеваниями. АИТ и ДТЗ имеют сходную этиологию - аутоиммунный процесс, но различный патогенез, специфичность которого на уровне организма проявляется, в том числе и уровнем тиреоидных гормонов (Петров Р.В., 1987; Кандрор В.И., 1988; Старкова Н.Т., 1996; Бала-болкин М.И., 1997; Игаатьева Г.А., 1997; Кандрор В.И. и соавт., 1997; Afeltra А. et.al., 1998; Vol Van Noort J.M., Amor S., 1998; Хаитов P.B. и соавт., 1999). Следовательно, в организме больных аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы (АИЗЩЖ) происходит перестройка иммуноэндокринных взаимосвязей.

Известно, что многочисленные взаимосвязи иммунной и эндокринной систем с нервной формируют гомеостатическую триаду, которая, осуществляя постояшшй контроль, обеспечивает постоянство внутренней среды организма (Горизонтов П.Д., 1981; Харди Р., 1986; Акмаев И.Г., Грипевич В.В., 2001). При этом, лимфоциты, как основные эффекторы иммунитета, не только определяют резистентность организма, но и выделяют цитокины, влияющие как на реактивность самой иммунной системы, так и на другие системы организма (Робинсон М.В., 1986). Кроме того, иммунокомпетентные клетки имеют богатый набор рецепторов, что делает их высокочувствительными к разнообразным изменениям гомеостаза организма (Труфакин В.А., 1995).

Таким образом, реактивность организма практически полностью определяется функциональной активностью иммунокомпетентных клеток. При этом доказано, что функциональная активность лимфоцитов зависит от интенсивности их метаболизма (Грязева Н.И. и соавт., 1998; Нарциссов Р.П., 1998; Северин С.Е. и соавт., 1998). Именно на уровне метаболической системы клеток формируются ответные реакции на воздействия, в том числе и гормональной природы.

Особенно высокой информативностью для исследования метаболизма активированных лимфоцитов обладают окислительно-восстановительные ферменты. Это связано с тем, что, являясь основными переносчиками электронов в клетке, они осуществляют ключевые реакции клеточного метаболизма и коор-

динируют сопряженные метаболические пути (Савченко A.A., Захарова Л.Б., 1992; Саприн А.Н. и соавт., 1996; Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1998; Грязева

H.И. и соавт., 1998; Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., 1998; Савченко А.А„ 1998; Комиссарова И.А. и соавт., 2001).

Таким образом, учитывая высокую информативность метаболических показателей для характеристики функционального состояния иммунокомпетент-ных клеток, исследование метаболических параметров позволит выяснить тонкие патогенетические процессы аутоиммунных заболеваний щитовидной железы.

Цель исследования: Выявить закономерности регуляции метаболизма лимфоцитов крови у женщин в патогенезе аутоиммунных заболеваний щитовидной железы.

Задачи исследования:

I., Исследовать уровни активности метаболических ферментов в лимфоцитах крови у женщин с АИТ и ДТЗ.

2. Изучить особенности влияния тиреоидных гормонов и кортизола на активность оксидоредуктаз лимфоцитов крови у женщин с АИТ и ДТЗ.

3. Исследовать метаболический ответ лимфоцитов крови больных АИТ на воздействие биологически активных веществ in vitro.

4.: Установить .особенности метаболического ответа лимфоцитов у женщин с ДТЗ на воздействие биологически активных веществ in vitro.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. . j.^первые проведено комплексное исследование с применением биолюминесцентных и цитоморфоденситометрических методов анализа ферментативной активности • флавинадениндинуклеотид- и НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в иммунокомпетентных клетках крови у женщин с АИЗЩЖ. Проведение данного исследования позволило получить информацию о роли обменных процессов в различных компартментах лимфоцитов и взаимосвязи между ферментами с энергетическими и пластическими функциями в организме больных АИТ и ДТЗ. Установлены особенности гормональной регуляции метаболических реакций иммунокомпетентных клеток крови у больных АИЗЩЖ.

Впервые при выявлении особенностей метаболизма иммунокомпетентных клеток женщин с АИТ и ДТЗ при использовании методов нейросетевой

классификации и предикции осуществлены качественная и количественная оценка нелинейных взаимосвязей между различными показателями клеточного метаболизма.

Впервые установлены особенности метаболического ответа лимфоцитов крови больных АИЗЩЖ на воздействие биологически активных веществ (БАВ) in vitro, что позволило получить информацию о регуляторных механизмах реактивности иммунокомпетентных клеток при нарушении иммуноэндокринных взаимосвязей.

Практическая значимость работы.

В результате проведенных исследований получены новые данные о закономерностях энзиматических изменений в иммунокомпетентных клетках женщин при АИЗЩЖ. Выявленные закономерности в изменениях активности внутриклеточных ферментов позволяют рекомендовать методы исследования метаболических параметров лимфоцитов при оценке выраженности нарушения иммуноэндокринных взаимосвязей.

Выявленные особенности изменения метаболического статуса лимфоцитов здоровых женщин и больных АИЗЩЖ при воздействии БАВ in vitro позволяют охарактеризовать реактивность иммунокомпетентных клеток, зависящую от регуляторных систем целостного организма.

Результаты проведенных исследований внедрены в практику работы Краевого эндокринологического центра при Краевой клинической больнице №1.

Положения, выносимые на защиту:

1. Сходность патогенеза при различном гормональном фоне определяет соответственно общие и специфические особенности метаболического статуса лимфоцитов крови у больных АИТ и ДТЗ, что проявляется в уровнях активности метаболических ферментов и системе регуляторных взаимосвязей с гормональными показателями.

