Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Выявление и оценка диагностического значения гиперметилированных генов супрессоров при опухолях молочной железы и яичников

На правах рукописи

ПОТАПОВА Анна Анатольевна

Выявление и оценка диагностического значения гиперметилированных генов супрессоров при опухолях молочной железы и яичников

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003477859

Саратов - 2009

003477859

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Защита состоится 22 октября 2009 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.094.04 при ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Росздрава по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Большая Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Росздрава.

Автореферат разослан «/£» 2009 г.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Дудченко Галина Петровна.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Гладилин Геннадий Павлович;

доктор медицинских наук, профессор Девдариани Зураб Леванович.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Бородулин В.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы

Гормонозависимые опухоли, в том числе рак молочной железы и рак яичников, являются одной из главных причин смертности среди женщин от злокачественных новообразований. К сожалению, в последние годы наблюдается значительный рост обоих заболеваний (Семиглазов В.Ф., 2008).

Из 10 млн. новых случаев злокачественных опухолей различных органов, выявляемых в мире, 10% приходится на молочную железу. Если оценивать только женскую популяцию, удельный вес рака молочной железы возрастает до 22%. В промышленно развитых странах удельный вес злокачественных новообразований молочной железы еще выше - 27%. В Российской Федерации ежегодно выявляется около 47 тыс. новых случаев этого заболевания (Семиглазов В.Ф., 2008).

В то же время рак яичников занимает 3 место в структуре заболеваемости женских половых органов по России. При этом смертность от этого заболевания находится на первом месте и составляет 43,1 % от общего числа умерших от злокачественных новообразований женских половых органов (Медик В.А. с соавт., 2001).

Скрытое течение обоих заболеваний и трудности в диагностике приводят к тому, что до 80% случаев выявляются на поздних стадиях, а смертность от них стойко опережает смертность от рака тела и шейки матки вместе взятых (Мерабишвили В.М. с соавт., 2001).

Надежды сократить число смертей от данных заболеваний основаны на раннем выявлении патологии, точности прогноза и эффективном лечении болезни в ее начальной стадии. В связи с этим очевидна необходимость поиска и внедрения в клиническую практику новых методов, которые сделают возможным определение злокачественных новообразований на ранних стадиях развития.

Известно, что одной из важнейших причин перерождения нормальной клетки в неопластическую является нарушение функционирования генов-супрессоров опухолевого роста. Изменения в работе этих генов приводят к возникновению и прогрессии развития рака, а восстановление функции - к существешюму замедлению пролиферации опухолевых клеток. Исследования последнего десятилетия показали, что наряду с генетическими событиями, обуславливающими инактивацию клеточных генов вследствие структурных изменений в ДНК, важную роль в процессе канцерогенеза играют также эпигенетические явления, не затрагивающие первичную структуру ДНК, но влияющие на экспрессию генов (Jones et al., 2002). Одним из таких эпигенетических изменений является локальное гиперметилирование специфических последовательностей - CpG-островков, расположенных в 5'-регуляторных районах многих генов, которое влечет за собой подавление экспрессии гена либо в результате прямого ингибирования связывания транскрипционных факторов с ДНК, либо в результате привлечения корепрессоров транскрипции (Klose et al., 2006). До сих пор

остается открытым вопрос о механизмах инициации гиперметилирования Срв-островков в процессе образования опухоли.

На данный момент известен ряд генов-супрессоров опухолевого роста, экспрессия которых нарушена вследствие гиперметилирования их Срв-островков и выявлена их ассоциация с различными видами опухолей (Esteller е1 а1., 2002). В настоящее время все более актуальным становится поиск новых, ранее не изученных генов-супрессоров опухолевого роста, метилирование которых специфично для опухолей определенных видов, т.к. результаты подобных исследований открывают новые возможности как для изучения механизмов канцерогенеза, так и для разработки методов диагностики, мониторинга, прогноза и терапии опухолей.

Тема диссертации является составной частью плана научно-исследовательской работы Волгоградского государственного медицинского университета и утверждена на заседании Ученого совета Волгоградского государственного медицинского университета (протокол № 9 от «16» мая 2007г.)

Цель исследования:

Целью данного исследования является анализ метилированого статуса генов-супрессоров опухолевого роста, а также новых кандидатов в гены-супрессоры опухолевого роста, которые могут являться потенциальными маркерами опухолей молочной железы и яичников.

Задачи исследования:

1. Подбор для исследования генов-супрессоров опухолевого роста, а также новых кандидатов в гены-супрессоры опухолевого роста путем скрининга существующих библиотек генов и научных статей, принимая за критерий отбора снижение или полное отсутствие экспрессии этих генов при опухолях молочной железы и яичников.

2. Анализ статуса метилирования отобранных генов в морфологически нормальных тканях, первичных опухолях и клеточных линиях карцином молочной железы и яичников.

3. Отбор генов, инактивированных в опухолях в результате метилирования, ко в тоже время не метилированных в морфологически нормальных тканях молочной железы и лимфоцитах человеческой крови.

4. Определение диагностической чувствительности и специфичности маркеров метилирования при анализе биопсийного материала карцином молочной железы и яичников.

5. Создание диагностических панелей из отобранных генов для анализа биопсийного материала, полученного от пациентов с опухолями молочной железы и яичников.

Научная новизна работы

В результате работы с научной литературой, для оценки статуса метилирования промоторной области генов супрессоров опухолевого роста

при спорадическом раке молочной железы и яичников были отобраны 12 генов. Все гены имеют в составе своих промоторов CpG-островки и транскрипционно активны в клетках морфологически нормальной молочной железы и поверхностном эпителии яичников.

При анализе статуса метилирования CpG-островков двенадцати отобранных генов в клеточных линиях рака молочной железы и яичников, а также морфологически нормальной ткани молочной железы и лимфоцитах человеческой крови, было показано, что гены RASSF1A, Р16, RAR|3, APC, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL, OPCML и DKK1 метилированы в клеточных линиях, но не метилированы в норме.

Был проведен статистический анализ статуса метилирования генов RASSF1A, Р16, RARp, APC, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL, BRCA1, OPCML и DKK1 в нормальных и клинических образцах рака молочной железы и яичников различных стадий. Результат наличия метилирования в клинических образцах и его отсутствие в нормальных образцах делает возможным использование генов RASSF1A, Р16, RARp, APC, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL, BRCA1, OPCML и DKK1 в лабораторной диагностике рака молочной железы и яичников.

Практическая ценность работы

В результате проведенных исследований было показано, что комбинация генов RASSFA1, HIN1, MAL позволяет диагностировать опухоль молочной железы с чувствительностью 98%, а комбинация генов BRCA1, MAL, DKK1 - злокачественную опухоль яичников с чувствительностью 94%. Полученные данные являются экспериментальным обоснованием для разработки скрининговых тест-систем с целью диагностики рака молочной железы и яичников. Использование таких систем может послужить основой для разработки нового молекулярно-биологического метода диагностики.

