Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Закономерности изменений иммунологических показателей и активности над(ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови у больных почечноклеточным раком в динамике послеоперационного периода и в зависимости от типа клеточной чувствительности к интерферону-α2а

На правахрукописи

¿г-

ХВАТ Наталья Сергеевна

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИЗМЕНЕНИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ И АКТИВНОСТИ НАД(Ф)-ЗАВИСИМЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ У БОЛЬНЫХ ПОЧЕЧНОКЛЕТОЧНЫМ РАКОМ В ДИНАМИКЕ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОГО ПЕРИОДА И В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ТИПА КЛЕТОЧНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ИНТЕРФЕРОНУ-а2а

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 О ДЕК 2012

Иркутск -2012

005047540

005047540

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Савченко Андрей Анатольевич

доктор медицинских наук, профессор Куртасова Людмила Михайловна

Официальные оппоненты:

Бодиенкова Галина Михайловна, доктор медицинских наук, профессор, Ангарский филиал Федерального государственного бюджетного учреждения «ВосточноСибирский научный центр экологии человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук - Научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека, заведующая лабораторией иммунологии.

Власов Борис Яковлевич, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия», профессор кафедры неорганической, органической и биологической химии.

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 634050, г. Томск, Московский тракт, 2.

Защита состоится « 26 » декабря 2012 г. в 10°° часов на заседании диссертационного совета Д 001.038.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Автореферат разослан « » ноября_2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.038.02,

доктор медицинских наук, профессор ' Шолохов Леонид Федорович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы:

Почечноклеточный рак (ПКР) относится к числу наиболее тяжелых онкоуроло-гических заболеваний. Так, число случаев поздней диагностики рака почки в 3 раза выше, чем при других урологических новообразованиях, а результаты лечения данного заболевания свидетельствуют, что у 40-50% больных в течение первого года после лечения появляются метастазы [В.И. Чиссов, В.В. Старинский, Г.В. Петрова, 2008].

В настоящее время доказано, что в патогенезе и исходе онкологических заболеваний основную роль играет уровень реактивности иммунной системы. В механизме развития злокачественных новообразований наблюдается сложный комплекс различных реакций, ведущих, в том числе, к нарушению основных внутриклеточных процессов клеток иммунной системы и межклеточных взаимодействий, что влечет за собой расстройство защитно-приспособителышх реакций целого организма. Не вызывает сомнений, что в основе функциональных проявлений лимфоцитов, основного структурно-функционального элемента иммунной системы, лежат их метаболические реакции. Особенно высокой информативностью для исследования метаболизма активированных лимфоцитов обладают окислительно-восстановительные ферменты. Это связано с тем, что, являясь основными переносчиками элеюронов в клетке, они осуществляют ключевые реакции клеточного метаболизма и координируют сопряженные метаболические пути [Лапешин, A.A. Савченко, 2005; О.В. Смирнова, В.Т. Ман-чук, 2008]. Изучение метаболических показателей лимфоцитов определяется как перспективное направление, позволяющее характеризовать уровень иммунореактивно-сти, а значит - развитие и исход болезни [JI.M. Куртасова, H.A. Шакина, 2004; Н.К. Ахматова, 2008].

Клетки иммунной системы продуцируют ряд цитокинов, которые являются регуляторами межклеточных взаимодействий, одним из которых являются интерферо-ны (IFN). Под действием IFN развивается целый каскад реакций, проявляющихся на клеточном, системном и организменном уровнях. Сегодня установлено, что интерфе-роны обладают противовирусным и антипролиферативным свойствами; установлен детоксикационный эффект; выявлено антимутагенное действие этих цитокинов, а также доказано их свойство усиливать апоптоз в опухолевых клетках, которые подверглись влиянию повреждающих факторов (в том числе облучения, цитостатиков) [З.Г. Кадагидзе, 2002]. Интерфероны обладают ярко выраженными иммуномодули-рующими свойствами: стимулирует активность клеток-киллеров, процессы фагоцитоза и цитотоксичность нейтрофильных гранулоцитов. В то же время необоснованное или несвоевременное применение препаратов интерферона может снизить эффективность терапии или даже оказать негативное воздействие на организм в целом [Б.В. Кондратьев, 1999].

Проблема лечения ПКР занимает чрезвычайно важное место в клинической онкологии. Ведущая роль в лечении ПКР, безусловно, принадлежит хирургическому методу. Однако, более целесообразна комбинированная модель терапии, включающая наряду с хирургическим лечением иммунотерапию препаратами интерферона, среди которых широкое распространение получил рекомбинантный интерферон-а2а [Ю.А. Дыхно, 2006].

Не подлежит сомнению, что изучение состояния иммунной системы, а также энзиматического статуса лимфоцитов на фоне онкогенеза является одной из актуальных проблем современной биологии и медицины. Кроме того, изучая состояние иммунной системы и активность основных окислительно-восстановительных ферментов

лимфоцитов в период лечения интерфероном-а2а у больных ПКР, можно не только охарактеризовать механизмы действия ИФН-а2а у больных ПКР, но и объективно оценивать результаты интерферонотерапии. Данные исследования позволяют вскрыть новые звенья патогенетических механизмов опухолевой прогрессии.

Цель исследования: выявить закономерности изменений иммунологических параметров и уровней активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у больных почечноклеточным раком в динамике послеоперационного периода и на их основе разработать метод прогноза клеточной чувствительности к интерферо-ну-а2а.

Задачи исследования:

1. Изучить закономерность изменений иммунологических показателей и активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов у больных ПКР в динамике послеоперационного периода.

2. Оценить изменения иммунологических параметров и показателей активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ у больных ПКР после курса интерферонотерапии.

3. Выявить особенности изменений иммунологических показателей и уровней активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов у больных ПКР в зависимости от клеточной чувствительности к интерферону-а2а.

4. Разработать метод прогноза клеточной чувствительности к интерферону-а2а у больных ПКР и установить метаболические механизмы ее сохранения после курса интерферонотерапии.

Научная новизна

Впервые установлены закономерности изменений активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов периферической крови у больных ПКР до оперативного вмешательства и после хирургического лечения. Метаболизм лимфоцитов у больных ПКР характеризуется значительным снижением уровня наработки интер-медиатов для реакций макромолекулярного синтеза, выраженным понижением интенсивности окислительно-восстановительных реакций на терминальных стадиях гликолиза, увеличением оттока субстратов на реакции аминокислотного обмена и снижением активности глутатионредукгазы.

Получены новые сведения об изменении фенотипического спектра лимфоцитов крови у больных раком почки после курса интерферонотерапии. Под действием ин-терферона-а2а у больных ПКР происходит понижение содержания лимфоцитов в периферической крови и повышение количества клеток, несущих на своей поверхности маркер «поздней» активации НЬЛ-БЯ, содержание СБЗ+- и СБ 19+-лимфоцитов, а так же ЫК-клеток достигает референтных значений.

Впервые обнаружено влияние ингерферона-а2а на активность НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у больных ПКР, заключающееся в активации пластических процессов и анаэробного гликолиза.

Выявлена зависимость энзиматического статуса лимфоцитов 1фови у больных ПКР от типа клеточной чувствительности к интерферону-а2а. У больных резистентных к ингерферону-а2а после курса интерферонотерапии по сравнению с группой больных с сохраненной клеточной чувствительностью отмечено снижение потока субстратов с липидного обмена на гликолиз, а так же понижение интенсивности аэробного гликолиза.

Впервые раскрыты отдельные звенья метаболических механизмов потери и сохранения клеточной чувствительности к интерферону-а2а у больных ПКР. Установ-

лено, что чувствительность к интерферону-а2а определяется интенсивностью потока субстратов между циклом Кребса и реакциями аминокислотного обмена в лимфоцитах крови до начала интерферонотерапии.

Практическая значимость работы

В результате проведенных исследований активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у больных ПКР до начала иммунотерапии были получены данные, которые позволяют прогнозировать в процессе лечения сохранение клеточной чувствительности к препарату интерферона-а2а.

По результатам исследования получены 3 патента на изобретения: патент № 2314123 РФ «Способ индивидуального подбора и коррекции лечебной дозы интерферона у больных раком почки»; патент № 2338202 РФ «Способ прогноза эффективности интерферонотерапии при раке почки»; патент № 2437101 РФ «Способ прогноза чувствительности к интерферону у больных почечноклеточным раком».