2. На фоне характерного для больных АИЗЩЖ повышения активности неспецифической эстеразы и оттока субстратов с цикла Кребса на аминокислотный обмен, у женщин с АИТ увеличен уровень дегидрогеназ митохондри-ального компартмента при снижении активности анаэробной реакции лактатде-гидрогеназы (ЛДГ), в то время как у больных ДТЗ уровень дегидрогеназ мито-

хондрий снижен, но при повышении активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

3. Особенности в гормональном статусе и обменных процессах иммуно-компетентных клеток больных АИЗЩЖ определяют специфичность реагирования лимфоцитов на воздействие БАВ in vitro.

Апробация материалов диссертации. Основные положения работы доложены и обсуждены на итоговых научно-практических конференциях Института медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск, 1999 и 2000), на Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 25-летию НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск, 2001), на I Всесибирском конгрессе женщин-математиков (Красноярск, 2000), на II Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых «Агроэкология и устойчивое развитие регионов» (Красноярск, 2000), на международном конгрессе «Научная молодежь на пороге XXI века» (Томск, 2000), на II и III молодежных научных конференциях «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2000, 2001), на VIII и IX Всероссийских семинарах «Нейроинформатика и ее приложения» (Красноярск, 2000 и 2001), I Всероссийская научно-практическая конференция «Актуальные проблемы заболеваний щитовидной железы» (Москва, 2000), международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых (Иваново, 2001), IV Всероссийский конгресс эндокринологов (Санкт-Петербург, 2001), на V Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2001), на заседаниях Красноярского отделения Всероссийского общества физиологов имени И.П. Павлова, Красноярск, 2001 г.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 25 печатных работы.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 2 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 46 рисунками, указатель литературы включает 295 библиографических издания (176 отечественных и 119 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В процессе работы обследовано 150 женщин: 73 здоровых, 46 больных АИТ и 31 - ДТЗ в возрасте от 20 до 45 лет. Диагноз АИТ и ДТЗ выставлялся на основании клинических данных, результатов ультрасонографии щитовидной железы, по анализу концентрации тиреоидных гормонов и антител к микросо-мальной фракции тиреоцитов (АВТМА). Здоровые женщины были отобраны по данным клинического осмотра врачами научно-исследовательского института медицинских проблем Севера.

У обследуемых женщин исследование ферментативного статуса проводилось в иммунокомпетентных клетках периферической крови. Венозную кровь из локтевой вены забирали в пробирки с гепарином. Выделение лимфоцитов производили центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина по методу A.Boyum (1968).

Определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ проводили биолюминесцентными методами (Савченко A.A., Сунцова Л.Н., 1989; Савченко A.A., 1991).

Регуляторные особенности метаболизма иммунокомпетентных клеток крови изучены с помощью функциональных тестов при инкубации с БАВ in vitro. Инкубацию лимфоцитов проводили в стерильных условиях во влажной камере при 37° С в течение 20 часов с добавлением 1 мкг гентамицина при 5% СОг- Ставили 5 проб: первая проба - контроль, вторая - с кортизолом в концентрации 10 мкМ, третья - с инсулином (10 мкМ), четвертая - с Т4 (10~7 М), пятая - с ФГА (5 мкМ).

Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ), а-глицерофосфатдегидро-геназы (аГФДГ) и неспецифической эстеразы (НЭ) в лимфоцитах крови определяли цитохимическими методами (Нарциссов Р.П., 1969; Хейхоу Ф.Г.Дж., Кваглино Дж., 1983). Анализ активности осуществлялся методом компьютерной морфоденситометрии (Жукоцкий A.B., 1994; Кузнецов С.Л. и соавт., 2000; Славянский A.A., Никитина Г.В., 2000). Активность СДГ, аГФДГ и НЭ характеризуется морфоденситометрическими параметрами: площадь (S), периметр (Р), фактор формы (FF), оптическая плотность (OD), интегральная оптическая

плотность (IOD) гранул продукта реакции и усредненными расстояниями между ними по осям X и Y (Rx и Ry, соответственно).

Концентрация тиреотропного (ТТГ), тиреоидных гормонов и кортизола в крови определялось радиоиммунологическими методами с использованием тест-наборов производства «Immunotech» (Чешская Республика). Содержание АВТМА в сыворотке крови определялось иммуноферментным методом с помощью тест-наборов производства «Мультитест» (Россия) (норма: 0-20 Е/мл). Данные исследования проводились на базе Краевого эндокринологического центра при Краевой клинической больнице №1.

По результатам исследования в пакете электронных таблиц MS Excel 7,0 была сформирована база данных, на основе которой с помощью пакетов прикладных программ SPSS 8,0 и "Statistica 6,0" производился статистический анализ. Проверку гипотезы о статистической достоверности двух выборок проводили с помощью критерия Манна-Уитни. Для оценки изменений активности ферментов в лимфоцитах крови при инкубации с БАВ применяли парный критерий Вилкоксона. Для исследования силы взаимосвязей показателей вычислялся коэффициент корреляции. Достоверность различий коэффициентов корреляции оценивали с помощью Т-критерия Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1990).

Для решения задач системного анализа использовали нейросетевой классификатор и предиктор (Горбань А.Н., 1990; Горбань А.Н., Россиев Д.А. 1996).

