Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Вопросы молекулярной эпидемиологии и молекулярной диагностики эпидемиологически значимых для России вирусов комплекса клещевого энцефалита

Актуальность проблемы. Несмотря на более, чем 60-летний период изучения клещевого энцефалита (КЭ), публикацию огромного числа работ, посвященных этой теме, разработку, коммерческий выпуск и использование в практике здравоохранения диагностических и профилактических средств нескольких поколений, актуальность проблемы не снижается и в настоящее время. Более того, в последние 20 лет заболеваемость КЭ растет в целом по Российской Федерации и, особенно, в восточных районах страны. Не вдаваясь в причины этого явления, что является предметом специальных исследований, отметим, что в сложившейся эпидемической ситуации чрезвычайно важными являются вопросы, связанные с более ясным пониманием популяционной структуры возбудителя, роли генетических вариантов вируса в формировании заболеваемости в разных географических районах, а также работы по усовершенствованию лабораторной диагностики и разработка стратегии специфической профилактики КЭ.

Несколько лет тому назад началось восстановление активности природных очагов еще одной инфекции из группы КЭ - омской геморрагической лихорадки (ОГЛ). После 30-летнего перерыва начался подъем заболеваемости ОГЛ среди людей, хотя основные черты эпидемиологии этой инфекции существенно изменились. На протяжении 1988-1994 годов в Западной Сибири было выявлено 133 больных с преимущественно нетрансмиссивны м путем заражения. Природные очаги ОГЛ и КЭ фактически накладываются друг на друга, образуя сочетанные очаги этих двух инфекций. Их возбудители являются близкородственными вирусами комплекса КЭ и их дифференциация имеет большое практическое значение, но представляет серьёзные трудности при использовании классических вирусологических методов.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций и изучение генетики вирусов сильно продвинулись в последние 10-15 лет, благодаря внедрению молекулярно-биологических методов в вирусологию. Были разработаны гибридизационные и ПЦР диагностические тест-системы для выявления ряда вирусов. В частности, были получены молекулярные зонды для детекции и дифференциации большой группы флавивирусов, включая вирус КЭ. Однако зонды для определения других вирусов комплекса КЭ не могли быть разработаны из-за отсутствия данных по первичным структурам геномов этих вирусов.

С использованием гибридизационных методов также изучали генетическую вариабельность вируса КЭ. Несмотря на то, что были показаны выраженные генетические различия штаммов, изолированных в тех или иных участках ареала, особенности их геномных структур не были расшифрованы. В последнее время в Институте эпидемиологии и микробиологии ВСНЦ СО РАМН были определены нуклеотидные последовательности фрагментов геномов около 30 штаммов вируса КЭ, что позволило оценить их гомологию и установить 6 генетических типов вируса. Вместе с тем развитие этих работ сдерживалось трудоемкостью и дороговизной использованных методов. Нам представлялось, что анализ расшифрованных первичных структур штаммов вируса КЭ мог дать необходимые сведения для конструирования генотипспецифических зондов, использование которых в значительной мере уменьшило бы сложности генотипи-рования штаммов и позволило бы осуществлять эти эксперименты серийно.

Разработка новых методических подходов для дифференциации близкородственных вирусов комплекса КЭ и широкого изучения природной генетической вариабельности вируса КЭ позволят усовершенствовать лабораторную диагностику этих заболеваний и получить новые важные данные о развитии эпидемического процесса на огромной территории занимаемого ими ареала.

Цель и задачи исследования

Цель работы: Разработать и применить новые методические подходы для молекулярной диагностики и молекулярной эпидемиологии вирусов КЭиОГЛ.

Задачи работы:

• Получить специфические синтетические дезоксиолигонуклеотидные зонды для дифференциальной диагностики КЭ и ОГЛ методом молекулярной гибридизации.

• На основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов РНК генотипов вируса КЭ получить генотипспе-цифические синтетические гибридизационные зонды.

• Применить полученные зонды для молекулярно- эпидемиологического анализа штаммов вируса КЭ, изолированных в европейской и азиатской частях ареала.

• Дать характеристику географического распространения генотипов вируса КЭ.

Научная новизна

Впервые получены специфичные олигонуклеотидные зонды для дифференциальной детекции эпидемиологически значимых для территории России вирусов комплекса КЭ : вируса КЭ и вируса ОГЛ.

Впервые получены гибридизационные зонды для генетического тонирования природных штаммов вируса КЭ.

Полученные зонды применены для генотипирования представительной коллекции штаммов и показано географическое распространение генотипов вируса КЭ с использованием новых методических подходов.