Материалы исследования таюке представляют интерес для получения новых дополнительных знаний об участии генов супрессоров опухолевого роста в процессе канцерогенеза, а также расширения понимания роли эпигенетических факторов в регуляции экспрессии этих генов при злокачественной трансформации клетки.

Реализация результатов исследования

Панели метилированных генов, составленные в результате проведенного исследования, используются в научной лаборатории ракового центра Фокс Чейз (Филадельфия, США) при анализе клинических образцов для изучения функционирования этих генов при раке молочной железы и яичников, а также внедрены в практику работы Волгоградского Областного Клинического Онкологического диспансера.

Результаты исследования, отражающие молекулярные механизмы канцерогенеза и иллюстрирующие новые подходы к диагностике

онкологических заболеваний, включены в лекционные курсы по молекулярной биологии, медицинской генетике и клинической биохимии Волгоградского государственного медицинского университета.

Основные положения, выносимые на защиту .

1. Гены RASSF1A, Р16, RARß, APC, GSTP1, HINl, NTRK2, CTGF и MAL метилированы в клеточных линиях рака молочной железы, но не метилированы в морфологически нормальных тканях молочной железы.

2. Установлено наличие метилирования генов RASSF1A, RARß, APC, GSTP1, HINl, NTRK2, CTGF и MAL в образцах карцином молочной железы всех стадий.

3. Гены MAL, OPCML, HINl, BRCA1 и DKK1 метилированы в клеточных линиях карцином яичников, но не метилированы во всех образцах лимфоцитов крови, полученных от людей без онкологических заболеваний.

4. Выявлено наличие метилирования генов MAL, OPCML, HINl, BRCA1 и DKK1 в образцах карцином яичников всех стадий.

5. Диагностическая чувствительность панели генов (RASSF1A, MAL, HINl) для выявления рака молочной железы составляет 98%, а при раке яичников она достигает 94% в случае одновременного определения статуса метилирования комбинации генов MAL, DKK1, BRCA1.

Публикации и апробация работы

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в реферируемых журналах.

Основные результаты работы докладывались на международных конференциях: «97th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research» (Washington, DC, USA, April 1-5, 2006); «15th SPORE meeting National Institutes of Health (Baltimore, MD,USA, 2007); «99th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research» (San Diego, CA, USA April 12-16, 2008); XLVT международная научная студенческая конференция "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2008).

Диссертация обсуждена на совместном заседании кафедр теоретической биохимии с курсом клинической биохимии, молекулярной биологии и генетики, биологии, патологической анатомии с участием НИИ фармакологии, ФГУЗ НИПЧИ (6 мая 2009 года, протокол № 14).

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 103 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов, 5 глав - результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Список использованной литературы включает 144

источника, из них 24 источника отечественных авторов и 120 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 13 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Клинические образцы рака молочной железы (РМЖ), рака яичников (РЯ), морфологически нормальной молочной железы и лимфоцитов крови людей без онкологических заболеваний были получены в Волгоградском Областном Клиническом Онкологическом диспансере (ВОКОД), а также в госпитале ракового центра Фокс Чейз (Филадельфия, США), в результате оперативных вмешательств. Клинический диагноз был подтвержден патоморфологическим исследованием в отделении патоморфологии ВОКОД и ракового центра Фокс Чейз. В общей сложности в работе были использованы 44 образца ДНК, выделенной из опухолей пациентов с диагнозом РМЖ, и 102 образца ДНК - с диагнозом РЯ. В ходе исследования образцы РМЖ и РЯ были разделены на две подгруппы согласно классификации по системе, разработанной Американским комитетом по борьбе с раком (TNM, Greene FL. et al., 2002). Первую подгруппу составляли образцы опухолей первой стадии; во вторую подгруппу были включены образцы опухолей на более поздней стадии развития. Средний возраст больных в первой подгруппе составил 58,1 года (46-80 лет); во второй подгруппе - 60,3 года (39-90 лет) для рака молочной железы, а для рака яичников - 56,1 года (18-76 лет) и 62,7 года (32-90 лет) соответственно по подгруппам. Также в работе были использованы 12 образцов ДНК, выделенной из морфологически нормальной ткани молочной железы (МЖ), и 10 образцов ДНК лимфоцитов крови здоровых людей. Отсутствие новообразований в МЖ было подтверждено патоморфологическим исследованием. Для исследования также использовали клеточные линии опухолей молочной железы: MDA231, MDA435, MCF7, T47D, HS-578T и клеточные линии опухолей яичников: А2780, SKOV3, OVCARIO, OVCAR5, OVCAR3.

Методы исследования. Для исследования геномную ДНК выделяли из клеточных культур, из тканевых срезов (зафиксированных в парафине или замороженных по методу N. Blin, DW. Stafford, 1976) и из человеческой крови по методу J. Sambrook, DW. Russell, 2001. Выделенную геномную ДНК подвергали бисульфитной модификации по методу S.V. Harden, 2003. С целью качественного анализа статуса метилирования исследуемых образцов проводили бисульфит-модифицированную ПЦР по Saiki, 1989, продукты реакции секвенировали при помощи автоматического секвенатора Model 377XL (Applied Biosystems). Для количественного анализа статуса метилирования применяли метил-специфичную количественную ПЦР в реальном времени по A.N. Reddy, 2003 с использованием амплификатора 7500 (Applied Biosystems). Оценку транскрипционной активности генов в морфологически нормальных и пораженных клетках молочной железы и яичников, а также анализ структуры (наличие/отсутствие и размер) CpG-

островков проводили с помощью научно-информационных баз данных, расположенных на сайтах: http://cgap.nci.nih.gov и

www.itb.cnr.it/sun/webgene/. Статистическую обработку данных осуществляли по методу точного критерия Фишера и t- тесту при помощи программы Statsoft 6 и Graphprism 5.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ экспрессии генов в клетках морфологически нормальной и пораженной молочной железы, а так же в клетках морфологически нормальных и пораженных яичников.

В результате работы с научной литературой (www.pubmed.gov), для исследования были отобраны двенадцать генов. Terni RASSF1A, PI6, APC, RARß, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF и MAL использовались для изучения статуса метилирования при опухолях молочной железы. Анализ статуса метилирования при злокачественных новообразованиях яичников проводился для генов OPCML, MAL, HIN1, DKK1 и BRCA1. Далее был осуществлен сравнительный анализ уровня экспрессии вышеперечисленных генов в клетках морфологически нормальной молочной железы и яичников с клетками молочной железы и яичников, пораженных раком. Для этого мы использовали базу данных Cancer Genome Anatomy Project (CGAP), где представлены результаты исследований уровней экспрессии генов в различных органах как в норме, так и при раковой патологии (http://cgap.nci.nih.gov). Все гены имели нормальный уровень экспрессии в не поврежденных тканях молочной железы и яичников, тогда как при опухолевом процессе отмечалось значительное снижение экспрессии или ее полное отсутствие. Следующий этап исследования представлял собой анализ CpG-островков отобранных генов.

Анализ CpG-островков

При анализе CpG-островков использовались три основных критерия: распределение CpG динуклеотидов по нуклеотидной последовательности, GC состав и длина последовательности.

Так, для оценки распределения CpG динуклеотидов вычисляется показатель Н/Т по следующей формуле:

Н_ il xN T NcxNo

9

где

H - наблюдаемое число CpG динуклеотидов;

Т - теоретическое число CpG динуклеотидов;

п - число CpG в последовательности;

N - общее число нуклеотидов в последовательности;

NC - число остатков цитозинов;

NG - число остатков гуанина.

Для CpG-островка этот показатель должен быть > 0,6. GC состав - доля цитозиновых и гуаниновых нуклеотидов в составе последовательности для CpG-островка должна быть не меньше 55%. Длина CpG-островка варьирует от 200 п.н. до несколько тысяч, составляя в среднем 1000 п.н. (GardinerGarden etal, 1987).

Данные условия отбора также способствуют исключению большинства Alu-повторяющихся элементов, которые могут входить в состав промоторов некоторых кодирующих белков генома человека и перекрываться с CpG-островками и цис-регуляторными модулями, представляющими собой кластеры сайтов связывания транскрипционных факторов, тем самым влияя на экспрессию генов (Oei et al., 2004). Дополнительно с той же целью была использована компьютерная программа обнаружения повторов Repeat Masker (www.repeatmasker.org).

При анализе нуклеотидных последовательностей промоторов исследуемых генов на наличие CpG-островков в их составе использовалась компьютерная программа Webgene CpG island prediction (www. itb. cnr. it/sun/ webgene/).

В результате анализа было установлено, что гены RASSF1A, Р16, RAR(3, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL, OPCML, DKK1 и BRCA1 имеют в своем составе CpG островки.

Хромосомная локализация и краткая характеристика отобранных генов представлены в таблице 1.

Таблица 1

Хромосомная локализация и краткая характеристика отобранных генов

№ Ген Хромосомная локализация Функция гена

1 RASSF1A 3р21.31 Супрессор опухолевого роста. Негативная регуляция клеточного цикла

2 Р16 9р21.3 Супрессор опухолевого роста. Контроль клеточного цикла

3 RARp Зр24.2 Рецептор. Регуляция клеточных процессов

4 АРС 5q22.2 Супрессор опухолевого роста

5 GSTP1 llql3.2 Обладает ферментативной активностью. Играет важную роль в процессе детоксификации

6 HIN1 5q35.3 Принадлежит к семье секретоглобинов

7 NTRK2 9q21.33 Рецептор. Принимает участие в развитии и формировании нервной системы

8 CTGF 6q23.2 Стимуляция пролиферации и дифференцировки хондроцитов

9 MAL 2q 11.1 Регуляция клеточных процессов

10 OPCML llq25 Рецептор. Клеточная адгезия

11 BRCA1 17q21.31 Репарация ДНК

12 DKK1 10q21.1 Ингибитор сигнального пути

Определение статуса метилирования CpG-островков, отобранных генов в морфологически нормальных тканях молочной железы и лимфоцитах человеческой крови.

Анализ статуса метилирования исследуемых генов проводился по двум направлениям. Первое направление представляло собой анализ статуса метилирования генов RASSF1A, Р16, APC, RAR0, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF и MAL в морфологически нормальных образцах ткани молочной железы. Второе направление включало в себя анализ статуса метилирования генов OPCML, MAL, HIN1, DKK1 и BRCA1 в лимфоцитах крови, полученных от людей, не имеющих онкологических заболеваний, так как сбор нормальных образцов поверхностного эпителия яичников, представляет собой достаточно сложную задачу для хирурга.

В результате секвенирования промоторных участков двенадцати генов было установлено, что CpG-островки генов RASSF1A, Р16, RARp, APC, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, и MAL не метилированы для 12 образцов морфологически нормальной ткани молочной железы, а CpG-островки генов: OPCML, MAL, HIN1, DKK1 и BRCA1 не метилированы для 10 образцов лимфоцитов человеческой крови. Результаты секвенирования генов RASSF1A, Р16, RARp, APC, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF и MAL дня 12 образцов морфологически нормальной ткани молочной железы представлены в таблице 2.

Таблица 2

Статус метилирования CpG-островков для морфологически нормальной

ткани молочной железы

Гены RASSF1A GSTP1 HIN1 NTRK2 CTGF Р16 MAL APC RARp

1 НМ1 - - - - - - - - -

2 НМ2 - - - - - - - - -

3 НМЗ - - - - - - - - -

4 НМ4 - - - - - - - - -

5 НМ5 - - - - - - - - -

6 НМ6 - - - - - - - - -

7 НМ7 - - - - - - - - -

8 НМ8 - - - - - - - - -

9 НМ9 - - - - - - - - -

10 НМ10 - - - - - - - - -

11 НМ11 - - - - - - - - -

12 НМ12 - - - - - - - - -

(-) - образец не метилирован; НМ - образец морфологически нормальной ткани молочной железы.

Результаты секвенирования генов OPCML, MAL, HIN1, DKK1 и BRCA1 для 10 образцов лимфоцитов человеческой крови представлены в таблице 3.

Таблица 3

Статус метилирования СрО-островков в лимфоцитах человеческой крови, _полученных от здоровых людей__

Гены MAL OPCML HIN1 BRCA1 DKK1

1 ЗЛ1 - - - - -

2 ЗЛ2 - - - - -

3 злз - - - - -

4 ЗЛ4 - - - - -

5 ЗЛ5 - - - - -

6 ЗЛ6 - - - - -

7 ЗЛ7 - - - - -

8 ЗЛ8 - - - - -

9 ЗЛ9 - - - - -

10 ЗЛЮ - - - - -

(-)-образец не метилирован; ЗЛ -образец лимфоцитов человеческой крови.

Из таблиц видно, что все анализируемые гены оказались не метилированы для всех двенадцати образцов морфологически нормальных тканей молочной железы и всех десяти образцов лимфоцитов человеческой крови.

Большая часть CpG-островков в отличие от одиночных CpG-динуклеотидов не метилированы в нормальных клетках. Однако из этого правила есть исключения: небольшая часть CpG-островков метилирована в нормальных клетках. Гиперметилирование промоторных районов генов в нормальных клетках выполняет специфические функции, связанные с аллель-специфической экспрессией генов (импринтинг, инактивация хромосомы X), с подавлением экспрессии некоторых тканеспецифических генов, а также транспозонов (Futscher et al., 2002). Гиперметилирование некоторых генов, обычно неметилированных, наблюдается также в нормальных клетках при старении (Ahuja et al., 1998).

В свою очередь, гены суггрессоры опухолевого роста, гиперметилированные при различных видах опухолей, в том числе и при опухолях молочной железы и яичников, отличаются обязательным отсутствием метилирования в нормальных тканях (Lehmann U. et. al., 2002).

Таким образом, отсутствие метилирования промоторных областей генов RASSF1A, Р16, RARß, APC, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL, OPCML, DKK1, BRCA1 в образцах морфологически нормальных тканей молочной железы и лимфоцитах человеческой крови является важным результатом и позволяет сделать вывод о нормальном функционировании этих генов в исследуемых тканях.

Определение статуса метилирования CpG-островков отобранных генов в клеточных линиях опухолей молочной железы и яичников.

Работа проводилась в два этапа. На первом этапе был проведен анализ статуса метилирования генов RASSF1A, Р16, RARJ3, APC, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF и MAL для пяти клеточных линий опухолей молочной железы: MDA231, MDA435, MCF7, T47D, HS-578T. Второй этап заключался в проведении анализа статуса метилирования генов OPCML, MAL, HIN1, DKK1 и BRCA1 для пяти клеточных линий опухолей яичников А2780, SKOV3, OVCARIO, OVCAR5, OVCAR3.

В результате секвенирования промоторных участков двенадцати генов было установлено, что CpG-островки генов - RASSF1A, Р1 б, RAR|3, APC, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF и MAL - метилированы хотя бы в одной из пяти клеточных линий опухолей молочной железы, а CpG-островки генов: OPCML, MAL, HIN1, DKK1, за исключением гена BRCA1, метилированы хотя бы в одной из пяти клеточных линий опухолей яичников. Результаты секвенирования генов RASSF1A, Р16, RARp, APC, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF и MAL для клеточных линий опухолей молочной железы представлены в таблице 4.

Таблица 4

Статус метилирования CpG-островков в клеточных линиях опухолей

молочной железы _ _

Гены RASSF1A GSTP1 HIN1 NTRK2 CTGF Р16 MAL APC RARP

1 MDA231 + - + + - - + - -

2 MDA435 + - + + - - + - -

3 MCF7 + + + + - - + + +

4 T47D + + + + + + + - -

5 HS-578T + - - - - - + - -

(+) - образец метилирован; (-) - образец не метилирован.

Из таблицы видно, что гены RASSF1A и MAL метилированы во всех пяти клеточных линиях опухолей молочной железы, гены HIN1 и NTRK2 метилированы только в четырех клеточных линиях, ген GSTP1 - в двух, а гены CTGF, Р16, APC и RARP - в одной клеточной линии опухолей молочной железы.

Таким образом, все девять генов метилированы хотя бы в одной клеточной линии карцином молочной железы.

Результаты секвенирования генов OPCML, MAL, HIN1, DKK1 и BRCA1 для клеточных линий опухолей яичников представлены в таблице 5.

Как видно из данных, представленных в таблице, гены OPCML, MAL и HIN1 метилированы во всех клеточных линиях опухолей яичников, ген DKK1 метилирован в одной клеточной линии, а ген BRCA1 оказался не метилирован во всех клеточных линиях карцином яичников.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что все пять генов за исключением гена В11СА1 были метилированы хотя бы в одной клеточной линии опухолей яичников.

Таблица 5

Статус метилирования Срв-островков в клеточных линиях опухолей

яичников

Гены MAL OPCML HIN1 BRCA1 DKK1

1 А2780 + + + - +

2 SKOV3 + + + - -

3 OVCARIO + + + - -

4 OVCAR5 + + + - -

5 OVCAR3 + + + - -

(+) -образец метилирован; (-) - образец не метилирован

Результат наличия метилирования промоторной области исследуемых генов для клеточных линий карцином молочной железы и яичников позволяет рассматривать эти гены как потенциальные маркеры опухолей молочной железы и яичников. Несмотря на то что промоторная область гена BRCA1 оказалась не метилирована для всех проанализированных клеточных линий, это не исключает данный ген из списка потенциальных биологических маркеров опухолей яичников. Во-первых, этот ген имеет важную функциональную активность. BRCA1 играет центральную роль в репарации ДНК, участвует в транскрипционной регуляции гена Р21, одной из функций которого является ингибирование клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК клетки. Во-вторых, по данным литературы, известны случаи гиперметилирования промоторной зоны данного гена-супрессора при различных типах рака (Dobrovic A., Simpfendorfer D., 1997). В то же время клеточные линии различных типов опухолей являются удобной, но не идеальной моделью анализа статуса метилирования генов, т.к. большинство из них представлено наиболее распространенными видами злокачественных новообразований, и по этой причине при исследовании не представляется возможным анализ всего спектра различных типов опухолей.

Таким образом, представляется интересным и перспективным продолжение исследования статуса метилирования промоторных областей генов RASSF1A, Р16, RARß, APC, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF и MAL в клинических образцах опухолей молочной железы, а генов OPCML, HIN1, MAL, DKK1, включая ген BRCA1, - в клинических образцах опухолей яичников.

Биопсийный материал, использованный в работе для анализа метилированого статуса исследуемых генов.

Для анализа метилированного статуса исследуемых генов использовали биопсийный материал, полученный от больных с двумя видами опухолей.

Первый вид представлял собой опухоль молочной железы. В этом случае, после тщательного изучения историй болезней пациентов с диагнозом «рак молочной железы», были отобраны 44 случая. В ходе исследования образцы были разделены на две подгруппы согласно классификации по системе, разработанной Американским комитетом по борьбе с раком (TNM, Greene FL. et al., 2002). Первую подгруппу составляли образцы опухолей первой стадии; во вторую подгруппу были включены образцы опухолей с более поздней стадией развития.

Все образцы первичной опухоли молочной железы принадлежали к одному гистологическому типу и представляли собой инфильтрирующий протоковый рак.

Второй вид биопсийного материала был представлен опухолью яичников в количестве 102 образца. Как и в первом случае, все образцы были разделены на две подгруппы согласно классификации по системе, разработанной Американским комитетом по борьбе с раком (TNM, Greene FL. et al., 2002). Первую подгруппу составляли образцы опухолей первой стадии; во вторую подгруппу были включены образцы опухолей на более поздней стадии развития. Все образцы представляли собой карциному яичников эпителиального происхождения. В таблице 6 приведены гистологические типы образцов первичных опухолей яичника, использованные в работе.

Таблица 6

Гистологические типы образцов первичных опухолей яичника,

использованные в работе

Тип клеток Количество образцов

Эпителиальные клетки 102

Серозные опухоли 56

Муцинозные опухоли 12

Эндометриоидные опухоли 17

Мезонефроидные опухоли (светлоклеточные) 17

Определение статуса метилирования Срв-островков отобранных генов в клинических образцах рака молочной железы и яичников на ранней и поздней стадиях проводили методом метил-специфичной ПЦР в реальном времени.

Для оперативной и объективной оценки качества результатов, полученных в ходе исследования, были применены два метода доказательной медицины - t-тест для одной выборки и точный критерий Фишера.

Сравнительный анализ статуса метилирования исследуемых генов в морфологически нормальных и опухолевых образцах для рака молочной железы и яичников при помощи t- теста.

Использованный t-тест для одной выборки позволяет выяснить, отличается ли среднее значение, полученное на основе данной выборки, от предварительно заданного контрольного значения. В нашем случае предварительно заданное контрольное значение равнялось «О», так как промоторные области всех исследуемых генов оказались не метилированы во всех двенадцати образцах морфологически нормальных тканей молочной железы и десяти образцах лимфоцитов человеческой крови. Расчеты проводили при помощи программы GraphPad Prism 5. Для расчетов использовали данные количественного анализа метилированного статуса исследуемых генов для клинических образцов и данные, полученные при количественном анализе статуса метилирования этих генов в образцах морфологически нормальных тканей молочной железы и лимфоцитах человеческой крови.

При раке молочной железы в результате статистической обработки данных было выявлено существенное отличие между статусом метилирования генов RASSF1A, RARp, APC, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF и MAL в образцах карцином молочной железы поздней стадии и морфологически нормальных тканях. В случае генов RASSF1A, RARp, APC, GSTP1, HINl, NTRK2, CTGF и MAL математическое ожидание p было <0,05, тогда как для гена Р16 математическое ожидание р было >0,05 заданного уровня значимости (Кобзарь А. И., 2006).

Также было обнаружено значимое отличие между статусом метилирования генов RASSF1A, MAL и АРС в образцах карцином молочной железы ранней стадии развития и нормальных тканях. В случае генов RASSF1A, MAL и АРС математическое ожидание р было <0,05, тогда как для генов RARp, GSTP1, HINl, NTRK2, CTGF и Р16 математическое ожидание р было >0,05.

При раке яичников в результате расчета данных по t-тесту было выявлено существенное отличие между статусом метилирования генов OPCML, MAL, HINl, DKK1 и BRCA1 в образцах карцином поздней стадии и нормальных лимфоцитах крови. Для всех генов математическое ожидание р было <0,05.

При этом наблюдалось значимое отличие между статусом метилирования генов OPCML, MAL, HINl, и DKK1 в образцах карцином ранней стадии развития и нормальных лимфоцитах крови. В случае генов OPCML, MAL, HINl и DKK1 математическое ожидание р было <0,05, тогда как для гена BRCA1 математическое ожидание р было >0,05.

Таким образом, представляется возможным заключить, что промоторные области генов RASSF1A, RARß, APC, GSTP1, HINl, NTRK2, CTGF и MAL, за исключением гена Р16, метилированы при злокачественных новообразованиях молочной железы. При этом для генов RASSF1A, MAL и АРС удается зафиксировать метилирование на достаточно ранних стадиях развития рака молочной железы. Промоторные области генов OPCML, MAL, HINl, DKK1П BRCA1 метилированы при злокачественных новообразованиях яичников. При этом для генов OPCML, MAL, HINl и DKK1 удается зафиксировать метилирование на достаточно ранних стадиях развития рака яичников.

Интересным представляется результат сравнительного анализа, выявивший существенное отличие между статусом метилирования генов RASSF1A, RARß, APC, GSTP1, HINl, NTRK2, CTGF, MAL, OPCML, DKK1 и BRCA1 в образцах карцином молочной железы, яичников и морфологически нормальных тканях молочной железы, а также лимфоцитах человеческой крови. Данный результат свидетельствует о нарушении закономерности метилирования в клетках, которое часто наблюдается при злокачественных новообразованиях (Robertson et al., 2000; Jones et al., 2002).

Также интересен факт обнаружения значимого отличия между статусом метилирования генов RASSF1A, MAL, APC, OPCML, HINl D DKK1 в образцах карцином молочной железы, яичников ранней стадии развития и морфологически нормальных тканях молочной железы, а также лимфоцитах человеческой крови. Данный факт подтверждает предположение о том, что метилирование генов-супрессоров может происходить на достаточно ранних стадиях неопластического процесса (Feinberg А.Р., Tycko В., 2004). Для гена-супрессора Р16 было показано отсутствие экспрессии, связанное с метилированием промоторной зоны этого гена для преинвазивной стадии рака легких и прямой кишки (Belinsky S.A. et al., 1998., Nuovo G.J. et al., 1999). Потеря экспрессии гена-супрессора GSTP1, связанная с метилированием промоторной области, была характерна для преинвазивной стадии рака простаты (Nelson W.G. et al., 2003).

Диагностическая чувствительность и специфичность исследуемых генов.

Расчет диагностической чувствительности всех генов по точному критерию Фишера проводили при помощи программы Statsoft 6.

Результаты расчетов диагностической чувствительности для генов RASSF1A, RARß, APC, GSTP1, HINl, NTRK2, Р16, CTGF и MAL, использованных при анализе биопсийного материала пациентов, больных раком молочной железы, представлены в виде графика на рисунке 1.

100

• Пи веем больным В том чпеле: □ Группа I ■ Группа 2

Рис. 1. Распределение пациентов (%), у которых было обнаружено метилирование reHOBiRASSFIA, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, Р16, MAL, APC и RARP для всех образцов карцином молочной железы, а также карцином молочной железы на ранней стадии (группа 1 ) и карцином молочной железы, находящихся на более поздних стадиях развития (группа 2).

По результатам статистического анализа, высокой чувствительностью обладают следующие гены: RASSF1A- 68%, HINl-55%, CTGF-39%, MAL-91%, АРС-52%, RARp-45%. Гены GSTP1, NTRK2 и Р16 имеют низкую чувствительность - 30%, 27% и 9% соответственно.

Хотелось бы отметить, что гены RASSF1A, HIN1, MAL, APC и RARp имеют высокую чувствительность при анализе образцов карцином молочной железы на ранней стадии. Для гена RASSF1A чувствительность составила-91%, для гена HINl-55%, для гена MAL-91%, для гена АРС-64%, для гена RARP-45%.

Так как в нашем случае метилирование не было обнаружено ни в одном образце, специфичность составила 100%, прогноз для всей группы составил не менее 92% с вероятностью 95%.

Результаты расчетов диагностической чувствительности для генов OPCML, MAL, HIN1, DKK1 и BRCA1, использованных при анализе биопсийного материала пациентов больных раком яичников, представлены в виде графика на рисунке 2.

so 60 40 20

О

♦ По liCPM больным Н том числе: □ ljivirir.t I • Грунпя 2

Рис. 2. Распределение пациентов (%), у которых было обнаружено метилирование генов: OPCML, MAL, HIN1, BRCA1 и DKK1 для всех образцов карцином яичников, а также карцином яичников на ранней стадии (группа 1) и карцином яичников, находящихся на более поздних стадиях развития (группа 2).

Высокой чувствительностью обладают два гена: OPCML-79% и MAL-70%. Гены HIN1, DKK1 и BRCA1 имеют низкую чувствительность - 27%, 22% и 15% соответственно. Гены OPCML, MAL и HIN1 имеют высокую чувствительность при анализе образцов карцином яичников, находящихся на ранней стадии развития. Для гена OPCML чувствительность составила 81%, для гена HIN1-42%, для гена MAL-72%.

Метилирование не было обнаружено ни в одном образце лимфоцитов человеческой крови, поэтому специфичность составила 100%, прогноз для всей группы составил не менее 96,5% с вероятностью 95%.

Расчеты диагностической чувствительности во всей группе больных раком молочной железы и яичников для генов RASSF1A, APC, RARP, GSTP1, PI6, HINl, OPCML и BRCA1 совпали с уже известными данными литературы. Так, например, для гена RASSF1A была ранее показана диагностическая чувствительность - 62% при раке молочной железы (Dammann R. et al., 2001). Ген-супрессор опухолевого роста АРС метилирован в 36% случаев при раке молочной железы (Jin Z. et al., 2001). Диагностическая чувствительность для генов-супрессоров Р16, RARp и GSTP1 при раке молочной железы составляет 16%, 24% и 24% соответственно (Esteller M., et al. 2001). Метилирование промоторной зоны гена HIN1, являющегося кандидатом в гены-супрессоры опухолевого роста, составляет 73% при раке молочной железы (Shigematsu H., et al., 2005).

Для генов - кандидатов в гены-супрессоры опухолевого роста CTGF, MAL и NTRK2 диагностическая чувствительность 39%, 91% и 27% при раке молочной железы была показана впервые нами.

При раке яичников диагностическая чувствительность для гена -супрессора опухолевого роста BRCA1 составляет 31% (Esteller M. et al.

2000). Для гена - кандидата в гены-супрессоры опухолевого роста OPCML известен процент метилирования - 53% при раке яичников (Chen H., et al., 2007). Диагностическая чувствительность гена - кандидата в супрессоры опухолевого роста HIN1 при раке яичников составляет 10% (Wu Q. et al., 2007). Отметим, что для генов MAL и DKK1 диагностическая чувствительность 70% и 22% при раке яичников была показана нами впервые.

Данные, полученные при расчете диагностической чувствительности всех исследованных генов для обоих видов злокачественных новообразований, использовались при расчете тройных тестов с целью нахождения комбинации генов, максимально повышающих диагностическую чувствительность.

По результатам тройного теста наиболее высокая диагностическая чувствительность при раке молочной железы достигается при совместном метилировании генов RASSF1A, MAL, HIN1 и составляет 98%. Интересно, отметить, что это на 7% выше, чем максимальная диагностическая чувствительность для одного гена.

При раке яичников комбинация генов MAL, DKK1, BRCA1 дает диагностическую чувствительность 94%. Это значительно выше, чем максимальная диагностическая чувствительность для одного гена, которая составила 79%.

Таким образом, для достижения более высокой чувствительности при диагностике рака молочной железы представляется целесообразным использование генов RASSF1A, MAL, HIN1, а при диагностике рака яичников - генов MAL, DKK1, BRCA1.

Таким образом, можно заключить, что определение статуса метилирования новых кандидатов в гены супрессоры опухолевого процесса является перспективным направлением исследований с целью создания новых высокоэффективных диагностических тестов для выявления злокачественных новообразований.

Представляется обоснованным следующий дизайн исследования, реализованный в данной работе. На первом этапе - работа с существующими базами данных и выявление генов, имеющих нарушение уровня экспрессии в сторону его понижения при опухолевом процессе. Затем - исследование статуса метилирования промоторной зоны этих генов. На заключительном этапе необходимо провести оптимизацию панелей генов, при помощи анализа чувствительности и специфичности.

Реализация описанного подхода позволила нам предложить оптимальные наборы генов для диагностики злокачественных опухолей молочной железы и яичников. Комбинация RASSFA1, HIN1, MAL позволяет диагностировать опухоль молочной железы с чувствительностью 98%, а комбинация BRCA1, MAL, DKK1 - диагностировать злокачественную опухоль яичников с чувствительностью 94%.

ВЫВОДЫ

1. Промоторные области генов RASSF1A, Р16, RARß, APC, GSTP1, HINl, NTRK2, CTGF, MAL оказались не метилированы в образцах морфологически нормальной ткани молочной железы.

2. Гены RASSF1A, Р16, RARß, APC, GSTP1, HINl, NTRK2, CTGF, MAL были метилированы хотя бы в одной из пяти изученных клеточных линий рака молочной железы.

3. Bö всех образцах все проанализированные гены метилированы при злокачественных новообразованиях молочной железы, при этом гены RASSF1A, RARß, APC, HINl, CTGF и MAL имеют высокую диагностическую чувствительность, а гены GSTP1, NTRK2 и Р16 обладают низкой диагностической чувствительностью.

4. Наиболее высокая диагностическая чувствительность при раке молочной железы достигается при совместном метилировании генов RASSF1A, MAL, HINl и составляет 98%.

5. Промоторные области генов MAL, OPCML, HINl, BRCA1 и DKK1 были не метилированы во всех образцах лимфоцитов крови, полученных от людей без онкологических заболеваний.

6. Гены MAL, OPCML, HINl, DKK1 за исключением гена BRCA1 оказались метилированы хотя бы в одной из пяти исследуемых клеточных линий рака яичников.

7. Выявлено, что промоторные области всех проанализированных генов метилированы при злокачественных новообразованиях яичников, при этом гены OPCML и MAL имеют высокую диагностическую чувствительность, а гены HINl, BRCA1 и DKK1 обладают низкой диагностической чувствительностью.

8. Установлено, что при раке яичников оптимальная диагностическая чувствительность достигается комбинацией генов MAL, DKK1, BRCA1 и составляет 94%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Потапова, A.A. Изучение статуса метилирования генов: RASSF1 A, BRCA1, HIN1 в клеточных линиях опухолей молочной железы и яичников / А.А:Потапова, О.В.Островский // Студент и научно-технический прогресс: Материалы XLVI международной научной студенческой конференций. -Новосибирск, 2008. - С.42-43.

2. Потапова, A.A. Анализ метилированого статуса генов: RASSF1A, BRCA1, HIN1 для клеточных линий опухолей молочной железы и яичников / А.А.Потапова, О.В.Островский, Г.П.Дудченко // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета.- 2009.-№2. -С.20-22.

3. Early Detection and Staging of Cancer by Translational Molecular Genetic Analysis / A.M.Hoffinan, A.A.Potapova, I.Ibragimova, P.J.Cairns // Scientific Report. Fox Chase Cancer Center. - Philadelphia (USA), 2006. - P.298.

4. Identification of novel tumor suppressor genes by epigenetic reactivation screen of ovarian cancer / I.Ibanez de Caseres, A.M. Hoffinan, A.A. Potapova, T.A1-Saleem et al.// 97th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. - Washington (USA), 2006. - P.384-385.

5. A Profile of the Ovarian Cancer Cell Methylome for Translational Application / I.Ibanez de Caseres, A.M.Hoffman, A.A.Potapova, T.Al-Saleem et al. //15th SPORE meeting National Institutes of Health Baltimore. - USA, 2007. - P. 13.

6. Promoter hypermethylation of the PALB2 susceptibility gene in inherited and sporadic breast and ovarian cancer / A.A.Potapova, A.M.Hoffman, A.K.Godwin, T.Al-Saleem et al.// 99th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research -San Diego. - USA, 2008. - P.250.

7. Promoter Hypermethylation of the PALB2 Susceptibility Gene in Familial and Sporadic Breast and Ovarian Cancer /A.A.Potapova, A.M.Hoffman, A.K.Godwin, T.Al-Saleem et al.// Cancer Research. - 2008. - V.68.,№4 - P.998-1002.

Подписано к печати 09.09.2009. Объем -1 печ.л. Тираж 100. Заказ №240.

Отпечатано в ООО «Экспресс-печать» 400005, г. Волгоград, ул. Пражская, 12

Актуальность работы

Гормонозависимые опухоли, в том числе рак молочной железы и рак яичников, являются одной из главных причин смертности среди женщин от злокачественных новообразований. К сожалению, в последние годы наблюдается значительный рост обоих заболеваний (В.Ф. Семиглазов, 2008).

Из 10 млн. новых случаев злокачественных опухолей различных органов, выявляемых в мире, 10% приходится на молочную железу (Аксель Е.М., 2005). Если оценивать только женскую популяцию удельный вес рака молочной железы возрастает до 22%. В промышленно развитых странах удельный вес злокачественных новообразований молочной железы еще выше - 27%. В Российской Федерации ежегодно выявляется около 47 тыс. новых случаев этого заболевания. (В.Ф. Семиглазов, 2008). В то же время рак яичников занимает 3 место в структуре заболеваемости женских половых органов по России. При этом смертность от этого заболевания находится на 1 месте и составляет 43,1 % от общего числа умерших от злокачественных новообразований женских половых органов (В.А.Медик и др., 2001).

Скрытое течение обоих заболеваний и трудности в диагностике приводят к тому, что до 80% случаев выявляются на поздних стадиях, а смертность от них стойко опережает смертность от рака тела и шейки матки вместе взятых (В. М. Мерабишвили и др., 2001).

Надежды сократить число смертей от данных заболеваний основаны на раннем выявлении патологии, точности прогноза и эффективном лечении болезни в ее начальной стадии. В связи с этим, очевидна необходимость поиска и внедрения в клиническую практику новых методов, которые сделают возможным определение злокачественных новообразований на ранних стадиях развития.

Известно, что одной из важнейших причин перерождения нормальной клетки в неопластическую является нарушение функционирования генов-супрессоров опухолевого роста. Изменения в работе этих генов приводят к возникновению и прогрессии развития рака, а восстановление функции -к существенному замедлению пролиферации опухолевых клеток. Исследования последнего десятилетия показали, что наряду с генетическими событиями, обуславливающими инактивацию клеточных генов вследствие структурных изменений в ДНК, важную роль в процессе канцерогенеза играют также эпигенетические явления, не затрагивающие первичную структуру ДНК, но влияющие на экспрессию генов (Jones et al., 2002). Одним из таких эпигенетических изменений является локальное гиперметилирование специфических последовательностей - CpG-островков, расположенных в 5'-регуляторных районах многих генов, которое влечет за собой подавление экспрессии гена либо в результате прямого ингибирования связывания транскрипционных факторов с ДНК, либо в результате привлечения корепрессоров транскрипции (Klose et al., 2006). До сих пор остается открытым вопрос о механизмах инициации гиперметилирования CpG-островков в процессе образования опухоли.

На данный момент известен ряд генов-супрессоров опухолевого роста, экспрессия которых нарушена вследствие гиперметилирования их CpG-островков и выявлена их ассоциация с различными видами опухолей (Esteller et al., 2002). В настоящее время все более актуальным становится поиск новых, ранее неизученных генов-супрессоров опухолевого роста, метилирование которых специфично для опухолей определенных видов, т.к. результаты подобных исследований открывают новые возможности, как для изучения механизмов канцерогенеза, так и для разработки методов диагностики, мониторинга, прогноза и терапии опухолей.

Тема диссертации является составной частью плана научно-исследовательской работы Волгоградского государтсвенного медицинского университета и утверждена на заседании Ученого совета Волгоградского государственного медицинского университета (протокол № 9 от «16» мая 2007г.)

Цель исследования:

Целью данного исследования является анализ метилированого статуса генов-супрессоров опухолевого роста, а также новых кандидатов в гены-супрессоры опухолевого роста, которые могут являться потенциальными маркерами опухолей молочной железы и яичников.

Задачи исследования:

1. Подбор для исследования генов-супрессоров опухолевого роста, а также новых кандидатов в гены-супрессоры опухолевого роста путем скрининга существующих библиотек генов и научных статей, принимая за критерий отбора снижение или полное отсутствие экспрессии этих генов при опухолях молочной железы и яичников.

2. Анализ статуса метилирования отобранных генов в морфологически нормальных тканях, первичных опухолях и клеточных линиях карцином молочной железы и яичников.

3. Отбор генов инактивированных в опухолях в результате метилирования, но в тоже время не метилированых в морфологически нормальных тканях молочной железы и лимфоцитах человеческой крови.

4. Определение диагностической чувствительности и специфичности маркеров метилирования при анализе биопсийного материала карцином молочной железы и яичников.

5. Создание диагностических панелей из отобранных генов для анализа биопсийного материала, полученного от пациентов с опухолями молочной железы и яичников.

Научная новизна работы

В результате работы с научной литературой, для оценки статуса метилирования промоторной области генов супрессоров опухолевого роста при спорадическом раке молочной железы и яичников, были отобраны 12 генов. Все гены имеют в составе своих промоторов CpG-островки и транскрипционно активны в клетках морфологически нормальной молочной железы и поверхностном эпителии яичников.

При анализе статуса метилирования CpG-островков двенадцати отобранных генов в клеточных линиях рака молочной железы и яичников, а так же морфологически нормальной ткани молочной железы и лимфоцитах человеческой крови, было показано, что гены RASSF1 А, Р16, RARP, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL, OPCML и DKK1 метилированы в клеточных линиях, но не метилированы в норме.

Был проведен статистический анализ статуса метилирования генов RASSF1A, Р16, RARp, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL, BRCA1, OPCML и DKK1 в нормальных и клинических образцах рака молочной железы и яичников различных стадий. Результат наличия метилирования в клинических образцах и его отсутствие в нормальных образцах делает возможным использование генов RASSF1A, Р16, RARJ3, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL, BRCA1, OPCML и DKK1 в лабораторной диагностике рака молочной железы и яичников.

Практическая ценность работы

В результате проведенных исследований было показано, что комбинация генов RASSFA1, HIN1, MAL позволяет диагностировать опухоль молочной железы с чувствительностью 98%, а комбинация генов BRCA1, MAL, DKK1 - злокачественную опухоль яичников с чувствительностью 94%. Полученные данные являются экспериментальным обоснованием для разработки скрининговых тест-систем с целью диагностики рака молочной железы и яичников. Использование таких систем служит одним из новых молекулярно-биологических методов диагностики.

Материалы исследования также представляют интерес для получения новых дополнительных знаний об участии генов супрессоров опухолевого роста в процессе канцерогенеза, а также расширения понимания роли эпигенетических факторов в регуляции экспрессии этих генов при злокачественной трансформации клетки.

Реализация результатов исследования

Панели метилированных генов, составленные в результате проведенного исследования, используются в научной лаборатории ракового центра Фокс Чейз (Филадельфия, США) при анализе клинических образцов для изучения функционирования этих генов при раке молочной железы и яичников. А так же внедрены в практику работы Волгоградского Областного Онкологического диспансера.

Результаты исследования, отражающие молекулярные механизмы канцерогенеза и иллюстрирующие новые подходы в диагностике онкологических заболеваний включены в лекционные курсы по молекулярной биологии, медицинской генетики и клинической биохимии Волгоградского государственного медицинского университета и курсы лекций по клинической лабораторной диагностике Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. академика И.П.Павлова

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гены RASSF1A, Р16, RAR0, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF и MAL метилированы в клеточных линиях рака молочной железы, но не метилированы в морфологически нормальных тканях молочной железы.

2. Установлено наличие метилирования генов RASSF1A, RARj3, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF и MAL в образцах карцином молочной железы всех стадий.

3. Гены MAL, OPCML, HIN1, BRCA1 и DKK1 метилированы в клеточных линиях карцином яичников, но не метилированы во всех образцах лимфоцитов крови, полученных от людей без онкологических заболеваний.

4. Выявлено наличие метилирования генов MAL, OPCML, HIN1, BRCA1 и DKK1 в образцах карцином яичников всех стадий.

5. Диагностическая чувствительность панели генов (RASSF1 A, MAL, HIN1) для выявления рака молочной железы составляет 98%, а при раке яичников она достигает 94% в случае одновременного определения статуса метилирования комбинации генов MAL, DKK1, BRCA1.

Апробация работы

Основные результаты работы докладывались на международных конференциях: «97th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research» (Washington, DC, USA, April 1-5, 2006); «15th SPORE meeting National Institutes of Health (Baltimore, MD,USA, 2007); «99th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research» (San Diego, CA,

USA April 12-16, 2008); XLVI международная научная студенческая конференция "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2008).

Диссертация обсуждена на совместном заседании кафедр теоретической биохимии с курсом клинической биохимии, молекулярной биологии и генетики, биологии, патологической анатомии с участием НИИ фармакологии, ФГУЗ НИПЧИ (6 мая 2009 года, протокол № 14).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в реферируемых журналах.

Структура и объем диссертации

ВЫВОДЫ.

1. Промоторные области генов RASSFIA, Р16, RARp, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL оказались не метилированы в образцах морфологически нормальной ткани молочной железы.

2. Гены RASSFIA, Р16, RARp, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL были метилированы хотя бы в одной из пяти изученных клеточных линий рака молочной железы.

3. Во всех образцах все проанализированные гены метилированы при злокачественных новообразованиях молочной железы, при этом гены RASSFIA, RARp, АРС, HIN1, CTGF и MAL имеют высокую диагностическую чувствительность, а гены GSTP1, NTRK2 и Р16 обладают низкой диагностической чувствительностью.

4. Наиболее высокая диагностическая чувствительность при раке молочной железы достигается при совместном метилировании генов RASSFIA, MAL, HIN1 и составляет 98%.

5. Промоторные области генов MAL, OPCML, HIN1, BRCAl и DKK1 были не метилированы во всех образцах лимфоцитов крови, полученных от людей без онкологических заболеваний.

6. Гены MAL, OPCML, HIN1, DKK1 за исключением гена BRCA1 оказались метилированы хотя бы в одной из пяти исследуемых клеточных линий рака яичников.

7. Выявлено, что промоторные области всех проанализированных генов метилированы при злокачественых новообразованиях яичников, при этом гены OPCML и MAL имеют высокую диагностическую чувствительность, а гены HIN1, BRCA1 и DKK1 обладают низкой диагностической чувствительностью.

8. Установлено, что при раке яичников оптимальная диагностическая чувствительность достигается комбинацией генов MAL, DKK1, BRCA1 и составляет 94%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Характерной чертой опухолевых и трансформированных in vitro клеток млекопитающих является дисбаланс метилирования геномной ДНК, который вносит значительный вклад в создание генетической и фенотипической нестабильности. В тоже время, нестабильность 5-МеС в составе CpG динуклеотидов, приводящая к эпимутациям, может иметь тот же конечный результат. Таким образом, метилирование, являясь эпигенетической модификацией ДНК, может в случае нарушения приводить к генетическим изменениям, делая очевидной взаимосвязь между генетическими и эпигенетическими процессами при возникновении и развитии опухоли.Нарушение паттерна метилирования проявляется на ранних стадиях злокачественной трансформации клеток млекопитающих.

Таким образом определение статуса метилирования новых кандидатов в гены супрессоры опухолевого процесса является перспективным направлением исследований с целью создания новых высокоэффективных диагностических тестов для выявления злокачественных новообразований.

Представляется обоснованным следующий дизайн исследования, реализованный в данной работе. На первом этапе работа с существующими базами данных и выявление генов, имеющих нарушение уровня экспресии в сторону его понижения при опухолевом процессе. Затем исследование статуса метилирования промоторной зоны этих генов. На заключительном этапе необходимо провести оптимизацию панелей генов, при помощи анализа чувствительности и специфичности.

Реализация описанного подхода позволила нам предложить оптимальные наборы генов для диагностики злокачественных опухолей молочной железы и яичников. Комбинация RASSFA1, HTN1, MAL позволяет диагностировать опухоль молочной железы с чувствительностью 98%, а комбинация BRCA1, MAL, DKK1 позволяет диагностировать злокачественную опухоль яичников с чувствительностью 94%.