Результаты исследований и их обсуждение

• иммунокомпетентных клетках женщин с аутоиммунным тиреоидитом повышение уровня активности глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (ГЗФДГ), по-видимому, не компенсирует субстратную недостаточность терминальных реакций гликолиза (Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1998; MacDonald M.J., Marshall L.K., 2000), так как снижена активность анаэробной реакции лактатдегидроге-назы (Обр.ЛДГ) (Табл.1.). К тому же, не выявлено взаимосвязей анаэробной реакции лактатдегидрогеназы с исследуемыми оксидоредуктазами, что может объясняться недостаточным субстратным наполнением гликолиза. Снижение активности аГФДГ определяется уменьшением количества фермента, что подтверждается результатами нейросетевого классификатора на модели Здоровые - Больные АИТ (Табл.2.). По-видимому, обнаруженное снижение ко-

личества фермента наблюдается вследствие уменьшения экспрессии соответствующего гена, что соответственно регулируется тиреоидными гормонами (Kneer N, Lardy Н., 2000). При этом увеличивается роль в транспорте никоти-намидадениндинуклеотидных коферментов основного малат-аспартатного челночного механизма, так как повышен уровень обратной реакции малатдегидро-

Таблица 1

Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови здоровых лиц, _ больных АИТ и ДТЗ (X ± т) _._

Показатели Здоровые N=73 1 АИТ N=46 2 ДТЗ N=31 3

Г6ФДГ 4,75±0,77 5,16±1,30 6,17±1,22 Ри<0,05

ГЗФДГ 0,18±0,04 0,40±0,07 Р,<0,001 0,30±0,10 Р2<0,05

лдг 37,20±5,31 13,41±2,89 Р,<0,01 20,44±4,48 0,1>Р,>0,05

МДГ 21,72±2,31 107,61±32,89 Р,<0,01 15,79±3,81 Р2<0,05

НАДФМДГ 8,22±1,66 0,66±0,17 Р,<0,05 1,39±0,50 Р, <0,001

НАДФГДГ 0,28±0,06 0,03±0,01 Р,<0,01 0,01±0,001 Р,<0,01

НАДГДГ 6,01+1,32 1,70±0,30 Р,<0,05 7,05±1,51 Р2<0,001

НАДФИДДГ 23,02±3,43 24,77±4,92 13,01±4,15 Pi<0,05 Р2<0,01

Обр.ЛДГ 19,96±3,43 4,17±1,16 Р,<0,001 14,64±4,46 Р2<0,01

Обр.МДГ 36,41±5,52 733,83±183,14 Р,<0,001 405,17±171,15 Р,<0,01

ГР 12,93±1,90 14,14±2,10 4,55±1,30 Р,<0,01 Р|.2<0,01

Обр.НАДГДГ 9,79±1,79 519,56±152,33 Р,<0,001 391,57±180,92 Р,<0,01

Обр.НАДФГДГ 29,04±4,11 439,97±118,87 Р,<0,001 125,74±34,84 Р,<0,001 Р2<0,05

геназы (Обр.МДГ) (Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., 1998; ОгаеПег К., е!:. а1., 2001). В иммунокомпетентных клетках крови женщин с АИТ обнаружено сни жение активности малик-фермента, что характеризует подавление синтеза липидов (Бе-рёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1998; Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., 1998).

Изменяется интенсивность обмена субстратов в цикле Кребса: увеличены уровни малатдегидрогеназы (МДГ) и СДГ (Табл.3.), снижены уровни НАД- и НАДФ-зависимых глутаматдегидрогеназ (НАД(Ф)ГДГ), а уровни их обратных реакций повышены. Тем не менее, интенсивность лимитирующего фермента цикла трикарбоновых кислот - НАДИЦДГ, не изменяется в лимфоцитах больных АИТ, по сравнению с группой здоровых. Сохранение активности НАДИЦДГ при изменении интенсивности обмена субстратов обеспечивается тесными устойчивыми взаимосвязями, выявленными в лимфоцитах крови больных женщин, между ферментами цикла, таких как МДГ с НАДФИЦДГ и с обратной реакцией НАДГДГ, НАДИЦДГ с НАДФИЦДГ, обратными реакциями НАДГДГ и НАДФГДГ.

К тому же, повышение уровня СДГ, являющегося компонентом Комплекса II дыхательной цепи, характеризует активирование окислительного фосфо-рилирования в цепи дыхательных ферментов (Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1998). Однако, как показал корреляционный анализ, происходит инверсия корреляционной связи концентрации свободного тироксина и уровня СДГ (с отрицательной - у здоровых до положительной - у женщин с АИТ).

Таблица 2

Морфоденситометрические параметры активности аГФДГ в лимфоцитах крови _здоровых людей, больных АИТ и ДТЗ (X + т)_

Показатели Здоровые N=44 1 АИТ N=26 2 ДТЗ N=18 3

Б, (мкм2) 1,90±0,26 1,18±0,22 Р]<0,05 0,68±0,06 Р,<0,01 0,1>Р2>0,05

Р, (мкм) 10,50±1,23 7,59±1,39 Р,<0,05 4,59±0,57 Р,<0,05 0,1>Р2>0,05

РЕ,(о.е.) 0,85±0,02 0,90±0,02 0,1>Р)>0,05 0,84±0,02 Р2<0,05

Таким образом, изменение гормонального фона и наличие аутоиммунного процесса у женщин с АИТ приводит к перераспределению субстратных потоков (которое выражается в усилении катаболизма липидов с одновременной интенсификацией аминокислотного анаболизма при сниженном уровне анаэробного окисления) и к нарушению иммуноэндокринной регуляции внутриклеточных обменных процессов.

