Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Закономерности и структурно-функциональные механизмы реорганизации дендритов нервных клеток головного мозга в постишемическом периоде

Акулинин Виктор Александрович

ЗАКОНОМЕРНОСТИ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕОРГАНИЗАЦИИ ДЕНДРИТОВ НЕРВНЫХ КЛЕТОК ГОЛОВНОГО МОЗГА В ПОСТИШЕМИЧЕСКОМ ПЕРИОДЕ

14 00.15 - патологическая анатомия 03.00.25 - гистология, цитология и клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Омск-2004

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Министерства здравоохранения Российской Федерации Омской государственной медицинской академии

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Семченко Валерий Васильевич

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки, чл.-корр. РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Шкурупий Вячеслав Алексеевич доктор медицинских наук, профессор Конев Владимир Павлович доктор медицинских наук, профессор Иванов Владимир Викторович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации

ею

Защита диссертации состоится 'Р^^у в

на заседании Диссертационного совета Д208.065 04 Омской государственной медицинской академии по адресу: 644099. Омск, ул. Ленина, 12, тел (3812)233289

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Омской государственной медицинской академии

Автореферат разослан С

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, доцент

И.Г.Ваганова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Дендриты, специализированные для восприятия афферентной импульсации отростки нейронов, посредством химических синапсов обеспечивают межнейронные взаимоотношения в центральной нервной системе млекопитающих (Сотников О.С. и др., 1994; Calverley R.K.S., Jones D.G., 1990; Matus A., 2000; Kaech S. et al., 2001; Segal M., 2001; Sheng M., 2001). Они осуществляют пространственную и временную сум-мацию афферентных импульсов, регулируют электротоническое распространение постсинаптических потенциалов к триггерным зонам нейрона (Шеперд Г., 1987). Названные функции опосредуются комплексом механизмов, реализация которых затрагивает практически все уровни структурно-функциональной организации дендритов (Sheng М., 2001 Toni N. et al., 2001; Jourdain P. et al., 2003).

Имеются данные о том, что любые физиологические и патологические влияния на мозг проявляются структурными изменениями синаптических контактов, пре- и постсинаптической зон (форма и размеры терминали, шипиков), дистальных отделов дендритного дерева и цитоскелета дендри-тов. Структурный гомеостаз на уровне дендритных отростков нейронов поддерживается посредством постоянной реализации механизмов деструкции и образования новых контактов, их созревания, активации, трансформации активно функционирующих синапсов в гипертрофированные с последующей их реорганизацией в более сложные синаптические устройства, а также гиперплазии структурных компонентов дендрита и роста его отростков (Jones D.G., Harris R.J., 1995; Edwards F.A., 1995; Kolodziej S.J. et al., 2000; MatusA., 2000; Geinisman, Y. etal., 2001; KaechS. et al., 2001; Segal M., 2001).

Активация мозга сопровождается усложнением пространственной организации наиболее пластичных отделов дендритного дерева, увеличением эффективности афферентных входов. Инактивация, напротив, приводит к упрощению организации дендритов. Острое воздействие ишемии на мозг, несмотря на включение компенсаторных процессов, первоначально за счет Са2+-зависимых механизмов эксайтотоксического повреждения приводит к деструкции значительной части дендритного дерева поврежденных нейронов, а затем - к выраженной стимуляции компенсаторно-восстановительных процессов преимущественно в дистальной зоне дендритного дерева, образующей основную массу межнейронных контактов сохранившихся нейронов (Guidner F. H., Phillips S. С, 1986; Jones D.G., Calverley R.K., 1991; Jones D.G.; Harris R.J., 1995; Jourdain P. et al., 2003).

Высокая избирательная чувствительность дендритов к гипоксии и ишемии мозга послужила основанием целенаправленного исследования этих образований нейрона при изучении патогенеза постишемической энцефалопатии. Дана подробная ультраструктурная характеристика дендритов при различных ишемических и гипоксических состояниях мозга (Семченко В.В. и др., 1995,1999; Geinisman Y., 1993,1996;FitzsimondsR.M.,PooM.M.,1998).

Однако эти данные получены в основном при изучении раннего пости-шемического периода и недостаточны для расшифровки общебиологических закономерностей реорганизации межнейронных взаимоотношений в отдаленном постишемическом периоде. Не ясна яоль тзличных уровней

структурно-функциональной организации дендритов (зона синаптическо-го контакта —> шипик —> ветви 3-го —> 2-го —> 1-го уровня) и дендритного цитоскелета в механизмах постсинаптической пластической реорганизации нейронов головного мозга

Для ответа на эти и другие вопросы представляется важным детальное исследование всех уровней дендритного дерева нейронов различных отделов головного мозга экспериментальных животных и человека в отдаленном периоде после тотальной ишемии мозга. Необходима сравнительная гистологическая характеристика апикальных и базальных дендритов пирамидных нейронов, пространственной организации дендритного дерева в целом и отдельных его компонентов (шипики, зоны ветвления и др.) в динамике постишемического периода Исследование пространственной реорганизации дендритов в отдаленном постишемическом периоде целесообразно проводить параллельно с изучением динамики реактивных, дистрофических, некробиотических и компенсаторно-восстановительных процессов в нейронах с помощью электронномикроскопических и иммуногис-тохимических методов.

Работы по патологии нейронов подобного рода отсутствуют, но они необходимы для определения структурной базы механизмов, лежащих в основе нарушения и восстановления интегративно-пусковой деятельности мозга в отдаленном постишемическом периоде. Это позволит более осознанно и целенаправленно воздействовать на реорганизацию межнейронных взаимоотношений в постишемическом периоде, контролировать процессы реабилитации функций мозга и блокировать образование патологических систем мозга

Цель исследования. Выявить закономерности структурно- функциональной организации дендритов различных типов нейронов в головном мозге в норме, при ишемии и в отдаленном постишемическом периоде для определения морфологических основ постишемической энцефалопатии.

Задачи исследования:

1. Изучить цитоархитектонику сенсомоторной коры большого мозга, вен-тролатеральных ядер таламуса и ретикулярной формации продолговатого мозга белых крыс в отдаленном постишемическом периоде.

2. Провести сравнительный анализ пространственной организации дендритного дерева пирамидных нейронов слоев III и V сенсомоторной коры большого мозга, ретикулярных нейронов вентролатеральных ядер та-ламуса п гигантоклеточных нейронов ретикулярной формации продолговатого мозга белых крыс в отдаленном постишемическом периоде.

3. Осуществить сравнительный анализ изменения аксо-шипиковых и аксо-дендритных синапсов различных слоев сенсомоторной коры, вентро-латеральных ядер таламуса и ретикулярной формации продолговатого мозга белых крыс в отдаленном постишемическом периоде.

4. Установить закономерности пространственной реорганизации различных отделов дендритного дерева пирамидных нейронов соматосенсор-ной коры белых крыс в постишемическом периоде с помощью метода ретроградной люминесцентной окраски дендролеммы и сопоставить их с данными метода Гольджи.

5. С помощью иммуногистохимических методов провести сравнительный

I *** I 4

анализ состояния опорно-двигательной системы нейрона, рецепторно-барьерно-транспортной системы, системы синтеза биополимеров, системы хранения, воспроизведения и реализации генетической информации, а также систем, обеспечивающих регуляцию внутриклеточного ионного гомеостаза нейронов коры большого мозга человека в отдаленном постишемическом периоде. 6. Выявить морфологические диагностические критерии постишемичес-кой энцефалопатии.

Научная новизна. В настоящей работе впервые дана сравнительная развернутая характеристика дендритов головного мозга белых крыс и человека в отдаленном постишемическом периоде. Раскрыты структурные механизмы, лежащие в основе реактивной и пластической реорганизации дендритного дерева, представлены новые данные о пластичности и регуляции структурного гомеостаза на различных уровнях структурно-функциональной организации дендрита. Физиологические и реактивные пространственные изменения дендритов зависят от типа (апикальный, базальный) и уровня иерархической организации дендрита (дистальный, проксимальный). Показано, что дендриты различных типов и уровней имеют различную устойчивость к ишемии, отличаются вариабельностью пространственной рекомбинации в постишемическом периоде. Впервые дана сравнительная характеристика пространственных, изменений дендритного дерева различных отделов головного мозга в процессе повреждения и восстановления нейронов. Показано, что деструктивные и репаративные процессы находятся в динамическом равновесии. В отдаленном постишемическом периоде дендритное дерево активных нейронов гипертрофируется; усложнение пространственной организации дендритного дерева происходит в основном за счет дистальной зоны мелких дендритов 2-3-го порядка, активации процессов гиперплазии в фокусах ветвления дендритов. Показана роль механизмов расщепления гипертрофированных синапсов, в результате чего происходит усложнение пространственной организации синаптического устройства по конвергентному или дивергентному типу и рост дистальных дендритов, а также увеличение числа дендритных шипиков.

Выявлены общие и специфические для конкретных нейронов и отделов мозга закономерности пространственной реорганизации дендритов в отдаленном постишемическом периоде. Степень этой реорганизации отличается в различных нейронах и отделах мозга. Показано, что активно функционирующий нейрон в силу особенностей организации дендритов и распределения синапсов имеет нестабильную дистальную зону дендритного дерева, посредством реорганизации которой реализуются высокие пластические возможности нейрона.

Впервые для отдаленного постишемического периода выявлено, что, несмотря на особенности структурно-функциональной реорганизации денд-ритов различных отделов мозга, общебиологические закономерности этой реорганизации направлены в конечном итоге на восстановление площади рецептивного поля. Однако компенсаторная гиперактивность отдельных нейронов в постишемическом периоде приводит к значительному увеличению их рецептивного поля, а это, в свою очередь, может быть причиной усиления пространственной суммации импульсов и структурной основой

формирования генераторов патологически усиленного возбуждения, на основании которых в отдаленном постишемическом периоде образуются патологические системы мозга.

Теоретическое и практическое значение. Проведенные нами сравнительные количественные исследования дендроархитектоники нейронов различных отделов головного мозга в огдаленном постишемическом периоде существенным образом расширили представления о структурно-функциональных механизмах реактивности и пластичности нейронов. Расшифровка реактивных и пластических механизмов мозга на уровне дендритов служит фундаментальной базой для целенаправленного изыскания способов регуляции функций мозга, разработки патогенетически обоснованной профилактики и терапии постишемической энцефалопатии, стимуляции компенсаторно- восстановительных процессов.

Полученные данные трехмерного нейронного картирования различных областей мозга крыс являются чрезвычайно важной информацией для патологической морфологии и анатомии в изучении межнейрональных взаимоотношений на разных уровнях организации мозга в центральной нервной системе в норме, при экстремальных состояниях и в постишемическом периоде. Впервые разработаны диагностические тесты постишемической энцефалопатии в раннем и отдаленном периодах после травмы.

Данные иммуногистохимического исследования коры большого мозга человека свидетельствуют о переходе большинства нейронов на иной уровень функционирования, когда механизмы повреждения одних дендритов и синапсов (в основном дистальные дендриты и возбуждающие синапсы) сочетаются с механизмами активации компенсаторно-восстановительных процессов в других дендритах и синапсах (проксимальные дендриты и тормозные синапсы).

Внедрение результатов в практику. Данные о закономерностях структурных изменений дендритов головного мозга в постишемическом периоде используются в лекционных курсах медицинских университетов и академий на кафедрах гистологии, цитологии и эмбриологии, неврологии, анестезиологии и реаниматологии при изучении разделов "нервная ткань", "органы нервной системы", "нарушение мозгового кровообращения". Полученные в настоящем исследовании данные использованы при написании монографий: Семченко В.В., Боголепов Н.Н., Степанов С.С. "Синптоархитек-тоника коры большого мозга" (морфологические аспекты). -Омск: ИПК "Омич", 1995. - 168с; Семченко В.В., Степанов С.С, Алексеева Г.В. Поста-ноксическая энцефалопатия. -Омск: ИПК "Омич", 1999. - 446с.

Положения, выносимые на защиту:

1. В отдаленном постишемическом периоде выявлена высокая реактивность и пластичность дендритов, степень выраженности которых зависит от зоны дендрита, его типа, разновидности нейронов и отдела головного мозга.

2. В результате последовательного включения деструктивных и компенсаторно-восстановительных механизмов происходит реорганизация дендритного дерева активно функционирующих нейронов, которая является структурной основой усиления пространственной суммации афферентных импульсов Нейропластические изменения на уровне денд-

ритов максимально реализуются в дистальной зоне дендритного дерева и дендритных синапсах.

3. Реорганизация дендритного дерева нейронов в отдаленном постише-мическом периоде приводит как к восстановлению межнейронных отношений, так и к появлению гиперактивных нейронов, структурно-функциональные особенности которых делают их основой формирования патологических систем мозга.

4. Диагностическими тестами постишемической энцефалопатии являются: атипичное разрастание дендритного дерева, увеличение количества дендритных шипиков и усложнение синаптического аппарата.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на республиканской научной конференции «Морфологические науки практической медицине и биологии» (Омск, 1986), учредительном конгрессе международного общества патофизиологов (Москва, 1991), симпозиумах и конференциях НИИ мозга РАМН (Москва, 1989,1990,1991,1992,2000,2001), научно-практической конференции НИИ общей реаниматологии РАМН (Москва, 1991), конференции ЦНИЛ Омской медицинской академии (Омск, 1991), конференции кафедры гистологии и эмбриологии Омской медицинской академии (Омск, 1992), международном симпозиуме, посвященном 85-летию академика РАМН В .А. Неговского (Москва, 1994), III съезде анатомов, гистологов и эмбриологов РФ (Тюмень, 1994), IV Российско-Шведском симпозиуме по новым исследованиям в неврологии (Москва, 1996), Ш международной конференции по функциональной нейроморфологии, посвященной 100-летию со дня рождения чл.-корр. АН и АМН СССР Н.Г. Колосова (Санкт-Петербург, 1997), проблемной комиссии "Морфология" РАМН Сибирское отделение (Новосибирск, 1997), IV конгрессе Европейского общества реаниматологов (Копенгаген, Дания, 1998), конгрессе "Социальный мозг" (Александрия, Египет, 2002), конференции "Социальный мозг" (Ге-теборг, Швеция, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 44 научные работы, в том числе в центральных отечественных и зарубежных журналах, в которых отражены основные положения диссертации.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 303 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Фактические данные иллюстрированы 35 графиками, 31 микрофотографией, 9 схемами и 1 таблицей Список литературы включает 474 источника (63 отечественных и 411 иностранных авторов).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Экспериментальная модель

Эксперименты выполнены на 120 половозрелых белых крысах массой 170210 г с соблюдением всех правил работы с лабораторными животными (приказ МЗ РФ №755 от 12.08.77). Под эфирным наркозом осуществляли интубацию крыс с помощью полихлорвиниловой трубки диаметром 2-2,5 мм. Тотальную ишемию организма вызывали путем 10-минутного пережатия

сердечно-сосудистого пучка без вскрытия грудной клетки с помощью Г-образного крючка (Корпачев В.Г. с соавт., 1982).