Практическая ценность

Практическая ценность работы заключается в усовершенствовании лабораторной диагностики инфекций, вызываемых вирусами комплекса КЭ.

Разработан надежный тест для дифференциации вирусов КЭ и ОГЛ, что будет иметь важное значение в условиях роста этих двух инфекций и существования их сочетанных очагов.

Сконструированы генотипспецифические гибридизационные зонды для серийных исследований по генотипированию и изучению молекулярной эпидемиологии вируса КЭ в пределах ареала на территории Азии и Европы, что имеет практическое значение для оценки и прогноза эпидси-туации в различных регионах.

Новые данные, полученные в работе, используются в учебном процессе в курсе «Молекулярная вирусология» и «Частная вирусология» для студентов биолого-почвенного факультета Иркутского Государственного университета и на циклах повышения квалификации в Иркутском Государственном институте усовершенствования врачей.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Сконструированы гибридизационные дезоксиолигонуклеотидные зонды для дифференциации близкородственных вирусов КЭ и ОГЛ - возбудителей наиболее значимых инфекций, вызываемых вирусами комплекса КЭ на территории России.

2. На основании анализа гомологии нуклеотидных последовательностей геномов штаммов вируса КЭ, относящихся к разным генотипам, получены синтетические дезоксиолигонуклеотидные зонды для генотипи-рования штаммов методом молекулярной гибридизации.

3. Проведены молекулярно-эпидемиологические исследования географического распространения генотипов вируса КЭ на базе представительной коллекции штаммов, изолированных в различных участках ареала в Евразии.

Апробация работы

Основные материалы работы были доложены и обсуждены на:

1. Международной научной конференции «Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами» (Иркутск, 1996);

2. VII Съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997);

3. VIII Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (Лозанна, 1997);

4. Всероссийской научной конференции «Природноочаговые инфекции в России: современная эпидемиология, диагностика, тактика защиты населения» (Омск, 1998).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Внедрение в практику

1. На основании анализа гомологии геномов штаммов вируса КЭ нуклеотидные последовательности фрагментов РНК трех штаммов депонированы в международный компьютерный банк данных (ОепВапк, США).

2. Материалы исследований используются в учебном процессе при подготовке студентов-биологов в Иркутском Государственном университете и врачей в Иркутском Государственном институте усовершенствования врачей.

Общая характеристика работы

Работа является одним из фрагментов исследований по молекулярной диагностике и молекулярной эпидемиологии возбудителей природно-очаговых трансмиссивных инфекций вирусной, риккетсиозной и бактериальной природы, проводимых в Институте эпидемиологии и микробиологии Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. Автор выполнял работу, будучи очным аспирантом института.

Диссертационная работа посвящена разработке новых методических подходов для специфического определения наиболее актуальных вирусов комплекса КЭ (КЭ и ОГЛ), генетического типирования вируса КЭ путем создания новых гибридизационных зондов, а также изучения с их помощью молекулярной эпидемиологии большой коллекции штаммов вируса КЭ, изолированных в различных частях ареала на территории Европы и Азии.

Полученные результаты позволяют усовершенствовать лабораторную диагностику вирусов комплекса КЭ, в т.ч. дают возможность проведения серийных исследований по генотипированию вируса КЭ, углубленного изучения проблем эпидемиологии КЭ в разных географических регионах, прогноза эпидситуации, накопления данных для совершенствования классификации вирусов комплекса КЭ.

Автор выражает искреннюю признательность научному руководителю работы директору Института эпидемиологии и микробиологии НЦМЭ ВСНЦ СО РАМН член-корреспонденту РАМН, д.м.н., профессору В.И.Злобину за предоставленную возможность выполнения диссертации, повседневную помощь и поддержку в работе.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, 2 глав обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы ( 64 отечественных и 71 зарубежных источников ).

выводы

1. Впервые получены синтетические дезоксиолигонуклеотидные зонды для специфического определения и дифференциации близкородственных вирусов комплекса клещевого энцефалита - КЭ и ОГЛ методом молекулярной гибридизации.

2. Показана способность зондов КЭ и ОГЛ эффективно гибридизоваться с РНК разных штаммов соответствующих вирусов.

3. Впервые сконструированы специфичные молекулярные зонды для выявления шести генотипов вируса КЭ, позволяющие проводить серийные опыты по генотипированию штаммов.

4. Впервые осуществлено генетическое типирование большой выборки штаммов ( 96) - изолятов из разных участков ареала и проведен моле-кулярно-эпидемиологический анализ географического распространения генотипов вируса КЭ.