В иммунокомпетентных клетках крови больных ДТЗ повышен уровень ппокозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), следовательно, активирован пенто-зофосфатный путь окисления глюкозы (Табл.1) (Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., 1998). Тем не менее, не выявлено взаимосвязей между уровнем Г6ФДГ и показателями гормонального фона, что подтверждает нарушение эндокринной регуляции метаболизма иммунокомпетентных клеток женщин с ДТЗ. Однако ней-росетевой предиктор выделил уровень Г6ФДГ, как один из наиболее информативных в определении содержания АВТМА в сыворотке крови больных ДТЗ. Следовательно, можно предположить, что повышение уровня данного фермента взаимосвязано с развитием аутоиммунного процесса. При повышенном отто-

Таблица 3

Морфоденситометрические параметры активности СДГ в лимфоцитах крови _здоровых людей, больных АИТ и ДТЗ (X ± т)_

Показатели Здоровые N=42 1 АИТ N=27 2 ДТЗ N=18 3

Б, (мкм2) 3,38±0,24 4,58±0,66 Р)<0,05 1,12±0,09 Р,.2<0,001

Р, (мкм) 21,84±1,33 23,26±2,98 15,97±2,54 Р,<0,05 0,1>Р2>0,05

БР, (о.е.) 0,79±0,01 0,74±0,03 0,1>Р,>0,05 0,82±0,02 Р2<0,05

ОБ, (е.о.п.) 18,02±0,26 20,49±1,32 Р,<0,05 17,20±0,50 0,1>Р2>0,05

Лх, (мкм) 2,14+0,06 1,64±0,08 Р,<0,001 1,69±0,07 Р,<0,001

Яу, (мкм) 2,14±0,06 1,59±0,08 Р,<0,001 1,86±0,13 Р,<0,05

ЮБ, (пик-сельхе.о.п.) 1443,31±80,77 6339,41±1278,61 Р,<0,001 846,63±92,12 Р|.2<0,001

ке глкжозо-6-фосфата в пентозофосфатный путь, уровень реакций гликолиза, по-видимому, понижается, что подтверждается сниженным уровнем ЛДГ. Также в лимфоцитах женщин с ДТЗ повышена активность НЭ (Табл.4.), что свидетельствует о повышенном катаболизме липидов. В тоже время, снижение уровня малик-фермента (НАДФМДГ) характеризует подавление синтеза липидов. Уровень глутатионредуктазы (ГР) в лимфоцитах больных ДТЗ снижен, что ведет к низкой пролиферативной и антиоксидантной активности иммунокомпе-тентных клеток.

: В лимфоцитах больных ДТЗ также выявлено снижение активности аГФДГ (Табл.2.), преимущественно за счет снижения количества фермента, что в том числе подтверждается результатами нейроклассификационной модели Здоровые - Больные ДТЗ (Рис.1.). При этом в лимфоцитах больных женщин малат-аспартатный челнок также активирован, что определяется повышенным уровнем обратной реакции МДГ.

. Обнаружено, что в митохондриях иммунокомпетентных клеток женщин с ДТЗ снижено субстратное наполнение цикла трикарбоновых кислот, на что указывает снижение уровней СДГ (Табл.3.), а также вспомогательных - НАДФ-зависимых глутаматдегидрогеназы и изоцитратдегидрогеназы (НАДФИЦЦГ). При этом повышены уровни обратных реакций НАД- и НАДФ-зависимых глу-таматдегидрогеназ (Обр.НАД(Ф)ГДГ). Несмотря на снижение поступления субстратов из цитоплазмы в цикл трикарбоновых кислот, интенсивность лимитирующего фермента не отличается от таковой здоровых женщин (Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1998). Однако уровень именно этого фермента взаимосвязан с концентрацией АВТМА и, следовательно, при аутоиммунном процессе (при ДТЗ), в том числе и, через его регуляцию осуществляется влияние на метаболизм лимфоцита. Сохранение интенсивности протекания аэробного окисления на нор-

Рис.1. Информативность морфоденситомет-рических параметров активности аГФДГ по результатам нейросетевого классификатора на модели Здоровые - Больные ДТЗ.

мальном уровне обеспечивается многосвязанностью внутрисистемных компонентов. Так, активность МДГ взаимосвязана с уровнями НАДИЦДГ и Обр.НАДГДГ, НАДГДГ с НАДФГДГ, НАДИЦДГ с НАДФИЦДГ и Обр.НАДГДГ, НАДФИЦДГ с Обр.НАДГДГ и Обр.НАДФГДГ.

Таблица 4.

Морфоденситометрические параметры активности НЭ в лимфоцитах крови здоровых женщин, больных АИТ и ДТЗ (X ± т)_

Показатели Здоровые N=55 1 АИТ N=34' 2 ДТЗ N=25 3

В лимфоцитах с диффузным распределением активности

Б, (мкм2) 0,43±0,03 0,60±0,07 Р,<0,05 0,85±0,13 Р,<0,001 0,1>Р2>0,05

Р, (мкм) 2,57±0,14 3,32±0,30 Р,<0,05 4,38±0,51 Р,<0,001 0,1>Р2>0,05

И?, (о.е.) 0,94±0,01 0,94±0,01 0,89±0,01 Р|,2<0,01

ОД (е.о.п.) 12,41±0,32 12,23±0,49 13,47±0,66 Р]<0,05 0,1>Р2>0,05

Ях, (мкм) 0,50±0,07 1,01±0,14 Р,<0,001 0,79±0,14 Р|<0,05

Яу, (мкм) 0,49±0,07 0,84±0,13 Р|<0,05 0,82±0,13 Р,<0,05

ЮО, (пиксельхе.о.п.) 744,57±48,05 673,51±55,29 1193,01±151,78 Р,,2<0,01

В лимфоцитах с локальным распределением активности

Б, (мкм2) 0,78±0,07 1,62±0,26 Р, <0,001 1,19±0,14 Р,<0,01

Р, (мкм) 4,77±0,37 7,69±1,26 Р,<0,01 6,05±0,77 0,1>Р|>0,05

И?, (о.е.) 0,85±0,02 0,86±0,02 0,78±0,04 0Д>Р,,2>0,05

ОБ, (е.о.п.) 15,93±0,28 16,11±0,55 17,84±0,62 Р,<0,01 Р2<0,05

ЮО, (пиксельхе.о.п.) 1402,18±115,83 2166,76±246,06 Р,<0,01 2522,25±252,16 Р, <0,001

Таким образом, в иммунокомпетентных клетках женщин с ДТЗ наблюдается перестройка метаболизма (определяется усилением катаболизма и снижением синтеза липидов, интенсификацией анаболизма аминокислот при снижении энергетических реакций анаэробных и аэробных процессов) и изменение иммуноэндокринных взаимосвязей, что, по-видимому, и приводит к нарушению регуляции функционирования лимфоцитов крови.