Реанимацию производили с помощью наружного массажа сердца и искусственной вентиляции легких воздухом через полихлорвиниловую трубку до появления роговичного рефлекса и ритмичного самостоятельного дыхания. Медикаментозная терапия в процессе восстановления системного кровотока не применялась. Сердечная деятельность восстанавливалась в течение первой минуты после начала массажа сердца. Первое дыхательное движение появлялось через 7-10 мин, а роговичный рефлекс — через 3-6 мин постишемического периода. Успешная реанимация составила 65%.

По данным литературы, в восстановительном периоде после ишемии, вызванной пережатием сосудистого пучка сердца, возобновление электрической активности мозга крыс регистрируется через 23-28 мин после начала реанимации (Kawai К. et al., 1992).

2. Методы исследования

Мозг животных фиксировали перфузией смеси раствора 4% параформаль-дегида и 1% глютарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) с 5% раствором сахарозы в течение 15-20 мин под давлением 90 мм рт. ст. через аорту. Мозг для световой микроскопии забирали в конце операционного контроля (через 10 мин после пережатия сердечно-сосудистого пучка), через 3 и 7 сут, 1, 3, 5, 7 и 9 мес восстановительного периода (по 3 животных на каждый срок) и у контрольных (интактных) животных (n=5). Вырезали фронтальный блок мозга на уровне сенсомоторной коры, таламу-са и продолговатого мозга с использованием стереотаксического атласа (Све-тухина В.М., 1962; Леонтович Т.А., 1978; Albe-Fessard D., 1966).

Световая микроскопия

Метод Гольджи. Кусочки мозга размером 3x5x5 мм и толщиной 150 мкм, включающие сенсомоторную кору и таламус, а также отдельный кусочек продолговатого мозга крыс, помещали на 2 сут. в 3,5% раствор К2СЮ7 (раствор Мюллера), затем промывали и перекладывали в 1% раствор OsO4npH температуре 37°С на 2 сут. Промывали и перекладывали в 0,75% раствор AgNO3 на 3 суток. Импрегнацию проводили в темноте при комнатной температуре. Затем блоки мозга дегидратировали, заключали в целлоидин. На препаратах, импрегнированных по методу Гольджи, изучали пирамидные нейроны слоев П-Ш и слов V-VI сенсомоторной коры мозга крыс, а также ретикулярные нейроны вентролатерального ядра таламуса и гиган-токлеточные нейроны продолговатого мозга. Эти нейроны зарисовывали с помощью «Camera lucida» на микроскопе «Ortholux» (Leitz, Germany) при увеличении хбОО. На точных зарисовках нейронов проводили количественный анализ геометрии дендритов нейронов (по 15 клеток в каждой группе) по методу Т.А. Леонтович (1978). С помощью графической программы через дигитайзер вводили в компьютер и анализировали две группы измеряемых и производных количественных параметров.

Кроме того, для более полной характеристики дендритов подсчитывали численную плотность дендритных шипиков на протяжении 100 мкм длины дендрита пирамидных нейронов в слоях II-Ш и V-VI сенсомоторной коры

мозга крыс. В зависимости от типа пирамидного нейрона подсчет шипиков проводили на апикальных, косых апикальных дендритах, стволе апикального дендрита и на базальных дендритах (Беличенко П.В., 1988) при увеличении хбОО под микроскопом «Ortholux»(Leitz, Germany).

Метод Лиселя. Фронтальные кусочки головного мозга фиксировали в 10% формалине в течение 6 сут, промывали в проточной воде в течение 24 часов, затем дегидратировали в этаноле и заливали в парафин. Полученные парафиновые блоки резали фронтально толщиной 20 мкм и окрашивали крезил-виолетом.

На препаратах оценивалась общая цитоархитектоника и проводился мор-фометрический анализ: выявление общей численной плотности нейронов, определение содержания реактивно, дистрофически и некробиотически измененных нейронов в различных слоях сенсомоторной коры, вентролате-ральном ядре таламуса и ретикулярной формации продолговатого мозга. Для этого в каждом случае (срок, n=5) численную плотность нейронов в единице плоскости среза (Ns) определяли на фронтальных срезах при увеличении х40 с помощью микрометра (окуляр х15). На общей площади среза 126660 мкм2 (10 полей зрения) подсчитывали количество нормохромных, гиперхромных несморщенных, гиперхромных сморщенных, гипохромных нейронов и клеток-теней. С помощью микрометра определяли продольный (D1) и поперечный (D2) диаметры тела нейронов. Средний диаметр тел нейрона (Dcp) рассчитывали, как: (Dl+D2)/2. Dcp использовался в формуле Abercrombie (1946) для определения численной плотности нейронов в единице объема (Nv). Nv в 1 мм3 рассчитывалась как: Nv = NsT/(Dcp+T) (Блинков СМ., Глезер И.И., 1964).

Люминесцентная микроскопия

Использовали флюоресцентную липофильную метку Dil (1,1 '-dioctadecyl-3,3,3', З'-tetramethyl-indocarbocyanineperchlorate). Это вещество способно к орто- и антидромному распространению вдоль клеточных мембран фиксированной ткани мозга без прохождения через синаптические контакты. Ортодромное распространение Dil окрашивает аксоны вплоть до их терми-налей, антидромное - тела нейронов, дендриты и их шипики (Hempel C.M.E. et al., 1993; Kurotani Т. et al., 1993). Это позволяет проследить ход окрашенных горизонтальных межмодульных, межсегментных аксонов коры до симметричных участков по другую сторону повреждения и обратно. На полученных с помощью люминесцентного микроскопа фотографиях определяли форму и размеры различных дендритов, а также численную плотность шипиков.

Электронная микроскопия

Для электронномикроскопического исследования после перфузионной фиксации головной мозг извлекали, выделяли сенсомоторную область коры большого мозга (поля Fpa и Fpp), вентролатсральное ядро таламуса и участки ретикулярной формации продолговагого мозга (Paxinos G., Watson Ch., 1982). Выделенные фрагменты дофиксировали в аналогичном фиксаторе при +4°С. Затем материал измельчали, промывали в фосфатном буфере. Одну часть материала (по 5 кусочков на случай) контрастировали в 1% растворе

четырехокиси осмия, другую - в 5% спиртовом растворе фосфорновольф-рамовой кислоты (ФВК), что значительно улучшает контраст активной зоны межнейронных контактов (Vrensen G. е.а, 1980). Блоки заключали в смесь эпона и аралдита. Для последующего просмотра материала использовали ультратонкие (70-100 нм) срезы, которые готовили на ультрамикротомах УМТП-4 и "Ultracut-E" (фирма Reichert-Jung). Все срезы помещали на сетки без подложки, а срезы с осмированного материала дополнительно контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Просмотр и фотографирование ультратонких срезов производили на электронном микроскопе "Hitachi-600Н".

На осмированных препаратах проводилась общая оценка состояния ней-ропиля и клеток мозга. Для морфометрического анализа межнейронных синапсов использовали ФВК-материал. В каждой группе животных фотографировали до 50 полей нейропиля (х 12000). Определение численной плотности синаптических контактов проводили с помощью фотоувеличителя на электроннограммах при конечном увеличении хЗ0000. Для количественной оценки общей численной плотности синаптических контактов использовались только поперечные профили контактов, где четко верифицируются пре- и постсинаптические зоны. Численная плотность синаптических контактов относительно единицы площади среза (Ns) пересчитывалась на 100 мкм2 нейропиля.

Иммуногистохимические методы (конфокальная лазерная сканирующая микроскопия)

Для иммуногистохимического исследования использовали участки различных отделов коры большого мозга (лобная, теменная, височная, затылочная) больных (n=6), умерших через 7 сут, 3 и 12 мес после клинической смерти, вызванной остановкой системного кровотока в результате инфаркта миокарда. Контролем служил мозг погибших в результате несчастных случаев (n=8).

Аутопсийный материал забирали в первые сутки после смерти. Исследовались следующие поля неокортекса: 4 (моторное), 2 (височное), 10 (лобное) и 17 (зрительное). Кусочек каждой области коры размером 20x10x10 мм погружался в 4% раствор параформальдегида с 0,1 М фосфатным буфером (ФБ) при рН 7,4 и хранился в этом растворе в холодильнике при температуре 4°С до последующей проводки. Срезы толщиной 10 mm делались во фронтальной плоскости через все слои коры на замораживающем криос-тате (Cryostat, Leica, Germany). Часть срезов хранили в ФБ при 4°С и использовали для иммунофлюоресцентной инкубации. Другую часть срезов окрашивали крезил-виолетом для обзорной микроскопии.

Для иммуногистохимического исследования готовили по 5 срезов с каждого исследуемого поля коры большого мозга промывали от параформа в 0,1 М фосфатном буфере при рН 7,4. Далее помещали срезы в 5% обезжиренное молоко с солевым ФБ (СФБ) при комнатной температуре в течение 1 ч. 3-л-ем осторожно отсасывали пипеткой СФБ. Использовали следующие первичные антитела: 1) синаптофизин (synaptophysin, р-38; предоставлен Р. Greengard, New Yoik, USA; разведение ] :5000); 2) ассоциированный протеин роста (Growth associated protein, GAP-43; предоставлен G. Wilkin, London,

UK; разведение 1:3000); 3) микротрубочко-ассоциированный протеин (Microtubule-associated protein, MAP-2; Sigma Chemicals, St. Louis, USA; разведение 1:400); 4) ядерный нейрональный протеин (Neuronal nuclei protein, NeuN; CHEMICON International Inc., Temecula, CA, USA; разведение 1:500); 5) калбиндин (Calbindin D ; SWant, Swiss antibodies, Switzerland; разведение 1:400); 6) нейропептид Y (Neuropeptide Y, NPY; Sigma Chemicals, St. Louis, USA; разведение 1:8000); 7) глиальный кислый фибриллярный протеин (Glial fibrillary acidic protein, GFAP; DAKO, Glostrup, Denmark; разведение 1:800).

Каждое первичное антитело оставляли на 12-14 ч при комнатной температуре на качающейся поверхности. Затем три раза в течение 15 мин промывали в ФБ. Далее срезы инкубировали со вторичными антителами (Biotinylated anti-mouse; Sigma Chemicals, St. Louis, USA; разведение 1:200) в 0,1 M СФБ при рН 7,4 с раствором 0,3% Triton XI00 в течение 2 ч. Затем три' раза в течение 15 мин промывали в ФБ. Далее срезы помещали с FITS-связанным стрептавидином (FITC-conjugated streptavidin; Amersham, Buckinghamshire, UK; разведение 1:200) в 0,1 M СФБ при рН 7,4 в темной комнате в течение 1 ч. После этого три раза в течение 15 мин промывали в ФБ. Все срезы были заключены под покровное стекло в 90% глицерин, приготовленный на ФБ.

Иммуногистохимические препараты просматривались на BioRad MRC 600 - конфокальном лазерном сканирующем микроскопе, присоединенном к флюоресцентному микроскопу Nikon FXA. Для обработки и количественного анализа изображений нами использовалась программа «Pixel Anatomy» (Belichenko P.V. et al, 1996).

Статистический анализ. Полученные результаты обработаны общепринятыми в медико-биологических исследованиях методами статистического анализа с применением программ SYSTAT, EXCEL, STAT1STICA и "StarView". В зависимости от характера распределения для определения достоверности отличий результатов в различных экспериментальных группах применяли непараметрический критерий Колмагорова-Смирнова и t-критерий Стьюдента для независимых выборок. В каждой сравниваемой группе количество измерений определялось требованиями выявления достоверности при/К0,05, что является достаточным для биологических объектов (Автандилов ГГ., 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Закономерности изменения дендроархитектоники сенсомоторной коры, вентролатерального таламуса и продолговатого мозга белых крыс в постишемическом периоде

Сенсомоторная кора. Общая картина дендроархитектоники сенсомоторной коры (СМК) слоев Ш и V, вентролатерального ядра (ВЛЯ) таламуса и продолговатого мозга в контроле и в постишемическом периоде определялась нами с помощью импрегнации нервной ткани по методу Гольджи. В результате применения этого метода окрашивается цитоскелет дендритно-

го дерева (ДД) и тела нейронов, что позволяет количественно оценить параметры, характеризующие число дендритных ветвей различного уровня, степень их ветвления, объем дендритной территории, протяженность различных дендритов и численную плотность дендритных шипиков (ДШ) в динамике постишемического периода.

Дендритное дерево пирамидных нейронов (ПН) Ш и V слоев СМК большого мозга контрольных животных - сложное пространственное образование, представленное системой дендритов разного диаметра, протяженности и топографии. Для ПН неокортекса характерно наличие толстых и коротких базальных, толстых и длинных апикальных проксимальных дендри-тов первого порядка, средних коротких и тонких длинных дистальных дендритов второго и третьего порядка. Последние составляют около 90% от общей длины дендритов ПН. На всем протяжении дендритов выявляются специализированные образования дендритов - дендритные шипики, которые отличаются формой и плотностью расположения на дендритах. Основная масса афферентных волокон оканчивается на мелких и средних шипи-ках дистальных дендритов 2-го и 3-го порядка, которые характеризуются наименьшим диаметром и наивысшим сопротивлением для электротонического распространения импульса (Чиженкова РА., 1986; Holmes W.R., 1989).

Максимальная редукция ДД пирамидных нейронов слоя Ш СМК отмечалась через 7 сут постишемического периода по сравнению с контролем. Так, через 7 сут после ишемии общая длина дендритов (Ld) пирамидных нейронов слоя Ш уменьшилась на 29,8% (p<0,05), длина базальных дендритов (Ld bas) - на 35,5% (р<0,05), при этом площадь апикальных дендритов (Sd apic) уменьшилась на 41,2% (р<0,05), а площадь базальных дендритов (Sd bas) - на 33,4% (р<0,05), объем дендритной территории (Vdt) уменьшился уже через 3 сут постишемического периода на 34,2% (р<0,05) и через 7сут-на59,1%(р<0,05).

Через 30 сут после ишемии все измеряемые и производные показатели, характеризующие дендроархитектонику ПН слоя Ш СМК мозга крыс, соответствовали контрольному уровню. В более отдаленном периоде (3-9 мес) только через 5 мес появлялись признаки повторной деструкции дисталь-ных дендритов. До уровня 7-х сут снижались такие показатели, как общая длина дендритов, длина базальных дендритов, общая площадь дендритного поля, площадь базальных дендритов ПН, максимальный радиус верхушечных апикальных дендритов, объем дендритного поля.

Через 7 мес после ишемии все параметры ДД пирамидных нейронов слоя Ш СМК вновь соответствовали контрольному уровню и больше не изменялись в течение последующих двух месяцев.

Достоверное снижение численной плотности ДШ апикальных дендритов ПН слоя Ш СМК мозга на уровне слоев I—II отмечалось через 7 сут (на 42,9%, p<0,01), а в остальных отделах - уже через 3 сут. В первые 3-е сут. острого постишемического периода отмечалось практически полное сохранение ДШ на дистальных апикальных дендритах и равномерное уменьшение численной плотности шипиков всех остальных отделов ДД пирамидных нейронов слоя Ш СМК мозга. В подостром периоде (7 сут) процесс деструкции шипиков углублялся и охватывал все отделы ДД. Однако сте-

пень редукции численной плотности шипиков на дистальных дендритах в этот период значительно превалировала над таковой на проксимальных дендритах (ствол) - соответственно 42,9-50,0% (р<0,05) и 18,8% (р<0,05) Полное восстановление численной плотности шипиков отмечалось через 3 мес после ишемии. Однако через 5 мес постишемического периода выявлялась новая волна деструкции шипиков, в результате чего их численная плотность снижалась до уровня острого и подострого периодов. Исход вторичного повреждения ДШ в отдаленном периоде отличался от такового в остром периоде тем, что полного восстановления численной плотности шипиков всех отделов ДД до контрольного уровня не происходило даже через 9 мес по-стишемического периода. В зоне дистальных апикальных дендритов сохранялся дефицит 53,6% (р<0,01) шипиков. Все это свидетельствует о значительной реорганизации дендроархитектоники ПН слоя Ш СМК мозга в отдаленном постишемическом периоде.

Совершенно иная динамика изменения дендроархитектоники характерна для ПН слоя V СМК мозга. Достоверное снижение основных параметров, характеризующих ДД, отмечалось уже через 3 сут постишемического периода. Так, по сравнению с контролем через 3 сут после ишемии общая длина дендритов (Ld) пирамидных нейронов слоя V СМК уменьшилась на 52,5% (р<0,01), общая площадь дендритного поля (Sda) - на 39,8% (р<0,05), при этом площадь апикальных деядритов (Sd apic) уменьшилась на 41,1 % (р<0,05), а площадь базальных дендритов (Sd bas) - на 67,5% (р<0,01) (рис. 1).

Через 7 сут после ишемии происходило дальнейшее углубление процесса деструкции ДД. Через 30 сут после ишемии основная масса измеряемых и производных показателей, характеризующих дендроархитектонику ПН слоя V СМК мозга крыс, в отличие от ПН слоя III СМК, оставалась на низком уровне. Однако на этом фоне до контрольного уровня восстанавливались показатели, характеризующие степень разветвленности дендритов, длины дендритов по всей дендритной территории и максимального радиуса ба-зального дендритного поля. Все это свидетельствовало об активации компенсаторно-восстановительных механизмов. Несмотря на это, даже через 3 мес после ишемии сохранялись выраженные признаки редукции дисталь-ной части всех отделов дендритного дерева ПН слоя V СМК. Только через 5 мес после ишемии все параметры дендритного дерева ПН слоя V СМК соответствовали контрольному уровню и больше не изменялись в течение последующих четырех месяцев.

Таким образом, для больших ПН слоя V СМК характерна более ранняя (уже через 3 сут), чем для мелких ПН слоя III СМК, редукция значительной части ДД, выявляемая с помощью метода импрегнации по Гольджи. Редукция осуществлялась в основном за счет выпадения терминальных веточек дендритов 2-го и 3-го порядка. Для поврежденных нейронов было характерно наличие большого количества варикозных расширений на всем протяжении ДД и очаговые повреждения дендрита, которые чаще встречались на апикальном дендритном поле. Особенностью популяции крупных ПН является длительное сохранение в постишемическом периоде клеток с выраженными признаками повреждения дистальных дендритов (до 3 мес). Тем не менее, на основании данных об увеличении значений таких показателей, как число свободных концов у всех дендритов, общая разветвленность клет-

Рис.1. Количественная характеристика (измеряемые параметры) депдроархи-тек-тоники ПН слоя V СМК мозга белых крыс в контроле (К), операционном контроле (ОК), через 3, 7 сут, 1, 3, 5, 7 и 9 мес постишемического периода. А-число всех первичных депдритов (d), В - число свободных концов у всех ден-дритов (Bd), С - площадь тела (Scl), D - общая длина дендритов (Ld), E - длина апикальных дендритов (Ld apic), F - длина базальных дендритов(Ы bas), G -общая площадь дендритного поля (Sda), H - площадь апикальных дендритов (Sd apic), I - площадь базальных дендритов (Sd bas) пирамидных нейронов.

ки, разветвленность дендритов, общая длина дендритов во всей дендритной территории и максимальный радиус базального поля, можно судить об активации процессов образования новых вторичных и третичных дендри-тов, росте дендритов в длину и их разветвлении в этот период. Нормализация зсех показателей, характеризующих дендроархитектонику ПН слоя V СМК, происходит только через 5 мес - в тот период, когда в ПН слоя Ш СМК отмечается вторичная волна деструктивных изменений. Для ПН слоя V СМК вообще не характерна повторная, после восстановления в течение

3-5 мес всех параметров ДД, деструкция дендритов, даже проксимальных ветвей.

Вышеописанные существенные различия динамики изменения пространственной организации дендритного дерева ПН слоев Ш и V СМК не касаются их шипиков. Максимальное уменьшение количества ДШ пирамидных нейронов слоя V происходило через 3 и 7 сут постишемического периода на базальных дендритах. В более отдаленном периоде выявлялось персистент-ное волнообразное течение реорганизации популяции ДШ, когда деструкция шипиков периодически стимулировала процесс их репаративной регенерации. При этом сохранившиеся шипики утолщались и изменяли форму, в результате чего края дендритов становились неровными. Результатом репаративной регенерации было увеличение общей численной плотности шипиков до контрольного уровня через 30 сут после ишемии. Необходимо отметить, что этот процесс не совпадал по времени'с процессом регенерации дистальных дендритных ветвей и в течение 3 мес осуществлялся на фоне выраженной редукции ДД только за счет проксимальных ветвей. Последующее восстановление проксимальных дендритных ветвей (через 5 мес), наоборот, совпадало с повторной редукцией значительной части шипиков на всех, кроме косых, дендритах. Подобное несоответствие было характерно только для крупных ПН слоя V СМК, и поэтому может быть рассмотрено как специфическое проявление заместительной реакции ДД этих нейронов в ответ на повреждение дистальных дендритов. Это свидетельствует в пользу того, что крупный ПН способен длительно (месяцы) поддерживать жизнедеятельность и функционировать за счет проксимальных неповрежденных дендритов 1-2-го порядка и на их основе восстанавливать поврежденные дистальные дендриты и межнейронные связи. В более отдаленном периоде происходит восстановление периферии ДД за счет роста мелких дистальных дендритов.

Таким образом, в СМК после острой 10-минутной ишемии в течение первых 7 сут происходит выраженная редукция дистальных отделов ДД нейронов и диффузно-очаговая деструкция ДШ на всех дендритах. Репаративная регенерация дендритных ветвей и шипиков в более отдаленном периоде происходит неравномерно и несинхронно. В отдаленном постишемичес-ком периоде повторные деструктивные процессы в большей степени характерны для апикальных дендритов мелких ПН слоя III СМК, а пластическая реорганизация - для крупных ПН слоя V СМК мозга.

При окраске DiI-методом и импрегнации по Гольджи нейронов контрольных животных выявлялась принципиально сходная картина пространственной организации ДД и распределения шипиков. Однако при DiI-мето-де темный фон и более детальная проработка мембраны мелких дендритов и дендритных выростов позволяла значительно лучше оценить морфологию самых мелких дистальных дендритов ПН. Это становится возможным за счет того, что липидная фосфор илирующая метка DiI распространяется антеро- и ретроградно только вдоль фосфолипидного бислоя мембраны, верифицируя самые мелкие инвагинации дендролеммы и точно отражая геометрию цитолеммы. Метод Гольджй, в основе которого лежит взаимодействие ионов серебра с компонентами цитосклета нейрона, дал информацию о структуре посредством выявления цитоскелетных филаментов,

являющихся структурной основой формообразования дендритов и их ши-пиков. Сочетанное использование выбранных нами методов верификации ДШ более объективно отражает реальную организацию шипиков, а результаты, полученные при их применении, не противоречат друг другу

При окраске по Гольджи поврежденные дендриты (даже при сохранении цитолеммы) прокрашиваются фрагментарно и дают несколько заниженные показатели численной плотности шипиков в зонах повреждения дендрита. Однако деструкция цитоскелета дендритов части нейронов в постишеми-ческом периоде не является фатально необратимым процессом. При нормализации микроциркуляции цитоскелет восстанавливается, а как следствие, восстанавливается и прокраска шипиков и отростков методом Гольджи. То есть, увеличение при этом численной плотности шипиков можно ошибочно трактовать только как образование новых шипиков и не учитывать проявление старых, ранее не прокрашиваемых выростов дендрита. Особенно наглядно это проявляется во время интенсивного увеличения численной плотности шипиков на 30-е сут после ишемии в ПН слое Ш и V СМК, когда методом Гольджи выявлялось значительное увеличение численной плотности шипиков. В то же время при исследовании динамики изменения численной плотности синапсов электронномикроскопическим методом значительного роста плотности зрелых контактов в ПН слоя Ш СМК в этот период не найдено. Поэтому мы полагаем, что в постишемическом периоде при относительной нормализации микроциркуляции коры большого мозга увеличение количества шипиков в ПН слое III и V СМК происходит не только за счет образования новых шипиков, но и за счет «проявления» (при методе Гольджи) уже существующих шипиков в результате восстановления структурных и тинкториальных свойств филаментов поврежденного цитос-келета ДД нейронов за счет усиления внутриклеточной репарагивной регенерации.

В течение 30 сут постишемического периода восприятие специфической соматосенсорной информации происходит в условиях значительного уменьшения площади контактов таламо-кортикальных проекций (слои III-IV). Это неизбежно приводит к изменениям пространственной суммации импульсов и нарушениям таламо-кортикальных взаимоотношений по типу ослабления и выпадения возбуждающего влияния специфических ядер таламуса.

В результате более интенсивного разрастания проекций неспецифических систем изменяется соотношение площади рецепториой поверхности нейронов, воспринимающей специфическую (1II-IV слои) и неспецифическую информацию (слой I). Это изменяет корково-подкорковые взаимоотношения и усиливает неспецифическую активацию нейронов неокортекса.

Вентролатеральное ядро таламуса. На препаратах, обработанных с помощью метода Гольджи, ретикулярные клетки ВЛЯ таламуса контрольных животных располагались равномерно и были немногочисленны. Основные измеряемые и производные показатели, характеризующие пространственную организацию ДД, значительно изменялись уже через 3 сут после ишемии Деструкция части дендритов ретикулярных нейронов таламуса сопровождалась появлением типичных признаков ишемического повреждения в сохранившихся дендритах - варикозных расширений и фрагментации ци-тоскелета.

Особенностью постишемической динамики изменения дендроархитек-тоники ВЛЯ таламуса являлось то, что максимальная редукция характеризующих ее показателей происходила уже через 3 сут, а через 7 сут отмечалась выраженная тенденция к их восстановлению. Достоверно увеличивались такие показатели, как общая длина дендритов, общая площадь дендритного поля, максимальный радиус дендритного поля, объем дендритного поля, объем дендритной территорий, общая длина дендритов ретикулярных нейронов во всей дендритной территории. Однако полное восстановление всех изучаемых показателей до контрольного уровня происходило только через 3 мес после ишемии.

Еще одной особенностью постишемической реорганизации дендроархи-тектоники ВЛЯ таламуса было то, что в отдаленном периоде (7, 9 мес) появлялись нейроны, значительно (на 20-30%) превосходящие по размерам типичные нейроны таламуса контрольных животных. Это приводило к тому, что такие показатели, как площадь дендритного поля, максимальный радиус дендритного поля и объем дендритного поля у животных, перенесших ишемию, превосходил уровень данных показателей в контроле.

Таким образом, реорганизация дендроархитектоники ВЛЯ таламуса в течение длительного постишемического периода имела ярко выраженные особенности и отличалась от таковой СМК. Выявленная нами максимальная редукция ДД уже через 3 сут после ишемии, вероятно, связана с тем, что ретикулярные нейроны ВЛЯ таламуса в норме обладают очень длинными и тонкими дендритами с незначительным объемом цитоскелета. Подобные тонкие и длинные дендриты менее устойчивы к ишемии и в сенсомоторной коре. Именно за счет этих дендритов происходит редукция дистальной части ДД и в коре, и в таламусе. Особенностью ретикулярных нейронов ВЛЯ таламуса является то, что быстрая редукция дистальных дендритов сопровождается и столь же быстрым их восстановлением, и гипертрофией ДД. Это приводит к тому, что подобные нейроны ВЛЯ таламуса приобретают большую способность к пространственной суммации восходящих импульсов. Накопление таких нейронов в постишемическом периоде неизбежно приведет к изменениям таламо-кортикальных взаимоотношений и изменениям интегративно-пусковой деятельности головного мозга в целом.

Продолговатый мозг. Гигантоклеточные нейроны продолговатого мозга контрольных животных располагались по всей ретикулярной формации, имели крупное тело и 5-6 стволовых редковетвящихся дендритов, от которых отходили более тонкие и длинные дендриты 2-3-го порядка.

Через 3 сут постишемического периода, как и в таламусе, все параметры, характеризующие дендроархитектонику ретикулярной формации, достоверно уменьшались. Через 7 сут постишемического периода отмечалась тенденция к восстановлению почти всех параметров ДД. Дефицит общей длины дендритов составлял уже 47,2% (р<0,05), общей площади дендритного поля - 55,7% (р<0,01), а объема дендритного поля - 56,8% (р<0,01). Через 30 сут после ишемии было отмечено восстановление всех параметров ДД до контрольного уровня. Особенностью реорганизации дендроар-хитектоники ретикулярной формации продолговатого мозга было то, что через 3 мес после ишемии происходило вторичное снижение уровня параметров, характеризующих степень развствленности ДД. Число свободных

концов у всех дендритов снижалось на 26,7% (р<0,05), общая разветвлен-ность - на 30,2% (р<0,05), разветвленность дендритов - на 24,1% (р<0,05) по сравнению с контролем. На этом уровне показатели разветвленности оставались и через 5 мес после ишемии. Через 7 и 9 мес достоверных различий с контролем не было выявлено ни по одному параметру, характеризующему ДД нейронов ретикулярной формации продолговатого мозга.

Таким образом, как и в таламусе, максимальное повреждение ДД нейронов ретикулярной формации продолговатого мозга выявлено через 3 сут после ишемии. Однако через 30 сут все показатели соответствовали контрольному уровню. В более отдаленном периоде изменялись только показатели, характеризующие разветвленность дендритов. Сначала (3, 5 мес) эти показатели снижались, а затем возрастали до контрольного уровня (7,9 мес). Такой интегральный показатель, как относительная длина дендритов (Ers) - отношение максимального радиуса дендритного поля к радиусу тела клетки, свидетельствует о том, что среди всех изученных отделов головного мозга в большей степени страдают эфферентные нейроны СМК. В ПН слоя Ш СМК после ишемии данный показатель вообще не меняется, в ВЛЯ таламу-са уменьшается через 3 и 7 сут соответственно на 48,8% и 25,0%, в ретикулярной формации продолговатого мозга - на 29,8% (3 сут), а в ПН слоя V СМК - на 50,0% (3 сут), 52,9% (7 сут), 50,6% (30 сут) и на 36,8% через 3 мес. Все это свидетельствует о том, что ретикулярная формация продолговатого мозга в постишемическом периоде, в отличие от СМК и ВЛЯ тала-муса, является очень стабильным образованием головного мозга.

Для непирамидных нейронов ВЛЯ таламуса и ретикулярной формации продолговатого мозга максимальное повреждение ДД выявлено через 3 сут после ишемии, а последующая реорганизация дендроархитектоники в течение длительного постишемического периода имеет ярко выраженные особенности и отличается от таковой СМК. В этих отделах мозга быстрая редукция дистальных дендритов сопровождается столь же быстрым их восстановлением и гипертрофией ДД.

2. Закономерности изменения цитоархитектоники сенсомоторной коры, вентролатерального таламуса и продолговатого мозга белых крыс в постишемическом периоде

В течение 30 сут постишемического периода общая численная плотность нейронов (в 0,001 мм3) в СМК мозга и ВЛЯ таламуса достоверно уменьшалась по сравнению с контролем. В ПН слоях П-Ш СМК через 30 сут дефицит нейронов составил 35,9% (р<0,05), в ПН слое V СМК - 32,5% (р<0,05), а в ВЛЯ таламуса - 28,2%( р<0,05). В более отдаленном периоде (3, 5,7 и 9 мес) общая численная плотность нейронов этих отделов мозга достоверно не изменялась. Численная плотность нейронов ретикулярной формации продолговатого мозга достоверно не изменялась в течение всего постише-мического периода (табл. 1).

Следовательно, тотальная 10-минутная ишемия приводит к существенным латологическим изменениям цитоархитектоники изученных отделов мозга в постишемическом периоде. При этом основная масса нейронов погибает и элиминируется в первые 30 сут после ишемии. В более отдаленном периоде сохраняется значительное содержание реактивно и дистрофи-

Таблица 1.

Численная плотность нейронов (на 0,001 мм1) в различных отделах головного мозга белых крыс в норме и постишемическом периоде (М±т)

Огдел мозга Контроль Операционный Постишемический период

контроль Зсут 7 сут 1 мес 3 мес 5 мес 7 мес 9 мес

ОМК мозга -

• слои П-Ш 169 ±3,2 165 ±5,3 158 ±2,6 159 ±4,7 108 + 3,3* 119 ±3,6* 121 ±4,1* 126 ±2,2* 106 ±3,5*

• слои У-\Т 117 ±2,1 П 7 ± 4,2 109 ±2,7 107 ±3,3 79 ± 3,0* 85 ± 4,4* 93 ± 2,9* 93 ±2,5* 88 ± 2,7*

Ретикулярные нейроны ВЛЯ галамуса 78 ± 0,4 72 ±1,2 81 ±0,8 79 ±1,2 56 ±1,0* 54 ± 1,1* 55 ± 0,7* 57 ± 1,2* 51 ±1,3*

Гигантаклеточные нейроны ПМ 28 ± 0,7 29 ± 1,0 27 ± 1,1 29 ±0,8 28 ±0,5 26 ± 0,7 29 ± 0,7 26 ± 0,4 28 ± 0,9

Примечание. Достоверность различий рассчитана в сравнении с контролем (* - Р<0,05).

чески измененных нейронов, но общая численная плотность нейронов остается стабильной.

Вполне вероятно, что нейроны после ишемии подвергаются некрозу и апоптозу. По литературным данным, в постишемическом периоде реализуются оба типа клеточной смерти, а соотношение типов гибели нейронов по объему повреждения клеток зависит от характера и продолжительности ишемии (№1а1оп Т., 1995). Необратимым некробиотическим изменениям подвержены только некоторые наиболее чувствительные нейроны в СМК и ВЛЯ таламуса головного мозга. Остальные нейроны нормально функционируют или подвергаются апоптозу в более отдаленном периоде. Из трех представленных отделов мозга максимально страдает популяция нейронов СМК, меньше повреждаются ретикулярные нейроны ВЛЯ таламуса, а для гигантоклеточных нейронов продолговатого мозга характерно наличие только обратимых реактивных и дистрофических изменений.

Мы полагаем, что именно наличие персистирующей зоны деструктивно измененных дистальных дендритов (непрокрашиваемых при импрегнации серебром) с грубыми нарушениями ионного гомеостаза, патологической деполяризацией мембран и нарушениями дендротока вследствие повреждения цитоскелета может быть причиной снижения порога возбуждения этих поврежденных нейронов. Увеличение количества подобных нейронов во всех отделах мозга после ишемии до некоего критического уровня приводит, вероятно, к появлению генераторов патологически усиленного возбуждения (Крыжановский Г.Н., 1997) В свою очередь, последние становятся дополнительным патогенетическим фактором, препятствующим нормализации трофики и реализации компенсаторно-восстановительных процес-

сов нейронов, способствуя длительному сохранению в отдаленном пости-шемическом периоде реактивно измененных нейронов Эти нейроны могут быть структурной базой формирования патологических систем мозга в по-стишемическом периоде.

3. Закономерности изменения синаптоархитектоники сенсомоторной коры, вентролатерального таламуса и продолговатого мозга белых крыс в постишемическом периоде

Периодическая активация механизмов деструкции синапсов неизбежно сопровождается параллельной активацией механизмов новообразования и реорганизации сохранившихся синапсов, а интенсивность этих механизмов в ишемически измененном мозге значительно выше, чем в неповрежденном.

В отдаленном постишемическом периоде происходит существенная реорганизация межнейронных взаимоотношений всех изученных отделов мозга. По совокупности признаков (динамика изменения численной плотности и относительного содержания различных типов синаптических контактов в разных отделах мозга) максимально выраженные изменения синапто-архитектоники СМК мозга характерны для 3,7 сут, 1 и 5 мес, а подкорковых образований -3,7 сут и 5 мес постишемического периода (рис 2).

Рис 2 Кластерный анализ распределения экспериментальных групп по общей численной плотности межнейроиных синапсов мозга белых крыс в копт-роле (К), операционном контроле (ОК), через 3 и 7 сут, 1, 3, 5, 7 и 9 мес пости-шемического периода.

В постишемическом периоде во всех слоях СМ К мозга выявлялась явная тенденция к увеличению относительного содержания крупных и очень крупных контактов и уменьшению содержания мелких и средних контактов, то есть в синаптической популяции происходило смещение равновесия в сторону крупных контактов.

Особое внимание к крупным синаптическим контактам связано с тем, что в зоне этих контактов осуществляется более эффективное воздействие пресинаптического нейрона на постсинаптический (Кендел Э., 1980; Poirazi P., Mel B.W., 2001). Увеличение содержания крупных активных контактов является прямым следствием активации компенсаторно-восстановительных и репаративных механизмов головного мозга. Кроме того, в популяцию крупных контактов входят практически все перфорированные контакты, которым уделяется особое место при реализации различных типов синаптичес-кой пластичности (Geinisman Y., 1993; Geinisman Y. et al., 1996). Показано, что перфорированные синапсы могут быть промежуточным звеном образования автономных неперфорированных синапсов путем расщепления активно функционирующих гипертрофированных контактов (Kaech, S. et al., 2001; SegalM., 2001).

Исходя из положения о существовании равновесия между различными формами синаптических контактов (Семченко В.В. и др., 1995), можно констатировать, что наши данные свидетельствовали о выраженной пластической реорганизации межнейронных взаимоотношений по пути: гипертрофия расщепление образование простых, множественных перфорированных и более сложных синапсов с участием неосинаптогенеза и последующим увеличением плотности ДШ. После частичного или полного разделения пре-/постсинаптической части синапса инвагинированной мембраной дальнейшая гипертрофия синапса приводит к окончательному разделению и расхождению фрагментов контакта с образованием автономных шипиков, терминалей или даже мелких дендритных ветвей. Синапсы с большим количеством автономных активных зон являются наиболее эффективными (Edwards FA., 1995).

4. Дендриты как интегрирующая система нейронов головного мозга

При сопоставлении данных, полученных в процессе изучения дендроар-хитектоники нескольких отделов головного мозга белых крыс в постише-мическом периоде с помощью метода Гольджи, обращает на себя внимание значительная (от 50% до 80%) редукция показателей, характеризующих ДД (рис.3). Столь существенное сокращение объема дендритной территории пирамидных нейронов СМК, ВЛЯ таламуса и ретикулярной формации продолговатого мозга, выявленное нами при импрегнации по Гольджи, обусловлено, вероятно, сочетанием следующих факторов, так или иначе нарушающих процесс импрегнации серебром.

Во первых, необходимо учитывать изменения конформационного состояния и тинкториальных свойств субстрата импрегнации (филаменты цитоскелета) в процессе его ишемических обратимых и необратимыхиз-менений, которые могут привести к снижению степени импрегнации части мелких дистальных дендритов при сохранении их дендролеммы и

структура синапсов

Рис.3. Схема: А - редукция и восстановление апикальных и базальных денд-ритов пирамидных нейронов СМК мозга в постишемическом периоде. В -уменьшение и восстановление числа дендритных шипиков пирамидных нейронов СМК мозга в постишемическом периоде. С - гипертрофия и расщепление межнейро-иальных синапсов СМК мозга в постишемическом периоде.

прокраске проксимальных более толстых дендритов, что связано с избирательным сродством к солям серебра. Выявленная нами фрагментация прокраски дендритов в постишемическом периоде также свидетельствует о локальной дезорганизации цитоскелета. Следовательно, вполне возможно, что за счет Са2+-зависимых конформационных изменений цитоскелета дендритов в постишемическом периоде появляются нейроны с непрокрашенной при импрегнации серебром зоной дистальной ча-

сти ДД.

Во вторых, появление варикозных утолщений дендритов свидетельствует о связанных с этим изменениях ретрактильных свойств дендритов и, вероятно, о сокращении дендритов, лишенных синаптических контактов (Сотников О.С. и др., 1994).

В третьих, в постишемическом периоде, наряду с обратимой, имеет место также полная необратимая деструкция дистальных дендритов (включая дендролемму и цитоскелет) и связанных с ними многочисленных аксо-дендритических синапсов (Семченко В.В. и др., 1995; Jones Т.А., Schallert, 1992) Следовательно, нейроны в постишемическом периоде могут терять часть ДД, трансформировать его форму и размеры, длительно сохраняться и функционировать при частичной деструкции цитоскелета дистальных дендритов.

О возможности подобных механизмов «исчезновения» и «проявления» структуры цитоскелета в зоне патологических изменений дендрита свидетельствуют данные М. Matsumoto et al. (1987). Он выявил, что через 5 мин острой тотальной ишемии в возбуждающих синапсах и субсинапти-ческой цитоплазме дендрита параллельно гидропическим изменениям появляются признаки деполимеризации микротрубочек. Вышеназванные структурные изменения являются обратимыми и исчезают после возобновления микроциркуляции. Механизмы Са2+-зависимых конформаци-онных изменений актина, в результате которых его филаментозная форма переходит в глобулярную и обратно, лежат в основе биомеханических изменений дендритов и шипиков (Matus A., 2000). В результате реализации этих механизмов в ответ на раздражение или повреждение мозга возможны очень быстрые реактивные и приспособительные изменения формы и размеров дендритных ветвей 2-3-го порядка и шипиков (Edwards F.A., 1995). При этом известно, что пластические процессы в нейроне начинают реализовываться при внутриклеточной концентрации Са2+ более 180 нмоль, а при их концентрации более 600 нмоль включаются механизмы деструкции нейронов - некроз и апоптоз (Cormier R.J. et al., 2001). Следовательно, путем регуляции содержания несвязанного внутриклеточного Са2+ можно контролировать структурно-функциональное состояние дендритов.

Мы показали, что восстановление структурно-функциональной основы дендритов в постишемическом периоде возможно за счет: 1) восстановления структуры поврежденного цитоскелета у дендритов с сохраненной дендролеммой, 2) новообразования и роста дендритов на месте необратимо поврежденных отростков (деструкция цитоскелета и денд-ролеммы) с последующим восстановлением межнейронных связей, 3) новообразования и атипичного роста дендритов с последующим формированием совершенно иного ДД и образованием несвойственных для неповрежденного мозга межнейронных связей.

Возможность реализации в постишемическом периоде первых двух путей подтверждается нашими данными о полном восстановлении до контрольного уровня через 30 сут после ишемии всех параметров, характе-

ризующих дендритное дерево ПН слоя III CMK и ретикулярных нейронов ВЛЯ таламуса и продолговатого мозга. При этом такие показатели, как общая разветвленность клетки, разветвленность дендритов, удельная плотность длин дендритов в срезе, в постишемическом периоде, по сравнению с контролем, достоверно не изменяются. Это свидетельствует о том, что основная масса «доишемических дендритов» полностью повторяет контур «постишемических дендритов». Тем не менее, появление ПН с атипичным дендритным деревом, характерное в большей степени для слоя Ш СМ К, свидетельствует и о возможности реализации третьего пути восстановления дендроархитектоники - полной реорганизации ДД некоторых нейронов. Нейроны такого типа появляются при нарушениях процесса созревания головного мозга, различных дисплази-ях, микродисгенезии (Harding D.N. et al., 1991) и рассматриваются как морфологический субстрат функциональных нарушений при генетически обусловленной патологии мозга (Belichenko P.V. et al., 1994). Следовательно, накопление подобных нейронов в постишемическом периоде также может быть причиной дисфункции мозга и одним из механизмов постишемической энцефалопатии.

Повторная деструкция дендритов в постишемическом периоде и последующее восстановление дистальных дендритов отражает изменение концентрации свободных Са2+ в дендритах, происходит постоянно. В различные временные периоды и в различных отделах мозга эти процессы имеют свою специфику. Вполне вероятно, что в частично поврежденных нейронах, где имеется чувствительная и одновременно высокопластичная зона ДД (дистальные ветви), грубые нарушения ионного гомеос-таза, патологическая постишемическая деполяризация мембраны и нарушения дендротока вследствие повреждения цитоскелета, с одной стороны, становятся причиной снижения порога возбуждения, а с другой стороны - активации механизмов репаративной реорганизации ДД. Увеличение количества подобных нейронов неизбежно приводит к изменениям процессов временной и пространственной суммации афферентных импульсов. Поэтому эти нейроны могут быть структурной базой формирования патологических систем мозга в постишемическом периоде.

Наши данные свидетельствуют о том, что после тотальной 10-минутной ишемии головного мозга необратимым некробиотическим изменениям подвержены только некоторые наиболее чувствительные нейроны в СМК и ВЛЯ таламусе головного мозга. Остальные нейроны нормально функционируют или подвергаются апоптозу в более отдаленном периоде. Из трех представленных отделов мозга максимально страдает популяция нейронов СМК, меньше повреждаются ретикулярные нейроны ВЛЯ таламуса, а для гигантоклеточных нейронов продолговатого мозга характерно наличие только обратимых реактивных и дистрофических изменений. Таким образом, реорганизация дендроархитектоники ретикулярной формации продолговатого мозга происходит без уменьшения общей численной плотности нейронов в этом отделе мозга. Вероятно, последнее сказывается на конечном результате реорганизации нейронной

сети продолговатого мозга. В отличие от СМК и ВЛЯ таламуса, где в силу необходимости компенсации функции необратимо поврежденных нейронов неизбежна реорганизации нейронных сетей, в продолговатом мозге нейронная сеть в целом остается стабильной, меняется только ди-стальная зона ДД образующих ее ретикулярных нейронов, возможно также усиление или ослабление эффективности отдельных афферентных входов за счет периодической реорганизации межнейронных синапсов.

Вышеизложенные изменения приводят к нарушениям пространственной и временной суммации импульсов, латерального и возвратного торможения в структурно-функциональных модулях и коре мозга в целом. Меняется характер распределения возбужденных и заторможенных зон рецепторных полей СМК, а, следовательно, и характер восприятия тала-мо-кортикальной импульсации и формирования эфферентной импуль-сации проекционными нейронами коры. В результате выявленных нару- . шений межнейронных синаптических отношений в неокортексе страдает формирование моносенсорного (высшая функция конкретного анализатора) и полисенсорного образа (результат совокупной деятельности анализаторов).

Таким образом, в постишемическом периоде на всех этапах таламо-кортикальной реверберации импульсов происходит изменение характера передачи информации за счёт: 1) снижения числа каналов таламо-кортикальных проекций и усиления их эффективности, 2) уменьшения числа афферентных нейронов вторичного проекционно-ассоциативного комплекса для таламо-кортикальных проекций в большей степени, чем проекционных нейронов выхода СМК (первичный проекционный комплекс), 3) усиления временной суммации импульсов на сохранившихся нейронах за счет появления большого количества высокоэффективных синапсов, 4) снижения степени конвергенции элементов входа на выход СМК и одновременного с вышеназванным усилением пространственной суммации на отдельно взятых ПН (гипертрофированные нейроны с более крупным дендритным деревом) и временной суммации в эффективных синапсах всех нейронов.

Вероятно, деафферентация части ПН в остром постишемическом периоде приводит к компенсаторному усилению временной и пространственной суммации за счет более интенсивного использования сохранившихся нейронов и их дендритов. При этом афферентная нагрузка значительно смещается с дистальных ветвей на проксимальные, обладающие меньшим входным сопротивлением. Особенно наглядно последнее выражено в период максимальной деструкции мелких дендритных ветвей и шипиков (1-7 сут). Очевидно, что смещение афферентного входа нейронов в проксимальном направлении приводит к снижению порога восприятия афферентных импульсов, облегчению электротонического распространения возбуждающих постсинаптических потенциалов, формированию серийных потенциалов действия, гиперактивности и даже эпилептизации нейронов. Появление подобных патологически активных нейронов, по данным ПН. Крыжановского (1997), является структурной

основой формирования генераторов патологически усиленного возбуждения вообще и в системе «кора большого мозга О таламус» в частности, а из них - патологических неконтролируемых систем мозга.

Следующим уровнем контроля активности кортикальных нейронов является ретикулярная формация головного мозга. Известно, что в физиологических и патологических условиях интегративная анализирующая система любого анализатора тесно связана с неспецифической активирующей системой (ретикулярная формация, молекулярный слой коры). Обе системы взаимно тонизируют друг друга (Кратин Ю.Г., Сотниченко Т.С., 1987). Любой специфический для данной анализирующей системы раздражитель вызывает в них появление циклически распространяющегося возбуждения. Кроме того, в норме с возбуждения всегда начинается процесс торможения, который является его результатом и существует только наряду с ним. Их сложное взаимодействие лежит в основе анализа сигналов мозгом.

В постишемическом периоде это взаимодействие смещается в сторону снижения тормозной модулирующей функции в модуле. Это происходит в результате более значительного, чем крупных ПН, повреждения мелкоклеточного пула тормозных интернейронов, входящих в состав вторичного проекционно-ассоциативного нейронного комплекса.

Материальная основа формирования и распространения специфической таламо-кортикальной и неспецифической подкорково-корковой им-пульсации в постишемическом периоде различна. Анализирующая специфическая система страдает в большей степени, чем активирующая неспецифическая система мозга (мезенцефальная, таламическая ретикулярная формация, молекулярный слой коры). Возникает дисбаланс возможности активирующих и анализирующих систем мозга, что приводит к большему истощению информационной емкости и пластических потенций специфических таламо-кортикальных систем.

Мы полагаем, что все это является структурной базой формирования постишемических дисфункций мозга, а степень выраженности структурных изменений определяет характер конкретной патологии (неврастенические проявления, эпилептизация мозга, нарушения интеллектуаль-но-мнестических функций).

5. Иммуногистохимическая характеристика нейронов и дендритов в норме и в постишемическом периоде

Использованный в эксперименте подход к получению информации необходимо дополнить изучением закономерностей морфологических изменений головного мозга человека в постишемическом периоде. Поэтому нами изучен аутопсийный материал (различные зоны неокортекса), полученный на вскрытии больных, умерших через 7, 90 сут и 1 год после клинической смерти. При анализе этого материала акцент был сделан на изучение состояния опорно-двигательной (цитоскелет), рецепторно-барьерно-транспортной систем (мембрана, синаптические контакты), белков, обеспечивающих регуляцию внутриклеточного ионного гомеос-

таза, а также систем хранения, воспроизведения, реализации генетической информации (ядро) и синтеза биополимеров нейрона.

Активация сохранившихся нейронов сопровождалась усилением экспрессии белка NeuN, который, по литературным данным, можно рассматривать как маркер активации биосинтетических процессов в нейроне (Komitova M. et al., 2002; Takasawa К. et al., 2002). В зависимости от отдела неокортекса численная плотность активированных нейронов увеличивалась от 17,1% до 72,9% (р<0,05). При этом существенно то, что в остром периоде (7 сут) активировались нейроны мелкоклеточных про-екционно-ассоциативных комплексов (слои II-III), а через 90 сут подобных нейронов было больше в крупноклеточных проекционных нейронных комплексах. Через 1 год после ишемии только в слоях Н-Ш височной коры содержание активированных нейронов снижалось до контрольного уровня. Все это свидетельствует о том, что постишемическая реорганизация нейронных сетей коры большого мозга человека происходит на фоне прогрессирующего снижения общей численной плотности нейронов и значительной активации сохранившихся нейронов.

Прогрессирующее уменьшение общей численной плотности нейронов в различных отделах неокортекса было подтверждено также данными иммуногистохимического изучения белка МАР-2. Дефицит нейронов в разных отделах коры, по данным этого метода, составил от 30,4% до 66,3% (р<0,05). Кроме того, распределение МАР-2 по нейрону свидетельствовало о том, что в значительной части сохранившихся нейронов цитоскелет дистальных дендритов подвергался деструктивным изменениям. Особенно страдали вторичные и третичные дендриты пирамидных нейронов слоев П-Ш. Это подтверждает данные нашего экспериментального исследования о более высокой чувствительности дисталь-ной зоны дендритного дерева мелких и крупных пирамидных нейронов неокортекса. То есть информация, полученная с помощью метода Гольд-жи, соответствует данным иммуногистохимического исследования ассоциированного с микротрубочками цитоскелетного белка МАР-2. Как и в эксперименте, деструкция элементов опорно-двигательного аппарата дендритов нейронов мозга человека приводит к изменению их формы. Дендриты укорачиваются, утолщаются, теряют шипики, приобретают форму «ожерелья» за счет образования варикозных утолщений. По внешним очертаниям все это напоминает поврежденные дендриты, верифицированные с помощью метода Гольджи. Вполне вероятно, что именно конформационное состояние МАР-2 определяет характер прокраски дендритного дерева при импрегнационом методе Гольджи. При ишемии и в постишемическом периоде конформация МАР-2 и прочность его связи с тубулином микротрубочек очень быстро изменяются, что позволяет использовать его в качестве чувствительного маркера структурно-функционального состояния дендритного цитоскелета (Ikeda Т. et al., 1999; Рора-Wagner A. et al., 1999).

Факты, подтверждающие значительную реорганизацию межнейронных взаимоотношений в неокортексе человека, получены нами при им-

муногистохимическом изучении распределения белка синаптофизина (Р-38), который принимает участие в Са2+-зависимом связывании синапти-ческих пузырьков с мембраной активной зоны синапса и образовании трансмембранной поры при экзоцитозе (Masliah E., Terry R., 1993). То есть, синаптофизин можно рассматривать как маркер активных (с экзо-цитозом) синапсов.

В остром периоде (7 сут) содержание синаптофизин-позитивных синапсов уменьшалось во всех отделах на 20-35% (р<0,05), что свидетельствовало об уменьшении каналов передачи информации. Через 90 сут дефицит синаптофизин-позитивных синапсов отмечался только в моторной коре, а в других отделах неокортекса, несмотря на повреждение дендритов и нейронов, происходило восстановление общей численной плотности синапсов до контрольного уровня. Это свидетельствовало о том, что восстановление синаптического пула происходило за счет активно функционирующих нейронов. Через 1 год после перенесенной клинической смерти резервные возможности нейронов неокортекса при их прогрессирующем выпадении, вероятно, снижаются, и это приводит к повторному дефициту общей численной плотности межнейронных контактов на 20-38% (р<0,05).

Существенно то, что в постишемическом периоде менялся характер распределения и форма синаптофизин-позитивных структур - появлялись крупные конгломераты иммунореактивных структур. Мы полагаем, что это документирует образование высокоэффективных каналов передачи информации за счет гипертрофии и реорганизации сохранившихся активно функционирующих синапсов. Возможность реализации подобных механизмов в постишемическом периоде с образованием усложненных синаптических структур доказана в эксперименте на животных (Сем-ченкоВ.В. и др., 2000).

Вышеназванные изменения синапсов, свидетельствующие об их реорганизации, максимально реализовались через 90 сут после ишемии и происходили на фоне выраженного дефицита общей численной плотности нейронов, но при контрольном уровне численной плотности GAP-43-позитивных нейронов. Это свидетельствовало о более интенсивной экспрессии образования GAP-43 в популяции сохранившихся нейронов и о поддержании активности механизмов нейропластичности на уровне, достаточном для восстановления межнейронных взаимоотношений при общем дефиците нейронов в постишемическом периоде. Наиболее интенсивно GAP-43 экспрессировался в нейронах лобной коры. Фактор роста-43 (GAP-43) - нейромодулин - считается маркером роста аксонов и дендритов, выявляется на мембранах растущих отростков нейрона и синапсов (BenowitzL.I., Perrone-Bizzozero N.I., 1991).

Компенсаторная активация механизмов экспрессии белков в пости-шемическом периоде приводит к тому, что увеличивается содержание нейропептид Y-позитивных нейронов (в различных отделах на 38,6-73,1% (р<0,05), значительную часть из которых можно было идентифицировать как интернейроны. При этом отмечается активация экспрессии этого

пептида в нейронах, которые в норме его не синтезируют, увеличиваются размеры и плотность нейропептид Y-иммунореактивных волокон. Вероятно, это свидетельствует о компенсаторной смене нейромедиатор-ного профиля части нейронов в постишемическом периоде.

Подобные изменения существенно влияют на соотношение процессов возбуждения и торможения в неокортексе, так как нейропептид Y-им-мунореактивные нейроны являются преимущественно GABA-эргически-ми тормозными интер нейронами (Freund T. et al., 1988).

Таким образом, нами подтверждена возможность компенсаторной активации нейронов тормозной системы коры большого мозга. С одной стороны, это можно рассматривать как саногенетический механизм, препятствующий образованию возбуждающих патологических систем головного мозга. Однако, с другой стороны, чрезмерная активация тормозной нейронной сети может способствовать формированию тормозных патологических систем головного мозга и развитию депрессивных состояний (Крыжановский Г.Н., 1997).

Еще одним саногенетическим механизмом, существование которого удалось показать с помощью иммуногистохимических методов в пости-шемическим периоде, является механизм регуляции концентрации внутриклеточного Са2+ путем экспрессии кальций-связывающего белка каль-биндина. Этот белок является буфером Са2+ и обладает нейропротектив-ным действием при ишемии (Choi D.W., 1995; Yenari M.A. et al., 2001).

Данные нашего исследования свидетельствуют о преимущественной редукции численной плотности кальбиндин-содержащих нейронов в первые 7 сут после ишемии, а кальбиндин-несодержащих нейронов - в более отдаленном периоде. Это говорит о том, что кальбиндин-содержа-щие нейроны значительно лучше сохраняются на фоне хронических нарушений микроциркуляции отдаленного периода. Вполне вероятно, что длительная острая ишемия приводит к более значительному увеличению внутриклеточного содержания свободных ионов Са2+ именно в кальбин-дин-содержащих нейронах за счет высвобождения связанного Са2+ из буфера, что способствует усилению некротических процессов и гибели этих клеток в остром периоде. Поэтому мы полагаем, что нейропротек-торное действие кальбиндина более полно реализуется в позднем по-стишемическом периоде, когда некробиотические процессы сменяются дистрофическими и преобладают Са2+-зависимые механизмы апоптоза.

Таким образом, данные исследования коры большого мозга человека в постишемическом периоде свидетельствуют о выраженной реорганизации межнейронных отношений, которая происходит на фоне изменения состояния всех систем жизнеобеспечения. Большинство нейронов переходит на более интенсивный уровень функционирования. При этом активируются механизмы репаративной нейропластичности. В совокупности все это приводит к изменениям опорно-двигательной, рецептор-но-барьерно-транспортной систем, системы синтеза биополимеров, хранения, воспроизведения и реализации генетической информации и белков, обеспечивающих регуляцию внутриклеточного ионного гомеостаза.

Структурными эквивалентами вышеназванных изменений является изменение формы и размеров межнейронных синапсов, дистальных дендритных ветвей. Активация и гипертрофия возбуждающих синапсов на дистальных дендритах сопровождается компенсаторной активацией тормозных интернейронов.

ВЫВОДЫ

1. После кратковременной (10 мин) остановки системного кровотока в течение длительного времени (9 мес) происходит значительная реорганизация дендроархитектоники пирамидных нейронов СМК мозга, ретикулярных нейронов ВЛЯ таламуса и гигантоклеточных нейронов продолговатого мозга. Процесс реорганизации осуществляется на фоне прогрессирующей гибели нейронов, имеет фазный характер - периоды преобладания механизмов деструкции дендритов сменяются периодами преобладания механизмов репаративной нейропластичности.

2. В процессе реорганизации дендроархитектоники изменяется пространственная организация дендритов, состояние его опорно-двигательной (цитоскелет), рецепторно-барьерно-транспортной систем (мембрана, синаптические контакты), белков обеспечивающих регуляцию внутриклеточного ионного гомеостаза, а также систем хранения, воспроизведения, реализации генетической информации (ядро) и синтеза биополимеров нейрона.

3. В эксперименте на белых крысах показано, что критическими периодами для всех изученных отделов головного мозга являются первые 7 сут, 1, 3 и 5 мес после ишемии. В эти периоды дефицит общей численной плотности синапсов составляет от 23,5 до 47,1%. При этом объем Территории поврежденных дендритов части нейронов достигает 80%. Плотность ДШ в различных отделах ДД пирамидных нейронов снижается на 30-47%. Деструкции подвергаются преимущественно терминальные веточки дендритов 2-го и 3-го порядка. Степень редукции численной плотности ДШ на дистальных дендритах составляет 42,9%, а на проксимальных - 18,8%. Максимальная деструкция дендритов и синапсов характерна для СМК мозга.

4. Различные отделы ДД пирамидных нейронов (апикальные прямые, косые, базальные) СМК отличаются разной чувствительностью к ишемическому воздействию и степенью постишемической репаратив-ной реорганизации дендритов и их синапсов. Наиболее чувствительными являются апикальные косые дендриты ПН на уровне слоев Ш-]У. На этом уровне уже в раннем периоде после ишемии восстановление численной плотности ДШ происходит за счет реорганизации шипиков неповрежденных проксимальных отделов ДД. В отдаленном периоде восстановление косых апикальных дендритов сопровождается увеличением количества ДШ, а для других типов дендритов подобной зависимости не выявлено. Через 5 мес после ишемии на фоне роста мелких прямых апикальных и базальных дендритов отмечается даже повторная волна редукции значительной части ДШ.

5. Характерной особенностью терминальных ветвей ДД пирамидных нейронов СМК мозга является то, что после повторного повреждения (5 мес) последующего полного восстановления численной плотности ДШ на них не происходит даже через 9 мес после ишемии. Компенсация потери осуществляется за счет более крупных проксимальных денд-ритов. Все это свидетельствует о смещении афферентного входа ПН в проксимальном направлении и неизбежном изменении пространственной суммации импульсов на этих нейронах.

6. Структурно-функциональное восстановление ДД пирамидных и непирамидных нейронов происходит в постишемическом периоде за счет: восстановления структуры обратимо поврежденных дендритов-особенно это характерно для дендритов с частично поврежденным цитоскелетом, но сохранной цитолеммой; новообразования и роста дендритов на месте необратимо поврежденных отростков; новообразования и атипичного роста дендритов с последующим формированием нетипичного ДД и образованием несвойственных для неповрежденного мозга псевдобиполярных, "динозавро-подобных" нейронов и нейронов с загнутым апикальным дендритом. Появление подобных нейронов с нетипичным ДД существенно изменяет пространственную организацию нейронных сетей изученных отделов головного мозга и наряду с частично поврежденными нейронами может быть структурной основой нарушения интегративно-пусковой деятельности головного мозга в постишемическом периоде.

7. В процессе реорганизации дендроархитектоники ПН слоя Ш СМК мозга после восстановления в первые 3 мес параметров ДД основной массы сохранившихся нейронов характерна повторная деструкция денд-ритов через 5 мес после ишемии с последующей активацией вышеназванных репаративных механизмов. Для крупных ПН слоя V такая особенность не характерна. Следовательно, в отдаленном постишемичес-ком периоде повторные деструктивные процессы в большей степени характерны для апикальных дендритов мелких ПН слоя III СМК, а пластическая реорганизация - для крупных ПН слоя V.

8. О возможности восстановления в постишемическом периоде пространственной организации ДД всех типов изученных нейронов за счет активации процессов образования новых вторичных и третичных денд-ритов, роста дендритов в длину и их ветвления свидетельствуют данные о статистически значимом увеличении показателей таких параметров, как число свободных концов у всех дендритов, общая разветвленность клетки, разветвленность дендритов, общая длина дендритов во всей дендритной территории и максимальный радиус апикальных и базальных полей. В совокупности это приводит к тому, что через 1-3 мес объем дендритной территории основной массы обратимо поврежденных нейронов восстанавливается до контрольного значения, а в некоторых нейронах даже превосходит его.

9. Репаративная реорганизация дендритов в постишемическом периоде сопровождается активацией механизмов синаптической пластичности, что структурно проявляется функциональной активацией синап-

са, гиперплазией субсинаптических структурных компонентов, гипертрофией сохранившихся неповрежденных и созреванием вновь образованных межнейронных синапсов. Компенсаторная длительная активация функционально зрелых синапсов сопровождается увеличением диаметра их контакта, образованием различных перфорированных синапсов и более сложных синаптических устройств. Это способствует существенному изменению эффективности активных синаптических входов и характера временной суммацию импульсов. Следовательно, параллельно изменениям пространственной суммации, зависимой от особенностей объемной организации ДД, в постишемическом периоде имеют место изменения временной суммации импульсов на уровне синапсов. В совокупности это оказывает влияние на интегративно-пусковую деятельность головного мозга и может быть структурной базой как восстановления функциональных систем мозга, так и образования патологических систем. Вышеназванные механизмы синаптической пластичности реализуются во всех изученных отделах головного мозга, но степень их выраженности статистически значимо выше в СМК мозга.

10. Неравномерное изменение цито-, дендро- и синаптоархитектони-ки различных ПН слоев СМК и подкорковых отделов в течение 9 мес после ишемии приводит к тому, что восприятие специфической сомато-сенсорной информации происходит в условиях значительного дефицита таламо-кортикальных проекций (слои Ш-ГУ) В результате более интенсивного разрастания проекций неспецифических систем изменяется соотношение площади рецепторной поверхности нейронов, воспринимающей специфическую (слои Ш-ГУ) и неспецифическую информацию (слой Г, У-УГ). Это изменяет корково-подкорковые взаимоотношения и усиливает неспецифическую активацию нейронов неокортекса.

11. По данным иммуногистохимического исследования коры большого мозга человека, в постишемическом периоде (7 сут, 3 и 12 мес) происходит прогрессивное уменьшение общей численной плотности МАР-2 иммунопозитивных нейронов (30,4-66,3%). Это подтверждает данные экспериментального исследования о деструкции значительной части нейронов коры и более высокой чувствительности дистальной зоны ДД мелких и крупных ПН мозга.

12. Изменения на уровне синапсов у человека в постишемическом периоде проявляются изменением численной плотности (на 20-38%) и увеличением размеров конгломератов иммунореактивных структур синап-тофизина, что свидетельствует об увеличении размеров синаптических терминалей Максимальные изменения по этому показателю характерны для слоев ГГ-1П лобной и височной коры большого мозга. Восстановление неврологического статуса у пациентов после реанимационных мероприятий коррелирует с восстановлением численной плотности и распределения Р-38 иммунопозитивных структур. В пользу активации механизмов синаптической пластичности в отдаленном постишемичес-ком периоде свидетельствуют данные об усилении образования вЛР-43 в сохранившихся нейронах до уровня, достаточного для активации меха-

низмов нейропластичности и восстановления межнейронных взаимоотношений.

13. В постишемическом периоде в различных отделах коры большого мозга на 61,6-71,3% увеличивается содержание нейропептид Y-позитив-ных нейронов, что свидетельствует об изменении соотношения активности тормозных и возбуждающих систем коры в сторону компенсаторной активации тормозных интернейронов. Подобные изменения, являясь естественными сапогенетическими механизмами, способствуют блокированию электротонического распространения возбуждающих пост-синаптических потенциалов с дендрита на тело нейрона, препятствуют распространению возбуждения по коре большого мозга.

14. Репаративные изменения опорно-двигательной и рецепторно-ба-рьерно-транспортной систем дендритов сопровождаются адекватными изменениями активности систем, обеспечивающих регуляцию внутриклеточного ионного гомеостаза, хранения, воспроизведения, реализации генетической информации и синтеза биополимеров нейрона. Так, ней-ропротекторное действие кальбиндина более полно реализуется в позднем постишемическом периоде, когда некробиотические процессы сменяются дистрофическими. О компенсаторной активации биосинтетических процессов в постишемическом периоде свидетельствует увеличение численной плотности NeuN-позитивных нейронов различных отделов коры мозга человека на 14,4-72,9%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При вскрытии трупов лиц перенесших клиническую смерть следует подвергать исследованию различные отделы головного мозга (кору большого мозга, таламус и продолговатый мозг).

2. При исследовании вышеназванных отделов мозга необходимо обращать внимание на формирование нетипичного дендритного дерева и образование несвойственных для неповрежденного мозга псевдобиполярных, "динозавро-подобных" нейронов и нейронов с загнутым апикальным дендритом.

3. Минимальным объемом при изучении мозга лиц, переживших клиническую смерть, следует считать: использование метода Ниссля, импрегнации по Гольджи, электронной микроскопии и методов им-муногистохимии (МАР-2, синаптофизин, GAP-43, NPY, NeuN, кал-биндин и GFAP).

14>с мламоимьмлл ММИОТККА

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Компенсаторно-приспособительные изменения нейронов неокортек-са человека при ишемии головного мозга по данным стереологи-ческого анализа / В.А Акулинин, В.В. Семченко, А.Ю. Савченко. Н.Г. Аржаева, Л. С. Беляева // Структурные основы и регуляция компенсаторно-приспособительных реакций: сб. науч. тр. / Омский мед, ин-т. - Омск, 1986. - С. 21-25

2. Семченко В.В. Ультраструктура цитоскелета дендритов нейронов коры большого мозга крыс в постишемическом периоде / В.В. Семченко, С.С. Степанов, ВА Акулинин // Гипотермия и реанимация при острой кровопотери и операциях на сердце : сб. науч. тр. / Омский мед. ин-т. - Омск, 1988. - С. 56-58.

3. Акулинин В.А Ультраструктура микротрубочек дендритов корковых нейронов в постишемическом периоде / В А Акулинин // Повреждение мембран и постреанимационная патология : материалы меж-вуз. науч. конф., Омск, 5 апр. 1988 г. - Омск, 1988. - С. 5 - 7. -Библиогр. : 3 назв. - Деп. в ВИНИТИ 5.04.88. № 4534.

4. Структурные механизмы нарушения интегративно-пусковой деятельности мозга в постишемическом периоде / С.С. Степанов, В.В. Семченко, В.А. Акулинин, А.Э. Никель // Патологическая физиология

• терминальных состояний : сб. науч. тр. / Омский мед. ин-т. - Омск, 1989.-С. 99-115.

5. Акулинин В.А. Пластичность дендритных шипиков пирамидных нейронов слоя V сенсомоторной коры мозга крыс в постишемическом периоде / В.А. Акулинин, В.В. Семченко, П.В. Беличенко // Пластичность нервной системы : сб. науч. тр. НИИ Мозга АМН ВНЦПЗ СССР. -М., 1989. - С. 133-134.

6. Акулинин В.А. Морфологические особенности реакции пирамидных нейронов слоя V сенсомоторной коры мозга крыс в восстановительном периоде после кратковременной тотальной ишемии / В.А. Акулинин, П.В. Беличенко // Структурное обеспечение и стимуляция компенсаторно-восстановительных реакций : сб. науч. тр. / Омский мед. ин-т. - Омск, 1989. - С. 8-9.

7. Акулинин В.А Структурные изменения гигантоклеточных нейронов ствола мозга крыс в постишемическом периоде / В.А Акулини, П.В. Беличенко, Г.И. Корзухина // Структурное обеспечение и стимуляция компенсаторно-восстановительных реакций : сб. науч. тр. / Омский мед. ин-т. - Омск, 1989. - С. 12-13.

8. Акулинин В.А. Структурная характеристика дендритного дерева пирамидных нейронов слоя V сенсомоторной коры в постишемическом периоде / В.А. Акулинин // Клеточно-тканевые механизмы адаптации к действию повреждающих факторов : сб. науч. тр. / Омский

9. Михель Г.В. Морфометрическое исследование синапсов молекулярного слоя коры большого мозга в постишемическом периоде / Г.В. Михель, В.А. Акулинин, Л.М. Серегина // Клеточно—тканевые механизмы адаптации к действию поврехдающих факторов : сб. науч. тр. / Омский мед. ин-т. - Омск, 1990. - С. 8-10.

10. Семченко В.В. Структурная организация локальных и системных межнейронных отношений в головном мозге в постреанимационном периоде / В.В. Семченко, С.С. Степанов, В.А. Акулинин // Макро и микроуровни организации мозга: сб. науч. тр. НИИ Мозга АМН СССР. -М., 1990.-С. 148-150.

11. Акулинин В.А. Пластичность дендритов головного мозга крыс в постишемическом периоде / В.А. Акулинин, А.Э. Никель // Многоуровневая организация церебральных функций: тез. докл. Всесоюз. конф. молод, ученых НИИ Мозга АМН СССР. - М., 1991.- 4с.

12. Акулинин В.А. Структурный анализ реактивности дендритного дерева нервных клеток двигательных центров головного мозга в восстановительном периоде после кратковременной тотальной ишемии организма / В.А. Акулинин // Нарушение механизмов регуляции при экстремальных и терминальных состояниях : сб. науч. тр. / Омский мед. ин-т. - Омск, 1991. - С. 37-43.

13. Структурные механизмы нарушения и восстановления интегратив-ной деятельности мозга в постреанимационном периоде / Семченко В.В., Степанов С.С, Акулинин В.А., Никель А.Э. // ЦНС и постреанимационная патология организма : материалы междунар. симпоз. АМН СССР Москва. 14-16 марта 1989. -М, 1991. -С. 47-57.

14. Акулинин В.А. Ранние структурные изменения реактивности нейронов сенсомоторнои коры мозга крыс в постишемическом периоде / В.А. Акулинин, П.В. Беличенко, Г.И. Корзухина // Медицинские аспекты изучения организма в норме и патологии : сб. науч. тр. / Омский мед. ин-т. - Омск, 1992. - С. 6-7.

15. Патогенез и профилактика судорожных пароксизмов в постреанимационном периоде / Семченко В.В., Ерениев СИ., Маковецкий К.К., Степанов С.С, Никель А.Э., Акулинин В.А. // Реабилитация коматозных и посткоматозных больных : материалы науч. практич. конф. НИИ общей реаниматологии РАМН, Москва, 15-17 декабря 1992. -М., 1992.-С61-63.

16. Структурные механизмы повышения судорожной готовности головного мозга белых крыс в постишемическом периоде / В.В. Семчен-ко, С.С Степанов, В.А. Акулинин, А.Э. Никель, СИ. Ерениев, П.В. Беличенко // Морфология. - 1992. -Т. 103, N 7-8. - С. 66-75.

17. Профилактика внутриутробной гипоксии: структурные изменения нейронов развивающегося мозга плодов и новорожденных / В.А. Аку-линин, A.M. Кочетов, В.Н. Стольный, Г.И. Корзухина // Вопросы диагностики, профилактики и реабилитации в работе врача-клинициста : сб. науч. тр. / Омский мед. ин-т. - Омск, 1993. - С. 8-9.

18. Акулинин В.А Структурные особенности трех функционально различных классов нейронов мозга крысы в постишемическом периоде / В.А Акулинин, Г.И. Корзухина // Структурно-функциональные механизмы патологических и компенсаторно-восстановительнык реакций : сб. науч. тр. / Омский мед. ин-т. - Омск, 1993. - С. 3-5.

19. Акулинин В.А Пластичность дендритов пирамидных нейронов слоя V сенсомоторной коры крыс в постишемическом периоде / В .А. Акулинин, В. В. Семченко, П.В. Беличенко // Бюлл. эксперим. биолог, и медицины. - 1993. - №7. - С. 94-96.

20. Структурные изменения дендритов развивающегося мозга человека при гипоксических состояниях / В.А Акулинин, В.В. Семченко, A.M. Кочетов, В.Н. Стольный// Морфология. - 1993, - Т. 104, №7-8. -17с.

21. Структурные механизмы эпилептизации мозга в постреанимационном периоде / Семченко В.В, Степанов С.С., Акулинин ВА, Никель А.Э., Ерениев СИ., Маковецкий К.К., Сергеева Е.Д. // Актуальные проблемы и перспективы развития современной реаниматологии : материалы междунар. симпоз. НИИ общей реаниматологии РАМН, 16-18 марта 1994. - М., 1994. - С.61-63.

22. Акулинин В.А. Трехмерная геометрия нейронов в неокртексе мозга человека в норме и при ишемии / В.А. Акулинин // Актуальные проблемы неотложных состояний : сб. науч. тр. / Омский мед. ин-т. -Омск, 1995.-С. 15-17.

23. Акулинин В.А. Влияние изоптина на динамику восстановления неврологического статуса у крыс в постреанимационном периоде / В.А. Акулинин, А.Э. Никель // Актуальные проблемы неотложных состояний : сб. науч. тр. / Омский мед. ин-т. - Омск, 1995. - С. 17-18.

24. Akulinin V.A. Three-dimensional geometry of the pyramidal neurons of human neocortex during the ischemia / VA Akulinin, VV. Semchenko, S.S. Stepanov // New Research in Neurology. The 4-th Russian-Sweden Simposium. - (20-22 May, 1996, Moskow, Russia) Brain Res Inst, 1996.-10р.

25. Пластичность межнейронных отношений в ЦНС при экстремальных воздействиях/В.В. Семченко, С.С. Степанов, СИ. Ерениев, Е.Д. Сергеева, И.И. Таскаев, В.А Акулинин, А.К. Десятниченко, С.Н. Воло-сатов // Ш Конгресс международной ассоциации морфологов : тез. докл. -М. - Т. 109, №2. -1996. -89с.

26. Semchenko V.V. Structural basis ofinformation capacity changes ofsensory-motor cerebral cortex of rat brain during post-iesuscitation period / V.V. Semchenko, S.S. Stepanov, VA Akulinin // Resuscitation. - 1996. - Vol. 31.-P. 151-158.

27. Структурные основы реорганизации межнейрональных взаимоотношений в мозге млекопитающих / Семченко В.В, Степанов С.С, Де-сятниченкоА.К., Акулинин В.А // Колосовские чтения : тез. докл. 3 междунар. конфер. стран СНГ по функциональной нейроморфоло-гии НИИ физиологии им. И.П.Павлова РАН, 7-8 апреля, 1997. - СПб., 1997.-С. 81-82.

28. Dendritic changes of the pyramidal neurons in layer V of sensory-motor cortex of the rat biain during the postresuscitation period / VA. Akulinin, S.S. Stepanov, V.V. Semchenko, P.V. Belichenko // Resuscitation. - 1997. -Vol. 35.-P. 157-164.

29. Akulinin V.A. The cellular distribution of GAP-43 immunoreactivity in human neocortical areas using immunofluorescence and confocal microscopy: post-ischemic influence / V.A, Akulinin, P.V. Belichenko, A. Dahlstrom // Brain Res. - 1998. - Vol. 784. - P. 341-346.

30. Akulinin V.A. Dendritic changes ofthe pyramidal neurons ofsensory-motor cortex of the rat brain during the postresuscitation period / V.A. Akulinin, V.V. Semchenko, P.V. Belichenko // Resuscitation. - 1998. - Vol. 37, № 2. -S 11.

31. Akulinin V.A. Quantitative analysis of synaptophysin immunoreactivity in human neocortex after cardiac arrest: confocal laser scanning microscopy study / V.A. Akulinin, P.V. Belichenko, A. Dahlstrom // Resuscitation. -1998.-Vol. 39.-P. 207-213.

32. An ultrastmctural study into the effect ofglobal transient cerebral ischaemia on the synaptic population of the cerebellar cortex in rats / S.S. Stepanov, E.D. Sergeyeva, V.V. Semchenko, V.A. Akulinin// Resuscitation. -1998. -Vol. 39.-P. 99-106.

33. Акулинин В.А. Дендритные изменения пирамидных нейронов сен-сомоторной коры мозга крыс в отдаленном постреанимационном периоде / В.А. Акулинин, В.В. Семченко, П.В. Беличенко // Морфологические науки практике здравоохранения и ветеринарии: сб. науч. тр. / Омский мед. ин-т. - Омск, 1999. - С. 8-9.

34. Постишемическая реорганизация дендроархитектоники сектора САЗ гиппокампа белых крыс с высокой судорожной готовностью мозга /

B.В. Семченко, С.С. Степанов, А.Э. Никель, В.А. Акулинин // Морфология. -2000. - Т. 118, №6. - С. 25-30.

35. Общие закономерности пластичности синапсов мозга млекопитающих / В.В. Семченко, С.С. Степанов, СИ. Ерениев, В.А. Акулинин,

C.Н. Волосатое, А.К. Десятниченко, А.С. Хижняк // Новое в изучении пластичности мозга : тез. докл. НИИ Мозга МЗ РФ. - М., 2000. -81с.

36. Влияние трансплантации эмбриональной нервной ткани на реорганизацию межнейрональных взаимоотношений после механического повреждения сенсомоторной коры большого мозга / СИ. Ерениев, В.А. Акулини, С.С. Степанов, В.В. Семченко, П.В. Беличенко // Бюлл. эксперим. биолог, и медицины, - 2001. - Т. 131, №3. - С. 263267.

37. Акулинин В.А. Дендритная геометрия пирамидных нейронов слоев П-Ш и V-VI сенсомоторной коры крыс в отдаленном постишемичес-ком периоде / В.А. Акулинин, В.В. Семченко // Организация и пластичность коры больших полушарий головного мозга: тез. докл. НИИ Мозга МЗ РФ. - М., 2001. -4с.

38. Post-ischemic leoigamzation ofthe dendroaichitectonics of field CA3 of the hippocampus ofwhite rats with high levels of convulsive readiness of the brain / V.V, Semchenko, S.S. Stepanov, A.E. Nikel, V.A. Akulmin // Neurosci. Behav. Physiol. -2001. - V.31, №6. - P. 617-622.

39. Структурные изменения дендритных шипиков пирамидных нейронов слоя Ш сенсомоторной коры большого мозга крыс в отдаленном постишемическом периоде / В.А. Акулинин, В.В. Семченко, С.С. Степанов, П.В. Беличеико // Морфология. - 2002. - Т. 122, №5. - С. 3944.

40. Akulinin V.A. Changes of the pyramidal and non-pyramidal neurons of neocortex of the human brain during a remote postischemic period /VA. Akulinin, A. Dahlstrom // The Social Brain. Abstracts. Inaugural Conference 24-27 April 2002, Bibliotheca Alexandrina, Egypt, 2002. -21p.

41. Akulinin V.A. Quantitative analysis ofMAP-2 immunoreactivity in human neocortex of three patients surviving after brain ischemic /V.A. Akulinin, A. Dahlstrom. //Neurochem. Res. -2003. -V.28, №2. - P. 373-378.

42. Akulinin V.A. Plastic changes of the neurons of neocortex of the human brain during postischemic period / V.A. Akulinin, A. DahlstromA. // The Social Brain. Abstracts. Conference 25-27 March 2003, Goteborg University, Sweden, 2003. - 26p.

43. Акулинин В.А. Пластичность нейронов неокортекса человека в отдаленном постишемическом периоде (иммуногистохимическое исследование) / В.А. Акулинин, А. Дальстрем // Омский научный вестник. -2004. - Т.26, №1. - С. 39-42.

44. Structural changes in the dendritic spines ofpyramidal neurons in layer III of the sensorimotor cortex of the rat cerebral cortex in the late post-ischemic period / VA. Akulinin, V.V. Semchenko, S.S. Stepanov, P.V Belichenko // Neurosci. Behav. Physiol. - 2004. -Vol.34, №3. - P.221 -227.

На правах рукописи

Акулинин Виктор Александрович

ЗАКОНОМЕРНОСТИ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕОРГАНИЗАЦИИ ДЕНДРИТОВ НЕРВНЫХ КЛЕТОК ГОЛОВНОГО МОЗГА В ПОСТИШЕМИЧЕСКОМ ПЕРИОДЕ

14 00 15 - патологическая анатомия 03 00 25 - гистология, цитология и клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

0мск-2004

Лицензия ЛР№ 020845

Подписано в печать 22 11 04 Формаг 60x84/16 Бумага офсетная П.л.-2,0 Способ печати - оперативный Тираж 100

Издательско-поли графический центр ОмГМА 6440991 ()мск,ул Ленина,12 тел. 23-05-98

1262 60

Актуальность исследования. Дендриты, специализированные для восприятия афферентной импульсации отростки нейронов, посредством химических синапсов обеспечивающие межнейронные взаимоотношения в центральной нервной системе млекопитающих [Сотников О.С. и др., 1994; Calverley R.K.S., Jones D.G., 1990; Matus А., 2000; Kaech S. et al., 2001; Segal M., 2001; Sheng M., 2001]. Они осуществляют пространственную и временную суммацию афферентных импульсов, регулируют электротоническое распространение постсинаптических потенциалов к триггерным зонам нейрона [Шеперд Г., 1987]. Названные функции опосредуются комплексом механизмов, реализация которых затрагивает практически все уровни структурно-функциональной организации дендритов [Sheng М., 2001 Toni N. et al., 2001; Jourdain P. et al., 2003].

Показано, что любые физиологические и патологические влияния на мозг проявляются структурными изменениями синаптических контактов, пре- и постсинаптической зон (форма и размеры терминали, шипиков), дистальных отделов дендритного дерева, цитоскелета дендритов. Структурный гомеостаз на уровне дендритных отростков нейронов поддерживается посредством постоянной реализации механизмов деструкции и образования новых контактов, их созревания, активации, трансформации активно функционирующих синапсов в гипертрофированные с последующей их реорганизацией в более сложные синаптические устройства, а также гиперплазии структурных компонентов дендрита и его роста [Jones D.G., Harris R.J., 1995; Edwards F.A., 1995; Kolodziej S.J. et al., 2000; Matus A., 2000; Geinisman, Y. et al., 2001; Kaech S. et al., 2001; Segal M., 2001].

Активация мозга сопровождается усложнением пространственной организации наиболее пластичных отделов дендритного дерева, увеличением эффективности афферентных входов, инактивация, напротив, упрощением организации дендритов. Острое воздействие ишемии на мозг, несмотря на включение компенсаторных процессов, первоначально за счет Са2+-зависимых механизмов эксайтотоксического повреждения приводит к деструкции значительной части дендритного дерева поврежденных нейронов, а затем - к выраженной стимуляции компенсаторно-восстановительных процессов преимущественно в дистальной зоне дендритного дерева, образующей основную массу межнейронных контактов сохранившихся нейронов [Guldner F. Н., Phillips S. С., 1986; Jones D.G., Calverley R.K., 1991; Jones D.G.; Harris R.J., 1995; Jourdain P. et al., 2003].

Высокая избирательная чувствительность дендритов к гипоксии и ишемии мозга послужила основанием целенаправленного исследования этих образований нейрона при изучении патогенеза посташемической энцефалопатии. Дана подробная ультраструктурная характеристика дендритов при различных ишемических и гипоксических состояниях мозга [Семченко В.В. и др., 1995, 1999; Geinisman Y., 1993, 1996; Fitzsimonds R.M., Poo М.М., 1998].

Однако эти данные получены в основном при изучении раннего постишемического периода и недостаточны для расшифровки глубинных общебиологических закономерностей реорганизации межнейронных взаимоотношений в отдаленном и позднем постишемическом периоде. Не ясна роль различных уровней структурно-функциональной организации дендритов (зона синаптического контакта —> шипик —» ветви 3-го —» 2-го —» 1-го уровня) и дендритного цитоскелета в механизмах постсинаптической пластической реорганизации нейронов головного мозга.

Для ответа на эти и другие вопросы представляется важным детальное исследование всех уровней дендритного дерева нейронов различных отделов головного мозга экспериментальных животных и человека в отдаленном периоде после тотальной ишемии мозга. Необходима сравнительная гистологическая характеристика апикальных и базальных дендритов пирамидных нейронов, пространственной организации дендритного дерева в целом и отдельных его компонентов (шипики, зоны ветвления и др.) в динамике постишемического периода. Исследование пространственной реорганизации дендритов в отдаленном постишемическом периоде целесообразно проводить параллельно с изучением динамики реактивных, дистрофических, некробиотических и компенсаторно-восстановительных процессов в нейронах с помощью электронномикроскопических и иммуногистохимических методов.

Работы по патологии нейронов подобного рода отсутствуют, но они необходимы для определения структурной базы молекулярных механизмов, лежащих в основе нарушения и восстановления интегративно-пусковой деятельности мозга в отдаленном постишемическом периоде. Это позволит более осознанно и целенаправленно воздействовать на реорганизацию межнейронных взаимоотношений в постишемическом периоде, контролировать процессы реабилитации функциональных систем мозга и блокировать образование патологических систем мозга.

Цель исследования. Выявить закономерности структурно-функциональной организации дендритов различных типов нейронов в головном мозге в норме, при ишемии и в отдаленном постишемическом периоде для определения морфологических основ постишемической у энцефалопатии.

Задачи исследования:

1. Изучить цитоархитектонику сенсомоторной коры большого мозга, вентролатеральных ядер таламуса и ретикулярной формации продолговатого мозга белых крыс в отдаленном постишемическом периоде.

2. Провести сравнительный анализ пространственной организации дендритного дерева пирамидных нейронов слоев III и V сенсомоторной коры большого мозга, ретикулярных нейронов вентролатеральных ядер таламуса и гигантоклеточных нейронов ретикулярной формации продолговатого мозга белых крыс в отдаленном постишемическом периоде.

3. Провести сравнительный анализ изменения аксо-шипиковых и аксо-дендритных синапсов различных слоев сенсомоторной коры, вентролатеральных ядер таламуса и ретикулярной формации продолговатого мозга белых крыс в отдаленном постишемическом периоде.

4. Выявить закономерности пространственной реорганизации различных отделов дендритного дерева пирамидных нейронов соматосенсорной коры белых крыс в постишемическом периоде с помощью метода ретроградной люминесцентной окраски дендролеммы (Dil-метод) и сопоставить их с данными метода Гольджи.

5. С помощью иммуногистохимических методов провести сравнительный анализ состояния опорно-двигательной системы нейрона, рецепторно-барьерно-транспортной системы, системы синтеза биополимеров, системы хранения, воспроизведения и реализации генетической информации и систем, обеспечивающих регуляцию внутриклеточного ионного гомеостаза, нейронов коры большого мозга человека в отдаленном постишемическом периоде.

6. Выявить морфологические диагностические критерии постишемической энцефалопатии.

Научная новизна. В настоящей работе впервые дана сравнительная развернутая характеристика дендритов головного мозга белых крыс и человека в отдаленном постишемическом периоде. Раскрыты структурные механизмы, лежащие в основе реактивной и пластической реорганизации дендритного дерева, представлены новые данные о пластичности и регуляции структурного гомеостаза на различных уровнях структурно-функциональной организации дендрита. Физиологические и реактивные пространственные изменения дендритов зависят от типа (апикальный, базальный) и уровня иерархической организации дендрита (дистальный, проксимальный). Показано, что дендриты различных типов и уровней имеют различную устойчивость к ишемии, отличаются вариабельностью пространственной рекомбинации в постишемическом периоде. Впервые дана сравнительная характеристика пространственных изменений дендритного дерева различных отделов головного мозга в процессе повреждения и восстановления нейронов. Показано, что деструктивные и репаративные процессы находятся в динамическом равновесии. В отдаленном постишемическом периоде дендритное дерево активных нейронов гипертрофируется; усложнение пространственной организации дендритного дерева происходит в основном за счет дистальной зоны мелких дендритов 2-3-го порядка, активации процессов гиперплазии в фокусах ветвления дендритов. Показана роль механизмов расщепления гипертрофированных синапсов, в результате чего происходит усложнение пространственной организации синаптического устройства по конвергентному или дивергентному типу и рост дистальных дендритов, а также увеличение числа дендритных шипиков.

Выявлены общие и специфические для конкретных нейронов и отделов мозга закономерности пространственной реорганизации дендритов в отдаленном постишемическом периоде. Степень этой реорганизации отличается в различных нейронах и отделах мозга. Показано, что активно функционирующий нейрон в силу особенностей организации дендритов и распределения синапсов имеет нестабильную дистальную зону дендритного дерева, посредством реорганизации которой реализуются высокие пластические возможности нейрона.

Впервые для отдаленного постишемического периода выявлено, что, несмотря на особенности структурно-функциональной реорганизации дендритов различных отделов мозга, общебиологические закономерности этой реорганизации направлены в конечном итоге на восстановление площади рецептивного поля. Однако компенсаторная гиперактивность отдельных нейронов в постишемическом периоде приводит к значительному увеличению их рецептивного поля, а это, в свою очередь, может быть причиной усиления пространственной суммации импульсов и структурной основой формирования генераторов патологически усиленного возбуждения, на основании которых в отдаленном постишемическом периоде образуются патологические системы мозга.

Теоретическое и практическое значение. Сравнительные количественные исследования дендроархитектоники нейронов различных отделов головного мозга в отдаленном постишемическом периоде, проведенные в настоящей работе, существенным образом расширилиj представления о структурно-функциональных механизмах реактивности и пластичности нейронов. Расшифровка реактивных и пластических механизмов мозга на уровне дендритов служит фундаментальной базой для целенаправленного изыскания способов регуляции функций мозга, разработки патогенетически обоснованной профилактики и терапии постишемической энцефалопатии, стимуляции компенсаторно-восстановительных процессов.

Полученные данные трехмерного нейронного картирования различных областей мозга крыс являются чрезвычайно важной информацией для патологической морфологии и анатомии в изучении межнейрональных взаимоотношений на разных уровнях организации мозга в центральной нервной системе в норме, при экстремальных состояниях и в постишемическом периоде. Впервые разработаны диагностические тесты постишемической энцефалопатии в раннем и отдаленном периодах после травмы.

Данные иммуногистохимического исследования коры большого мозга человека свидетельствуют о переходе большинства нейронов на иной уровень функционирования, когда механизмы повреждения одних дендритов и синапсов (в основном дистальные дендриты и возбуждающие синапсы) сочетаются с механизмами активации компенсаторно-восстановительных процессов в других дендритах и синапсах (проксимальные дендриты и тормозные синапсы).

Внедрение результатов в практику. Данные о закономерностях структурных изменений дендритов головного мозга в постишемическом периоде используются в лекционных курсах медицинских университетов и академий на кафедрах гистологии, цитологии и эмбриологии, неврологии, анестезиологии и реаниматологии при изучении разделов "нервная ткань", "органы нервной системы", "нарушение мозгового кровообращения". Полученные в настоящем исследовании данные использованы при написании монографий: Семченко В.В., Боголепов Н.Н., Степанов С.С. "Синптоархитектоника коры большого мозга" (морфологические аспекты). -Омск: ИПК "Омич", 1995. - 168с.; Семченко В.В., Степанов С.С., Алексеева Г.В. Постаноксическая энцефалопатия. -Омск: ИПК "Омич", 1999.-446с.

Положения, выносимые на защиту:

1. В отдаленном постишемическом периоде выявлена высокая реактивность и пластичность дендритов, степень выраженности которых зависит от зоны дендрита, его типа, разновидности нейронов и отдела головного мозга.

2. В результате последовательного включения деструктивных и компенсаторно-восстановительных механизмов происходит реорганизация дендритного дерева активно функционирующих нейронов, которая является структурной основой усиления пространственной суммации афферентных импульсов. Нейропластичность на уровне дендритов максимально реализуется в дистальной зоне дендритного дерева и дендритных синапсах.

3. Реорганизация дендритного дерева нейронов в отдаленном постишемическом периоде приводит к формированию нейронов, структурно-функциональные особенности которых делают их основой образования патологических систем мозга.

4. Диагностическими тестами постишемической энцефалопатии являются: атипичное разрастание дендритного дерева, увеличение количества дендритных шипиков и усложнение синаптического аппарата.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на республиканской научной конференции "Морфологические науки практической медицине и биологии" (Омск, 1986), учредительном конгрессе международного общества патофизиологов (Москва, 1991), симпозиумах и конференциях НИИ мозга РАМН (Москва, 1989, 1990, 1991, 1992, 2000, 2001), научно-практической конференции НИИ общей реаниматологии РАМН (Москва, 1991), конференции ЦНИЛ Омской медицинской академии (Омск, 1991), конференции кафедры гистологии и эмбриологии Омской медицинской академии (Омск, 1992), международном симпозиуме, посвященном 85-летию академика РАМН В.А. Неговского (Москва, 1994), III съезде анатомов, гистологов и эмбриологов РФ (Тюмень, 1994), IV Российско-Шведском симпозиуме по новым исследованиям в неврологии (Москва, 1996), III международной конференции по функциональной нейроморфологии, посвященной 100-летию со дня рождения чл.-корр. АН и АМН СССР Н.Г. Колосова (Санкт-Петербург, 1997), проблемной комиссии "Морфология" РАМН Сибирское отделение (Новосибирск, 1997), IV конгрессе Европейского общества реаниматологов (Копенгаген, Дания, 1998), конгрессе "Социальный мозг"

Александрия, Египет, 2002), конференции "Социальный мозг" (Гетеборг, Швеция, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 44 научные работы, в том числе в центральных отечественных и зарубежных журналах, в которых отражены основные положения диссертации.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 303 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Фактические данные иллюстрированы 35 графиками, 31 микрофотографиями, 9 схемами и 1 таблицей. Список литературы включает 474 источника (63 отечественных и 411 иностранных авторов).

ВЫВОДЫ

1. После кратковременной (10 мин) остановки системного кровотока в течение длительного времени (9 мес) происходит значительная реорганизация дендроархитектоники пирамидных нейронов СМК мозга, ретикулярных нейронов ВЛЯ таламуса и гигантоклеточных нейронов продолговатого мозга. Процесс реорганизации осуществляется на фоне прогрессирующей гибели нейронов, имеет фазный характер - периоды преобладания механизмов деструкции дендритов сменяются периодами преобладания механизмов репаративной нейропластичности.

2. В процессе реорганизации дендроархитектоники изменяется пространственная организация дендритов, состояние его опорно-двигательной (цитоскелет), рецепторно-барьерно-транспортной систем (мембрана, синаптические контакты), белков обеспечивающих регуляцию внутриклеточного ионного гомеостаза, а также систем хранения, воспроизведения, реализации генетической информации (ядро) и синтеза биополимеров нейрона.

3. В эксперименте на белых крысах показано, что критическими периодами для всех изученных отделов головного мозга являются первые 7 сут, 1, 3 и 5 мес после ишемии. В эти периоды дефицит общей численной плотности синапсов составляет от 23,5 до 47,1%. При этом объем территории поврежденных дендритов части нейронов достигает 80%. Плотность ДШ в различных отделах ДД пирамидных нейронов снижается на 30-47%. Деструкции подвергаются преимущественно терминальные веточки дендритов 2-го и 3-го порядка. Степень редукции численной плотности ДШ на дистальных дендритах составляет 42,9%, а на проксимальных — 18,8%. Максимальная деструкция дендритов и синапсов характерна для СМК мозга.

4. Различные отделы ДД пирамидных нейронов (апикальные прямые, косые, базальные) СМК отличаются разной чувствительностью к ишемическому воздействию и степенью постишемической репаративной реорганизации дендритов и их синапсов. Наиболее чувствительными являются апикальные косые дендриты ПН на уровне слоев Ш-IV. На этом уровне уже в раннем периоде после ишемии восстановление численной плотности ДШ происходит за счет реорганизации шипиков неповрежденных проксимальных отделов ДД. В отдаленном периоде восстановление косых апикальных дендритов сопровождается увеличением количества ДШ, а для других типов дендритов подобной зависимости не выявлено. Через 5 мес после ишемии на фоне роста мелких прямых апикальных и базальных дендритов отмечается даже повторная волна редукции значительной части ДШ.

5. Характерной особенностью терминальных ветвей ДД пирамидных нейронов СМК мозга является то, что после повторного повреждения (5 мес) последующего полного восстановления численной плотности ДШ на них' не происходит даже через 9 мес после ишемии. Компенсация потери осуществляется за счет более крупных проксимальных дендритов. Все это свидетельствует о смещении афферентного входа ПН в проксимальном направлении и неизбежном изменении пространственной суммации импульсов на этих нейронах.

6. Структурно-функциональное восстановление ДД пирамидных и непирамидных нейронов происходит в постишемическом периоде за счет: восстановления структуры обратимо поврежденных дендритов - особенно это характерно для дендритов с частично поврежденным цитоскелетом, но сохранной цитолеммой; новообразования и роста дендритов на месте необратимо поврежденных отростков; новообразования и атипичного роста дендритов с последующим формированием нетипичного ДД и образованием несвойственных для неповрежденного мозга псевдобиполярных, "динозавро-подобных" нейронов и нейронов с загнутым апикальным дендритом. Появление подобных нейронов с нетипичным ДД существенно изменяет пространственную организацию нейронных сетей изученных отделов головного мозга и наряду с частично поврежденными нейронами может быть структурной основой нарушения интегративно-пусковой деятельности головного мозга в постишемическом периоде.

7. В процессе реорганизации дендроархитектоники ПН слоя Ш СМК мозга после восстановления в первые 3 мес параметров ДД основной массы сохранившихся нейронов характерна повторная деструкция дендритов через 5 мес после ишемии с последующей активацией вышеназванных репаративных механизмов. Для крупных ПН слоя V такая особенность не характерна. Следовательно, в отдаленном постишемическом периоде повторные деструктивные процессы в большей степени характерны для апикальных дендритов мелких ПН слоя III СМК, а пластическая реорганизация - для крупных ПН слоя V.

8. О возможности восстановления в постишемическом периоде пространственной организации ДД всех типов изученных нейронов за счет активации процессов образования новых вторичных и третичных дендритов, роста дендритов в длину и их ветвления свидетельствуют данные о статистически значимом увеличении показателей таких параметров, как число свободных концов у всех дендритов, общая разветвленность клетки, разветвленность дендритов, общая длина дендритов во всей дендритной территории и максимальный радиус апикальных и базальных полей. В совокупности это приводит к тому, что через 1-3 мес объем дендритной территории основной массы обратимо поврежденных нейронов восстанавливается до контрольного значения, а в некоторых нейронах даже превосходит его.

9. Репаративная реорганизация дендритов в постишемическом периоде сопровождается активацией механизмов синаптической пластичности, что структурно проявляется функциональной активацией синапса, гиперплазией субсинаптических структурных компонентов, гипертрофией сохранившихся неповрежденных и созреванием вновь образованных межнейронных синапсов. Компенсаторная длительная активация функционально зрелых синапсов сопровождается увеличением диаметра их контакта, образованием различных перфорированных синапсов и более сложных синаптических устройств. Это способствует существенному изменению эффективности активных синаптических входов и характера временной суммацию импульсов. Следовательно, параллельно изменениям пространственной суммации, зависимой от особенностей объемной организации ДД, в постишемическом периоде имеют место изменения временной суммации импульсов на уровне синапсов. В совокупности это оказывает влияние на интегративно-пусковую деятельность головного мозга и может быть структурной базой как восстановления функциональных систем мозга, так и образования патологических систем. Вышеназванные механизмы синаптической пластичности реализуются во всех изученных отделах головного мозга, но степень их выраженности статистически значимо выше в СМК мозга.

10. Неравномерное изменение цито-, дендро- и синаптоархитектоники различных ПН слоев СМК и подкорковых отделов в течение 9 мес после ишемии приводит к тому, что восприятие специфической соматосенсорной информации происходит в условиях значительного дефицита таламо-кортикальных проекций (слои III-IV). В результате более интенсивного разрастания проекций неспецифических систем изменяется соотношение площади рецепторной поверхности нейронов, воспринимающей специфическую (слои III-IV) и неспецифическую информацию (слой I, V-VI). Это изменяет корково-подкорковые взаимоотношения и усиливает неспецифическую активацию нейронов неокортекса.

11. По данным иммуногистохимического исследования коры большого мозга человека, в постишемическом периоде (7 сут, 3 и 12 мес) происходит прогрессивное уменьшение общей численной плотности МАР-2 иммунопозитивных нейронов (30,4-66,3%). Это подтверждает данные экспериментального исследования о деструкции значительной части нейронов коры и более высокой чувствительности дистальной зоны ДД мелких и крупных ПН мозга.

12. Изменения на уровне синапсов у человека в постишемическом периоде проявляются изменением численной плотности (на 20-38%) и увеличением размеров конгломератов иммунореактивных структур синаптофизина, что свидетельствует об увеличении размеров синаптических терминалей. Максимальные изменения по этому показателю характерны для слоев II-III лобной и височной коры большого мозга. Восстановление неврологического статуса у пациентов после реанимационных мероприятий коррелирует с восстановлением численной плотности и распределения Р-38 иммунопозитивных структур. В пользу активации механизмов синаптической пластичности в отдаленном постишемическом периоде свидетельствуют ' данные об усилении образования GAP-43 в сохранившихся нейронах до уровня, достаточного для активации механизмов нейропластичности и восстановления межнейронных взаимоотношений.

13. В постишемическом периоде в различных отделах коры большого мозга на 61,6-71,3% увеличивается содержание нейропептид Y позитивных нейронов, что свидетельствует об изменении соотношения активности тормозных и возбуждающих систем коры в сторону компенсаторной активации тормозных интернейронов. Подобные изменения, являясь естественными саногенетическими механизмами, способствуют блокированию электротонического распространения возбуждающих постсинаптических потенциалов с дендрита на тело нейрона, препятствуют распространению возбуждения по коре большого мозга.

14. Репаративные изменения опорно-двигательной и рецепторно-барьерно-транспортной систем дендритов сопровождаются адекватными изменениями активности систем, обеспечивающих регуляцию внутриклеточного ионного гомеостаза, хранения, воспроизведения, реализации генетической информации и синтеза биополимеров нейрона. Так, нейропротекторное действие кальбиндина более полно реализуется в позднем постишемическом периоде, когда некробиотические процессы сменяются дистрофическими. О компенсаторной активации биосинтетических процессов в постишемическом периоде свидетельствует увеличение численной плотности NeuN позитивных нейронов различных отделов коры мозга человека на 14,4-72,9%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При вскрытии трупов лиц перенесших клиническую смерть следует подвергать исследованию различные отделов головного мозга (кору большого мозга, таламус и продолговатый мозг).

2. При исследовании вышеназванных отделов мозга необходимо обращать внимание на формирование нетипичного дендритного дерева и образование несвойственных для неповрежденного мозга псевдобиполярных, "динозавро-подобных" нейронов и нейронов с загнутым апикальным дендритом.

3. Минимальным объемом при изучении мозга лиц переживших клиническую смерть, следует считать: использование метода Ниссля, импрегнации по Гольджи, электронной микроскопии и методов иммуногистохимии (МАР-2, синаптофизин, GAP-43, NPY, NeuN, калбиндин и GFAP).