5. Впервые показано, что на большей части ареала, исключая регион Дальнего Востока, доминирующим генотипом ( более 60 % штаммов) является генотип 5 ( прототипный штамм Лесопарк -11, Западная Сибирь).

6. Установлено, что из состава изученной коллекции штаммы генотипа 1 ( прототипный штамм Софьин, Дальний Восток) распространяются на запад до Ленинградской области, штаммы генотипа 2 ( прототипный штамм Ыеиёоегй, Австрия) - до Западной Сибири, генотип 3 ( штамм Вергина, Греция) не обнаружен, а каждый из генотипов 4 ( штамм 178\79) и 6 ( штамм 886\84) представлены одним штаммом, изолированным в Восточной Сибири.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Среди арбовирусных инфекций в России наиболее важное место принадлежит клещевому энцефалиту. Заболеваемость этой тяжелой нейро-инфекцией на протяжении последних 20 лет растет, особенно в азиатской части страны. Складывающаяся неблагоприятная эпидситуация диктует необходимость повышения уровня лабораторной диагностики, специфической профилактики и лечения болезни. Прогресс в этих областях зависит, в свою очередь, от более полного понимания молекулярной структуры, биологических, в том числе, патогенных свойств возбудителя, состава, генетической вариабельности и географических особенностей природных вирусных популяций.

В последнее время в Западной Сибири отмечена реставрация активности природных очагов и рост случаев заболеваний людей Омской геморрагической лихорадкой. Это заболевание, вызываемое близкородственным вирусу КЭ членом антигенного комплекса КЭ вирусом ОГЛ, занимает второе место среди трансмиссивных вирусных клещевых инфекций по медицинскому значению для населения России. В силу тесных эволюционных связей и сходства основных биологических свойств два этих вируса (КЭ и ОГЛ) трудно различимы обычными (классическими) вирусологическими методами. Учитывая, что ареалы вирусов КЭ и ОГЛ практически накладываются друг на друга и образуют сочетанные природные очаги, разработка более надежных современных методов их дифференциации представляется в настоящее время чрезвычайно актуальной.

В свете представленных выше проблем целью настоящей работы было разработать новые методические приемы на базе молекулярно-биологических технологий для усовершенствования дифференциальной диагностики вирусов комплекса КЭ (КЭ и ОГЛ), осуществления быстрого и экономичного генетического типирования штаммов вируса КЭ, реально изучить большую выборку штаммов и представить молекулярно-эпидемиологический анализ географического распространения различных генотипов вируса.

Основой выполнения работы явились полученные в Институте эпидемиологии и микробиологии ВСНЦ СО РАМН с участием автора материалы о первичных структурах фрагментов геномов 30 штаммов вируса КЭ, а также данные литературы, касающиеся нуклеотидных последовательностей вирусов комплекса КЭ и нескольких штаммов вируса КЭ. В работе были использованы штаммы вирусов комплекса КЭ из коллекции вирусов ИЭМ ВСНЦ СО РАМН, а также штаммы, полученные из других научных учреждений.

С помощью компьютерного анализа гомологии фрагментов геномов ряда вирусов комплекса КЭ были определены оптимальные структуры для конструирования видоспецифических олигонуклеотидных зондов к вирусам КЭ и ОГЛ. При этом анализ был направлен на выбор таких последовательностей, которые позволили бы при дальнейшем молекулярном зондировании охватить штаммовые варианты вирусов при сохранении видовой специфичности. С этой целью оценивались также уровни гомологии геномов группы штаммов вируса КЭ, в том числе, относящихся ко всем шести установленным в настоящее время генотипам.

Опыты молекулярной гибридизации с использованием сконструированных нами дезоксиолигонуклеотидных зондов к вирусу КЭ - TBE и вирусу ОГЛ - OHF/N продемонстрировали их видовую специфичность. В то же время зонды успешно гибридизовались с РНК всех испытанных штаммов вирусов КЭ и ОГЛ соответственно.

Таким образом можно заключить, что нами впервые сконструированы молекулярные зонды для детекции и дифференциации вирусов комплекса КЭ - КЭ и ОГЛ. Доказана видоспецифи чность зондов и их способность выявлять разные штаммы вирусов, в том числе, изолированные в географически удаленных друг от друга районах и принадлежащие разным генотипам.

Полученные специфичные к вирусам КЭ и ОГЛ молекулярные зонды рекомендуются для практического использования при детекции и дифференциации этих близкородственных вирусов в сочетанных природных очагах.