Таким образом, метаболизм иммунокомпетентных клеток больных АИТ и ДТЗ значительно различается. В лимфоцитах больных ДТЗ, по сравнению с женщинами с АИТ, повышен уровень пластических процессов, о чем свидетельствует активность Г6ФДГ. Увеличение активности Г6ФДГ в лимфоцитах больных ДТЗ, как относительно контроля, так и относительно больных АИТ, сопровождается повышением значимости данного фермента в определении нейропредиктором концентрации АВТМА в сыворотке женщин с ДТЗ, что свидетельствует об имеющемся нарушении иммуноэндокринных взаимосвязей. Также в лимфоцитах женщин с ДТЗ выше уровень распада липидов, о чем свидетельствует повышенная активность НЭ (Calore Е.Е. et al., 1999). При этом в иммунокомпетентных клетках этой группы, по сравнению с больными АИТ, снижен уровень ГЗФДГ, следовательно, продукты катаболизма липидов в меньшей степени поступают в гликолиз. Снижение активностей ГЗФДГ и аГФДГ указывает на более низкую интенсивность глицерофосфатного шунта в иммунокомпетентных клетках больных ДТЗ, по сравнению с женщинами с АИТ (Бе-рёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1998; Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., 1998). Также в лимфоцитах женщин с ДТЗ выявляется увеличение активности анаэробной реакции ЛДГ (по сравнению с уровнем у больных АИТ), по-видимому, определяющее повышенную интенсивность гликолиза (Spriet L.L. et al., 2000). К тому же, именно уровень анаэробной реакции ЛДГ является наиболее значимым при нейросетевой классификации групп больных женщин. В иммунокомпетентных клетках больных ДТЗ снижена активность ГР. следовательно, ниже уровень антиоксидантной защиты, чем в лимфоцитах женщин с АИТ (Abiaka С. Et al., 2000; Cavanagh Е.М. et al., 2000). К тому же, этот показатель выделен нейропредиктором как информативный в определении уровня АВТМА.

□ больные ДТЗ

Б

корпплл ГТ4 Т4 ТЗ

□ здоровые ■ больные АНТ □ больные ДТЗ

В лимфоцитах женщин с ДТЗ обнаружено снижение субстратного потока по циклу Кребса, относительно группы больных АИТ, что определяется меньшим уровнем активности МДГ, НАДФИЦДГ и СДГ (Сасес1а II. й а1., 2001; Огиейег И.. е1 а1., 2001). По-видимому, такой эффект достигается благодаря повышенному поступлению продуктов аминокислотного обмена в цикл Кребса и меньшему оттоку а-кетоглутората из него в лимфоцитах женщин с ДТЗ (выше уровень НАДГДГ и ниже - обратной НАДФГДГ), относительно группы больных АИТ. При этом именно НАД- и НАДФ-зависимые глутаматдегидрогеназы определены нейросетевым классификатором как наиболее информативные при классификации групп больных женщин.

При всем этом, проведенный анализ позволяет предположить, что выявленные особенности метаболизма иммунокомпетентных клеток женщин с АИЗЩЖ отражают различный уровень гормональной регуляции, а именно сниженный тиреоидный фон, повышение концентрации тиреотропного гормона в сыворотке крови при АИТ и, наоборот, при ДТЗ - повышенный тиреоидный фон, снижение содержания тиреотропного гормона и кортизола (Табл.5.). Вместе с тем, для обследованных больных характерна регуляторная значимость одних гормональных показателей. Анализ нейропредикторного моделирования уровня Г6ФДГ в лимфоцитах здоровых женщин и больных АИТ, ДТЗ выявил одни и те же наиболее инфор мативные гормональные показатели: содержание

Рис.2. Информативность гормональных показателей в предикции уровней Г6ФДГ (А) и СДГ (Б) нейросетевыми моделями здоровых женщин, больных АИТ и ДТЗ.

Таблица 5

Концентрация тиреоидных, тиреотропного гормонов, кортизола в сыворотке крови здоровых женщин, больных АИТ и ДТЗ (X ± т)_

Показатели Здоровые ; N=23 1 АИТ N=44 2 ДТЗ N=17 3

ТТГ, мкед/мл 1,52±0,10 2,32±0,22 Р,<0,05 0,77±0,10 Р,.2<0,001

Трийодтиронин, нмоль/ji 1,70±0,07 1,83±0,10 3,72±0,62 Pi<0,001 Р2<0,01

Тироксин, нмоль/л 114,44±3,08 94,06±7,20 Р[<0,05 171,32±15,47 Р,.2<0,001

Свободный тироксин, нмоль/л 14,35±0,33 12,95±1,21 Р,<0,05 39,19±5,20 Р,.2<0,001

Кортизол 389,35±13,67 1 410,22±28,41 320,62±77,82 0,1>Р,,2>0,05

ТТГ, кортизола и тиреоидного гормона в сыворотке крови (Рис.2.А.). Следовательно, изменение гормонального фона при АИЗЩЖ кардинально не отражается на регулировании уровня пластических процессов в иммунокомпетентных клетках.