Результаты проведенных исследований внедрены в практическую работу Красноярского краевого клинического онкологического диспансера, клиники ФГБУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН, ККБУЗ Красноярского краевого центра по профилактике и борьбе со СПИД.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. У больных ПКР в динамике послеоперационного периода изменяется имму-нофенотипический спектр лимфоцитов крови, показатели гуморального звена иммунитета и снижается фагоцитарная активность нейтрофильных гранулоцитов. Состояние метаболизма лимфоцитов крови у больных ПКР характеризуется нарушением энергетических и пластических процессов в клетке.

2. Закономерностью изменений метаболизма лимфоцитов крови после курса интерферонотерапии является активация реакций пентозофосфатного цикла, повышение активности реакций начального этапа цикла Кребса и снижение активности глутатионредуктазы. Состояние клеточного иммунитета после интерферонотерапии характеризуется достижением контрольных величин содержания Т-лимфоцитов и их субпопуляций, В-лимфоцитов и ЫК-клеток. Иммунологические параметры и показатели активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови изменяются в зависимости от клеточной чувствительности к интерферону-а2а.

3. У больных ПКР метаболическим механизмом, определяющим сохранение клеточной чувствительности к интерферону-а2а, является интенсивность потока субстратов между циклом Кребса и реакциями аминокислотного обмена. Клеточная чувствительность к интерферону-а2а у больных ПКР в период до начала курса иммунотерапии прогнозируется по соотношению пластического и энергетического обмена в лимфоцитах крови.

Личный вклад автора

Лично автором проведено планирование работы, поиск и анализ литературы по проблеме диссертации. Автором непосредственно выполнялось исследование показателей иммунного статуса и активности внутриклеточных НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ у наблюдаемых больных, статистическая обработка и анализ полученных результатов, написание публикаций и диссертации.

Апробация материалов диссертации

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Красноярском крае» (Красноярск, 2004), на Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2005, 2006,

2010), at the XII symposium of the Russia - Japan Medical Exchange (Krasnoyarsk, 2005), на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири» (Красноярск, 2006, 2009), на региональной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2006), на Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006), на научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири - 2008» (Томск, 2008), на 13-й межрегиональной научно-практической конференции с международным участием (Абакан, 2010), на 8-й научно-практической конференции молодых ученых (Красноярск, 2010), на региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы развития специализированной медицинской помощи в Республике Тыва» (Кызыл, 2010), на заседании Красноярского регионального отделения РААКИ (Красноярск, 2010).

Публикации

Основные положения диссертации опубликованы в 20 печатных работах, из них 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 2 глав собственных исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 10 таблицами, 26 рисунками и 2 схемами, список литературы включает 184 библиографических изданий (93 отечественных и 91 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

На базе Красноярского краевого клинического онкологического диспансера им. А.И. Крыжановского проведены динамические наблюдения за больными ПКР (T3N0M0) до хирургического лечения (N=132), через 14 дней (N=119) и через 30 дней после радикальной нефрэкгомии (до курса интерферонотерапии, N=44) в возрасте 4055 лет (из них 150 женщин и 174 мужчины). Кроме того, дополнительно проведено исследование иммунологических показателей и уровней активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов у больных после курса интерферонотерапии (N=29). Интерферонотерапия осуществлялась лекарственным препаратом «Реаферон» (Вектофарм, Новосибирск). Диагноз ПКР у всех больных верифицирован гистологически. В качестве контрольной группы были обследованы 35 практически здоровых доноров. Все исследования выполнены с информированного согласия обследуемых и в соответствии с этическими нормами Хельсинской Декларации (2001 г.).

Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов крови оценивали с помощью моноклональных антител с флуоресцентной меткой, используя набор для иммунофенотипирования (Сорбент, Москва). Концентрацию иммуноглобулинов класса A, M и G в сыворотке крови определяли методом радиальной иммунодиффу-зии в геле [G. Mancini, А.О. Carbonaro, J.F. Haremans, 1965]. Фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови изучали в реакции с частицами латекса. Клеточную чувствительность к интерферону-а2а in vitro определяли по методу Л.М. Куртасовой с соавт., 2006.

Биолюминесцентное определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов проводили по методике (A.A. Савченко, JI.H. Сунцова, 1989). Данным методом определялась активность следующих ферментов: глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (ГЗФДГ, КФ 1.1.1.8), малик-фермента (НАДФМДГ, КФ 1.1.1.40), НАД- и НАДН-зависимой реакции лактатдегидрогеназы (ЛДГ и НАДН-ЛДГ, КФ 1.1.1.27), НАД- и НАДН-зависимой реакции малатдегидрогеназы (МДГ и НАДН-МДГ, КФ 1.1.1.37), НАДФ-и НАДФН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФ-ГДГ и НАДФН-ГДГ, КФ 1.4.1.4), НАД- и НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАД-ГДГ и НАДН-ГДГ, КФ 1.4.1.2), НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (НАД-ИЦДГ, КФ 1.1.1.41 и НАДФ-ИЦДГ, КФ 1.1.1.42, соответственно) и глутатионредуктазы (ГР, КФ 1.6.4.2). Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ выражали в ферментативных единицах на 104 клеток, где 1 Е=1 мкмоль/мин.

По результатам исследования в пакете электронных таблиц MS Excel была сформирована база данных, на основе которой, с помощью пакетов прикладных программ Statistics 7,0 (StatSoft Inc., 2004) осуществлялся статистический анализ. Описание выборки производили с помощью подсчета медианы (Me) и интерквартильного размаха в виде 25 и 75 процентилей (С25 и С73). Достоверность различий между показателями независимых выборок оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни, различия между показателями связанных выборок оценивали по непараметрическому критерию Вилкоксона. Для сравнения нескольких независимых выборок применяли ранговый дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса (Kruskal-Wallis ANOVA) [Г.Ф. Лакин, 1980]

Для определения наиболее значимых показателей активности ферментов в лимфоцитах периферической крови применяли дискриминантный анализ по методу Forward stepwise. Количество заданных шагов соответствовало количеству исследуемых параметров в модели. Для решения задач системного анализа использовали ней-росетевой классификатор [А.Н. Горбань, 1990].

Результаты исследований

Результаты проведенных исследований установили у больных ПКР в период до хирургического лечения снижение процентного и абсолютного содержания лимфоцитов периферической крови относительно параметров контрольной группы. Изучение иммунофенотипического спектра лимфоцитов крови позволило выявить статистически значимое снижение, как по относительным, так и абсолютным показателям CD44-клеток по сравнению с контрольными величинами. Одновременно с отмеченными изменениями наблюдалось уменьшение абсолютного числа зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) и клеток, несущих CD 19+-антиген, а также повышение процентного содержания лимфоцитов, экспрессирующих активационный маркер HLA-DR+ относительно показателей контрольной группы (табл.1). Реакция гуморального звена иммунитета у больных ПКР в период до оперативного вмешательства характеризовалась снижением концентрации IgG в сыворотке крови по сравнению с показателями контрольной группы. Содержание IgM и IgA статистически значимых различий с параметрами контроля не имели (табл.2). Изучение фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови у больных ПКР в период до хирургического лечения установило снижение как количества активно «работающих» нейтрофилов крови, так и их поглотительной способности относительно показателей контроля (табл.2).

