Возможности акустического метода определения биохимических и гематологических показателей крови

Тамарова, Елена Николаевна

Диссертации по медицине → Клиническая лабораторная диагностика

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Возможности акустического метода определения биохимических и гематологических показателей крови

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Тамарова, Елена Николаевна Москва 2006 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.46

Автореферат диссертации по медицине на тему Возможности акустического метода определения биохимических и гематологических показателей крови

На правах рукописи

ТАМАРОВА Елена Николаевна

ВОЗМОЖНОСТИ АКУСТИЧЕСКОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ И ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КРОВИ

14.00.46. - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -2005

Работа выполнена в ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Научный консультант:

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Долгов Владимир Владимирович

Клемин Виктор Александрович

Яровая Галина Алексеевна Титов Владимир Николаевич

Ведущая организация:

Главный военный госпиталь им.Н.Н.Бурденко МО РФ

Защита состоится « »

2006 г. в

часов на заседании

специализированного Совета Д.208.071.04. при ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава» по адресу: 123995, г. Москва, ул. Баррикадная, д.2/1.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава» по адресу: 125445, г. Москва, ул. Беломорская, д. 19.

Автореферат разослан «___»_2005г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Морозова В.Т.

<?K>06 - Ч 30//0

Актуальность темы

В настоящее время в лабораторной практике применяется большое количество методов определения биохимических показателей сыворотки крови: фотометрические, турбидиметрические, электрофоретические и т.д. (Меньшиков В.В., 2002). Большинство методов предполагает применение реактивов, а это значит, что исследования находятся в зависимости от наличия, стоимости и качества диагностических наборов. Более того, реагенты являются преобразователями первичного сигнала. Это привносит дополнительный этап в измерительную процедуру, что неизбежно сопровождается увеличением погрешностей лабораторных исследований (Тиц У., 2003). Для определения некоторых биохимических параметров требуется достаточно длительное время проведения анализа. При этом каждая из известных методик исследования биохимических показателей предназначена для определения только одного из компонентов сыворотки крови. Не существует единого метода определения сразу нескольких биохимических показателей в одном образце крови.

При исследовании цельной крови для анализа клеток крови с высокой точностью в небольшом объеме с 50-х годов прошлого столетия применяется технология автоматического анализа крови в гематологических анализаторах, что позволяет подвергать исследованию сразу большое количество клеток крови одного пациента (Каргопценко А.И., 1998). Однако до сих пор в лабораториях используются ручные методы подсчета клеток крови (эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов) в счетных камерах под микроскопом, что является трудоемким процессом с большим количеством ошибок. Более того, не существует методов одновременного определения скорости оседания эритроцитов (СОЭ) и показателей красной крови. Широко применяемый в нашей стране метод Панченкова для определения СОЭ не удовлетворяет современным требованиям к лабораторным исследованиям: он не автоматизирован, характеризуется низкой воспроизводимостью и подвержен влиянию человеческого фактора.

перспективности использования ультразвука для диагностики величины кровопотери у пострадавших при авариях, катастрофах, в анализаторах групп крови, для разрушения тромбов в сосудистой хирургии и т.п. (Haider L., Snabre Р., 2004; Gribaus Р., Kazhis R., 2005).

В последние годы отечественными производителями лабораторной техники был предложен акустический (ультразвуковой) метод и прибор для лабораторных исследований (Клемин В .А., Глазков ВЛ., 2005). Попытка применить ультразвуковые исследования в практике клинико-диагностических лабораторий обусловлена, прежде всего, надеждами на появление безреагентных методов исследования. Однако лабораторные аспекты новой технологии практически не разработаны.

Авторами акустического метода и прибора «БИОМ» /ЗАО «БИОМ»,

H.Новгород/ были предложены методики для определения:

• концентрации общего белка в сыворотке крови;

• фракций белков сыворотки крови;

• показателей липидного обмена;

• концентрации гемоглобина в стабилизированной крови;

• количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов в крови;

• СОЭ.

Большинство методик требовало уточнения и доработки, поэтому работа велась в тесном контакте с разработчиками.

Целью настоящей работы явилась оценка возможностей безреагентного еретического метода в лабораторной практике и анализ выборки для коррекции математических программ прибора «БИОМ». Задачи исследования:

I. Оценить область применения акустического метода при определении общего белка и белковых фракций.

2. Разработать методику анализа гематологических параметров цельной стабилизированной крови для одновременного определения в ней концентрации гемоглобина, подсчета лейкоцитов, тромбоцитов, эритроцитов и определения скорости оседания эритроцитов. Определить область применения акустического метода при гематологических исследованиях.

3. Проанализировать аналитические характеристики акустического метода (сходимость, воспроизводимость, диагностическая чувствительность, специфичность и т.д.) при определении биохимических и гематологических показателей.

4. Дать оценку возможности метода проводить многопараметровый одномоментный анализ крови, в том числе определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ).

5. Оценить особенности и ограничения акустического метода определения биохимических и гематологических показателей по сравнению с традиционными методами их определения.

Научная новизна

Впервые проведена оценка возможностей акустического безреагентного метода для определения в сыворотке пациентов концентрации общего белка и распределения белковых фракций, а в цельной крови - одномоментного определения гематологических показателей: концентрации гемоглобина, количества клеток крови, гематокрита, эритроцитарных индексов и скорости оседания эритроцитов. Определено место акустического метода в лабораторной практике на сегодняшний день. Акустический метод, принципиально отличный от традиционных, позволил без применения реактивов и дорогостоящей аппаратуры достаточно быстро получить некоторые биохимические и гематологические показатели, при этом часть из них - одномоментно.

Основные положения, выносимые на защиту

" Акустический метод исследования некоторых биохимических и гематологических показателей крови позволяет проводить скрининговые исследования сыворотки крови для выявления случаев шло- и пшерпротеинемий, анемических состояний, увеличения скорости оседания эритроцитов.

■ Акустический метод позволяет проводить одномоментный многопараметровый анализ, как сыворотки, так и цельной крови.

■ Акустический метод может предшествовать биохимическому и гематологическому анализу в тех же образцах крови.

■ Ограничения акустического метода связаны с невозможностью применения дня акустики стандартных контрольных материалов, что не позволяет использовать его в качестве референтного.

Практическая значимость полученных результатов

■ Реализованный в приборе отечественных производителей «БИОМ» акустический метод стал применяться в клинико-диагностических лабораториях для скрининга гипо- и гиперпротеинемий, скрининга анемических состояний, определения СОЭ и т.д., благодаря тому, что принципиально иные сигналы о свойствах крови были сопоставлены с традиционными показателями, привычными и понятными для врачей.

■ В ходе клинических испытаний данного метода были написаны методические указания для определения акустическим методом концентрации общего белка и белковых фракций в сыворотке крови, а так же для определения показателей красной крови и скорости оседания эршроцигов в цельной крови.

■ Благодаря систематическому анализу данных исследования сыворотки и крови пациентов, удалось усовершенствовать математическую модель для определения биохимических показателей крови, а также внести значительный вклад в разработку методики определения гематологических параметров крови, включая скорость оседания эритроцитов.

Личный вклад соискателя

Автором лично проведены исследования всех образцов сыворотки крови и цельной крови акустическим методом и параллельно традиционными средствами. Также проведено сравнение между собой двух распространенных методов измерения скорости оседания эритроцитов. Автор самостоятельно осуществил всю необходимую статистическую обработку, активно участвовал в создании базы данных для усовершенствования математической модели акустического прибора. Автором написаны методические указания по использованию акустического прибора «БИОМ» для определения концентрации общего белка и белковых фракций сыворотки и гематологических показателей цельной крови.

Внедрение результатов исследования

Результаты работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий по теме «Современные методы в биохимической лаборатории» на кафедре клинической лабораторной диагностики ГОУ ДПО «РМАПО Росздрава» (ректор - академик РАМН, профессор Мошетова Л.К., зав. кафедрой • профессор Долгов В.В.), внедрены в практику клинико-диагностической лаборатории ЗАО «Вымпел-медцеитр (Ген. директор- Кудряшов С.П.).

Апробация работы

Материалы проводимой работы были представлены на 7-м Балтийском конгрессе по лабораторной медицине (Пярну, 2004), Национальных днях лабораторной медицины (Москва, 2004), конференции "Стандарты и протоколы лабораторной диагностики" (Москва, 2005), 16-м Европейском конгрессе по клинической химии и лабораторной медицине (Глазго, 2005).

Апробация диссертации состоялась на научной конференции кафедры клинической лабораторной диагностики РМАПО 27.06.2005.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, изданных в отечественной (3) и зарубежной печати (3).

Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен на 134 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает в себя 137 источников (70 отечественных и 67 зарубежных публикаций). Диссертация иллюстрирована 18 таблицами, 36 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

■ Материалы исследования

Материалом исследования служили сыворотка крови и цельная венозная кровь, стабилизированная К2ЭДТА (случайная выборка на начальных этапах работы и прицельная затем - для внесения корректив в программы). Образцы были получены у пациентов многопрофильной больницы им. С.П.Боткина (зав. клинико-диагностической лабораторией В.И.Коровина). Все образцы крови подвергались исследованию в тот же день. Исследовано 367 проб сыворотки крови и 1000 проб цельной крови акустическим методом и параллельно традиционными.

■ Акустический метод исследования

Метод акустического интерферометра постоянной длины (прецизионный резонаторный метод), реализованный в приборе отечественных производителей "БИОМ" для лабораторных исследований /ЗАО «фирма БИОМ», Н.Новгород/ основан на том, что столбик исследуемой жидкости, находящейся в цилиндрической полости между двумя пьезопреобразователями, является механическим резонатором, собственные частоты которого линейно связаны со скоростью ультразвука в исследуемой среде. Измерение скорости ультразвука в жидкости, заполняющей ячейку, сводится к определению частоты заданного резонансного пика по максимуму амплитудно-частотной характеристики или по точке перегиба на фазово-частотной характеристике (рис.1). Одновременно измеряется ширина резонансного пика на уровне 0,707 от максимума амплитуды или крутизна фазово-частотной характеристики в точке перегиба, связанные с величиной поглощения ультразвука.

Ubx/Ч

(п+/)Я

пя

i з г

частота

Рис. 1. Схематическое изображение резонаторной ячейки (А) и участок ее фазо-и амплитудно-частотной характеристик (В).

1, 2 - пьезопреобразователи; 3 - цилиндрический корпус с высокопараллелъными торцевыми плоскостями; Uex - амплитуда входящего ультразвукового сигнала; ивых - амплитуда сигнала на выходе; <р - фаза; по оси абсцисс - частота УЗ (КГц). Микро-ЭВМ прибора получает информацию о резонансной частоте, максимальной амплитуде, ширине резонансного пика, и, следовательно, определяет скорость УЗ в данной среде и величину его поглощения Математическая модель позволяет представить эту информацию на выходе в привычной для врана форме (концентрации).

Прибор проводит последовательное измерение резонансных частот термостатируемых акустических ячеек с дистиллированной водой и исследуемой средой, выражает связь между этими характеристиками через АКП (акустический параметр) и позволяет выразить изменения в биосреде после различных воздействий, а также определять концентрацию веществ в биосредах после предварительной градуировки анализатора. Прибор подключен к персональному компьютеру (ПК), который в результате обработки полученных данных при помощи оригинальных математических моделей (решения системы линейных уравнений) выдает информацию в привычном для врача и исследователя виде.

■ Методы сравнения

В качестве метода сравнения для определения концентрации общего белка был взят биуретовый метод с использованием диагностических наборов Vital Diagnostics /Россия/ на биохимическом анализаторе Eos-bravo /Италия/.

Разделение белковых фракций проводилось в агарозном геле при помощи электрофоретической системы "Paragon" / "Beckman", США/ с дальнейшим денситометрированием на аппарате "Apprise" той же фирмы.

Гематологические показатели образцов цельной крови определялись на гематологическом анализаторе "Sysmex 8Е-9000"/Япония/, где концентрация гемоглобина определялась фотометрическим методом, подсчет клеток крови -кондуктометр ическим.

Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) определялась методом Панченкова и Вестергрена (Westergren).

■ Контрольные материалы

При работе использовались контрольные материалы (KM) Serodos и Serodos phis /Ншпап,Германия/, Normal Protein Electrophoresis Control /"Beckman, США/, Abnormal Protein Electrophoresis Control /"Beckman, США/, Lyphochek /BIO-Rad, США/, Randox /Великобритания/, а также сливная сыворотка.

■ Статистический анализ данных

Статистический анализ проводился с использованием программы "STATISTTCA 6.0". При этом определялись средние значения в группе, ошибки средней, коэффициент вариации, смещение, коэффициенты корреляции Пирсона и Спирмена с проверкой статистической значимости и т. д Для проверки гипотез о различии результатов в двух группах применялись непараметрические критерии: Т-критерий Манна-Уитни с поправкой Йетса и критерий Уилкоксона.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Применение данного акустического метода и прибора «БИОМ», несомненно, имеет свое место среди современных лабораторных исследований. Сравнение с традиционными методами с дальнейшим статистическим анализом данных показали, что метод работает успешно при определении многих показателей. При этом некоторые показатели совпадают с традиционными методами с высокой корреляцией, другие - имеют значительные расхождения. Невозможно утверждать хуже ли данный метод, либо лучше, так как в основе работы прибора лежат принципиально другие механизмы анализа биожидкостей, соответственно, полученную информацию, и трактовать следует иначе. Попытка же привести

полученные данные под стандартную форму выдачи результата в виде перечисления показателей крови в привычных единицах измерения, скорее дань традиции и возможность убедиться, что метод работает. В отличие от биохимических методов, где определяется состав крови, акустический метод анализирует структуру макромолекул по их гидрофильным и гидрофобным свойствам.

При определении концентрации общего белка акустическим методом на приборе «БИОМ» были получены достаточно высокие аналитические характеристики. Коэффициент корреляции с биуретовым методом составил 0,98 (р<0.05). Коэффициент вариации и смещение не превышали предельно допустимых значений по ОСТ 91500.13.0001-2003 (приказ №220 МЗ РФ от 26.05.03). (CVio=l,7%; Вю=-3,0 в контрольном материале "Serodos" /Human, Германия/) (рис.2, табл. 1). При этом чувствительность метода позволила определять значения концентрации белка в диапазоне 10-150 г/л (при норме по этому показателю 60-85 г/л), линейность метода сохранялась во всем диапазоне рассмотренных значений.

Концентрация общего бшю

Рис. 2. Графическое представление о регрессионной зависимости значений концентрации общего белка, полученной двумя сравниваемыми методами. По оси абсцисс - значения, полученные три определении традиционным биуретовым методом, по оси ординат-акустическим методом (прибор «БИОМ»).

Таблица 1.

Коэффициенты вариации и смещение, полученные при определении концентрации общего белка в контрольном материале «Бегодов»/Нитап, Германия/ и сливной сыворотке акустическим методом.

"Serados" Сливная сыворотка Предельные допускаемые значения по ОСТ 91500.13.0001-2003

С Vio, % Bio, % CVio, % CVio, % В|0,%

Сходимость 0,26 0,23

Воспроизводимость 1,7 -3 0,72 3 ±5

Полученные статистические характеристики не превышают предельно-допустимых значений по ОСТ 91500.13.0001-2003. Более высокие цифры для Serados объясняются видимо, тем, что эта сыворотка не является нашивной (неизмененной), и через 2-3 дня показатели прибора становятся нестабильными (увеличивается разброс значений).

Таким образом, было показано, но прибор «БИОМ» может быть применен для определения концентрации общего белка сыворотки крови наряду с биуретовым и другими методами. Более того, выяснилось, что потенциально метод может работать и с более низкими концентрациями белка, то есть с большей чувствительностью, а это, в свою очередь, значительно расширяет возможности применения метода в лабораторной практике (рис.3).

При дальнейшем усовершенствовании акустический метод сможет работать для определения других индивидуальных белков, например, а2 -макроглобулина, гаптоглобина, альбумина и т.п. Кроме того, определение концентрации белка не менее актуально и в других биожидкостях организма, например, моче, транссудатах, воспалительных экссудатах и т.д.

Зависимость показаний прибора от разведения в одной и той же сыворотт

Доля цельной сыворотки в пробе, %

Рис. 3. Зависимость показаний прибора от разведения в одной и той же сыворотке. Линейная зависимость выполняется лишь в первых нескольких разведениях (примерно до 15 г/л).

Концентрация белка в сыворотке определялась та приборе «БИОМ» в течение 1 минуты. При этом прибор не требовал применения каких либо реактивов, следовательно, решал одномоментно массу различных проблем, таких как адаптация диагностических наборов к конкретному анализатору, проведение ежедневного контроля качества измерений, соблюдение сроков и условий хранения диагностических наборов и т.п. Следует отметить, что метод является уникальным способом одномоментного (одновременного) определения сразу нескольких показателей сыворотки в короткие сроки (При определении концентрации общего белка сыворотки на экран ПК выводятся данные по липидному обмену данного пациента).