Итак, как показано, у больных АИЗЩЖ происходит перестройка метаболизма иммунокомпетентных клеток. Вследствие этого инкубация лимфоцитов с БАВ выводит клетки из состояния относительного покоя. В силу адекватности ответа на раздражение происходит изменение метаболических потоков, а-присутствующие в клетке нарушения, не играющие значимой роли в покое, будут обостряться, что позволит получить дополнительную информацию о метаболизме и оценить реактивность иммунокомпетентных клеток, зависящую от состояния регуляторных систем целостного организма (Рагимов A.A., Байрамали-бейли И.Э., 1985; Савченко A.A., Захарова JI.Б., 1992). ■•:

В отличие от неспецифического митогенного воздействия, гормоны вызывают специфические изменения метаболизма. Специфичность гормонального действия обеспечивается не каскадной системой вторичных мессенджеров (неспецифическое действие гормонов и митогенов), а процессами регуляции экспрессии генов, модифицирования транскрипции, стимуляции рибосомальной трансляции, синтеза белков. Итак, самое позднее по времени гормональное

действие - синтез белка, регулируемый на уровне транскрипции, обнаруживается через 20 - 24 часа. Таким образом, именно в этот временной период выявляются наиболее специфичные изменения внутриклеточного метаболизма в ответ на гормональное воздействие.

Анализ воздействия митогена на иммунокомпетентные клетки больных АИЗЩЖ и здоровых женщин позволяет заключить о наличии как общих закономерностей реагирования отдельных метаболических процессов лимфоцитов крови больных ЛИТ и ДТЗ, так и специфических, проявление которых зависит от гормонального статуса и исходного состояния метаболизма иммунокомпе-тентных клеток. К общему для всех групп относится активирование НАД- и НАДФ-зависимых глутаматдегидрогеназ. В тоже время, как в лимфоцитах здоровых женщин, так и больных ДГЗ при инкубации с ФГА активируется малик-фермент. Также в лимфоцитах при инкубации с митогеном обнаружены общие изменения для групп больных: активирование ГЗФДГ и обратной реакции НАДГДГ. Кроме того, в иммунокомпетентных клетках только больных АНТ после инкубации с митогеном обнаружено повышение уровня НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (НАДИЦЦГ), а в лимфоцитах женщин с ДТЗ - активирование анаэробных и аэробных реакций ЛДГ.

Специфичность регуляторных особенностей метаболизма иммунокомпетентных клеток больных АИЗЩЖ проявляется при инкубации лимфоцитов крови с кортизолом. Установлено, что для каждой из исследуемых групп характерен специфический метаболический ответ лимфоцитов на данное воздействие. Так, воздействие кортизола на метаболизм лимфоцитов крови здоровых женщин вызывает торможение гликолиза, интенсификацию аминокислотного обмена, макромолекулярного синтеза и антиоксидантных процессов. В тоже время, в иммунокомпетентных клетках больных АИТ инкубация с кортизолом приводит к повышению интенсивности пластических процессов и активации цикла трикарбоновых кислот. В лимфоцитах больных ДТЗ при воздействии кортизола не выявлено существенных изменений метаболических процессов, кроме активирования анаэробного гликолиза при повышении уровня ЛДГ.

При инкубации с инсулином в лимфоцитах здоровых женщин и больных АИЗЩЖ выявлены как общие, так и специфические изменения уровней окси-доредуктаз. Однако, при общем для лимфоцитов больных АИЗЩЖ активиро-

вании ГЗФДГ, характеризующей интенсивность липидного катаболизма, при влиянии инсулина (противоположно реакции иммунокомпетентных клеток здоровых женщин), выявляется разнонаправленное изменение интенсивности процессов аэробной энергетики - активация реакций в группе больных АИТ, на что указывает повышение уровней МДГ и НАДГДГ и подавление в группе женщин с ДТЗ, так как снижены уровни МДГ, НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратде-гидрогеназ. Также в лимфоцитах здоровых женщин и больных АИТ при воздействии инсулина ингибируется анаэробная реакция ЛДГ, а в лимфоцитах женщин с ДТЗ — ГР. В тоже время только в лимфоцитах больных АИТ при инкубации с инсулином активируется малик-фермент.

Воздействие тироксина на иммунокомпетентные клетки приводит к общей трех групп1 обследуемых женщин активации ГЗФДГ, малик-фермента и ПХДФГДГ. Также к повышению уровня аэробной реакции ЛДГ в лимфоцитах здоровых женщин и больных ДТЗ, обратной реакции МДГ в группах здоровых женщин и больных АИТ, а также повышению активности прямой и обратной реакций НАДГДГ в иммунокомпетентных клетках больных АИЗЩЖ, что противоположно таковому группы здоровых. К тому же в лимфоцитах женщин с АИЗЩЖ, в отличие от контрольной группы не изменены уровни Г6ФДГ и ГР. Следовательно, выявленные общие изменения уровней дегидрогеназ в лимфо-цитфе больных АИЗЩЖ, приводят к интенсификации аминокислотного и липидного обмена.

Таким образом, нами установлены значительные изменения метаболического статуса иммунокомпетентных клеток больных АИТ и ДТЗ. Для лимфоцитов женщин с АИТ характерно усиление катаболизма липидов (за счет активации ГЗФДГ и НЭ) с одновременной интенсификацией оттока субстратов на реакции аминокислотного анаболизма через НАД- и НАДФ-зависимые глутамат-дегидрогеназы при сниженном уровне анаэробного окисления. Для метаболизма иммунокомпетентных клеток больных ДТЗ свойственно усиление катаболизма и снижение синтеза липидов, интенсификация оттока субстратов на реакции анаболизма аминокислот при снижении энергетических реакций ана-

эробных и аэробных процессов. Также нами продемонстрировано изменение иммуноэндокринных взаимосвязей, что, по-видимому, и приводит к нарушению регуляции функционирования лимфоцитов крови. Проведенный анализ позволяет предположить, что выявленные особенности метаболизма иммуно-компетентных клеток женщин с АИТ и ДТЗ отражают как различный уровень гормональной регуляции (сниженный тиреоидный фон, повышение концентрации 111 в сыворотке крови при АИТ, а при ДТЗ - увеличение содержания ти-реоидных гормонов, пониженный уровень ТТГ и кортизола), так и течение аутоиммунных процессов.