Динамика показателей клеточного иммунитета у больных ПКР (Me, С2з-С75)

Показатели Контрольная группа п=35 1 Вольные до операции п= 132 2 Больные через 14 дней после операции п= 119 3 Больные через 30 дней после операции п=44 4

Лейкоциты, 109/л 5,20 3,10-6,30 5,00 4,20-6,00 5,50 4,70-6,60 р2<0,01 4,30 3,90-5,10 Рг<0,05 р3<0,001

Лимфоциты, % 34,5 27,0-37,0 21,0 14,0-26,0 Р1 <0,001 16,0 11,0-21,0 Р1Д<0,001 26,5 20,0-36,0 Р1<0,05 Р2<0,01 Рз<0,001

Лимфоциты, 109/л 1,52 1,16-2,20 1,03 0,67-1,36 р,<0,01 0,84 0,64-1,13 Р1<0,001 Р2<0,05 1,36 0,95-1,49 Рч<0,01

CD3+, % 49,0 44,0-55,0 47,0 40,0-53,0 46,0 40,0-52,0 Р1<0,05 45,5 37,0-52,0 Р1<0,05

CD3+, 109/л 0,65 0,43-1,13 . 0,50 0,29-0,60 р,<0,05 0,35 0,26-0,51 р,<0,001 р2<0,01 0,56 0,29-0,66 Р1<0,05 рз<0,01

CD4+, % 28,0 21,0-29,0 23,0 18,0-29,0 Р,<0,05 23,0 19,0-31,0 22,0 16,0-25,0 Р1<0,01

CD4+, 109/л 0,42 0,23-0,45 0,21 0,13-0,31 Р1<0,01 0,17 0,12-0,30 Р1<0,01 0,26 0,10-0,33 Р1<0,05

CD8+, % 22,0 18,0-26,0 22,0 19,0-29,0 22,5 14,0-26,0 р2<0,05 22,0 19,0-24,0

CD8+, 109/л 0,35 0,16-0,66 0,24 0,14-0,34 0,16 0,10-0,24 Р1.2<0,01 0,28 0,17-0,33 Рз<0,01

CD4+/ CD8+ 1,19 0,72-1,47 1,05 0,67-1,38 1,09 0,76-1,93 Р2<0,05 0,94 0,65-1,27 р3<0,05

CD16+, % 28,0 21,0-30,0 28,0 21,0-36,0 29,0 24,0-34,0 Р|<0,05 30,0 26,0-34,0 Р1<0,05

CD16+, 109/л 0,37 0,22-0,49 0,30 0,23-0,39 0,25 0,17-0,39 Ри<0,05 0,35 0,24-0,45 Рз<0,05

CD19+, % 26,0 18,0-29,0 24,0 19,0-29,0 25,0 20,0-30,0 26,0 19,0-29,0

CD19+, 109/л 0,44 0,34-0,55 0,23 0,15-0,34 Р|<0,01 0,21 0,13-0,32 Р1<0,001 0,29 0,19-0,39 Р1з<0,05

HLA-DR+, % 35,0 30,0-42,0 40,5 32,0-53,0 Р1<0,05 40,5 33,0-52,0 Р!<0,01 35,5 30,0-41,0 Р2.З<0,05

HLA-DR+, 109/л 0,61 . 0,42-0,74 0,41 0,32-0,50 0,39 0,26-0,57 Р1<0,05 0,42 0,20-0,57 Р1<0,05

Примечание: р1 - статистически достоверные различия с показателями контрольной группы; рг - статистически достоверные различия с показателями больных

ПКР до хирургического лечения; р3 - статистически достоверные различия с показателями больных ПКР через 14 дней после операции,

Таблица 2

Динамика уровней сывороточных иммуноглобулинов и показателей фагоцитарной ак-_тивности нейтрофилов крови у больных ПКР (Ме, С25-С70_

Параметры Контрольная группа п=35 1 Больные до операции п=132 2 Больные через 14 дней после операции п=119 3 Больные через месяц после операции п=44 4

IgA, (г/л) 2,40 1,10-2,90 2,90 1,27-3,90 2,50 1,65-3,50 2,65 1,70-3,70

IgM, (г/л) 0,90 0,70-0,93 0,90 0,60-1,30 0,90 0,42-1,30 1,00 0,80-1,30 Рч<0,05

IgG, (г/л) 16,20 13,54-18,10 11,60 7,66-16,50 Pi<0,01 9,50 6,80-13,70 Pi<0,001 tb<0,05 11,45 9,38-15,50 Pi з<0,01

ФЧ, (%) 10,90 9,29-11,50 4,60 3,40-4,90 Pi<0,01 3,90 2,60-4,00 Pi<0,001 4,50 3,90-4,60 <0,001 рз<0,05

ФИ, (у.е.) 73,00 68,00-79,00 46,00 34,00-60,00 Pi<0,001 38,00 34,00-40,00 р,<0,001 39,00 28,00-43,00 Pi <0,001

Примечание: то же, что и для табл. 1.

Результаты проведенного анализа показали, что у больных ПКР в период через 14 дней после хирургического лечения содержание лейкоцитов в периферической крови находится на уровне, достоверно более высоком, чем в дооперационном периоде и не имеет статистически значимых различий с показателями контрольной группы (табл.1). Следует отметить, что у больных ПКР в данный период наблюдения обнаружено снижение относительного и абсолютного количества лимфоцитов периферической крови по сравнению с параметрами контроля и значениями, зарегистрированными в период до операции. В то же время выявлено снижение процентного содержания и абсолютного числа зрелых Т-лимфоцитов относительно показателей контрольной группы.

При этом относительное содержание CD4+-, CD8+-, CD 19+-лимфоцитов не имеет статистически значимых различий с параметрами контроля, а снижение абсолютных показателей, очевидно, связано с имеющейся лимфопенией. Кроме того, у больных ПКР в период через 14 дней после хирургического лечения сохраняется повышенная экспрессия HLA-DR-маркера «поздней» активации (табл.1). Сравнительный анализ показал, что у больных ПКР в период через 14 дней после хирургического лечения повышается процентное содержание CD8 -клеток относительно параметров зарегистрированных в период до операции. Изменение процентного соотношения CD4 /CD8 - клеток отражает увеличение индекса дифференцировки у больных ПКР в период после хирургического лечения (табл.1). При оценке гуморального звена иммунитета обнаружено статистически значимое снижение содержания IgG в сыворотке крови как относительно показателей контроля, так и по сравнению с параметрами до-операционного периода (табл.2). У больных ПКР в период через 14 дней после радикальной нефрэктомии остается пониженным количество активно фагоцитирующих нейтрофилов крови и не восстанавливается до уровня контрольной группы их поглотительная способность (табл.2).

При исследовании иммунологических показателей у больных ПКР через 30 дней после радикальной нефрэктомии на фоне относительной лимфопении отмечается повышение процентного содержания CD 1б+-клеток по сравнению с показателями контрольной группы. Кроме того, установлено статистически значимое снижение, как по относительным, так и абсолютным показателям CD3+- и CD4+-tuieTOK в сравнении с величинами группы контроля. Необходимо отметить, уменьшение абсолютного числа В-лимфоцотов относительно значений, установленных в контрольной группе. В то же время обнаружено повышение данного показателя по сравнению с величинами, зарегистрированными в период через 14 дней после операции. Помимо этого выявлено понижение абсолютного числа клеток, экспрессирующих акгивационный маркер HLA-DR, относительно контроля и снижение их процентного содержания по сравнению с показателями, зарегистрированными в период до оперативного лечения и через 14 дней после операции (табл.1). Так же в данный период наблюдения в сравнении с показателями до операции и через 14 дней после хирургического лечения отмечалось статистически значимое снижение количества лейкоцитов. Количество лимфоцитов у больных через 30 дней после оперативного вмешательства достоверно превышает уровень, установленный в период через 14 дней после хирургического лечения. Кроме того, у наблюдаемых больных через 30 дней после радикальной нефрэктомии выявлено повышение абсолютного числа CD3+-, CD8+- и CD16+- клеток по сравнению с показателями, зафиксированными в период через 14 дней после оперативного вмешательства. Значение индекса дифференцировки (CD4+/CD8+) в период через 30 дней после операции оказалось ниже относительно показателя, зарегистрированного у пациентов через 14 дней после хирургического лечения (табл.1). Реакция гуморального звена иммунитета у больных ПКР в период через 30 после хирургического лечения характеризовалась снижением концентрации IgG в сыворотке крови относительно параметров контрольной группы. При этом содержание IgM и IgG в сыворотке в период через 30 дней после операции статистически значимо превышало показатели у больных через 14 дней после операции (табл.2). Количество активно «работающих» ней-трофилов периферической крови и их поглотительная способность в данный период наблюдения остаются ниже контрольного уровня. При этом, количество активно «работающих» нейтрофилов периферической крови превышает параметры зарегистрированные в период через 14 дней после хирургического лечения (табл.2).

При использовании рангового дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса по результатам исследования была установлена статистическая достоверность восстановления таких параметров клеточного звена как, процентное и абсолютное содержание лимфоцитов (р<0,001 и р<0,05, соответственно), абсолютного содержания Т-лимфоцигов (р<0,01) и СБ8+-позитивных лимфоцитов (р<0,001). В гуморальном звене установлена статистическая достоверность к восстановлению уровня IgG в сыворотке крови (р<0,01).

Анализ активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ у больных ПКР в период до хирургического лечения показал, что ферментный статус лимфоцитов периферической крови характеризуется понижением наработки рибозо-5-фосфата и НАДФН-зависимых реакций макромолекулярного синтеза. Уровень энергетических процессов определяется снижением анаэробной реакции ЛДГ, что отражает понижение субстратного потока по гликолизу (табл.3). При этом наблюдается увеличение оттока субстрата с цикла трикарбоновых кислот на реакции аминокислотного обмена через НАДНГДГ. Кроме того, установлено значительное снижение уровня активности ГР -

фермента глутатионгзависимой антиоксидантной системы и в определенной степени модулирующего пролиферативную активность лимфоцитов (табл.3).

Таблица 3

Показатели активности НАД(Ф) - зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови у боль-

ных ПКР до и после операции (Ме, С25-С75)

Показатели Контрольная группа п= 35 1 Больные до операции п= 100 2 Больные через 14 дней после операции п= 90 3 Больные через 30 дней после операции п=44 4

Г6ФДГ 3,11 0,53-6,24 1,14 0,15-3,87 Р1<0,05 1,24 0,21-4,64 Р1<0,05 0,46 0,01-2,03 Р1<0,01 рз<0,05

ГЗФДГ 0,00 0,00-1,01 0,15 0,00-4,19 1,26 0,00-4,55 Р2<0,01 0,09 0,00-2,50

НАДЛДГ 11,53 2,37-20,34 15,50 1,45-66,04 17,64 5,21-61,82 Р1<0,05 7,85 1,51-27,52

НАДФМДГ 0,33 0,00-1,14 0,11 0,00-0,64 0,09 0,00-0,54 0,08 0,00-0,38

НАДФГДГ 0,53 0,00-4,52 0,25 0,01-2,69 0,51 0,02-5,29 0,64 0,00-2,48

НАДФИЦДГ 2,99 1,87-6,32 1,74 0,04-20,63 4,22 0,32-19,73 1,96 0,37-5,35

НАДМДГ 4,58 0,00-11,61 69,39 0,00-200,33 58,34 0,56-198,61 32,26 0,00-114,78 Р1<0,01

НАДГДГ 4 24 0,00-15,48 7 85 0,00-69,24 6,49 0,00-36,01 8,63 0,00-28,01

НАДИЦДГ 0,56 0,00-13,79 0,51 0,00-8,99 0,66 0,00-8,47 0,21 0,00-3,22

НАДНЛДГ 30,57 0,00-52,46 3,07 0,00-28,35 Р1<0.01 2,84 0,00-24,46 Р1<0,01 р2<0,001 0,00 0,00-16,51 Р1<0,01

НАДНМДГ 58,13 24,98-114,15 74,76 27,10-106,34 70,83 30,51-145,64 58,18 27,51-95,54

ГР 13,82 7,24-36,74 2,24 0,04-7,74 Р1<0,001 4,39 0,10-14,31 р,<0,01 Р2<0,05 1,30 0,00-7,63 р,<0,01

НАДНГДГ 5,19 0,00-22,70 16,49 6,33-47,68 Р1<0,05 22,55 7,51-48,62 Р1<0,01 19,93 5,19-32,28 р1<0,05

НДДФНГДГ 25,20 11,20-46,79 15,34 3,99-41,81 25,85 6,97-60,67 25,27 1,95-43,80

Примечание: то же, что и для табл. 1.

Помимо этого в ходе деятельности ГР образовавшийся восстановленный глута-тион принимает непосредственное участие в транспорте аминокислот внутрь клетки. Следовательно, снижение ферментативной активности ГР, может свидетельствовать не только об уменьшении антиоксидантной функции данной системы, но и о снижении потока аминокислот из внеклеточного пространства (табл.3).

В период через 14 дней после хирургического лечения у больных ПКР в лимфоцитах периферической крови показатели активности Г6ФДГ сохраняются пони-

женными относительно контрольных величин и не отличаются от данных, зарегистрированных у пациентов до оперативного вмешательства. Следовательно, можно предположить снижение основных биосинтетических процессов в клетке. В то же время повышается активность НАДЛДГ, что отражает более полное потребление клеткой наработанного пирувата.

Следует отметить, что НАДН - зависимая реакция ЛДГ по-прежнему остается сниженной как относительно контрольных показателей, так и по сравнению с данными, зафиксированными в дооперационный период (табл.3). Увеличение уровня активности ГЗФДГ в лимфоцитах крови в данный период наблюдения по сравнению с периодом до операции, возможно, способствует более насыщенному поступлению продуктов метаболизма липидов и жиров на гликолиз. Помимо этого повышение активности ГЗФДГ приводит к увеличению роли глицерофосфатного водородного шунта в энергетике клетки, который принимает непосредственное участие в переносе восстановленного НАД1" через мембрану митохондрий на дыхательную цепь. В период через 14 дней после хирургического лечения у больных ПКР в лимфоцитах периферической крови сохраняются повышенными показатели активности НАДНГДГ относительно контрольных параметров (табл.3). Кроме того, по-прежнему наблюдается снижение активности ГР относительно контрольных показателей. Уменьшение активности данного фермента приводит к понижению количества восстановленного глутатиона в клетке, а значит, снижается эффективность работы глутатион-зависимой антиокси-дантной системы. В то же время показатели активность ГР в период через 14 дней после операции увеличиваются относительно величин, зафиксированных в период до хирургического лечения (табл.3).

Изучение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у больных ПКР в период через 30 дней после хирургического лечения выявило снижение уровня Г6ФДГ - ключевого фермента пентозофосфатного цикла, продукты которого используются в реакциях макромолекулярного синтеза (табл.3). Анализ активности исследуемых дегидрогеназ с преимущественно энергетической направленностью установил снижение уровня активности НАДНЛДГ в лимфоцитах крови по сравнению с данными, зафиксированными в контрольной группе, что отражает понижение субстратного потока по гликолизу. В то же время по сравнению с контролем обнаружено увеличение показателей активности НАДМДГ, одного из ферментов определяющего интенсивность потока по циклу трикарбоновых кислот. В связи, с чем можно предположить повышение аэробных внутриклеточных процессов. При этом усиление субстратного потока по циклу Кребса сопровождается увеличением оттока ин-термедиатов через повышение уровня НАДНГДГ на реакции аминокислотного обмена. Следует отметить у больных ПКР через 30 дней после операции падение активности ГР (табл.3).

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что у больных ПКР в дооперационном периоде и в динамике через 14 и 30 дней после радикальной нефрэкгомии наблюдается снижение рибозо-5-фосфат и НАД(Ф)-зависимых пластических процессов и напряженность энергетического внутриклеточного обмена, что отражается на функционировании иммунной системы. На основании вышеизложенного можно предложить следующую патофизиологическую схему (схема 1).

Анализ иммунологических параметров у больных ПКР после курса интерферо-нотерапии установил снижение процентного содержания и абсолютного числа лимфоцитов периферической крови относительно значений контрольной группы. При этом обнаружено увеличение процентного содержания клеток, несущих активацион-

ный маркер НЬА-БЯ. Следует отметить снижение абсолютного количества зрелых Т-лимфоцигов, С04+-клеток и В-лимфоцитов по сравнению с контрольными показателями (табл.4).

Повышение оттока субстратов с ЦТК на реакции аминокислотного обмена

Повышение митохондриального транспорта

Снижение митохондриального транспорта

Схема 1. Особенности метаболизма лимфоцитов у больных ПКР до операции и в динамике послеоперационного периода.

Количество активно фагоцитирующих нейтрофилов крови и их поглотительная способность после курса интерферонотерапии снижаются по сравнению с величинами контрольной группы (табл.5). В показателях концентрации и ^А в сыворотке крови после курса лечения интерфероном-а2а статистически значимых различий не выявлено (табл.5).

Показатели клеточного иммунитета у больных ПКР после курса

интерферонотерапии (Ме, С25-С75)

Показатели Контрольная группа п=35 1 Больные ПКР

до лечения п=44 2 после лечения п=29 3

Лейкоциты, 109/л 5,20 . 3,10-6,30 4,30 3,90-5,10 4,40 3,10-5,10

Лимфоциты, % 34,5 27,0-37,0 26,5 20,0-36,0 Р1<0,05 22,9 18,0-18,0 р1<0,05

Лимфоциты, 109/л 1,52 1,16-2,20 1,36 0,95-1,49 0,99 0,75-1,12 Р1<0,05

СБЗ+, % 49,0 44,0-55,0 45,5 37,0-52,0 Р1<0,05 47,0 39,0-49,0

СЭЗ+, 109/л 0,65 0,43-1,13; 0,56 0,29-0,66 Р1<0,05 0,37 0,15-0,54 Р1<0,01

СП4+, % 28,0 21,0-29,0 22,0 16,0-25,0 Р1<0,01 24,0 17,0-29,0

С04+, 109/л 0,42 0,23-0,45 0,26 0,10-0,33 Р1<0,05 0,24 0,14-0,28 р,<0,05

С08+, % 22,0 18,0-26,0 22,0 19,0-24,0 20,0 15,0-24,0

СЭ8\ 10% 0,35 0,16-0,66 0,28 0,17-0,33 0,19 0,09-0,27

С04+/С08+ 1,19 0,72-1,47 0,94 0,65-1,27 1,20 0,83-1,33

СР16+, % 28,0 21,0-30,0 30,0 26,0-34,0 Р1<0,05 28,0 22,0-33,0

СШб+, 109/л 0,37 0,22-0,49 0,35 0,24-0,45 0,27 0,21-0,32

СШ9+, % 26,0 18,0-29,0 26,0 19,0-29,0 27,0 19,0-29,0

СШ9+, 109/л 0,44 0,34-0,55 0,29 0,19-0,39 Р1<0,05 0,22 0,18-0,29 Р1<0,01

НЬА-Б^, % 35,0 30,0-42,0 35,5 30,0-41,0 44,0 30,0-49,0 р,<0,05

НЬАЛЖ+, 109/л 0,61 0,42-0,74 0,42 0,20-0,57 Р1<0,05 0,41 0,26-0,53

Примечание: р] - статистически достоверные различия с показателями кон-

трольной группы.

Показатели гуморального иммунитета и фагоцитарной активности нейтрофи-лов крови у больных ПКР после курса интерферонотерапии (Ме, С25-С75)

Показатели Контрольная группа п=35 1 Больные ПКР

До лечения п=44 2 После лечения п=29 3

А, г/л 2,40 1,10-2,90 2,65 1,70-3,70 2,90 1,77-3,50

1% М, г/л 0,90 0,70-0,93 1,00 0,80-1,30 1,20 0,80-1,40

в, г/л 16,20 13,54-18,10 11,45 9,38-15,50 Р1<0,01 12,30 7,20-15,70

ФЧ, (%) 10,90 9,29-11,50 4,50 3,90-4,60 Р1<0,001 4,50 3,10-4,50 Р1<0,01

ФИ, (у.е.) 73,00 68,00-79,00 39,00 28,00-43,00 Р1<0,001 28,00 26,00-28,00 р,<0,01

Примечание: то же, что и для табл. 4.

У больных ПКР в период после интерферонотерапии отмечается изменение биосинтетических процессов в лимфоцитах крови. Так, в ходе исследования обнаружено повышение активности Г6ФДГ относительно параметров до лечения (табл.6). Кроме того, меняется активность энзимов метаболизирующих энергопродуцирующие реакции в митохондриях. Установлено, что у больных после курса лечения повышается активность НАДИЦДГ относительно показателей в период до лечения. При этом активность НАДМДГ после курса иммунотерапии понижается относительно показателей в периоде до лечения. Так же в лимфоцитах крови больных ПКР после интерферонотерапии выявлено достоверное снижение активности НАДГДГ отаосительно показателей зарегистрированных в период до лечения (табл.6). Снижение активности данного фермента свидетельствует об уменьшении потока субстратов с аминокислотного обмена на цикл Кребса. При этом отмечено не только изменение процессов окислительного дезаминирования, но и процессов восстановительного аминирования, так на фоне повышения уровня активности НАДНГДГ обнаружено снижение активности НАДФНГДГ по сравнению с показателями контрольной группы. Следует отметить снижение уровня активности ГР относительно контрольных показателей, что может привести к понижению эффективности работы глутатион-зависимой антиокси-дантной системы (табл.6).

Таким образом, интерферон-а2а влияет на основные энергетические и биосинге-тические внутриклеточные реакции в лимфоцитах крови, переключает субстратные потоки преимущественно на пластические процессы.

При сравнительном исследовании иммунологических показателей у больных ПКР после курса интерферонотерапии выявлены изменения в зависимости от клеточной чувствительности к интерферону-а2а. Так, в группе больных с сохраненной клеточной чувствительностью к интерферону обнаружено снижение абсолютного и. относительного количества лимфоцитов крови в сравнении с показателями контрольной группы (табл.7). В группе больных с отсутствием клеточной чувствительности к ин-терферону-а2а установлено снижение процентного содержания лимфоцитов по сравнению с данными, зарегистрированными в группе контроля (табл.7).

Таблица 6

Изменение активности НАД(Ф) - зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови у боль-

ных ПКР после курса интерферонотерапии (Ме, С25-С75)

Показатели Контрольная Больные ПКР

группа до лечения после лечения

п=35 п=44 п=29

1 2 3

Г6ФДГ 3,11 0,46 1,30

0,53-6,24 0,01-2,03 0,19-3,45

Р^0,01 Р?.<0,05

ГЗФДГ 0,00 0,09 0,84

0,00-1,01 0,00-2,50 0,00-1,69

НАДЛДГ 11,53 7,85 6,33

2,37-20,34 1,51-27,52 0,00-29,05

НАДФМДГ 0,33 0,08 0,24

0,00-1,14 0,00-0,38 0,05-0,37

НАДФГДГ 0,53 0,64 1,264

0,00-4,52 0,00-2,48 0,000-6,182

НАДФИЦДГ 2,99 1,96 1,66

1,87-6,32 0,37-5,35 0,18-5,99

НАДМДГ 4,58 32,26 0,00

0,00-11,61 0,00-114,78 0,00-59,18

Р1<0,01 Р2<0,01

НАДГДГ 4,24 8,63 4,98

0,00-15,48 0,00-28,01 0,00-7,81

Р2<0,05

НАДИЦЦГ 0,56 0,21 7,19

0,00-13,79 0,00-3,22 0,14-13,81

Рз<0,01

НАДНЛДГ 30,57 0,00 6,59

0,00-52,46 0,00-16,51 0,00-37,70

р,<0,01

НАДНМДГ 58,13 58,18 49,19

24,98-114,15 27,51-95,54 25,27-67,60

ГР 13,82 1,30 3,25

7,24-36,74 0,00-7,63 0,29-11,43

Р1<0,01 Р1<0,05

НАДНГДГ 5,19 19,93 33,34

0,00-22,70 5,19-32,28 4,49-44,92

Р1<0,05 р,<0.05

НАДФНГДГ 25,20 25,27 13,02

11,20-46,79 1,95-43,80 1,57-26,54

р,<0,05

Примечание: р! - статистически достоверные различия с показателями контрольной группы; р2 - статистически достоверные различия с показателями больных ПКР до лечения интерфероном-а2а.

Так же, у больных с чувствительностью к интерферону-а2а обнаружено снижение процентного содержания зрелых Т-лимфоцитов (СОЗ+) относительно контрольных показателей. В группе пациентов резистентных к интерферону-а2а, по сравнению с больными до лечения установлено повышение процентного числа СБ4+- клеток. Помимо этого в обеих группах (больные, сохранившие клеточную чувствительность и резистентные к шггерферону-а2а после курса лечения) выявлено понижение абсолютного числа С019+-клеток по сравнению с показателями контроля. В то же время процентное содержание В-клеток в группе больных резистентных к интерфе-

рону достоверно снижено по сравнению с данными, полученными в группе пациентов с клеточной чувствительностью к интерферону-а2а (табл.7).

Таблица 7

Показатели клеточного иммунитета у больных ПКР

в зависимости от чувствительности к интерферону-а2а (Ме, С23-С75)

Показатели Контрольная группа п=35 1 Больные ПКР

До лечения п=44 2 После лечения

Чувств ительностЕ (+) п=16 3 Чувствительность (-) п=13 4

Лейкоциты, 109/л 5,20 3,10-6,30 4,30 3,90-5,10 5,00 4,20-5,60 4,00 3,60-8,40

Лимфоциты, % 34,5 27,0-37,0 26,5 20,0-36,0 Pi<0,05 21,0 17,5-30,0 Pi<0,01 19,0 12,0-22,0 Р1<0,001

Лимфоциты, 109/л 1,52 1,16-2,20 1,36 0,95-1,49 1,10 0,78-1,45 Pi<0,05 0,79 0,76-1,01

СОЗ+, % 49,0 44,0-55,0 45,5 37,0-52,0 Pi<0.05 43,5 39,0-48,0 Pi<0,01 49,5 46,5-60,0

СБЗ+, 10% 0,65 0,43-1,13 0,56 0,29-0,66 Pi<0,05 0,53 0,31-0,60 0,40 0,34-0,48

С04+, % 28,0 21,0-29,0 22,0 16,0-25,0 Pi<0,01 24,0 17,0-27,0 31,5 26,5-34,5 р2<0,05

СХ)4+, 10% 0,42 0,23-0,45 0,26 0,10-0,33 Pi<0,05 0,25 0,19-0,39 0,24 0,23-0,25

С08+, % 22,0 18,0-26,0 22,0 19,0-24,0 19,5 18,0-23,0 23,0 16,5-29,0

С08+, 10% 0,35 0,16-0,66 0,28 0,17-0,33 0,23 0,16-0,42 0,17 0,09-0,25

С04+/С08+ 1,19 0,72-1,47 0,94 0,65-1,27 1,17 1,00-1,26 1,26 1,01-2,09

С016+,% 28,0 21,0-30,0 30,0 26,0-34,0 Pi<0,05 28,0 23,0-33,0 31,0 22,0-36,5

С01б+, 10% 0,37 0,22-0,49 0,35 0,24-0,45 0,28 0,23-0,42 0,29 0,25-0,32

СШ9+, % 26,0 18,0-29,0 26,0 19,0-29,0 28,5 24,0-32,0 19,0 12,5-22,5 Рз<0,01

С019+, 109/л 0,44 0,34-0,55 0,29 0,19-0,39 Pi<0,05 0,23 0,21-0,33 Pi<0,01 0,17 0,07-0,23 Р1<0,001

НЬА-ОЯ+, % 35,0 30,0-42,0 35,5 30,0-41,0 41,5 35,0-49,0 44,0 32,0-54,5

Ш-А-Б^, 10% 0,61 0,42-0,74 0,42 0,20-0,57 Pi<0,05 1 0,43 0,32-0,71 0,29 0,27-0,44

Примечание: р! - статистически достоверные различия с показателями контрольной группы; р2 - статистически достоверные различия с показателями больных ПКР до

лечения; р3 - статистически достоверные различия с показателями больных ПКР с сохра-

ненной клеточной чувствительностью к интерферону-а2а.

В группе больных ПКР с отсутствием клеточной чувствительности к интерферо-ну-а2а после курса иммунотерапии обнаружено статистически достоверное повышение содержания 1§М в сыворотке крови относительно контрольного уровня. В то время как в группе пациентов с клеточной чувствительностью к интерферону-а2а уровни

и 1&А в сыворотке крови не имели статистически значимых различий с параметрами когпроля (табл.8).

Таблица 8

Уровни иммуноглобулинов в сыворотке крови у больных ПКР в зависимости от чув-

ствительности к интерферону-а2а (Me, C25-C7S)

Показатели Контрольная группа п=35 1 Больные ПКР

До лечения п=44 2 После лечения

Чувствительность (+) п=16 3 Чувствительность (-) п=13 4

IgA, г/л 2,40 1,10-2,90 2,65 1,70-3,70 2,98 2,42-4,20 2,44 1,77-3,75

IgM, г/л 0,90 0,70- 0,93 1,00 0,80-1,30 1," 0,70-1,32 1,59 1,35-2,14 Pi<0,01

IgG, г/л 16,20 13,54-18,10 11,45 9,38-15,50 Р1<0,01 15,04 11,22-16,13 7,14 6,87-17,40

Примечание: р] - статистически достоверные различия с показателями кон-

трольной группы.

При изучении активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови в группе пациентов с сохранившейся клеточной чувствительностью к интерферону-а2а после курса лечения обнаружено повышение активности ГЗФДГ как относительно величин контрольной группы, так и показателей в группе пациентов резистентных к ингерферону-а2а (табл.9). В лимфоцитах крови в группе больных резистентных к ин-терферону-а2а отмечено снижение активности НАДЛДГ относительно контроля, периода до лечения и группы пациентов чувствительных к интерферону-а2а. В сравниваемых группах больных ПКР после интерферонотерапии, установлено повышение активности НАДИЦДГ (основного фермента цикла трикарбоновых кислот) по сравнению с показателями в период до лечения. Активность НАДМДГ в группе больных чувствительных к интерферону-а2а статистически значимо снижается по сравнению с показателями до лечения (табл.9). Кроме того, в группе больных, сохранивших клеточную чувствительность к ингерферону-а2а, установлено снижение уровня НАДГДГ по сравнению с показателями в период до лечения, что отражает снижение потока ин-термедиатов с аминокислотного обмена на цикл Кребса, В группе пациентов резистентных к интерферону-а2а выявлено снижение активности НАДНМДГ относительно показателей отмеченных в группе пациентов чувствительных к интерферону-а2а после курса лечения, что отрицательно сказывается на работе малат-аспартатного шунта, принимающего непосредственное участие в переносе восстановленного НАД1' из цитоплазмы клетки в матрикс митохондрий (табл.9).

Таблица 9

Изменение активности НАД(Ф) - зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови у больных ПКР после курса интерферонотерапии в зависимости от

чувствительности к интерферону-а2а (Me, C2S-C73)

Показатели Контроль п=35 1 Больные ПКР до лечения п=44 2 Больные ПКР после курса лечения

чувствительность (+) п=16 3 чувствительность (-) п=13 4

Г6ФДГ 3,11 0,53-6,24 0,46 0,01-2,03 Р.<0.01 1,30 0,83-9,85 0,06 0,06-2,58

ГЗФДГ 0,00 0,00-1,01 0,09 0,00-2,50 1,31 0,11-2,59 Р1<0,01 0,00 0,00-0,00 Рз<0,05

НАДЛДГ 11,53 2,37-20,34 7,85 1,51-27,52 16,50 1,93-36,32 0,00 0,00-2,50 Р12.3<0,01

НАДФМДГ 0,33 0,00-1,14 0,08 0,00-0,38 0,28 0,07-0,43 0,07 0,05-0,07

НАДФГДГ 0,53 0,00-4,52 0,64 0,00-2,48 1,08 0,00-12,90 1,45 0,02-4.52

НАДФИЦЦГ 2,99 1,87-6,32 1,96 0,37-5,35 1,62 0,18-5,30 7,86 0,30-12,12

НАДМДГ 4,58 0,00-11,61 32,26 0,00-114,78 Р1<0,01 0,00 0,00-59,18 р2<0,05 0,00 0,00-62,67

НАДГДГ 4,24 0,00-15,48 8,63 0,00-28,01 5,18 0,89-16,94 р?<0,05 1,08 0,00-7,22

НАДИЦЦГ 0,56 0,00-13,79 0,21 0,00-3,22 5,79 0,16-19,20 Р2<0,01 7,44 0,48-10,28 Р2<0,05

НАДНЛДГ 30,57 0,00-52,46 0,00 0,00-16,51 Р1<0,01 11,40 0,00-56,61 3,30 0,00-10,28

НАДНМДГ 58,13 24,98-114,15 58,18 27,51-95,54 65,27 43,40-160,48 29,23 24,20-40,50 Рз<0,05

ГР 13,82 7,24-36,74 1,30 0,00-7,63 Р1<0,01 3,25 0,30-11,69 4,79 0,97-14,24

НАДНГДГ 5,19 0,00-22,70 19,93 5,19-32,28 Р1<0,05 12,90 4,50-44,92 42,84 26,05-80,19

НАДФНГДГ 25,20 11,20-46,79 25,27 1,95-43,80 13,02 2,67-27,25 14,87 3,89-26,82

Примечание: то же, что и для табл.7.

Для полного представления изменений, происходящих в лимфоцитах, и в определенной степени отражающих клеточную чувствительность к интерферону-а2а, нами был изучен энзиматический статус у больных ПКР в период до иммунотерапии в зависимости от чувствительности к интерферону-а2а. Была обследована группа пациентов до лечения интерфероном-а2а. Данная группа больных ПКР делилась на две выборки - больные, сохранившие клеточную чувствительность к интерферону-а2а

после курса лечения (1 группа) и больные, которые утратили чувствительность к ин-терферону-а2а после курса лечения (2 группа).

В ходе исследования было установлено, что в обеих группах обследуемых относительно контроля наблюдалось снижение активности Г6ФДГ и ГР, что отражает понижение реакций макромолекулярного синтеза и снижение реакции восстановления глутатиона (рис.1). Помимо этого в группе пациентов резистентных к интерферону-а2а наблюдается достоверное повышение уровня активности НАДФГДГ и НАДНГДГ относительно контрольных показателей и значений, зарегистрированных в группе пациентов чувствительных к интерферону-а2а (рис.1).

Г6ФДГ

Р1<0,05

—

— Р1<0,01

■ Лп

1 2 3

ГР

40 т-

35 -

Ш 30 ■

1

£ 2! -

а

20 -

15-

г

< 10 -

5

0

р,<0,05

р,<0,05

т

I 13

13

14

Щ 12

а

а

&

® «

I в в

1 4

НАДФГДГ

НАДНГДГ

Ри<0,05

1

43

40

ш 35 я

В 30

К

| 25 в-

ёи о

г 15 е

м

< 10

5

р1.2< 0,05

1

Рис. 1. Активность НАД(Ф) - зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах у больных ПКР до лечения интерфероном-а2а в зависимости от чувствительности после курса интерферонотерапии.

Примечание: 1- контроль; 2-1 группа обследуемых; 3-2 группа обследуемых; р! - статистически достоверные различия с группой контроля; рг - статистически достоверные различия с 2-й группой.

Дискриминантный анализ, примененный для определения наиболее значимых ферментов в лимфоцитах, характеризующих клеточную чувствительность к интерфе-рону-а2, выявил высокую значимость исследуемых оксидоредуктаз в классификационной модели. Наиболее значимыми параметрами дискриминантной модели являются уровни активности НАДФНГДГ, Г6ФДГ, НАДМДГ, НАДИЦЦГ.

Исследование информативности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов периферической крови у больных ПКР до лечения в зависимости от клеточной чувствительности к интерферону-а2а с помощью модели нейросетевого классификатора показало, что наиболее информативными показателями модели являлись уровни активности Г6ФДГ, НАДМДГ и НАДФНГДГ, НАДНГДГ

В ходе исследования изучен энзиматический статус лимфоцитов периферической крови у больных ПКР, а так же исследованы механизмы влияния интерферона-а2а на пластические и энергетические внутриклеточные процессы лимфоцитов в период иммунотерапии. Исходя из результатов исследования активности НАД(Ф) - зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у больных ПКР до курса иммунотерапии, нами предложен метод прогноза клеточной чувствительности к интерферону-а2а. В качестве прогностического параметра рассматривается коэффициент соотношения пластического и энергетического обмена (СПЭО), представляющий собой отношение произведения активности Г6ФДГ и НАДФГДГ к произведению активностей НАДМДГ и НАДГДГ:

СПЭО=(Г6ФДГхНАДФГДГ)/(НАДМДГхНАДГДГ).

При значении СПЭО равном 0,12 и выше прогнозируют, что такие больные будут чувствительны к препарату интерферона-а2а после курса лечения. При значении СПЭО ниже 0,12 - прогнозируют резистентность к препарату интерферона-а2а после курса иммунотерапии. Определение показателя СПЭО перед началом интерфероно-терапии у больных ПКР позволяет прогнозировать клеточную чувствительность к препарату интерферона-а2а после курса лечения. Чувствительность метода составляет 100%, а его специфичность 83,3%.

Коэффициент соотношения пластического и энергетического обмена характеризует уровень интенсивности пластических и энергетических процессов. А именно, при преобладании пластических процессов в клетках увеличивается наработка НАДФН необходимого для биосинтетических процессов (в том числе на синтез рецепторов к интерферону). Следовательно, клетки становятся более чувствительными к данному препарату.

На основании вышеизложенного можно предложить следующую патофизиологическую схему (схема 2.).

Схема 2. Метаболические механизмы сохранения клеточной чувствительности после курса интерферонотерапии у больных ПКР чувствительных и резистентных к интерферону-а2а.

выводы

1. Общей закономерностью изменений иммунологических показателей у больных ПКР в период до хирургического лечения является лимфопения, снижение в 1,2 раза относительного и в 2 раза абсолютного количества С04+-клеток, уменьшение в

1.3 раза абсолютного числа зрелых Т-лимфоцитов и в 1,9 раза СБ19+-клеток, повышение в 1,1 раза процентного содержания клеток, экспрессирующих активационный маркер HLA-DR, а так же уменьшение в 2,4 раза фагоцитарного числа и в 1,6 раза фагоцитарного индекса нейтрофилов периферической крови и снижение уровня IgG в сыворотке крови. В послеоперационном периоде сохраняется понижение процентного содержания лимфоцитов периферической крови, относительное и абсолютное число CD4 -клеток, наблюдается уменьшение количества зрелых Т-лимфоцитов и повышение процентного содержания NK-клеток, остаются пониженными фагоцитарное число, поглотительная способность нейтрофилов крови и концентрация IgG в сыворотке крови.

2. Характерными особенностями метаболизма лимфоцитов крови у больных ПКР в период до оперативного вмешательства являются низкие уровни активности ферментов, характеризующих пластические реакции, анаэробное окисление и реакцию восстановления глутатиона. Значительных изменений показателей активности исследуемых ферментов в лимфоцитах крови у больных ПКР в послеоперационном периоде, по сравнению с периодом до операции не установлено. Сохраняется сниженная активность ГР и анаэробной реакции ЛДГ и отмечается понижение активности Г6ФДГ.

3. Под влиянием интерферона-а2а у больных ПКР в 1,5 раза снижается количество лимфоцитов в периферической крови и в 1,2 раза повышается уровень HLA-DR+-клеток. Содержание Т-лимфоцитов и их субпопуляций, NK-клеток и В-лимфоцитов достигает контрольных значений. Метаболическая реакция лимфоцитов крови больных ПКР на воздействие интерферона-а2а характеризуется активацией пластических процессов, анаэробного гликолиза, повышается в 34,2 раза уровень НАДИЦДГ и снижается в 32 раза активность НАДМДГ.

4. У больных с сохраненной клеточной чувствительностью к интерферону-а2а in vitro после курса иммунотерапии показатели иммунного статуса остаются на уровне, зарегистрированном в период до лечения интерфероном-а2а. В группе больных резистентных к интерферону in vitro после курса лечения установлено повышение в

1.4 раза процентного содержания СВ4+-лимфоцитов. Независимо от типа клеточной чувствительности к интерферону- а2а после курса иммунотерапии у больных ПКР восстанавливается уровень IgG в сыворотке крови.

5. Особенностью метаболической реакции лимфоцитов крови на иммунотерапию у больных ПКР с сохраненной клеточной чувствительностью к интерферону-а2а является снижение в 32 раза активности НАДМДГ и в 1,6 раза - НАДГДГ, тогда как у больных резистентных к интерферону-а2а отмечается понижение в 16 раз активности аэробной реакции ЛДГ. Независимо от типа клеточной чувствительности к интерфе-рону-а2а после курса иммунотерапии у больных ПКР повышается активность НАДИЦДГ.

6. Прогноз чувствительности к интерферону-а2а у больных ПКР в период до начала курса иммунотерапии осуществляется по коэффициенту соотношения пластического и энергетического обмена в лимфоцитах 1фови. При величине коэффициента равном 0,12 и выше прогнозируют чувствительность к интерферону-а2а, а при значении коэффициента ниже 0,12 - резистентность к интерферону-а2а.

7. Метаболическим механизмом потери клеточной чувствительности к интер-ферону-а2а у больных ПКР является активация субстратного потока между ЦТК и реакциями аминокислотного обмена. Сохранение клеточной чувствительности к ин-терферону-а2а определяется интенсивностью субстратного взаимодействия между ЦТК и реакциями аминокислотного обмена на уровне контрольного диапазона.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в рецензируемых журналах и изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Куртасова Л.М. Особенности энзиматического статуса и функциональной активности иммунокомпетентных клеток периферической крови у больных раком почки / JIM. Куртасова, Н.С. Хват, A.A. Савченко // Вестник РАМН. - 2010. - №5. - С.29-34.

2. Куртасова JI.M. Изменение ферментного профиля лимфоцитов крови у больных раком почки до лечения и после интерферонотерапии / Л.М. Куртасова, Н.С. Хват, A.A. Савченко // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. -Т.150, №11. - С.571-574.

3. Куртасова Л.М. Изменения иммунологических показателей у больных почечно-клеточным раком в динамике до и после хирургического лечения / Л.М. Куртасова, Н.С. Хват // Сибирское медицинское обозрение. - 2012. - №5. - С.27-30.

Публикации в иных изданиях

1. Хват Н.С. Оценка состояния иммунной системы у больных почечноклеточным раком после хирургического лечения / Н.С. Хват, Е.А. Шкапова, A.A. Савченко, Л.М. Куртасова, P.A. Зуков II Матер. Всероссийской научно-пракг. конф. с международным участием «Дни иммунологии в Красноярском ¡фае». - Красноярск, 2004,- С.156-158.

2. Shkapova Е.А. Change of cell sensitivity to interferon in patients with renal cell carcinoma after first course of reaferontherapy / E.A. Shkapova, R.A. Zukov, N.S. Hvat, L.M. Kurtasova, A.A. Savchenko // Abstracts of the XII symposium of the Russia-Japan Medical Exchenge.-Krasnoyarsk, 2005.-P.672.

3. Шкапова Е.А. Фенотипический спектр лимфоцитов крови и особенности гуморального иммунитета у больных почечноклеточным раком в послеоперационном периоде / Е.А. Шкапова, Н.С. Хват // Дни иммунологии в Сибири: матер. Всероссийской научно-пракг. конф. - 2005.-С.101-102.

4. Хват,Н.С. Состояние иммунной системы у больных почечноклеточным раком до и после оперативного вмешательства / Н.С. Хват, Е.А. Шкапова // Сборник матер, региональной конф. молодых ученых «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии».-Томск, 2006. - С.60-61.

5. Хват Н.С. Особенности состояния иммунного статуса у больных почечноклеточным раком / Н.С. Хват, Е.А. Шкапова, A.A. Савченко, Л.М. Куртасова // Медицинская иммунология. - 2006. - Т.8, №2-3. - С.354-355.

6. Хват Н.С. Изменение функциональной активности гранулоцитов у больных почечноклеточным раком с различными гистологическими типами в до и послеоперационный период / Н.С. Хват, Е.А. Шкапова, A.A. Савченко, Л.М. Куртасова // Матер. Всероссийской научно-пракг. конф. «Дни иммунологии в Сибири». - Красноярск, 2006. - С.106-108.

7. Хват Н.С. Оценка иммунофенотипического спектра лимфоцитов у больных по-чечноклеточным раком с различными гистологическими типами в до и послеоперационный период / Н.С. Хват, Е.А. Шкапова, A.A. Савченко, Л.М. Куртасова II Матер. Всероссийской научно-практ. конф. «Дни иммунологии в Сибири».-Красноярск, 2006. - С.108-110.

8. Хват Н.С. Состояние иммунного статуса у больных почечноклеточным раком с различными гистологическими типами в до и послеоперационный период / Н.С. Хват, Е.А. Шкапова // Матер, ежегодной научно-практ. конф. молодых ученых, посвященной 30-летию ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири ».- Красноярск, 2006. - С.170-171.

9. Куртасова Л.М. Показатели шггерферонового статуса у больных раком почки / Л.М. Куртасова, Е.А. Шкапова, Н.С. Хват // Российский иммунологический журнал,- 2008.- Т.2, № 2-3. - С.318.

10. Хват, Н.С., Уровень функциональной активности нейтрофилов крови у больных почечноклеточным раком с различными гистологическими типами в до и послеоперационный период / Н.С. Хват, Е.А. Шкапова, Л.М. Куртасова, A.A. Савченко, Т.В. Валькова, A.A. Герт // Сибирский медицинский журнал.-2008.-Т.23, №3, Вып.1. - С.126-127.

11. Хват Н.С. Сравнительный анализ метаболической активности лимфоцитов периферической крови у больных почечноклеточным раком после первого курса ин-терферонотерапии / Н.С. Хват, A.A. Савченко, Л.М. Куртасова // Матер, научно-практ. конф. молодых ученых «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири». - Красноярск, 2009.- С.84-86.

12. Шкапова Е.А. Особенности состояния функциональной активности нейгрофиль-ных гранулоцитов крови больных почечноклеточным раком до и после оперативного лечения / Е.А. Шкапова, Л.М. Куртасова, A.A. Савченко, Н.С. Хват, P.A. Зу-ков // Матер. Всероссийской научно-практ. конф. с международным участием «Дни иммунологии в Сибири». - Красноярск, 2010. - С.88-90.

13.Хват Н.С. Состояние иммунного статуса и метаболизма лимфоцитов периферической крови у больных раком почки / Н.С. Хват, A.A. Савченко, Л.М. Куртасова // Актуальные проблемы медицины: матер. 13-й межрегиональной научно-практ. конф. с международным участием Абакан, 2010. - С. 301-312.

14. Хват Н.С. Особенности состояния иммунного статуса у больных раком почки в динамике после операции / Н.С. Хват, A.A. Савченко, Л.М. Куртасова // Сборник научных статей "Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири." - Красноярск, 2010. - С.71-74.

15.Хват Н.С. Состояние метаболизма лимфоцитов периферической крови у больных раком почки до и после лечения / Н.С. Хват, A.A. Савченко, Л.М. Куртасова, A.A. Герд // Сборник научных статей "Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири." - Красноярск, 2010. - С.74-77.

16. Хват Н.С. Состояние метаболизма лимфоцитов периферической крови у больных раком почки / Н.С. Хват, A.A. Савченко, Л.М. Куртасова // Актуальные проблемы развития специализированной медицинской помощи в Республике Тыва: матер, юбилейной научно-практ. конф., посвященной 80-летию ГУЗ «Республиканская больница № 1» Министерства здравоохранения Республики Тыва. - Красноярск, 2010.-С. 198-200.

17.Шкапова Е.А. Определение клеточной чувствительности лейкоцитов крови к интерферону in vitro у больных почечноклеточным раком / Е.А. Шкапова, JI.M. Кур-тасова, А.А.Савченко, Н.С. Хват // Матер. Всероссийской научно-практ. конф. с международным участием «Дни иммунологии в Сибири», г. Абакан. - Абакан: Издательство ГОУ ВПО «Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катано-ва», 2011. - С. 111-114.

Патенты

1. Шкапова Е.А., Куртасова JI.M., Савченко A.A., Суховерхов А.О., Хват Н.С. Способ индивидуального подбора и коррекции лечебной дозы интерферона у больных раком почки//Патент № 2314123 РФ, МПК А61К 38/21 А61Р 37/02. - Заявка 2005139085/14,-Опубл. 10.01.2008 Бюл. № 1.- 6 с.

2. Куртасова JI.M., Савченко A.A., Хват Н.С. Способ прогноза эффективности ин-терферонотерапии при раке почки // Патент № 2338202 РФ, МПК G01N 33/68 (2006.01).-Заявка20071 Ю275/15.-Опубл. 10.11.2008Бюл.№6.-5 с.

3. Савченко A.A., Куртасова JI.M., Хват Н.С. Способ прогноза чувствительности к интерферону у больных почечноклеточным раком // Патент № 2437101 РФ, МПК G01N 33/573 (2006.01), G01N 33/49 (2006.01). - Заявка 2010129152/15. - Опубл. 20.12.2011 Бюл. №35.-10 с.

Список основных сокращений

CD Кластер дифференцировки

Ig Иммуноглобулины

ГЗ Ф ДГ Глицерол-3-фосфатдегидрогеназа

Г6ФДГ Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

ГКГ Главный комплекс гистосовместимости

ГР Глутатионредукгаза

НАД Никотинадениндинуклеотид

НАДГДГ НАД-зависимая глутаматдегидрогеназа

НАДИЦДГ НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа

НАДЛДГ НАД-зависимая лакгатдегидрогеназа

НАДМДГ НАД-зависимая малатдегидрогеназа

НАДНГДГ НАДН-зависимая глутаматдегидрогеназа

НАДНЛДГ НАДН-зависимая лакгатдегидрогеназа

НАДНМДГ НАДН-зависимая малатдегидрогеназа

НАДФ Никотшгадениндинуклеотидфосфат

НАДФГДГ НАДФ-зависимая глутаматдегидрогеназа

НАДФИЦДГ НАДФ-зависимая изоцитратдегидрогеназа

НАДФМДГ НАДФ-зависимая малатдегидрогеназа

НАДФНГДГ НАДФН-зависимая глутаматдегидрогеназа

ПКР Почечноклеточный рак

Подписано в печать 20.11.2012. Печать ризограф. Бумага офс. 80 гр/м2 Формат 84x108'/3, Усл. печ. л. 1,63 Тираж 100 экз. Заказ № 4616.

Отпечатано в типографии ООО «Версо». 660079, г. Красноярск, ул. А. Матросова, ЗОк. Тел.: 235-05-89,235-04-89.