Исследования последних лет, основанные на применении молекуляр-но-биологических методов, принесли новые данные, касающиеся природной вариабельности вируса КЭ. Как было выявлено первоначально с помощью тестов гибридизации с зондами, сконструированными на основе первичной структуры генома дальневосточного штамма Софьин и отчасти западного - Найдорф, на огромной территории ареала доминируют штаммы, существенно отличающиеся от этих двух прототипов. Вместе с тем использованный методический подход не дал возможности установить молекулярные основы этих различий и осуществить генетическое типирование штаммов, изолированных из разных географических районов. Это стало возможным в результате проведенных в Институте эпидемиологии и микробиологии ВСНЦ СО РАМН работ по секвенированию фрагментов геномов 30 штаммов вируса КЭ. Сравнительный анализ гомологии нуклеотидных последовательностей этих штаммов позволил выделить 6 генотипов, каждый из которых объединял штаммы с высоким уровнем гомологии, но имел существенные отличия от представителей других пяти генотипов вируса. С помощью полученных данных были сделаны предварительные (из-за недостаточного числа анализируемых штаммов) оценки географического распространения разных генотипов вируса КЭ, однако проведение серийных исследований по генотипирова-нию штаммов не представлялось возможным в силу дороговизны и трудоемкости использованных методов.

Нами осуществлен анализ гомологии нуклеотидных последовательностей фрагментов геномов 35 штаммов вируса КЭ и на его основе впервые сконструированы дезоксиолигонуклеотидные зонды, специфичные по отношению к каждому из 6 генотипов. Важно отметить, что в качестве мишеней для зондов были выбраны участки вирусного генома, характеризующиеся тем, что нуклеотидные последовательности существенно различались у штаммов разных генотипов, но были гомологичны у штаммов внутри генотипов. В перекрестных опытах молекулярной гибридизации подтверждена генотипспецифическая реактивность зондов.

Использование высокоспецифичного и технологичного метода, каким является МГНК, для генетического типирования штаммов позволяет преодолеть трудности в развитии исследований по молекулярной эпидемиологии вируса КЭ, связанные с необходимостью секвенирования вирусных геномов. Мы применили полученные зонды для типирования представительной коллекции штаммов (96), изолированных в разных географических районах. В этих опытах специфичность гибридизацион-ной активности зондов на уровне генотипов вируса КЭ была подтверждена. Впервые была типирована большая выборка штаммов, выявлены доминирующие генотипы в разных участках ареала, а также широта распространения тех или иных генотипов на территории Евразии. В частности, полученные результаты опровергают сложившееся у многих исследователей мнение о преобладании штаммов, гомологичных дальневосточному штамму Софьин, в северной и восточной частях Восточно- Европейской равнины и в азиатской части ареала - в зоне обитания клеща Ixodes persulcatus. Показано, что только около 26 % изученных штаммов были отнесены к генотипу 1 (прототипный штамм Софьин), а более 60 % - пренадлежали генотипу 5 ( прототипный штамм Лесопарк -11 ). Штаммы генотипа 1 преобладали на Дальнем Востоке, но встречались и в ряде других регионов, включая Северо-Запад. Установлено, что штаммы, об

-по ладающие структурой, близкой западному штамму Меис1оегП ( генотип 2) , встречались не только в западной, но и в восточной частях ареала - в Предуралье, на Урале и в Сибири. Наиболее выраженная генетическая вариабельность отмечена в природной популяции вируса КЭ юга Восточной Сибири. Здесь, в зоне Байкальского рифта нами выявлена циркуляция четырех генотипов (1, 4, 5 и 6), а по данным В.И.Злобина и др., полученным с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирова-ния, в этом районе также обнаружены штаммы, относящиеся к генотипу 2.

Успешное генетическое тонирование штаммов с помощью МГНК демонстрирует возможность проведения широких молекулярно-эпидемиологических исследований вируса КЭ. Результатом этих работ может быть более ясное понимание современной эпидемической ситуации, роли тех или иных генетических типов вируса в заболеваемости в разных регионах, а также развитии патологии разной степени тяжести и причин региональных различий в клинических проявлениях этой инфекции. Новый уровень лабораторной диагностики, возможно, будет иметь важное прогностическое значение и позитивно повлияет на результативность лечебных мероприятий. Наконец, полноценный молекулярно-эпидемиологический анализ природных популяций вируса на эндемичных территориях даст новую информацию для решения стратегических вопросов, связанных с будущим специфической профилактики КЭ.