Установленные различия в исходных уровнях метаболизма, во внутриклеточных взаимосвязях иммунокомпетентных клеток больных АИТ и ДТЗ привели к выявленным особенностям изменений метаболических потоков лимфоцитов женщин с исследуемыми заболеваниями на воздействие БАВ in vitro. Обнаруженные особенности метаболического ответа лимфоцитов женщин с АИЗЖЩ характеризуют реактивность иммунокомпетентных клеток, зависящую от регуляторных систем целостного организма.

ВЫВОДЫ

1. У женщин с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы в лимфоцитах крови увеличена активность НЭ, а также изменены уровни ферментов, определяющих интенсивность анаэробных и аэробных энергетических реакций, при увеличенном оттоке субстратов с цикла Кребса на аминокислотный обмен.

2. Специфичность метаболического статуса лимфоцитов крови у больных АИТ определяется повышением активности МДГ и СДГ - ферментов цикла Кребса. В то время как у женщин с ДТЗ в лимфоцитах интенсивность реакций цикла трикарбоновых кислот снижается, также понижается уровень ГР, но при повышении активности ключевого фермента пентозофосфатного цикла - Г6ФДГ.

3. Различный гормональный фон у больных АИЗЩЖ определяет специфичность гормональной регуляции метаболизма иммунокомпетентных клеток. У больных АИТ содержание тиреоидных, тирсотропного гормонов и корти-зола взаимосвязаны с уровнями активности СДГ, Г6ФДГ, ГЗФДГ и ГР, а у больных ДТЗ - с активностью ГЗФДГ, анаэробной и аэробной реакциями ЛДГ, НАДГДГ, НАДФГДГ и ГР в лимфоцитах крови.

4. С помощью методов нейросетевого моделирования установлены общие закономерности в гормональной регуляции активности СДГ и Г6ФДГ лимфо-цитрв крови больных АИТ и ДТЗ, а также специфические особенности информативности метаболических параметров иммунокомпетентных клеток в предикции уровня аутоантител.

5. Тироксин при воздействии на иммунокомпетентные клетки больных АИТ и ДТЗ in vitro вызывает однотипную метаболическую реакцию, заключающуюся в повышение активности ГЗФДГ, малик-фермента, прямой и обратной реакций НАДГДГ, анаэробной реакции ЛДГ, которые определяют интенсивность обмена липидов, аминокислотного переаминирования и анаэробных окислительных процессов.

6. Метаболический ответ лимфоцитов крови больных АИТ и ДТЗ на воздействие инсулина, кортизола и ФГА in vitro специфичен для каждой патологии и характеризуется изменением активности ферментов, участвующих в реакциях гликолиза, цикла трикарбоновых кислот и пентозофосфатного цикла.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕТАЦИИ

1. Морфоденситометрическая оценка распределения активности неспецифической эстеразы в лимфоцитах крови//В книге «Молодежь и наука - третье ты-сячелетие».-Красноярск.-1998.-с.70-71.

2. Особенности метаболической реакции лимфоцитов крови у больных аутоиммунным тиреоидитом и диффузным токсическим зобом на воздействие биологически активных веществ in vitro/fB книге «Этно-экологические проблемы сохранения здоровья населения Сибири и Крайнего Севера».-Красноярск,-1999.-С.52-55. (В соавторстве с Савченко A.A., Бураковым А.Ю., Догадиным С.А.).

3. Информативность уровней активности метаболических ферментов лимфоцитов у больных с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы//В книге «I Всесибирский конгресс женщин-математиков».-Красноярск.-2000.-С.82. (В соавторстве с Савченко A.A., Бураковым А.Ю.).

4. Особенности метаболической реакции лимфоцитов у больных аутоиммы-нымизаболеваниями щитовидной железы на воздействие биологически активных веществ in vitro/ÍB книге «Материалы II Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых "Агроэкология и устойчивое развитие регионов"».-Ч.2.-Красноярск.-2000.-С.66-67. (В соавторстве с Акоповой Ю.С., Бураковым А.Ю.).

5. Особенности морфоденситометрических параметров активности неспецифической эстеразы и аглицеро-3-фосфатдегидрогеназы лимфоцитов у больных аутоиммынным тиреоидитом//В книге «Материалы II Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых "Агроэкология и устойчивое развитие регионов"»,-Ч.2.-Красноярск.-2000.-С.67-68. (В соавторстве с Бураковым АЛО., Акоповой Ю.С.).

6. Исследование активности метаболических ферментов лимфоцитов у больных с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы.// В сборнике статей молодых ученых и специалистов «Науки о человеке».-Томск, СГМУ.-2000.-С.38-39. (В соавторстве с Бураковым А.Ю.).

7. Особенности метаболической реакции лимфоцитов у больных аутоиммы-ными заболеваниями щитовидной железы на воздействие биологически активных веществ in у;>о//Материалы II молодежной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины».-Новосибирск.-2000.-С.20-22.

8. Информативность уровней активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов у больных с аутоиммунными заболеваниями щитовидной желе-зы//В сборнике научных трудов посвященном 5-летию Красноярского Отделения Российской медицинской ассоциации.- Красноярск.-2000.-С.287-290. (В соавторстве с Савченко A.A., Манчуком В.Т., Бураковым А.Ю.).

9. Особенности информативности метаболических лимфоцитов крови у больных с аутоиммунным тиреоидитом и диффузным токсическим зобом/Материалы VIII Всероссийского семинара 6-8 ноября 2000 года «Ней-

роинформатика и ее приложения».-Красноярск: ИПЦ КГТУ.-2000.-С.150-151. (В соавторстве с Савченко A.A., Догадиным С.А.).