При определении белковых фракций результаты были получены через 10-15 минут для каждого образца, в отличие от электрофоретического способа разделения белковых фракций, где необходимо не менее 2-3 часов для исследования, а затем еще и денситометрирование результатов. При этом удавалось решить еще одну проблему. Диагностические наборы для электрофоретического разделения рассчитаны на одновременное исследование 8-

10 образцов сыворотки, таким образом, в небольших лабораториях приходится ждать наличия сразу нескольких пациентов в целях экономив расхода наборов. С другой стороны, полученное распределение белковых фракций на приборе «БИОМ», оказалось достаточно трудно оценить, хотя результат, благодаря программному обеспечению прибора, было представлен в виде графика распределения белка на 5 фракций и концентрации каждой фракции в абсолютных (г/л) и относительных (%) единицах измерения, т.е. в привычном для врача виде (как при электрофорезе). Дело в том, что сравнение проводилось с электрофоретическим методом, который сам является лишь ориентировочным, с большим допустимым разбросом значений, определения индивидуальных же белков не проводилось ввиду их большого разнообразия. Тем не менее, оценка этих показателей была проведена. Характерные изменения белковых фракций при патологии выявлялись акустическим методом с достоверной корреляцией с электрофоретическим методом и высокой чувствительностью практически во всех группах сравнения. Для альбумина коэффициент корреляции составил 0,77, для а, -фракции глобулинов - 0,47, для у- фракции - 0,92. Достоверной корреляции с электрофорезом для а2- и -фракций глобулинов выявлено не было. В случаях нефротического синдрома прибор четко указывал на увеличение фракций аг,, аг и р на фоне снижения альбумина и у-пюбулинов, что соответствует характерным изменениям при этих состояниях. У пациентов с синдромом острого и хронического воспаления (по данным электрофоретического распределения) характер сдвига белкового спектра по сравнению с контрольной группой также достоверно совпадал с прибором «БИОМ».

В случае присутствия в сыворотке парапротеинов акустический метод работал с достоверной чувствительностью далеко не всегда. В группе пациентов с содержанием общего белка более 85 г/л и концентрацией парапротеина более 20 г/л чувствительность метода достигала 94%, в случаях же более низких концентраций парапротеина и значений общего белка в диапазоне нормы, что встречается у пациентов на фоне лечения, чувствительность была очень низкой для этого показателя (около 15%). В связи с вышесказанным, не рекомендуется применять прибор «БИОМ» в настоящем исполнении в гематологических отделениях и центрах.

Так же, как и в случае определения концентрации общего белка, при определении белковых фракций лишь в контрольном материале «Бепхкю» /Ншпап, Германия/ и сливной сыворотке самостоятельного приготовления были получены стабильные результаты, позволившие сделать оценку воспроизводимости и правильности измерений. Значения коэффициента вариации (СУю ) и смещения (Вю) не превышали предельно-допустимых значений по ОСТ 91500.13.0001-2003 для сливной сыворотки, в контрольном материале «Бегоёоз» значения превышали рекомендуемые по альбумину и а,-глобулинам. При этом и в контрольном материале «$егос1о5» /Ншпап, Германия/ показатели становились нестабильными через 3-4 дня исследований. Нет уверенности в том, что этот контрольный материал другой серии или партии будет работать с акустическим методом, так как он также является лиофилизиро ванным. В связи с этим, перед разработчиками метода была поставлена задача дальнейшего поиска путей контроля работы акустического метода. Чувствительность метода по отношению к белковым фракциям оценить оказалось сложно ввиду огромного количества возможных вариантов изменения белковых спектров.

Тем не менее, в работе было показано, что акустический прибор «БИОМ» способен выполнять в клинико-диагностических лабораториях скрининговые исследования сыворотки крови для выявления случаев гипо- и гиперпротеинемий, а также некоторых видов диспротеинемий, например, нефротического синдрома, случаев парапротеинемий (рис 4).

80 * 60

•I 40 £

а 20

УЗ

□ норма С1нефротич.с-м

гПгпГИ

альб. альфа1 альфа2 бета гамма ЭФ

Внорма Пнефротич с-м

альб альфа1 альфа2 бета гамма

Рис.4. Изменение соотношения фракций по сравнению с контрольной группой для каждого метода УЗ - акустический прибор «БИОМ»; ЭФ - распределение белковых фракций на электрофоретической системе «Paragon»(USA). По оси абсцисс - 5 белковых фракций сыворотки крови; по оси ординат - доля фракции от концентрации общего белка в сыворотке(%). Указаны средние значения по группе. Видно, что тенденции изменений однотипны для двух методов.

Для определения гематологических показателей акустическим методом была разработана методика, позволившая работать с цельной кровью. Аналитические характеристики для определения концентрации гемоглобина и других показателей определялись в образцах крови пациента путем десятикратного измерения, так как и для гематологических показателей не существует аттестованных контрольных материалов для акустического метода. Значения коэффициента вариации (СУШ) и смещения (Вю) не превышали предельно-допустимых значений по ОСТ 91500.13.0001-2003 . СУю=0,5%; Вю=-1,25. Линейность метода для гемоглобина сохранялась в диапазоне 20-180 г/л, что говорит о высокой чувствительности

метода по этому показателю. Таким образом, точность определения гемоглобина акустическим методом фактически не уступала современным гематологическим анализаторам, при этом, как и в случае определения концентрации общего белка, не требовалось наличия реактивов. Было показано, что акустический прибор «БИОМ» позволяет в настоящее время проводить многопараметровый анализ цельной крови, приближаясь тем самым к гематологическим анализаторам. Одновременно с концентрацией гемоглобина в том же образце осуществлялся подсчет клеток крови (ЯВС, \УВС, РИ-Т), определение гематокрита, расчет эритроцитарных индексов (МСН, МСНС, МСУ), а также фиксировалась скорость оседания эритроцитов (СОЭ)(рис.5). Всего было проанализировано 5 вариантов математических программ акустического прибора для гематологических исследований. Важным отличием прибора «БИОМ» от гематологических анализаторов является возможность одновременного определения в том же образце крови СОЭ в течение 3 минут исследования. Для определения СОЭ традиционными методами обычно необходимо не менее 1 часа. Была получена статистически значимая корреляция акустического метода определения СОЭ с методом Вестергрена (\Vestergren) в диапазоне значений 1-100 мм/ч (11=0,89; р<0.05)(рис.6). Благодаря этому результату удалось уйти от применения широкораспространенного в нашей стране метода Панченкова, который не автоматизирован и имеет большое количество источников ошибок. На начальных этапах разработки этой методики был проведен отдельный эксперимент по сравнению между собой методов Панченкова и \Vestergren (п=150) для решения вопроса о выборе референтного метода сравнения. В диапазоне нормальных значений (1-20 мм/час) была отмечена линейная корреляция (11=0,98; р<0.05), в области патологии (значения СОЭ более 20 мм/ч) корреляция также не вызывала сомнения, хотя уже не была линейной. Было решено в качестве референтного метода принять метод >Уе51ецре11, как рекомендованный международным комитетом по стандартизации. Ложного повышения значений СОЭ выявлено не было во всем диапазоне рассматриваемых значений (1-170 мм/ч), что говорит о высокой специфичности метода по этому показателю. До сих пор не существовало метода, позволяющего определять СОЭ одновременно с другими показателями крови. Исследуемый метод, кроме того, способен фиксировать кинетику осаждения

эритроцитов, что может дать дополнительную информацию исследователю о процессах, протекающих в крови пациента. Имея такую возможность, можно использовать данную технологию, например, для изучения процессов свертываемости крови и т.п.

При подсчете количества эритроцитов (КВС) корреляция К с гематологическим анализатором "вуяпех 8Е-9000"/Япония/ составила 0,74-0,87 в разных вариантах программы). Этого оказалось достаточно, чтобы прибор «БИОМ» с высокой точностью определял показатели красной крови в образцах в течение 5-10 минут и оценивал степень анемии. Для гематокрита коэффициент корреляции составил 0,98 во всем диапазоне значений. Следует отметить, что показатели эритроцпгарных индексов крови (МСУ, МСН, МСНС) значительно отличались от показателей гематологического анализатора, следовательно, пока нельзя говорить о способности прибора «БИОМ» проводить дифференцировку анемий по содержанию гемоглобина в эритроцитах и контролировать эффективность лечения анемических состояний в той мере, что позволяют анализаторы. Все случаи гипо- и гиперхромных анемий «БИОМ» трактовал как нормохромные. С одной стороны, дело в том, что эти показатели расчетные, строго связаны с показателем гематокрита и количеством эритроцитов, и малейшие расхождения с гематологическим анализатором по этим показателям ведут к значительным отличиям после арифметических действий. С другой стороны, такие расхождения могут быть связаны и с самим принципом определения акустических характеристик. Объем клеток крови акустический метод определяет не по диаметру, как кондуктометрический, а ан&пизнруя прошедший через клетки сигнал. В настоящее время коэффициент корреляции по эритроцитарным индексам составила не более 0,5. Таким образом, не удалось применить акустический метод для дифференциальной диагностики анемий. Однако, авторы методики («ЗАО БИОМ», Н.Новгород) говорят о том, что найден подход для прямой оценки среднего объема эритроцитов (МСУ) по акустическим параметрам. В случае успеха, остальные эритроцитарные индексы будут просто пересчитаны.

Рис. 5 . Данные, полученные при помощи программы №5 для гемоглобина, количества эритроцитов и гематокрита Сравнение двух методов. По оси абсцисс - традиционный метод (гематологический анализатор "Эувтех 8Е-9000"); по оси ординат - акустический метод (прибор "БИОМ").

К-сожалению, к настоящему времени не удалось достигнуть успеха в определении количества лейкоцитов (\УВС) и тромбоцитов (РЬТ) с высокой точностью акустическим методом на приборе «БИОМ». Процесс пробоподготовки для таких исследований оказался неоправданно длительным и кропотливым, а корреляции с гематологическим анализатором недостаточны. Таким образом, прибор «БИОМ» пока не может быть рекомендован для определения количества лейкоцитов и тромбоцитов в образцах крови.

Метал ИМагдгм.мм'ч

Рис.6. Сравнение акустического метода определения СОЭ и метода ФеМег^еп. К=0,89.

К-сожаленшо, к настоящему времени не удалось достигнуть успеха в определении количества лейкоцитов (\УВС) и тромбоцитов (РЬТ) с высокой точностью еретическим методом на приборе «БИОМ». Процесс пробоподготовки для таких исследований оказался неоправданно длительным и кропотливым, а корреляции с гематологическим анализатором недостаточны. Таким образом, прибор «БИОМ» пока не может быть рекомендован для определения количества лейкоцитов и тромбоцитов в образцах крови.

На последних этапах работы были обследованы акустическим методом пациенты отделения гемодиализа, у которых обычно присутствуют значительные сдвиги лабораторных показателей цельной крови н сыворотки. Исследуемый метод успешно справился с поставленной задачей с высокой точностью и достоверностью. Были выявлены характерные изменения по липидному и белковому обмену, а также степень анемии. Было проведено повторное обследование пациентов через 3 месяца, и показана возможность использования данного метода и прибора «БИОМ» для наблюдения пациентов в динамике.

Среди преимуществ акустического метода следует отметить также возможность использования сыворотки после акустического воздействия для

других биохимических исследований, автоматическое сохранение всех показателей в базе данных компьютера, возможность поиска и распечатки результатов в любое время. Были выявлены и некоторые серьезные ограничения метода, например возможность исследования только свежей крови объемом не менее 1 мл и т.д.

Выводы

1. Акустический метод способен проводить скрининговый анализ сыворотки крови для выявления rano- и гиперпротеинемий, а также диспротеинемических состояний: нефротичесного синдрома, синдромов острого и хронического воспаления, случаев появления парапротеинемий. При определении концентрации общего белка коэффициент корреляции R с традиционным биуретовым методом составил 0,98 (р<0,05). Метод позволил выделить в течение 10 минут 5 белковых фракций в относительных (%) и абсолютных (г/л) единицах измерения. Коэффициент корреляции меящу акустическим и электрофоретическим методами для альбумина составил 0,77; для -фракции глобулинов 0,47, для у- фракции 0,92.

2. Разработана методика определения гематологических показателей крови акустическим методом, которая позволяет определять в цельной крови концентрацию гемоглобина, количество эритроцитов, показатель гематокрита и скорость оседания эритроцитов (СОЭ). Достигнуты коэффициенты корреляции между акустическим методом и методами, реализованными в гематологическом анализаторе Sysmex-SE 9000 для гемоглобина 0,98; для эритроцитов 0,74-0,87 в разных вариантах программы, гематокрита 0,98; и для скорости оседания эритроцитов с методом Вестергрена 0,89 (р<0,05). В настоящем виде акустический метод не дает надежных диагностически-значимых результатов при подсчете количества лейкоцитов и тромбоцитов в цельной крови, а также при определении эритроцитарных индексов (среднего объема эритроцитов, средней концентрации гемоглобина в эритроцитах, среднего содержания гемоглобина в эритроцитах).

3. Коэффициент вариации CV и смещение В при определении в сыворотке концентрации общего белка и распределения белковых фракций, концентрации гемоглобина и количества эритроцитов в цельной крови не превышали

предельных допускаемых значений этих показателей (ОСТ 91500.13.00012003). Линейность метода выполнялась в диапазоне значений концентрации общего белка 10-150 г/л, гемоглобина 20-180 г/л, количества эритроцитов (0,65,6)* 10"/л; гематокрита 14-50%. Диагностическая чувствительность метода по отношению к парапротеинам, в целом, недостаточна, хотя при миеломной болезни с содержанием общего белка более 85 г/л и концентрация парапротеина более 20г/л чувствительность метода достигала 94% при специфичности, близкой к 100%. Не рекомендуется применять акустический метод в гематологических отделениях.

4. Акустический метод способен выполнять многопараметровый анализ сыворотки крови для одномоментного определения в ней показателей белкового и липидного обмена, а в цельной крови - для определения скорости оседания эритроцитов и показателей красной крови в одном и том же образце, в том числе и в случаях значительных отклонений от нормы ряда показателей, а также дня наблюдения пациентов в динамике.

5. В ходе испытаний акустического метода определения биохимических и гематологических показателей при помощи прибора «БИОМ» был выявлен ряд важных особенностей н ограничений.

■ Для определения большинства параметров сыворотки и цельной крови не нужны реактивы (кроме белковых фракций), следовательно, исследованию подвергается неизмененная биожидкость.

■ После акустического метода исследования сыворотку крови можно использовать для фугах биохимических тестов.

■ Для исследования применяется только свежая неизмененная сыворотка (возможно хранение в холодильнике при 1=3-5°С до 3 дней), либо свежая цельная кровь, стабилизированная К2 ЭДТА.

Практические рекомендации

1. Акустический метод определения биохимических показателей крови рекомендуется для скрининговых исследований сыворотки крови с целью выявления случаев гипер- и гипопротеинемий.

2. Акустический метод определения гематологических показателей цельной крови может быть использован для одновременного определения в

стабилизированной цельной крови концентрации гемоглобина, выявления случаев анемий, определения СОЭ.

3. Для определения белковых фракций и выявления парапротеинемий акустический метод обладает недостаточной чувствительностью.

4. 6 качестве контроля сходимости и воспроизводимости рекомендуем применение свежей сыворотки и цельной крови. Ввиду отсутствия на данном этапе аттестованных контрольных материалов для акустического метода рекомендуем применение контрольного материала «Serodos» / Германия/ с дополнительным измерением показателей традиционными методами.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Tamarova Е., Dolgov V., Roitman A., Klemin V. Acoustic measurement of total protein concentration and a serum protein separation. // Clinical Chemistry and Laboratory Medicine.- 2003,- V.41.- S232.

2. Тамарова E.H., Клемин B.A., Ройтман А.П., Долгов В.В. Акустическое определение концентрации общего белка и белковых фракций сыворотки крови. // Клиническая лабораторная диагностика. Тез. Национальных дней лабораторной медицины (Москва, 2004)- 2004.- №10.- С.56.

3. Tamarova Е., Klemin V., Dolgov V. Acoustic measurement of hemoglobin concentration and other parameters of blood without reagents./ The 7-th Baltic Congress in Laboratory Medicine, abstract Estonia.- 2004.- P. 137.

4. Долгов B.B., Тамарова E.H., Клемин B.A. Безреагентный способ определения биохимических и гематологических показателей крови. // Здравоохранение и медицинская техника,- 2005.- №2.- С.6.

5. Тамарова Е.Н., Клемин В.А., Ройтман А.П., Долгов В.В. Акустическое (ультразвуковое) определение общего белка и белковых фракций сыворотки крови. // Клиническая лабораторная диагностика.- 2005,- №2,- С. 12-18.

6. Tamarova Е., Dolgov V., Klemin V. Acoustic measurement of erythrocyte sedimentation rate and other parameters of blood without reagents. // Clinica Chimica Acta.- 2005.-V. 355/S.- S.297.

Перечень сокращений.

СОЭ - скорость оседания эритроцитов; HGB (hemoglobin) - концентрация гемоглобина; HCT (hematocrit) - гематокриг, RBC (red blood count) - количество эритроцитов

МСН (mean corpuscular hemoglobin) - среднее содержание гемоглобина в эритроцитах; МСНС (mean corpuscular hemoglobin concentration) - средняя концентрация гемоглобина вэртроцвгс;

MCV (mean corpuscular volume) - средний объем эритроцита.

РНБ Русский фонд

2006-4 30110

Заказ №638. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ra

Оглавление диссертации Тамарова, Елена Николаевна :: 2006 :: Москва

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1.1. Акустические методы исследования.

1.2. Диагностическое значение фракционирования белков. Известные методы.

1.3. Современные методы в гематологии.

1.3.1. Определение гемоглобина.

1.3.2. Подсчет клеток крови.

1.3.3. Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ).

Глава II. Материалы и методы.

2.1. Материалы исследования.

2.2. Акустический метод исследования биожидкостей.

2.2.1. Принцип метода.

2.2.2. Акустическое определение биохимических показателей.

2.2.3. Акустическое определение гематологических показателей

2.3. Методы сравнения.

2.4. Контрольные материалы.

2.5. Статистический анализ данных.

Глава III. Определение биохимических показателей крови.

3.1. Определение концентрации общего белка.

3.2. Количественный и качественный анализ полученных белковых спектров.

Глава IV. Оценка гематологических показателей крови.

4.1. Оценка показателей красной крови.

4.2. Скорость оседания эритроцитов.

4.3. Подсчет лейкоцитов и тромбоцитов.

Глава V. Дополнительные сведения.

5.1. Комплексное обследование пациентов (одновременное определение нескольких показателей крови).

5.2. Особенности и ограничения акустического метода.

5.2.1. Особенности метода.

5.2.2. Ограничения метода.

Обсуждение.

Выводы.

Введение диссертации по теме "Клиническая лабораторная диагностика", Тамарова, Елена Николаевна, автореферат

В настоящее время в лабораторной практике применяется большое количество методов определения биохимических показателей сыворотки крови: фотометрические, турбодиметрические, электрофоретические и т.д. [21, 24, 32, 41, 60, 61]. Большинство методов предполагает применение реактивов, а это значит, что исследования находятся в зависимости от наличия, стоимости и качества диагностических наборов. Более того, реагенты являются преобразователями первичного сигнала, что привносит дополнительный этап в измерительную процедуру, что неизбежно сопровождается увеличением погрешностей лабораторных исследований [16, 61]. Для определения некоторых биохимических параметров требуется достаточно длительное время проведения анализа [52, 62, 64]. При этом каждая из известных методик исследования биохимических показателей предназначена для определения только одного из компонентов сыворотки крови. Не существует единого метода определения сразу нескольких биохимических показателей в одном образце крови.

Многие физиологические и патологические процессы в организме протекают при непосредственном участии белков [21, 34, 60]. Белки поддерживают коллоидно-осмотическое давление плазмы крови, осуществляют транспорт многих эндо- и экзогенных веществ (гормонов, липидов, лекарственных средств), являются ферментами, факторами свертывания крови и так далее. И хотя на сегодняшний день возможна идентификация и количественное определение многих индивидуальных белков [24, 35, 107], определение общего белка сыворотки крови по-прежнему актуально в скрининговых исследованиях. Важным тестом является и фракционирование белков, так как при многих состояниях возникает диспротеинемия с сохранением концентрации общего белка в диапазоне нормальных значений [21, 25, 60]. В этой ситуации очевидна необходимость проведения биохимического скрининга для распределения белковых фракций. В некоторых странах эта задача решается при помощи электрофоретического разделения белковых фракций сыворотки крови. Однако в нашей стране этот метод не получил широкого распространения ввиду трудоемкости и дороговизны, и фактически как скрининг не применяется [27]. В связи с этим, перспектива появления нового метода с целью биохимического скрининга диспротеинемий вполне актуальна [29].

При исследовании цельной крови сложилась следующая ситуация. Для анализа клеток крови с высокой точностью в небольшом объеме с 50-х годов прошлого столетия применяется технология автоматического анализа крови в гематологических анализаторах, что позволяет подвергать исследованию сразу большое количество клеток крови одного пациента [17, 31, 39, 41]. Однако до сих пор сохраняются ручные методы подсчета клеток крови (эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов) в счетных камерах под микроскопом, что является трудоемким процессом с большим источником ошибок [52, 90]. Более того, не существует методов одновременного определения скорости оседания эритроцитов (СОЭ) и показателей красной крови [11, 36, 38, 40]. Широко применяемый в нашей стране метод Панченкова для определения СОЭ не удовлетворяет современным требованиям к лабораторным исследованиям, так как он не автоматизирован и, следовательно, не оснащен системой автоматического документирования результатов [17, 41].

В то же время, современные ультразвуковые технологии являются объективными методами исследования некоторых количественных и качественных особенностей такой сложной биологической среды как кровь [30, 42, 45, 48, 96]. При анализе литературы последних лет встретились сообщения о перспективности использования ультразвука для диагностики величины кровопотери у пострадавших при авариях, катастрофах, в анализаторах групп крови, для разрушения тромбов в сосудистой хирургии и т.п. [26, 101,103, 104, 114].

В последние годы отечественными производителями лабораторной техники был предложен акустический (ультразвуковой) метод и прибор для лабораторных исследований [20, 29, 30, 45, 46, 48]. Попытка применить ультразвуковые исследования в практике клинико-диагностических лабораторий обусловлена, прежде всего, надеждами на появление безреагентных методов исследования. Способ измерения относительного содержания белка и липопротеидов в биологических жидкостях в предлагаемом методе основан на изменении значений скорости и поглощения ультразвука, зависимости этих параметров от частоты ультразвукового сигнала (резонаторный метод) [53, 54, 73, 95]. Однако лабораторные аспекты новой технологии практически не разработаны.

Авторами акустического метода и прибора «БИОМ» /ЗАО «БИОМ»,

H.Новгород/ были предложены методики [45, 46] для определения:

• концентрации общего белка в сыворотке крови;

• фракций белков сыворотки крови;

• показателей липидного обмена;

• концентрации гемоглобина в стабилизированной крови;

• количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов в крови;

• СОЭ.

Цель настоящей работы - оценка возможностей безреагентного акустического метода в лабораторной практике и анализ выборки для коррекции математических программ прибора «БИОМ». Для этого решались следующие задачи:

I. Оценить область применения акустического метода при определении общего белка и белковых фракций.

Научная новизна

Практическая значимость исследования

Метод определения общего белка и белковых фракций был запатентован производителями акустического метода [29]. В ходе наших совместных клинических испытаний данного метода были написаны методические указания для определения концентрации общего белка и белковых фракций в сыворотке крови. Благодаря систематическому анализу данных исследования сыворотки и крови пациентов, удалось усовершенствовать математическую модель для определения биохимических показателей крови, а также внести значительный вклад в разработку методики определения гематологических параметров крови, включая скорость оседания эритроцитов. Реализованный в приборе отечественных производителей «БИОМ» акустический метод стал применяться в клинико-диагностических лабораториях для скрининга гипо- и гиперпротеинемий, скрининга анемических состояний, определения СОЭ и т.д., благодаря тому, что принципиально иные сигналы о свойствах крови были сопоставлены с традиционными показателями, привычными и понятными для врачей. Также метод применяется в учебном процессе и научно-исследовательских работах кафедры клинической лабораторной диагностики ГОУ ДПО «РМАПО» и кафедры биофизики с курсом лабораторной диагностики медико-биологического факультета ГОУ ВПО РГМУ. Материалы проводимой работы были представлены на 15-м Европейском конгрессе по клинической химии и лабораторной медицине (Барселона, 2003) [122], 7-м Балтийском конгрессе по лабораторной медицине (Пярну, 2004) [123], Национальных днях лабораторной медицины (Москва, 2004) [58], конференции "Стандарты и протоколы лабораторной диагностики" (Москва, 2005), 16-м Европейском конгрессе по клинической химии и лабораторной медицине (Глазго, 2005) [121]. По теме диссертации опубликовано б печатных работ.

Заключение диссертационного исследования на тему "Возможности акустического метода определения биохимических и гематологических показателей крови"

ВЫВОДЫ

1. Акустический метод способен проводить скрининговый анализ сыворотки крови для выявления гипо- и гиперпротеинемий, а также диспротеинемических состояний: нефротического синдрома, синдромов острого и хронического воспаления, случаев появления парапротеинемий. При определении концентрации общего белка коэффициент корреляции Я с традиционным биуретовым методом составил 0,98 (р<0,05). Метод позволил выделить в течение 10 минут 5 белковых фракций в относительных (%) и абсолютных (г/л) единицах измерения, а также в виде графика распределения белковых фракций. Коэффициент корреляции между акустическим и электрофоретическим методами для альбумина составил 0,77; для сц-фракции глобулинов 0,47, для у- фракции 0,92.

2. Разработана методика определения гематологических показателей крови акустическим методом в цельной крови: концентрация гемоглобина, количество эритроцитов, показатель гематокрита и скорость оседания эритроцитов (СОЭ). Получены коэффициенты корреляции между акустическим методом и методами, реализованными в гематологическом анализаторе 8у5шех-8Е 9000 для гемоглобина 0,98; для эритроцитов 0,740,87 в разных вариантах программы, гематокрита 0,98; и для скорости оседания эритроцитов методом Вестергрена 0,89 (р<0,05).

В настоящем виде акустический метод не дает надежных диагностически-значимых результатов при подсчете количества лейкоцитов и тромбоцитов в цельной крови, а также при определении эритроцитарных индексов (среднего объема эритроцитов, средней концентрации гемоглобина в эритроцитах, среднего содержания гемоглобина в эритроцитах).

3. Коэффициент вариации СУ и смещение В при определении в сыворотке концентрации общего белка и распределения белковых фракций, концентрации гемоглобина и количества эритроцитов в цельной крови не превышали предельных допускаемых значений этих показателей (ОСТ 91500.13.0001-2003). Линейность метода выполнялась в диапазоне значений концентрации общего белка 10-150 г/л, гемоглобина 20-180 г/л, количества эритроцитов (0,6-5,6)* 1012/л; гематокрита 14-50%. Диагностическая чувствительность метода по отношению к парапротеинам, в целом, недостаточна, хотя при миеломной болезни с содержанием общего белка более 85 г/л и концентрации парапротеина более 20г/л чувствительность метода достигала 94% при специфичности, близкой к 100%. Не рекомендуется применять акустический метод в гематологических отделениях.

4. Акустический метод способен выполнять многопараметровый анализ сыворотки крови для одномоментного определения в ней показателей белкового и липидного обмена, а в цельной крови - для определения скорости оседания эритроцитов и показателей красной крови в одном и том же образце, в том числе и в случаях значительных отклонений от нормы ряда показателей, а также для наблюдения пациентов в динамике.

5. В ходе испытаний акустического метода определения биохимических и гематологических показателей при помощи прибора «БИОМ» был выявлен ряд важных особенностей и ограничений.

Для определения большинства параметров сыворотки и цельной крови не нужны реактивы (кроме белковых фракций), следовательно, исследованию подвергается неизмененная биожидкость.

После акустического метода исследования сыворотку крови можно использовать для других биохимических тестов.

Для исследования применяется только свежая неизмененная сыворотка (возможно хранение в холодильнике при 1=3-5°С до 3 дней), либо свежая цельная кровь, стабилизированная К2 ЭДТА.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

2. Акустический метод определения гематологических показателей цельной крови может быть использован для одновременного определения в стабилизированной цельной крови концентрации гемоглобина, выявления случаев анемий, определения СОЭ.

4. В качестве контроля сходимости и воспроизводимости рекомендуем применение свежей сыворотки и цельной крови. Ввиду отсутствия на данном этапе аттестованных контрольных материалов для акустического метода рекомендуем применение контрольного материала «ЗегоёоБ» /Германия/ с дополнительным измерением показателей традиционными методами.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2006 года, Тамарова, Елена Николаевна

1. Агеева Т.С., Акимова JI.A. Диагностическое значение СОЭ в клинической практике. // Материалы юбилейной конференции, посвященной 200-летию Российской Военно-медицинской академии.- Томск.- 1999.-вып.7.- т.2.

2. Алмазов В.А. Оседание эритроцитов: Большая медицинская энциклопедия.- М.: Советская энциклопедия, 1981.-Т. 17.-С. 1306-1311.

3. Баранов В.В. Устройство для автоматического измерения кинетики оседания крови. // New Technologies for the 21st Century.- 6.- 2001,- P.39-41.

4. Баранов B.B., Кленин C.M., Кузнецов М.И.и др. РОЭГРАФ прибор для автоматизации исследования крови. // XI международном симпозиум «Новые технологии восстановительной медицины и курортологии» 21-28 ноября 2003 г.: тез.докл.- г.Агадир. Марокко.

5. Бергман JI. Ультразвук и его применение в науке и технике: Пер. с нем. -М: Издательство иностранной литературы, 1957. 320 с.

6. Блохина М.Е., Эссаулова И.А., Мансурова Г.В.: Руководство к лабораторным тестам по медицинской и биологической физике.- М.: Дрофа, 2001.- 288 с.

7. Вальдман В.А. Седиментограф. (Прибор для графической регистрации РОЭ). // Физиологический журнал.- 1955.- Т. 41,- № 3.- С. 430-432.

8. Василевский С.С., Калафати Т.И., Зайцева И.В. Иммуноседиментационный анализ белков //Бюллетень экспериментальной биологии, 1985.- №1.- С.113-116.

9. Владимиров Ю.А., Рощупкин Д.И., Потапенко А .Я., Деев А.И. Биофизика: Учебник. М.: Медицина, 1983.- 272 с.

10. Ю.Воейков B.JI. Физико-химические и физиологические аспекты реакцииоседания эритроцитов. // Успехи физиологических паук. -1998. -Т. 29. -№ 4.- С. 55-73.

11. П.Воейков В.Д., Гурфинкель Ю.И., Дмитриев А.Ю., Кондаков С.Э.

12. Немонотонные изменения скорости оседания эритроцитов в цельной крови. // Доклады РАН,- 1998.- Т. 359.- № 5.- С. 686-690.

13. Воейков В.Л., Дмитриев А.Ю. Биофизические механизмы реакции оседания эритроцитов. //Биофизика.- 1998.- Т. 43.- С. 575-579.

14. Вопросы кибернетики: Моделирование процессов ультразвуковой медицинской диагностики. Москва, 1993.- 130 с.

15. Гавалов С.М., К механизму фракционной реакции оседания эритроцитов. // Советская медицина.- 1957. № 8.- С. 62-66.

16. Гаранина E.H. Качество лабораторного анализа. М.: Лабинформ, 1997,- 192 с.

17. Гематологические исследования в клинической лабораторной диагностике: Методические рекомендации для специалистов по клинической лабораторной диагностики / Первушин Ю.В., Луговская С.А. и др.- Ставрополь, 2000.- 78 с.

18. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Москва, 1999.- 459 с.

19. Долгов В.В., Луговская С.А., Почтарь М.Е. Лабораторная диагностика нарушений обмена железа.- СПб.: Витал диагностике СПб, 2002.- 52 с.

20. Долгов В.В., Тамарова E.H., Клемин В.А. Безреагентный способ определения биохимических и гематологических показателей крови. // Здравоохранение и медицинская техника.- 2005.- №2.- С.6.

21. Долгов В.В., Шевченко О.П. Лабораторная диагностика нарушений обмена белков: Учебное пособие. Москва, 1997.- 68с.

22. Ивченко Г.И., Медведев Ю.И. Математическая статистика: учебное пособие для ВТУЗов.- М.: Высшая школа, 1984.- 248 с.

23. Каландаров P.C., Н.Н.Князьков, С.И.Донсков. Оптический способ регистрации реакции гемагглютинации и его применение для определения группы крови. // Проблемы гематологии и переливания крови.- 1997.- №2.- С. 5-8.

24. Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике.- Минск: Беларусь, 2000.- 495 с.

25. Карягина И.Ю. Электрофорез. Клинико-диагностическая интерпретация электрофореграмм белков сыворотки крови.- С.Пб., 2000.- 60 с.

26. Кисилевский Ю., Оганесян Н., Костин Г., Конколь К. Электрофоретические методы в лабораторной диагностике. Гродно, 1999.- 100 с.

27. Кишкун A.A. Теоретические и практические аспекты разработки медицинских технологий повышения качества и эффективности клинической лабораторной диагностики: автореферат диссертации доктора мед. наук: 14.00.46/ 2003.

28. Клемин В.А. Акустический безреагентный метод определения параметров белкового и липидного спектра сыворотки крови. // Лаборатория.- 2003.-№2,-С.16-17.

29. Клемин В.А., Майоров В.А., Ручкин В.В., Сарвазян А.П. Исследование частотных зависимостей акустических характеристик биологических тканей резонаторным методом. // Акустический журнал.- 1981. вып.6.- С. 895-900.

30. Клиническая гематология. / Под ред. проф. Шт. Берчану.- Бухарест, 1985.

31. Клиническая лабораторная аналитика. Том 1. / Под ред. В.В.Меньшикова. М.: Агат-Мед.- 2002.-860 с.

32. Клиническая лабораторная аналитика. Том 2. / Под ред. В.В.Меньшикова. М.: Лабинформ-РАМЛД, 1999. - С. 9-11.

33. Кухта В.К., Морозкина Т.С., Таганович А.Д., Олецкий О.И. Основы биохимии. М.: Медицина, 1999.- 416 с.

34. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник. / Под ред. В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987.- 364 с.

35. Лакин Г.Ф. Биометрия: учебное пособие для биологических специальностей ВУЗов. М.: Высшая школа, 1990.- 352 с.

36. Левтов В.А., Регирер С.А., Шадрина Н.Х. Реология крови. -М.: Медицина, 1982.- 290 с.

37. Лизунова A.A., Добросердова В.П. О трех характерных типах РОЭ. : Сб. науч. работ воронежского обл. инст. Охраны материнства и младенчества. — Воронеж, 1938.- В. 3.- С. 141-150.

38. Луговская С.А., Почтарь М.Е. Гематологический атлас. Москва-Тверь: Триада, 2004.- 227 с.

39. Малкэм JL, Бригден. Клиническое значение скорости оседания эритроцитов. // Международный медицинский журнал.- 2000.- №2.- С. 121-125.

40. Медицинские лабораторные технологии. Справочник. / Под ред.

41. A.И.Карпищенко. С.Пб: Интермедика, 1998.- 408 с.

42. Михайлов И.Г., Соловьев В.А., Сырников Ю.П. Основы молекулярной акустики. М.: Наука, 1964.- 516 с.

43. Михайлова Т.А. Сравнительное исследование сыворотки крови методами поляграфического и элементного анализов // Вопросы медицинской химии.-1995.- 41.- №3.- С. 56-58.

44. Мошкин A.B., Долгов В.В.Обеспечение качества в клинической лабораторной диагностике: Практическое руководство.- М: Медиздат, 2004.- 216с.

45. Патент РФ № 2039978, МКИ 6 G 01 N 29\02. Устройство для ультразвукового контроля биологических жидкостей / Глазков В.Я., Клемин В.А., Ляпина И.В. Заявка № 5055138; Приоритет от 16.07.92; Зарегистрирован 20.07.95. в Государственном реестре изобретений.

46. Патент РФ № 2253115, МКИ G 01 N 33/49. 29/18/ Способ определения общего белка, белковых фракций и липидных компонентов сыворотки крови./ Клемин

47. B.А., Долгов В.В., Клемина A.B. Заявка № 2003115002; Приоритет от 22.05.0; Зарегистрирован 27.05.05 в Государственном реестре изобретений Российской Федерации.

48. Первушин Ю.В., Евсевьева М.Е., Мириджанян Э.М. и др. Применение анализатора «БИОМ» для популяционных исследований уровня липидов крови у молодых людей акустическим методом. // Клиническая лабораторная диагностика.- 2004.-№9.- С.86.

49. Простяков А.П., Колабская JT.C., Трусова Л.И., Школьников Е.Э., Колупаева Т.Д., Ковадло A.M., Токарик Э.Ф. Фракционирование белков сыворотки крови риванолом. // Лабораторное дело.- 1978.- №4.- С. 247-250.

50. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTIC А. М.: МедиаСфера, 2003,- 312 с.

51. Ремизов А.Н. Медицинская и биологическая физика: Учебник для медицинских специальностей ВУЗов. М.: Высшая школа, 1996. - 608 с.

52. Руководство по клиническим лабораторным исследованиям. / Под ред. Е.А.Кост и Л.Г.Смирновой.- М: Медицина, 1964.

53. Сарвазян А.П. Основные проблемы в исследовании акустических свойств биологических объектов // Материалы Всесоюзного симпозиума "Взаимодействие ультразвука с биологическими средами". Пущино, 1979.- С. 62-66.

54. Сарвазян А.П., Айрапетян Г.А. Акустические характеристики мягких тканей экспериментальных животных. // Механика композитных материалов.- 1980.-№3,- С. 514-518.

55. Сергиенко В.И., Бондарева И.Б. Математическая статистика в клинических исследованиях. -М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001,- 256 с.

56. Смирнов A.B., Кожевников А.Д. Нарушение липидного и углеводного обменов при нефротическом синдроме. // Нефротический синдром. Актуальные вопросы нефрологии.- Вып. 1 / Ред. С.И.Рябов.- СПб.: Гиппократ, 1992. С. 196-215.

57. Справочник: Лабораторные методы исследования в клинике. / Под ред. проф. В. В. Меньшикова,- М.: Медицина, 1987.- 256 с.

58. Тамарова E.H., Клемин В.А., Ройтман А.П., Долгов В.В. Акустическое (ультразвуковое) определение общего белка и белковых фракций сыворотки крови. // Клиническая лабораторная диагностика.- 2005.- №2.- С. 12-18.

59. Титов В.Н, Амелюшкина В.А. Электрофорез белков сыворотки крови.- М.: Оптимум пресс, 1994.- 62 с.

60. Тиц У. Клиническое руководство по лабораторным тестам. / Пер.с англ. Под ред. В.В.Меньшикова. Москва, 2003,- С. 539-540.

61. Ультразвук. Маленькая энциклопедия. / Гл.ред. И.П.Галямина.- М.: Советская энциклопедия, 1979.- 400 с.

62. Фок М.В., Зарицкий А.Р., Прокопенко Г.А., Грачев В.И. Эритроцит как физическая система. Кинетика трансмембранного переноса кислорода. // Журнал общей биологии.- 1994.- Т. 55.- № 4-5.- С. 583-612.

63. Фракционирование белковых компонентов биоматериалов с помощью электрофоретической системы «Парагон» фирмы "Beckman". / Практические рекомендации. Алма-Ата, 1990.- 44с.

64. Чижевский А.Л., Биофизические механизмы реакции оседания эритроцитов.-Новосибирск: НАУКА, 1980.

65. Шиффман Ф.Дж. Патофизиология крови. М.-СПб., 2000.- 446 с.

66. Яворский Б.М., Детлаф А.А. Справочник по физике для инженеров и студентов вузов. -М.: Наука, 1979.- 944 с.

67. Яронене Г., В.Сукацкас, А.Лукашявичус, А.Волейшис. Вопросы ультразвуковой диагностики крови. // В сб. Проблемы техники в медицине.-Томск, 1983.- С. 196-197.

68. Alves СН, Machado JC. Measurement of plasma clotting time using ultrasonic shear waves. // Physiol Meas.- 1994,- Aug;15(3):309-16

69. Apparatus for sedimentation based blood analysis. US Pat. N5575977. / McKinney D.K., Fuller M.E, Carone B.V.- 19.11.96.

70. Bamber J.C., Hill C.R. Ultrasonic attenuation and propagation speed in mammalian tissues as a function of temperature. // Ultrasound in Med. & Biol.- 1979.- Vol.5.-P.149-157.

71. Bedell S.E., Bush B.T. Erythrocyte sedimentation rate, from folklore to facts. // Am J Med.- 1985.- 78:1001-9.

72. Borawski J, Mysliwiec M. The hematocrit-corrected erythrocyte sedimentation rate can be useful in diagnosing inflammation in hemodialysis patients. // Nephron.-2001.- Dec.-89(4): 381-3.

73. Brigden M. Clinical utility of the erythrocyte sedimentation rate. // Postgrad. Med.-1998.- V.103(5). -P. 257-272.

74. Carstensen E.L., Li K., Schwan H.P. Determination of acoustic properties of blood and its components. // JASA.- 1953,- v.25.- P.286-289.

75. Carstensen E.L., Schwan H.P. Absorption of sound arisin from the presence of intact cells in blood. //JASA.- 1959.- v.31.- P.185-189.

76. Carstensen E.L., Schwan H.P. Acoustic properties of hemoglobin solutions. // JASA.-1959.- v.31.-P.305-311.

77. Chamorro A., Vila N., Ascaso C., et al. Early prediction of stroke severity. Role of the erythrocyte sedimentation rate. // Stroke.- 1995.- V. 26. № 4.- P. 573-576.

78. Dobashi T, Goto H, Sakanishi A, Oka S, Erythrocyte sedimentation rate I. Volume fraction dependence in saline solution. // Biorheology.- 1987.-24: 2.- P. 153-62.

79. Dorrington et al. The Erythrocyte Sedimentation Rate Curve: Critique of an Established Solution. // Biomechanics.- 1983.- V. 16.- № 1.- P. 99-100.

80. Fabry TL. Mechanism of erythrocyte aggregation and sedimentation. // Blood.-1987.- 70: 5.- 1572-6.

81. Fincher R-M., Page M.I. Clinical Significance of Extreme Elevation of the Erythrocyte Sedimentation Rate. //Arch. Int. Med.- 1986: 146: 1581-1583.

82. Fischbach F.T: A Manual of Laboratory Diagnostic Tests.- JB Lippincott: Philadelphia .- PA , 1980.- P. 50-54.

83. Gammel P.M., D.H.Le Croissete and R.C.Heyser. Temperature and frequency dependence of ultrasonic attenuation in selectid tissues. // Ultrasound in Med. & Biol.- 1979.- Vol.5.- P.269-277.

84. Gribauskas P, Kazhis R, Mazheika L, Grubauskene PG, Mongrigene A, Shilteris P, Voleishene B, Voleishis A. A study of biological fluids by ultrasound coagulography. // Biofizika.- 2005.- May-Jun. 50(3).- P. 550.

85. Henry-Amar M., Friedman S., Hayat M., et al. Erythrocyte sedimentation rate predicts early relapse and survival in early stage Hodgkin disease. // Ann. Intern. Med.- 1991.- V. 114. № 5.- P. 361-365.

86. Höpen G., Schreiner A. // Scand. J. Haematol. 1979. V. 22. P. 219-225. 91.Internation Committee for Standartizations in Heamatology (ICSH):

87. Kaibara M. Rheological behaviors of bovine blood forming artificial rouleaux. // Biorheology.- 1983.- V. 20.- N. 5.- P. 583-92.

88. Klemin V.A., I.D.Karev, A.P.Sarvazyan, L.N.Timokhina, V.V.Ruchkin, E.A.Mayorov. Relation of acoustic characteristics of human gastric juice to its composition for some stomach diseases. // Studia biophysica.- 1981.- v.84.- №2.- P. 139-144.

89. Kuo IY, Hete B, Shung KK. A novel method for the measurement of acoustic speed. // J Acoust Soc Am.- 1990.- Oct; 88(4): 1679-82.

90. Kuo IY, Shung KK. High frequency ultrasonic backscatter from erythrocyte suspension. // IEEE Trans Biomed Eng. 1994 Jan; 41(1): 29-34

91. Kuo CD, Bai JJ, Chang IT, Wang JH, Chien S, Continuous monitoring of erythrocyte sedimentation process: a new possible mechanism of erythrocyte sedimentation. // J Biomech Eng.- 1988.- 110: 4. P. 392-5.

92. Kuo CD, Bai JJ, Chien S, Erythrocyte sedimentation realizable in terms of population dynamics. // Biorheology.- 1989.- 26: 6.- 1003-10.

93. L. Haider, P. Snabre, M. Boynard. Rheology and Ultrasound Scattering from Aggregated Red Cell Suspensions in Shear Flow// Biophysical Journal.- 2004.- 87.-P. 2322-2334.

94. Machado JC, von Kruger MA, Fontes EM, de Almeida MM. Evaluation of an ultrasonic method applied to the measurement of blood coagulation time. // Physiol Meas.- 1997

95. Marc R. Happe. Validation of the Diesse Mini-Ves Erythrocyte Sedimentation Rate (ESR) Analyzer Using the Westergren ESR Method in Patients With Systemic Inflammatory Conditions. // Am J Clin Pathol.- 2002; 118:14-17.

96. Maruvada S, Shung KK, Wang SH. High-frequency backscatter and attenuation measurements of porcine erythrocyte suspensions between 30-90 MHz. // Ultrasound Med Biol.- 2002.- Aug; 28(8):1081-8.

97. Petersson F, Nilsson A, Holm C, Jonsson H, Laurell T. Separation of lipids from blood utilizing ultrasonic standing waves in microfluidic channels. // Analyst.- 2004.-Qct;129(10).-P. 938.

98. Piva E., Sanzari M., Servidio G. Length of Sedimentation Reaction in Undiluted Blood (Erythrocyte Sedimentation Rate): Variations with Sex and Age and Reference Limits. // Clinical Chemistry and Laboratory Medicine.- V.39.- 5/- P. 451-454.

99. Plebani M., Piva E. Erythrocyte sedimentation rate: use of fresh blood for quality control.// Am J Clin Pathol.- 2002.- Apr.-l 17(4):621-6.

100. Putnam F.M. Structure and function of plasma proteins. The Proteins. Composition. Structure and Function. / Second Edition. Ed.- Hans Neurath.: Academic Press.- New York and London . -1965. -P. 154-267.

101. R.L. Jurado. Why Shouldn't We Determine the Erythrocyte Sedimentation Rate? // Clinical Infectious Diseases.- 2001.- 33: 548-9

102. Razavian SM, Wenby RB, Fisher TC, Meiselman JH. Determination of particle sedimentation rate by ultrasonic interferometry: role of particle size, density and volume fraction. //Biorheology.- 1997.- Jul-Oct; 34(4-5): 349-62.

103. Reid JM, Shung KK. Prediction of ultrasonics scattering in the blood: an historical note. // Ultrasound Med Biol.-1980.- 6(3): 293-4.

104. Reinhart W.H., Nagy C. Albumin effects erythrocyte aggregation and sedimentation. // Eur. J. Clin. Invest. -1995. -V. 7.- P. 523-528.

105. Reinhart W.H., Singh A., Straub P.W., Red blood cell aggregation and sedimentation: the role of the cell shape. // Br. J. Haemotol.- 1989.- V. 73. -N 4.- P. 551-556.

106. Roos MS, Apfel RE, Wardlaw SC. Application of 30-MHz acoustic scattering to the study of human red cells.//J Acoust. Soc. Am.- 1988.-Apr;83(4).- P. 1639-44.

107. Rourke M.D., Ernstene A.C. A method for correcting the erythrocyte sedimentation rate for variation in the cell volume percentage of blood. // J. Clin. Invest. 1930.- V. 8.- P. 549-559.

108. Salvarani C, Hunder GG. Giant cell arteritis with low erythrocyte sedimentation rate: frequency of occurence in a population-based study. // Arthritis Rheum.- 2001.-Apr.-45(2): 140-5.

109. Shung KK, Fei DY, Ballard JO 3rd. Further studies on ultrasonic properties of blood clots. // J Clin Ultrasound.- 1986,- May; 14(4): 269-75

110. Shung KK. Ultrasonic characterization of biological tissues. //J Biomech Eng.1985.-Nov; 107(4): 309-14

111. Sox H.C., Liang M.H. The erythrocyte sedimentation rate. // Ann. Int. Med.1986.-V. 104.- P. 515-23.

112. Sox H.C., Liang M H. The erythrocyte sedymentation rate Guidelines for rational use Ann Intern Med.- 1986,- 104 515-523.

113. Tamarova E., Dolgov V., Klemin V. Acoustic measurement of erythrocyte sedimentation rate and other parameters of blood without reagents. // Clinica Chimica Acta.- V. 355/S297.

114. Tamarova E., Dolgov V., Roitman A., Klemin V. Acoustic measurement of total protein concentration and a serum protein separation. // Clinical Chemistry and Laboratory Medicine.- 2003.- V.41.- Special supplement.- S232.

115. Tamarova E., Klemin V., Dolgov V. Acoustic measurement of hemoglobin concentration and other parameters of blood without reagents./ The 7-th Baltic Congress in Laboratory Medicine, abstract Estonia.- 2004.- P. 137.

116. Tatarinov A, Sarvazyan N, Sarvazyan A. Use of multiple acoustic wave modes for assessment of long bones: model study. // Ultrasonics.- 2005.- Aug;43(8): 672-80.

117. Thomas RD, Westergard JC, Hay KL, et al. Calibration and validation for erythrocyte sedimentation rate tests. Roles of the International Committee on Sandardization in Hematology reference procedure. // Arch Pathol Lab Med.-1993;117:719-23.

118. Van den Broe N.R., Letsky EA. Pregnancy and the erythrocyte sedimentation rate. //BJOG.-2001,-Nov; 108(11): 1164-7.

119. Vinceneux P., Pouchot J., Gaudin H. Relation of fever and the erythrocyte sedimentation rate. // Presse Med. V. 19. № 24. P. 1147-1149.

120. Viroj Wiwanitkit. Comparative study dttween the Westergren and Automated method for determination of the Erythrocyte Sedimentation Rate. // Chiang Mai Med Bull/- 2001; 40(3): 139-141.

121. Wang SH, Shung KK. In vivo measurements of ultrasonic backscattering in blood. // IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control.- 2001,- Mar; 48(2): 425-31.

122. Westergren A. Studies on the suspension of the blood in pulmonary tuberculosis. // Acta. Med. Scand. 1921.- V. 54.- P. 247-281.

123. Woodland N.B., Cordatos K., Hung W.T., Reuben A., Holley L. Erythrocyte sedimentation in columns and the significance of ESR. // Biorheology.- 1996.- Vol. 33.- P. 477-88.

124. Yuan YW, Shung KK. Echoicity of whole blood. // J Ultrasound Med. -1989.-Aug;8(8): 425-34

125. Yuan YW, Shung KK. Ultrasonic backscatter from flowing whole blood. II: Dependence on frequency and fibrinogen concentration. // J Acoust Soc Am. 1988.-Oct; 84(4): 1195-200

126. Zhang J, Rose JL, Shung KK. A computer model for simulating ultrasonic scattering in biological tissues with high scatterer concentration. // Ultrasound Med Biol.- 1994; 20(9): 903-13.

127. Zhang J, Rose JL, Shung KK. A computer model for simulating ultrasonic scattering in biological tissues with high scatterer concentration. // Ultrasound Med Biol. 1994; 20(9): 903-13

128. Zhao T.X., Jacobson B. Quantitative correlations among fibrinogen concetration, sedimentation rate and electrical impedance of blood. // Med. Biol. Eng. Comput. -1997.- V.35.-N3.-P. 181-185.

129. Zlonis M. The mystique of the erythrocyte sedimentation rate. A reappraisal of one of the oldest laboratory tests still in use. // Clin Lab Med.- 1993.- Vol. 13.- P. 787-800.