Ю.Особенности морфоденситометрических параметров активности неспецифической эстеразы и а-глицерофосфатдегидрогеназы лимфоцитов крови у больных аутоиммунным тиреоидитом//В книге «Этно-экологические аспекты здоровья и патологии населения Сибири и Крайнего Севера».-Красноярск.-2000.-С.79-82. (В соавторстве с Савченко A.A., Бураковым А.Ю., Догадиным С.А.).

П.Морфоденситометрические особенности активности неспецифической эстеразы и а-глицерофосфатдегидрогеназы лимфоцитов крови больных аутоиммунным тиреоидитом//Сибирский медицинский журнал.-2000.-№2.-С.ЗЗ-36. (В соавторстве с Савченко A.A., Догадиным С.А., Бураковым А.Ю.).

12.Особенности морфоденситометрических параметров активности неспецифической эстеразы и а-глицерофосфатде-гидрогеназы в лимфоцитах больных с аутоиммунным тиреоидитом//Материалы I Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы заболеваний щитовидной железы», 7-8 декабря 2000г, Москва.-Москва.-2000-С.127. (В соавторстве с Савченко А.А, Догадиным С.А., Бураковым А.Ю., Селиверстовой Е.В.).

13.Особенности метаболической реакции лимфоцитов у больных аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы на воздействие биологически активных веществ in vitro//Материалы I Всероссийской научно-практической •конференции «Актуальные проблемы заболеваний щитовидной железы», 7. ■ £ декабря 2000г, Москва.-Москва.-2000-С.60. (В соавторстве Савченко А.А, Догадин С.А., Бураков А.Ю.).

14.Морфоденситометрическая оценка ферментативного статуса лимфоцитов при исследовании патогенеза хронического алкоголизма//Клиническая лабораторная диагностика.-2000.-№12.-С.35-39. (В соавторстве с А.И. Альбран-том, A.A. Савченко, Е.В. Смолиной).

15:Метабллический ответ иммунокомпетентных клеток у пациентов с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы на воздействие биологически активных веществ in vitro//Тезисы докладов международной научной конференции. Иваново, 19-20 апреля 2001г. Часть V. Биология. Экология. Ивано-

во: Ивановский государственный университет.-2001.-С. 22-23. (В соавторстве с Савченко A.A.).

6.Метаболическая реакция лимфоцитов у больных аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы in vjiW/Материалы IV Всероссийского конгресса эндокринологов, Санкт-Петербург-2001.-Санкт-Петербург.-2001.-С.374. (В соавторстве с Савченко A.A., Догадиным С.А., Селиверстовой Е.В.).

7.Морфоденситометрические параметры активности неспецифической эстера-зы и а-глицерофосфатдегидрогеназы лимфоцитов у больных аутоиммунным тиреоидитом//Материалы IV Всероссийского конгресса эндокринологов, Санкт-Петербург-2001.-Санкт-Петербург.-2001.-С.306. (В соавторстве с Савченко A.A., Догадиным С.А., Бураковым А.Ю.).

8.Информативность активности метаболических ферментов лимфоцитов у больных с аутоиммунным тиреоидитом и диффузным токсическим зобом/Материалы IV Всероссийского конгресса эндокринологов, Санкт-Петербург-2001.-Санкт-Петербург.-2001.-С.373. (В соавторстве с Савченко A.A., Догадиным С.А.).

9.Нейросетевая классификация морфоденситометрических параметров активности сукцинатдегидрогеназы и а-глицсрофосфат-дегидрогеназы у женщин с аутоиммунным тиреодитом и диффузным токсическим зобом//В книге "Статистическая метафизика'2001".-Красноярск.-2001.-С.112-119. (В соавторстве с Савченко A.A.).

¡О.Метаболический ответ иммунокомпетентных клеток у пациентов с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы на воздействие биологически активных веществ in уг>о//Медицинская иммунология.-2001.-Т.З, №2.-С.-181. (В соавторстве с Савченко A.A.).

Ч.Клинико-метаболические показатели детей в период адаптации к шко-ле//Педиатрия.-2001.-№ 5 .-С.57-59. (В соавторстве с Грицинской B.JL, Гор-диец A.B., Галактионовой М.Ю., Савченко A.A., Манчуком В.Т.).

!2.Особенности метаболического ответа иммунокомпетентных клеток на воздействие биологически активных веществ как пример динамического равновесия биологических систем//В книге "Север-Человек: Проблемы сохранения здоровья". Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященная 25-летию НИИ медицинских проблем Севе-

ра СО РАМН, 2-4 октября 2001г.-Красноярск.-2001.-С.164-166. (В соавторстве с Савченко A.A., Догадин С.А.).

23.Нейросетевая классификация морфоденситометрических параметров активности ФАД-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов женщин с аутоиммунной патологией щитовидной железы//Материалы IX Всероссийского семинара 57 октября 2001 года «Нейроинформатика и ее приложения».-Красноярск: ИПЦ КГТУ.-2001.-С.91-92. (В соавторстве с Савченко A.A.).

24.Нейросетевая классификация морфоденситометрических параметров активности сукцинатдегидрогеназы и а-глицерофосфатдегидрогеназы лимфоцитов у женщин с аутоиммунными заболеваниями щитовидной желе-зы//Материалы III молодежной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины».-Новосибирск.-2001.-С.11-

25.Особенности метаболизма иммунокомпетентных клеток у больных аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы//Сборник докладов Сибирского конкурса молодых ученых «Терания и фундаментальные науки - перспективы содружества в новом тысячелетии».-Новосибирск.-2001.-С.63-71.

13.

Соискатель: