Автореферат и диссертация по медицине (14.01.30) на тему:Влияние сверхэкспрессии гена D-GADD45 в нервной системе Drosophila melanogaster на продолжительность жизни, возрастзависимые физиологические показатели и стрессоустойчивость

005000924

На правах рукописи

ПЛЮСНИНА Екатерина Николаевна

ВЛИЯНИЕ СВЕРХЭКСПРЕССИИ ГЕНА 0-вАВ045 В НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ ЖОБОРНИА МЕЬАМОвАБТЕК НА ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ, ВОЗРАСТЗАВИСИМЫЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ И СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТЬ

14.0130 - геронтология и гериатрия

1 7 НОЯ 2011

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2011

005000924

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент Москалев Алексей Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Попович Ирина Григорьевна

заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Баранов Владислав Сергеевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Защита диссертации состоится «29» ноября 2011 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110, Россия, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110, Россия, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3).

Автореферат разослан «30» октября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Козина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Старение представляет собой закономерный разрушительный процесс, при котором происходит снижение адаптационных возможностей организма и увеличение вероятности его смерти [БЭС, 1995]. Скорость старения определяется способностью организма эффективно отвечать на воздействие внешнесредовых и физиологических факторов, которая обусловлена механизмами обеспечения стрессоустойчивости. Долгоживущие особи разных видов имеют повышенную устойчивость к действию стресс-факторов [Sohal R.S. et al., 1990; Landis G.N. et al., 2003; HyunM. et al., 2008; Amrit F.R. et al., 2010]. В то же время короткоживущие мутанты различных модельных организмов, напротив, гиперчувствительны к стрессовым воздействиям [Москалев А.А. и др., 2007; Morrow G. et al., 2004; Venneulen C.J. et al., 2005; Moskalev A. et al., 2009; Zhao B.et al., 2009].

Важнейшим механизмом, определяющим стрессоустойчивость клетки и организма в целом, является распознавание повреждений и репарация ДНК. Известно, что мутации генов репарации ДНК значительно снижают продолжительность жизни и стрессоустойчивость у животных [Москалев А.А. и др., 2007; de Boer J. et al., 2002; Zhao В. et al., 2009]. У человека наследственные синдромы, ассоциированные с преждевременным старением, (синдром Вернера, синдром Ротмунда-Томпсона, синдром Блума, синдром Хатчинсона-Джилфорда, пигментная ксеродерма, трихотиодистрофия, атаксия-телеангиэктазия, синдром Коккейна, анемия Фанкони) обусловлены мутациями в генах, кодирующих ферменты репарации ДНК [Mallery D.L. et al., 1998; Lehmann A.R., 2003; Opresko P.L. et al., 2003; von Kobbe C. et al., 2004; Cleaver J.E., 2005; Navarro C.L. et al., 2006; Scaffidi P., Misteli Т., 2006]. Также показано, что с возрастом происходит снижение эффективности работы систем распознавания повреждений и репарации ДНК. С одной стороны, это связано со снижением экспрессии генов ключевых ферментов, ответственных за устранение повреждений ДНК [Soerensen М. et al., 2009; Zhang L. et al., 2010]. С другой стороны, при старении сами репарационные системы могут подвергаться ошибкам, приводя к увеличению вероятности возникновения мутаций [Анисимов В.Н., 2008]. Накапливающиеся с возрастом нарушения генетического материала могут затрагивать локусы генов, которые отвечают за функционирование систем клеточной защиты от стресса и обеспечение метаболизма, контроль клеточного цикла и клеточную гибель. В конечном итоге происходит возникновение связанных с возрастом патологий и старение организма [Анисимов В.Н., 2008; Zhang L. et al., 2010]. Однако прямым подтверждением геропротекторных свойств белков репарации ДНК может служить лишь увеличение продолжительности жизни организма при сверхэкспрессии их генов. Тем не менее, подобного рода данные из литературных источников неизвестны.

Белки консервативного в эволюции семейства GADD45 играют ключевую роль в ответе на повреждение ДНК и в репарации ДНК в ряду от насекомых до

человека [ЫеЬегтапп Б.А., НоАтал В., 2008]. У дрозофилы описан ортолог СА0045 - ген Св11086, или £>-<л4Ш45 в. й а1., 2007]. Мы

предположили, что сверхэкспрессия гена 0-СА0045 у особей Огояоркйа melanogaster приведет к более эффективному устранению спонтанно возникающих повреждений ДНК и вызовет увеличение продолжительности жизни. Для проверки этой гипотезы ген 0-0АВ045 сверхактивировали в нервной системе дрозофилы, поскольку нейрогуморальная регуляция гомеостаза детерминирует продолжительность жизни и процессы старения клеток и организма.

Цель исследования

Цель исследования заключалась в изучении влияния сверхэкспрессии гена £>-6уШ/>/5 в нервной системе Вго$орЫ1а mela.noga.ster на продолжительность жизни, возрастзависимые физиологические показатели и стрессоустойчивость.

Задачи исследования

1. Изучить возрастзависимую динамику экспрессии гена 0-САБ045 в нервной ткани.

2. Выявить действие сверхэкспрессии гена £>-СЛ£)£>45 в нервной системе на продолжительность жизни.

3. Оценить влияние сверхэкспрессии гена £>-<ЗтШ045 в нервной системе на возрастзависимые физиологические показатели - плодовитость (фекундность самок и фертильность самцов) и нервно-мышечную активность (отрицательный геотаксис и спонтанную нервно-мышечную активность);

4. Оценить влияние сверхэкспрессии гена на уровень повреждений ДНК и частоту апоптоза в нервной ткани.

5. Исследовать изменение устойчивости к действию стресс-факторов (окислительному стрессу, гипертермии, голоданию) в результате сверхэкспрессии гена В-СА0045 в нервной системе.

Теоретическая значимость и научная новизна работы

Показано, что сверхэкспрессия гена й-САОВ45 в нервной системе ОгозорИИа те1апо£аз1гг увеличивает продолжительность жизни без снижения плодовитости и нервно-мышечной активности. Это связано с более эффективным обнаружением и устранением повреждений ДНК, так как уровень повреждений ДНК в нервной ткани у личинок третьего возраста со сверхэкспрессией гена 0-САП045 достоверно снижен по сравнению с особями без сверхэкспрессии. Кроме того, в большинстве вариантов эксперимента наблюдали повышение стрессоустойчивости у особей со сверхэкспрессией гена 0-СА0045 в нервной системе. У старых дрозофил дикого типа выявлено существенное снижение спонтанной активности гена 0-САйВ45. Таким образом, впервые показаны вклад в регуляцию продолжительности жизни и геропротекторная роль сверхактивации эволюционно консервативного гена £)-СА0045, вовлеченного в ответ на повреждение и репарацию ДНК.

Практическая значимость работы

У млекопитающих и человека присутствует группа ортологов гена D-GADD45. Нарушение их регуляции играет роль в патогенезе некоторых видов рака, атеросклерозе, нейродегенеративных заболеваниях. Выявленная нами геропротекторная роль активации гена GADD45 открывает перспективы разработки фармакологических препаратов, направленных на профилактику и лечение возрастзависимых патологий у человека. Обнаруженный нами факт возрастзависимой динамики активности гена GADD45 позволяет использовать экспрессию данного гена в качестве биомаркера скорости старения при оценке биологического возраста организма и эффективности геропротекторной терапии.

Положения, выносимые на защиту

1. Сверхэкспрессия гена D-GADD45 в нервной системе Drosophila melanogaster увеличивает продолжительность жизни без ухудшения возрастзависимых физиологических показателей - плодовитости и нервно-мышечной активности.

2. Наблюдаемые геропротекторные эффекты связаны с повышенной эффективностью обнаружения и устранения повреждений ДНК в результате сверхактивации гена D-GADD45 в нервной системе.

3. Сверхэкспрессия гена D-GADD45 в нервной системе влияет на устойчивость к различным видам стресса.

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 17 работ, в том числе 7 статей в журналах, включенных в Перечень ВАК Министерства образования и науки РФ, 10 материалов и тезисов докладов.

Апробация

Результаты работы докладывались на научных конференциях молодых ученых Института биологии и Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2009-2011), на международной конференции «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды» (Сыктывкар, 2009), 37th Arnual Meeting of the European Radiation Research Society (Прага, Чехия, 2009), 1-ой международной научной конференции «Генетика продолжительности жизни и старения» (Сыктывкар,

2010), международной конференция «Современные проблемы генетики, радиобиологии, радиоэкологии и эволюции» (Алушта, 2010), 14th International Congress of Radiation Research (Варшава, Польша, 2011), 5й1 Stratégies for Engineered Negligible Senescence Conference (Кембридж, Великобритания,

2011), 26th ISTC-Korea Workshop on Advanced Nuclear Materials, Materials Evaluation and Radiation Biology (Теджон, Южная Корея, 2011).

Связь с планом НИР

Исследования проводились в течение 2008-2011 гг. в рамках бюджетных тем отдела радиоэкологии Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Проведенные исследования были поддержаны грантом РФФИ на 2008-2010 гг., грантом Президиума РАН по целевым программам «Молекулярная и клеточная

биология» и «Фундаментальные науки - медицине» на 2009-2011 гг., Молодежным научным грантом УрО РАН на 2009 г. и 2010 г.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материал и методы, результаты, обсуждение результатов), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 532 публикации, в том числе 502 публикации из зарубежных изданий. Работа изложена на 186 страницах машинописного текста и содержит 3 таблицы и 22 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Линии Drosophila melanogaster и условия содержания

Для проведения экспериментов использовали следующие лабораторные линии Drosophila melanogaster: линия дикого типа Canton-S; линия UAS-D-GADD45 (генотип: w"; P{UAS-D-GADD45}) содержит дополнительную копию гена D-GÂDD45 под контролем промотора UAS (любезно предоставлена Dr. Uri Abdu, Ben-Gurion University, Израиль); GAL4-1407 (генотип: w*; P{GawB}1407) несет конститутивный драйвер GAL4 в нервной системе дрозофилы (любезно предоставлена Bloomington Stock Center, США); ELAV (генотип: / w*; P{ELAV-GeneSwitch}) содержит тканеспецифичный мифепристон-индуцибельный драйвер GAL4-Switch, активный в нервной системе дрозофилы (любезно предоставлена Dr. Keshishian, Yale University, США).

Дрозофил содержали в термостате при 25 °С и 12-часовом режиме освещения на агарно-дрожжевой питательной среде [Ashburner M., 1989].

Активация сверхэкспрессии гена D-GADD45

Для конститутивной сверхактивации гена D-GADD45 в нервной системе дрозофилы производили скрещивание самок линии UAS-D-GADD45 с самцами линии GAL4-1407.

Для кондиционной сверхэкспрессии D-GADD45 в нервной системе производили скрещивание самок линии UAS-D-GADD45 с самцами линии ELAV. Затем потомков скрещивания содержали на питательной среде, обработанной раствором мифепристона RU486 (Mifepritone, Sigma) (индуктор экспрессии драйвера GAL4-Switch) [Poirier L. et al., 2008].

Количественный анализ ПЦР «в реальном времени»

Использовали по 50 голов имаго на вариант эксперимента. РНК выделяли с помощью TRIzol Reagent (Invitrogen) по инструкции изготовителя. Обратную транскрипцию для синтеза кДНК проводили с использованием Oligo(dT) праймера (Invitrogen) и обратной транскриптазы SuperScript III (Invitrogen) по инструкции изготовителя. ПЦР «в реальном времени» проводили в амплификаторе АНК-32 (Институт аналитического приборостроения) с использованием реакционной смеси с красителем SYBR Green PCR Master Mix

(Applied Byosystems) и праймеров гена D-GADD45 и гена «домашнего хозяйства» p-Tubulin (СИНТОЛ). Рассчитывали относительную экспрессию с помощью метода 2"MCt [Livak K.J., Schmittgen T.D., 2001].

Анализ продолжительности жизни Отбирали по 150-250 мух на вариант эксперимента. Ежедневно проводили подсчет числа умерших мух. Два раза в неделю дрозофил переносили на свежую среду. По полученным данным строили кривые выживаемости и рассчитывали среднюю, медианную, минимальную, максимальную продолжительность жизни, возраст 90 % смертности, параметры уравнения Гомпертца. Для оценки достоверности различий по продолжительности жизни применяли непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова (для сравнения распределения смертности в выборках) [Fleming T.R. et al., 1980] и Гехана-Бреслоу-Вилкоксона (для сравнения различий по медианной продолжительности жизни) [Breslow N.A., 1970]. Достоверность различий по максимальной продолжительности жизни оценивали с помощью метода Ванг-Аллисона [Wang С. et al., 2004].

Оценка фекундности самок Отбирали по 50 самок на вариант эксперимента. Раз в неделю считали количество яиц, отложенных самками за сутки, и количество куколок, развившихся из яиц на 10-14 сут после кладки. Достоверность различий оценивали с помощью критерия хи-квадрат.

Оценка фертильности самцов Для каждого варианта эксперимента отбирали по 30 самцов. Раз в неделю исследуемых самцов рассаживали в пробирки с девственными самками линии дикого типа Саnton-S в соотношении 1 самец на 5 самок. Считали количество яиц, отложенных оплодотворенными самками за сутки, и количество куколок на 10-14 сут после кладки. Достоверность различий оценивали с помощью критерия хи-квадрат.

Исследование показателей нервно-мышечной активности Отбирали по 90 мух на вариант эксперимента. Оценку спонтанной нервно-мышечной активности и тест на отрицательный геотаксис осуществляли по стандартной методике с помощью аппаратно-программного комплекса Drosophila Population Monitor (TriKinetics, США). Достоверность различий оценивали с помощью критерия хи-квадрат.

Выявление уровня повреяедений ДНК и частоты апоптоза Для исследования уровня повреждений ДНК (методом «ДНК-комет» [Mukhopadhyay I. et al., 2004]) и частоты апоптоза (методом диффузии ДНК в геле [Singh N.P., 2000]) использовали нервные ганглии личинок третьего возраста (по 7 препаратов из 4 ганглиев на вариант эксперимента). Уровень повреждения ДНК характеризовали медианой «момента хвоста» по П. Оливе [Olive P.L. et al., 1990] для 400 клеток на вариант эксперимента. Долю клеток, подвергшихся апоптозу, оценивали по 4000 и более клеток на вариант эксперимента. Различия между выборками оценивали с помощью t-критерия Стьюдента (для метода «ДНК комет») и ф-критерия Фишера для выборочных

долей (для метода диффузии ДНК в геле).

Оценка стрессоустойчивости

Для каждого варианта эксперимента отбирали по 200-300 мух. Для определения устойчивости к оксидативному стрессу мух помещали в баночки, где вместо питательной среды использовали фильтровальную бумагу, пропитанную раствором 20 мМ параквата (Methyl Viologen, Sigma) в 5 % растворе сахарозы. Для определения устойчивости к гипертермии мух содержали при 35 °С на стандартной питательной среде. Для определения устойчивости к голоданию дрозофил содержали в банкочках, где вместо питательной среды использовали фильтровальную бумагу, пропитанную водой. Два раза в день подсчитывали количество умерших особей. Рассчитывали процент умерших особей через 48 ч и строили кривые выживаемости. Достоверность различий оценивали с помощью ф-критерия Фишера (для сравнения % умерших особей спустя 48 ч) и критерия Колмогорова-Смирнова (для сравнения распределения смертности в выборках).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изменение уровня экспрессии гена D-GADD45 в нервной системе у особей Drosophila melanogaster с возрастом

Оценивали изменение экспрессии гена D-GADD45 в нервной системе особей линии дикого типа Canton-S сразу после появления имаго, через 28 сут соответствует началу вымирания дрозофил линии дикого типа Canton-S в экспериментальных условиях) и через 56 сут (соответствует возрасту 90 % смертности). У самок и самцов линии дикого типа Canton-S уровни экспрессии D-GADD45 существенно не отличались. По сравнению с возрастом появления имаго у самцов и самок спустя 28 сут наблюдали увеличение экспрессии гена D-GADD45 в 2.5-2.9 раза, но в возрасте 56 сут экспрессия гена D-GADD45 снизилась более чем в 10 раз. Таким образом, при старении дрозофилы происходит декомпенсаторное снижение экспрессии TenaD-GADD45.

Сверхэкспрессия гена D-GADD4S в нервной системе Drosophila melanogaster

Для подтверждения конститутивной сверхактивации гена D-GADD45 сравнивали экспрессию D-GADD45 у особей с генотипом UAS-D-GADD45/GAL4-1407 и особей с генотипом Canton-S/GAL4-1407. Выявлена сверхактивация гена D-GADD45 у самцов в 10 раз, у самок - в 3 раза.

Для подтверждения кондиционной сверхэкспрессии гена D-GADD45, , сравнивали уровень его экспрессии у особей с генотипом UAS-D-GADD45/ELAV, содержащихся на среде с мифепристоном, у особей с таким же генотипом, но содержащихся на среде без мифепристона, и у особей с генотипом Canton-S/ELA V. Показана сверхэкспрессия гена D-GADD45 у самцов в 3-4 раза, у самок - в 2 раза.

Влияние сверхэкспрессии гена 2)-бАОВ45 в нервной системе на продолжительность жизни особей 1)га$0/>/н7а melanogaster

Изучали влияние конститутивной и кондиционной сверхэкспрессии гена 0-СА0045 в нервной системе на продолжительность жизни йгозорИНа melanogaster. В первом эксперименте оценивали эффект конститутивной сверхэкспрессии 0-СгА0й45 в нервной системе. Обнаружено, что у самцов и самок с конститутивной сверхэкспрессией 0-САВ045 кривые выживаемости проходят выше, а максимальная продолжительность увеличивается по сравнению с особями без сверхэкспрессии (р<0.001) (рис. 1.1). Медианная продолжительность жизни увеличилась у самцов (на 73-77 %, р<0.001) и у самок (на 22-46 %, р<0.001) с конститутивной сверхэкспрессией Б-СА0045 по сравнению с особями родительских линий \JAS-D-GADD45 и САЬ4-1407. У самцов с конститутивной сверхэкспрессией £>-С/Ш£>45 по сравнению с самцами СаШоп-8/<ЗАЬ4-1407 медианная продолжительность жизни выше на 617 % (р<0.001), у самок - до 7 % (р<0.05). Кроме того, показано увеличение возраста 90 % смертности у особей с конститутивной сверхэкспрессией й-САОВ45 на 5-59 % по сравнению с особями без сверхэкспрессии (табл. 1).

Таблица 1

Влияние конститутивной сверхэкспрессии гена й-СА0045 в нервной системе на

продолжительность жизни Drosophila melanogaster

Вариант эксперимента M Х±Дщ 90% min max б ! R MRDT N

<$ UAS-D-GADD45 (-)* 43* 45.Ш.2 71* 3 84 0.0510.0041 13.7 258

$ UAS-D-GADD45 (-)* 57* 56.6±1.2 76* 3 84 0.07 0.0007 9.9 211

S GAL4-1407 (-)* 44* 45.б±0.8 56* 4 73 0.10 0.0006 6.9 136

$ GAL4-1407 (-)* 48* 45.0±1.0 56* 6 64 0.11 0.0004 6.3 138

S Canton-S/GAL4-l407 (1-)* 72* 65.3±1.4 87* 6 91 0.06 0.0005 11.6 238

$ Canton-S/GAL4-1407 (2-)* 77* 69.1±1.5 84* 6 90 0.08 0.0001 8.7 200

$ Canton-S/GAL4-I407 (1-)* 75* 74.6±0.6 84** 7 90 0.14 0.0000 5.0 273

5 Canton-S/GAL4-1407 (2-) 72 68.3±1.2 84 6 90 0.09 0.0001 7.7 199

в UAS-D-GADD45/GAL4-1407 (1+) 76 74.2±1.4 89 34 98 0.09 0.0001 7.7 186

S UAS-D-GADD45/GAL4-1407 (2+) 84 81.8±1.1 96 6 102 0.11 0.0000 6.3 176

в UAS-D-GADD45/GAL4-1407 (3+) 82 77.8±1.2 91 20 98 0.10 0.0000 6.9 175

? UAS-D-GADD45/GAL4-1407 (1+) 70 67.0±1.1 84 15 98 0.08 0.0003 8.7 173

$ UAS-D-GADD45/GAL4-1407 (2+) 80 77.0±0.8 89 6 96 0.13 0.0000 5.3 271

$ UAS-D-GADD45/GAL4-1407 (3+) 70 69.Ш.0 84 21 97 0.0910.0001 7.7 211

Здесь и далее: М - медианная продолжительность жизни (сут); Х±Дщ -средняя продолжительность жизни (сут) и ошибка средней; 90 % - возраст 90 % смертности (сут); min - минимальная продолжительность жизни (сут); тах -максимальная продолжительность жизни (сут); б и R - параметры уравнения Гомпертца; MRTD - время удвоения интенсивности смертности; N -количество особей в выборке; «-» - особи без сверхэкспрессии; «+» - особи со сверхэкспрессией D-GADD45; - самцы; $ - самки; 1, 2, 3 - повторы эксперимента; * - р<0.001; ** - р<0.05 (первый столбец - по критерию Колмогорова-Смирнова, второй столбец - по критерию Гехана-Беслоу-Вилкоксона; четвертый столбец - по критерию Ванг-Аллисона).

.........иА8-0-вАП045.....вА14-1407 — СаЫоп-$/вАЕ4-1407

-иА5-В-ОАОО45/ОАЬ4-!407 (сверхэкспрессия 0-0А0045)

.........Ш5-1)-а<ШГ>4 5 - " ЕМ V---СапЮп-т1А V--Ш8-В-САОВ45/Е1А V

-иАЗ-П-0АОО45/ЕЬА¥ + мифепристон (сверхэкспрессия О-0А0045)

--Ш8-В-САВ045/ЕЕА V

-Ш8-и-0АОО45/ЕЬА V + мифепристон (сверхэкспрессия 0-0АВ045 с 30 сут)

Рис. 1. Влияние конститутивной (1) (объединены три повторности), * кондиционной (2) и отсроченной кондиционной (3) (объединены две повторности) сверхэкспрессии гена В-ОАОВ45 в нервной системе на продолжительность жизни самцов ($<$) и самок ($$) ИговорИИа melanogaster, * -р<0.001; ** -р<0.05 (по критерию Колмогорова-Смирнова).

Таким образом, конститутивная сверхэкспрессия £-(7/Ш£>45 в нервной системе увеличивает медианную и максимальную продолжительность жизни дрозофил. Значительный вклад в продление жизни вносит эффект гетерозиса, поскольку различия особей с конститутивной сверхэкспрессией й-СА0045 по сравнению с особями Сап1оп-5/САЬ4-]407 меньше, чем по сравнению с особями родительских линий \JAS-D-GADD45 и САЬ4-1407. Также на длительность жизни могли повлиять разный генетический фон и эффекты сверхэкспрессии 0-ОАОй45 на эмбриональной и личиночной стадиях развития. Поэтому во втором эксперименте изучили эффект кондиционной (мифепристон-индуцибельной) сверхэкспрессии гена 0-СА0045 в нервной системе.

Кривые выживаемости самцов и самок с генотипом и А 5-О-0АБ045/Е1А V, содержащихся на среде с мифепристоном, проходят выше с увеличением максимальной продолжительности жизни по сравнению с кривыми выживаемости особей с тем же генотипом, необработанных мифепристоном (р<0.001 у самцов и р<0.05 у самок), а также по сравнению с особями родительских линий иАБ-О-0АОО45 и ЕЬАУ (р<0.001). Однако кривые выживаемости самцов со сверхэкспрессией 0-СА0Б45 и самцов СаЫоп-Б/ЕЬАУ в одной из повторностей отличаются при р<0.05, а в другой -недостоверно; у самок различия достоверны (р<0.001) (рис. 1.2). Индукция сверхэкспрессии 0-СА0045 увеличивает медианную продолжительность жизни самцов на 40-42 % (р<0.001), самок - на 3-6 % (р<0.05). Медианная продолжительность жизни самцов с кондиционной сверхэкспрессией £>-0А0045 по сравнению с медианной продолжительностью жизни самцов с генотипами \JAS-D-GADD45, ЕЬАУ и СаМоп-Б/ЕЕАV увеличена на 5-84 % (р<0.001), самок - на 27-102 % (р<0.001). Кроме того, у особей с кондиционной сверхэкспрессией 0-СА0045 возраст 90 % смертности выше на 5-54 % по сравнению с особями без сверхэкспрессии (табл. 2). Таким образом, кондиционная сверхэкспрессия гена 0-СА0045 в нервной системе увеличивает продолжительность жизни особей ОгозорЪИа melanogaster, что обусловлено не только влиянием генетического фона и эффектом гетерозиса.

В следующем эксперименте изучили влияние отсроченной кондиционной сверхэкспрессии гена В-САОБ45 в нервной системе. Для этого мухам с генотипом \JAS-D-GADD457ELA V в среду добавляли мифепристон, начиная с 30 сут жизни имаго. У особей с отсроченной кондиционной сверхэкспрессией Б-САВВ45 кривые выживаемости проходят выше, чем у особей без индукции сверхэкспрессии мифепристоном (р<0.001 у самцов и р<0.05 у самок) (рис. 1.3). Отсроченная кондиционная сверхэкспрессия 0-СА0045 увеличила медианную продолжительность жизни самцов на 11-14 %, самок - на 8 %, но критерий Гехана-Бреслоу-Вилкоксона достоверных различий не показал (табл. 3). Таким образом, при отсроченной кондиционной сверхэкспрессии гена П-САПй45 в нервной системе наблюдается увеличение продолжительности жизни по сравнению с особями без сверхэкспрессии, но в меньшей степени, чем при конститутивной и кондиционной сверхэкспрессии с первого дня жизни имаго.

Таблица 2

Влияние кондиционной сверхэкспрессии гена £>-С/Ш£>45 в нервной системе на _продолжительность жизни Ргокоркйа те1апо%а$1ег__

Вариант эксперимента М Х±Дт 90% тт тах б И мшг N

3 Ш5-В-0А0045 (-)* 40* 39.1±0.7 52* 10 54 0.13 0.0004 5.2 162

9 (-)* 55* 56.1±0.9 69* 4 85 0.09 0.0004 7.7 173

6 Е£АУ(-)* 37* 32.5±1.2 57* 1 70 0.05 0.0092 15.4 221

$ ЕМУ 35* 33.8±1.1 57* 4 63 0.05 0,0067 12.8 223

$ Сшоп-5/ЕИУ(-)** 57** 55.5±1.2 74* 9 81 0.07 0.0007 9.3 172

$ СаЫоп-8/ЕЫ V (-) * 55* 55.6±0.9 72* 10 80 0.09 0.0003 7.8 176

<3 ИА5-В-С]А0045/ЕЬА К(1-)* 48* 45.4±1.8 74** 4 80 0.05 0.0032 13.1 110

$ Ш8-0-0А0045/ЕЫ V (2-)* 43* 39.5±2.1 64** 2 80 0.04 0.0064 16.1 105

? Ш8-0-СА0045/ЕЬ4 К(1-)* * 67** 59.9±2.0 83 4 95 0.05 0.0015 13.6 145

5 иА5-В-САВВ45/ЕЫV(2-)** 68 63.7±1.7 83 2 92 0.07 0.0005 9.9 127

в ШЗ-0-0А0В45/ЕЕЛ V + м (1+) 68 61.3±1.5 78 7 85 0.08 0.0003 8.3 124

с? Ш8-0-0А0045/Е1А V f м (2+) 60 54.4±1.8 74 4 85 0.06 0.0012 11.0 112

О ИА$-Ъ-САиВ45/Е1АУ+ м (1+) 71 65.0±2.1 86 9 92 0.06 0.0006 11.4 125

$ иА8-0-0А0045/ЕЬАУ + и (2+) 70 65.4±1.8 88 4 85 0.06 0.0006 10.8 139

Таблица 3

Влияние отсроченной (начиная с 30 сут) кондиционной сверхэкспрессии

гена В-ОАОБ45 в нервной системе на продолжительность жизни _Drosoph.Ua те1апо^а51ег__

Вариант эксперимента М Х±Дщ 90% тт тах б Я \4RDT N

$ 11А5-0-СА0045/ЕЫ К (1 -)* 56 55.9±1.6 80 3 89 0.06 0.0013 11.6 123

$ илЗ-О-0АОО45/ЕЬА V (2-) * 64 64.6±1.5 80 9 94 0.09 0.0002 8.0 106

? Ш5,-0-0АП045/ЕЫ У(1-)** 62 59.6±1.2 80 8 82 0.07 0.0006 9.7 191

$ Ш&'-0-0А0П45/£и V (2-) 64 64.Ш.5 87 9 94 0.07 0.0003 9.2 127

О Ш8-0-0А0045/ЕИУ+ м (1+) 64 58.6±1.4 74 6 85 0.07 0.0008 10.1 133

в 1/А5-0-0А0045/ЕЬА V + м (2+) 71 60.4±2.4 80 9 92 0.06 0.0010 11.9 101

$ Ш8-О-0А0В45/ЕЫУ + м (1+1 67 61.4±1.5 81 9 88 0.07 0.0006 10.1 144

9 Х]А8-Т)-ОАВЕ)45/Е1А У + м (2+) 64 60.6±1.8 80 9 88 0.07 0.0004 9.3 107

Влияние сверхэкспрессии гена в нервной системе на

фекундность самок ОговорМЫ melanogaster

У самок с конститутивной сверхэкспрессией гена £>-СЛ£Ю45 в нервной системе по сравнению с самками родительских линий \jas-d-gadd45 и ЪаЬ4-1407 фекундность выше на протяжении всей жизни. В среднем количество яиц на самку, отложенных за сутки, повышено в 2-2.3 раза (р<0.001), количество куколок - в 3.7-4.4 раза (р<0.001). Но по сравнению с самками Сап1оп-8/оаь4-1407 фекундность достоверно не отличается (рис. 2.1).

2

25

30

&

I 25

0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0 -,-1--.--.

О 10 20 30 40 50 60 70

Возраст, сут

Возраст, сут

.........

—- вА14-1407 — СаШоп-ЖА14'1407 - иЛ5-й-САОВ45/САЬ4-1407

Ш8-0-вА0045 ЕЬАУ

- Саыоп-Б/ЕЬА V

(сверхэкспрессия 0-СА0045)

- иАв-О-ОА ПВ45/Е1А V

— Ь'А8-0-СА0В45/Е1А V + мифепристон (сверхэкспрессия .0~<Я4 Д045)

Рис. 2. Влияние конститутивной (1) и кондиционной (2) сверхэкспрессии гена Р-СА0045 в нервной системе на яйцепродукцию самок ИговоркИа melanogaster, * - р<0.001 (по критерию хи-квадрат).

У самок с кондиционной сверхэкспрессией гена В-САВВ45 в нервной системе количество яиц на самку, отложенных за сутки, в среднем повышено в 1.7-2.6 раз по сравнению с самками ЕЬАУ и Сапеоп-Б/ЕЬАУ (р<0.001), и недостоверно отличается от самок других генотипов. Количество куколок выше в 1.5-2.9 раз по сравнению с самками \JAS-D-GADD45 (р<О.05), ЕЬАУ и СапЮп-Б/ЕЬАУ (р<0.001) и незначительно отличается от самок иАБ-О-0АОО45/ЕЬАУ, содержащихся на среде без мифепристона (рис. 2.2).

Таким образом, конститутивная и кондиционная сверхэкспрессия гена Б-0АОО45 в нервной системе не снижает фекундность самок Drosoph.Ua melanogaster. Более того, фекундность самок с конститутивной и кондиционной сверхэкспрессией гена £>-(7/Ш1)45 выше, чем у самок родительских генотипов.

У самцов с конститутивной сверхэкспрессией гена 0-СА0045 в нервной системе увеличена фертильность по сравнению с самцами родительской линии САЬ4-1407 в 1.8 раз по количеству яиц (р<0.001) и в 2.6 раз по количеству куколок (р<0.05). Различия с другими генотипами недостоверны.

Фертильность самцов с кондиционной сверэкспрессией гена 0-СА0045 в нервной системе достоверно выше (в 4-5 раз, р<0.001) по сравнению с самцами родительской линии ЕЬА V. Различия с другими генотипами недостоверны.

Таким образом, фертильность самцов Drosoph.Ua meíanogaster также не снижается при конститутивной и кондиционной сверхэкспрессии гена В-ОАЭВ45 в нервной системе.

Влияние сверхэкспрессии гена в нервной системе

на фертильность самцов

Влияние сверхэкспрессии гена ¿>-Су4Ш>45 в нервной системе на нервно-мышечную активность особей Вго$орМ1а melan.oga.ster

Нервно-мышечная активность у самцов и самок с конститутивной сверхэкспрессией гена П-САОВ45 в нервной системе выше по сравнению с особями родительских линий и САЬ4-1407 на протяжении всей

жизни по показателю спонтанной нервно-мышечной активности (р<0.001) и по тесту на отрицательный геотаксис (р<0.001). Тест на спонтанную нервно-мышечную активность также показал позитивный эффект конститутивной сверхактивации В-ОАОВ45 в нервной системе (р<0.001) у самцов и у самок по сравнению с особями с генотипом Сап1оп-5/СА14-1407 (рис. 3.1). В то же время тест на отрицательный геотаксис достоверных различий не выявил.

2 Л?

150

га

э °

1° £ т

г I го

а.

ф X

О

Рис. 3. Влияние конститутивной (1) и кондиционной (2) сверхэкспрессии гена В-САВВ45 в нервной системе на спонтанную нервно-мышечную активность самцов (<$$) и самок ($ $) Ого$орЫ1а melanogaster; * - р<0.001 (по критерию хи-квадрат).

3 ° -а х

0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 „30 40 50 60 70

Возраст, сут Возраст, сут

СШ-£>-&4Д045 ь -ЕЫУ х — СапЮп^ЕЕАУ ♦--1]А5-В-ОАОП45/Е1АУ

• — иА8-0-СА0й45/Е1АУ + мифепристон (сверхэкспрессия 0-СА0й45)

0 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, оут Возраст, сут

а —- вА14-1407 х —- СапШп-ЖАЬ4-1407 — иА8-1>ОАи045/вАи-1407 (сверхэкспрессия 0-вА0045)

2 99

150

ф £ Ю0

Э °

Ц. о

£ I

2 т

Нервно-мышечная активность у самцов с кондиционной сверхэкспрессией гена 0-СА0Б45 в нервной системе повышена и достоверно отличается по сравнению с самцами с генотипами ЕЬАУ и СапЮп-Б/ЕЬАУ по показателю спонтанной активности и по тесту на отрицательный геотаксис (р<0.001). Различия с другими контрольными генотипами недостоверны. Тест на спонтанную активность показал ее увеличение у самок с кондиционной сврерхэкспрессией В-САПВ45 по сравнению с самками родительских линий ЕЬАУ и и с генотипом СстШ-Я/ЕЬАУ (р<0.001).

Но отсутствуют достоверные различия между самками иА5-Б~СА0045/ЕЬАУ, содержащимися на среде с мифепристоном и на среде без мифепристона (рис. 3.2). Тест на отрицательный геотаксис показал повышение нервно-мышечной активности у самок с кондиционной сверхэкспрессйей 0-САЭ045 по сравнению с самками без сверхэкспрессии (р<0.001).

Таким образом, конститутивная и кондиционная сверхэкспрессия гена 0-САй045 в нервной системе не ухудшила показатели нервно-мышечной активности у самцов и самок ОгояоркПа melanogaster.

Влияние сверхэкспрессии гена в нервной системе

ИгозоркИа melanogaster на уровень повреждений ДНК и частоту апоптоза

В нейробластах личинок ОгоэоркИа melanogaster с конститутивной и кондиционной сверхэкспрессией гена 0-СА0В45 в нервной системе уровень повреждений ДНК достоверно снижен на 21-27 % (р<0.001) по сравнению с особями с генотипами Сапгоп~8/САЬ4-1407, Сап(оп-5/ЕЬА V и живущими на среде без мифепристона особями с генотипом иА5-0-СА0П45/ЕЬАУ. Таким образом, сверхактивация Б-СА0045 повышает эффективность обнаружения и устранения повреждений ДНК. В то же время частота апоптоза в нейробластах личинок с конститутивной и кондиционной сверхэкспрессией 0-СА0045 значимо не отличается от особей без сверхэкспрессии.

Влияние сверхэкспрессии гена /)-<?/Ш.£)¥5 в нервной системе на устойчивость особей ОпкоркИа melanogaster к действию стресс-факторов (оксидативному стрессу, гипертермии, голоданию)

У самцов конститутивная и кондиционная сверхэкспрессия гена В-СА0045 в нервной системе вызвала достоверное увеличение устойчивости к действию индуктора свободных радикалов параквата в 1.6-2.6 раз (р<0.05) по сравнению с самцами без сверхэкспрессии, кроме самцов с генотипом Сяи/оя-Б/САЬ4-1407 (различия недостоверны). У самок достоверные различия по проценту умерших особей спустя 48 часов наблюдаются только при кондиционной сверхэкспрессии Б-СА0045 ~ он снижен в 2.1-3.5 раза по сравнению с самками \JAS-D-GADD45, ЕЬА V и СаШоп-Б/ЕЬА V (рис. 4).

1 40

¿ш

□ иА8-0-0А0Б45 9 вАЬ4-1407 □ Сагаоп-&аА14-1407 ■ иА8-П-САПП45/вА14-1407 (сверхэкспрессия 0-вА0045)

29?

*

I •

" П I А

1

□ 11А8-0-вА0045 Я ЕЬАУ Ш СсаЛоп-ШЬАУ □ Ш5Ф-СА0045/Е1АV Ш \JAS-D-GADD45ZELAV + мифепристон (сверхэкспрессия 0-вА0045)

Рис. 4. Влияние конститутивной (1) и кондиционной (2) сверхэкспрессии гена В-САОй45 в нервной системе на устойчивость особей ОгоэоркИа melanogaster к оксидативному стрессу (паракват); * р<0.001, ** р<0.05 (по ц-критерию Фишера).

Обнаружено повышение устойчивости к гипертермии (35 °С) по величине процента умерших особей спустя 48 ч в 2.7-5.4 раза у самцов и самок с конститутивной сверхэкспрессией £>-СЛГ>£>45 в нервной системе по сравнению с особями линии САЬ4-1407 (р<0.001) (рис. 5.1). Кондиционная сверхэкспрессия 0-СА0045 снизила процент умерших самцов спустя 48 ч в 2.2-14.9 раза по сравнению с самцами с тем же генотипом без индукции сверхэкспрессии и самцами с генотипами ЕЬАУ и СаЫоп-Б/ЕЬАУ (р<0.05); а также снизила процент умерших самок в 54-166 раз по сравнению с самками ШS'-D-GЛDD45 и ЕЬАУ {рис. 5.2).

\вв

19?

70

'1 60 § 50

0

; 40

1 30

<в

2 20

* 10 О

п

70 а: ВО

ф

•§ 50 | 40

I зо

I 20 # 10 о

1

2 36

□ ШЗ-Д-ОЛДО« Н ОАЬ4-1407 □ Сап1оп-ЖА14-1407

I иА8-0-ОА0045ЮА14-1407 (сверхэкспрессия £>-04£Ю45)

2??

100

ж

* -г-1-

□ \JAS-D-GADD45 И ЕЬАV И СапШ-Б/ЕМГ □ иА8-1}-вА0045/Е1АУ ■ Ш8-Л-САП045/Е1,А V + мифепристон (сверхэкспрессия 0-САВ045)

Рис. 5. Влияние конститутивной (1) и кондиционной (2) сверхэкспрессии гена £>-<ЗЛД045 в нервной системе на устойчивость особей ОгозоркИа

melanogaster к гипертермии (35 °С); Фишера).

р<0.001, ** р<0.05 (по ц-критерию

Показано увлечение устойчивости к голоданию у самцов с конститутивнои и кондиционной сверхэкспрессией гена й-СА0045 в нервной системе в 1.8-8.3 раз (р<0.05) по сравнению с особями без сверхэкспрессии, кроме особей с генотипом Сап1оп-5/САЬ4-1407 (различия недостоверны). Повышение устойчивости к голоданию наблюдается только у самок с конститутивной сверхэкспрессией гена В-САОВ45 по сравнению с самками драйверной линии САЬ4-1407 в 2.4 раза (р<0.05) и у самок с кондиционной сверхэкспрессией гена D-GЛDD45 по сравнению с самками линии ЕЬАУ в 2.1 раза (р<0.001). Однако у самок с конститутивной сверхэкспрессией В-ОАОВ45 устойчивость к голоданию по сравнению с остальными вариантами эксперимента без сверхэкспрессии различается недостоверно, а у самок с кондиционной сверхэкспрессией гена 0-СА0045 - снижается в 2.2-5.9 раза (р<0.001) (рис. 6).

Таким образом, в условиях интенсивного стресса различной природы (оксидативного стресса, гипертермии, голодания) конститутивная и кондиционная сверхэкспрессия гена В-САВВ45 в нервной системе в большинстве вариантов эксперимента способствует увеличению выживаемости особей, при этом выраженность эффектов зависит от пола и уровня экспрессии исследуемого гена.

ââ

9?

ri-]

2ââ

ri

J_В

n

i_[fx

□ UAS-D-GADD45 В GAL4-1407 □ Canton-S/GAL4-1407 I UAS-D-GADD45/GAL4-1407 (сверхэкспрессия D-GADD45)

2 ?$

100

is •о 80

о

о 60

3 о. 40

0>

2

> 20

*

** - ;

*

Inj

□ \JAS-D-GADD4S Н Е1АУ И Сапсоп-З/ЕЬАУ □ К

■ иА5-0-0А0045/Е1.АУ мифепристон+ (сверхэкспрессия 0-СА0045)

Рис. 6. Влияние конститутивной (1) и кондиционной (2) сверхэкспрессии гена 0-СА0045 в нервной системе на устойчивость особей Drosoph.Ua melanogaster к голоданию; * р<0.001, ** р<0.05 (по ц-критерию Фишера).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Нарушение функций многих генов ведет к снижению продолжительности жизни, однако это может быть не только результатом ускорения процесса нормального старения, но и следствием патологии, независимой от старения. Для выявления механизмов, регулирующих продолжительность жизни и старение, часто используется поиск генов, снижение или полное выключение активности которых продлевает жизнь. С другой стороны, гены долгожительства могут быть идентифицированы путем измерения продолжительности жизни у животных со сверхэкспрессией гена-кандидата.

С помощью первого подхода был выявлен целый ряд эволюционно консервативных механизмов, отвечающих за регуляцию процессов старения и продолжительность жизни. Например, показано, что мутации генов инсулинового и TOR сигналинга способны продлевать жизнь различных видов живых организмов [Friedman D.B., Johnson Т.Е., 1988; Larsen P.L. et al., 1995; Lithgow G.L. et al., 1995; Guarente L., Kenyon C., 2000; Barsyte D. et al, 2001; Clancy D.J. et al., 2001; Lee R.Y. et al., 2001; Tatar M. et al,, 2001; Meissner В. et al, 2004; Halaschek-Wiener J. et al., 2005; Kenyon C., 2005; Sun L.Y. et al., 2005; Selman C. et al., 2008; Henis-Korenblit S. et al., 2010]. Продление жизни,

вызванное мутациями некоторых генов, часто сопровождается ухудшением других параметров, например, замедлением развития и нарушением метаболизма, снижением репродуктивных способностей. При отсутствии таких негативных побочных эффектов следовало бы ожидать, что случайные гипоморфные аллели данных генов, приводящие к долголетию, закрепились бы в популяции и вытеснили обычные варианты.

Более перспективным представляется второй подход, заключающийся в изучении продолжительности жизни у особей со сверхэкспрессией определенных генов. Например, было обнаружено, что сверхэкспрессия dFOXO в жировом теле Drosophila melanogaster продлевает жизнь [Giannakou М.Е. et al., 2004]. Сверхэкспрессия гена малого белка теплового шока Hsp22 в мотонейронах дрозофилы увеличивает продолжительность жизни одновременно с повышением двигательной активности и устойчивости к оксидативному и температурному стрессу [Morrow G. et al., 2004]. Значительное увеличение продолжительности жизни и устойчивости к оксидативному стрессу у дрозофилы также наблюдали при сверхэкспрессии гена метионин сульфоксид редуктазы msrA [Ruan Н. et al., 2002]. С другой стороны, сверхэкспрессия других генов может снижать продолжительность жизни и стрессоустойчивость. Например, к подобному эффекту приводит гиперактивация транскрипционного фактора р53 у мышей [Bauer J.H. et al., 2005]. Однако до настоящего момента не было изучено, каким образом сверхэкспрессия генов, вовлеченных в репарацию ДНК, влияет на продолжительность жизни. В данной работе впервые исследовано влияние на продолжительность и возрастзависимые физиологические показатели сверхэкспрессии гена D-GADD45, участвующего в ответе на повреждение ДНК.

Белки семейства GADD45 играют первостепенную роль в ответе на экзогенный и эндогенный стрессы. Они контролируют G1/S и G2/M проверочные точки клеточного цикла [el-Deiry W.S. et al., 1993; Xiong Y. et al., 1993; Zhang H. et al., 1993; Wang X.V. et al., 1999; Zhan Q. et al., 1999; Liebermann D.A., Hoffman В., 2003], опосредуют эксцизионную репарацию оснований и нуклеотидов, а также репарацию мисматчей [Hall P.A. et al., 1995; Vairapandi M. et al., 2000; Hartman A.R., Ford J.M., 2002; Chang H.C. et al., 2003; Le May N. et al., 2010; Ma D.K. et al., 2010; Schäfer A. et al., 2010], регулируют апоптоз [Kojima S. et al., 1999; Yoo J. et al., 2003; Papa S. et al., 2004; Gupta M. et al., 2006; Liebermann D.A., Hoffman В., 2008; Papa S. et al., 2008; Du F. et al., 2008; Yang Z. et al., 2009]. Кроме того, известна роль белка GADD45a в стимулировании эпигенетической активации генов путем деметилирования ДНК [Ma D.K. et al., 2010] (рис. 7). Эти процессы определяют стрессоустойчивость и влияют на скорость старения живых организмов. С возрастом происходит снижение способности старых клеток индуцировать Gadd45 в ответ на генотоксический стресс [Edwards M.S. et al., 2004]. Результаты нашей работы показали, что у старых дрозофил спонтанная активность гена D-GADD45 незначительна. Поэтому мы предположили, что

сверхэкспрессия 0-САБй45 приведет к повышению эффективности работы механизмов стресс-ответа и вызовет увеличение продолжительности жизни.

Повреждение ДНК

р53

FOXO

[GADD45a,p,Y

Рис. 7. Белки семейства GADD45 в стресс-ответе.

В нашей работе ген d-gadd45 был сверхэкспрессирован в нервной ткани, поскольку функционирование данной системы играет ключевую роль в регуляции функций организма [Хавинсон В.Х. и др., 2001]. Известно, что сигналы, поступающие из нервной системы к другим тканям и изменение экспрессии генов стресс-ответа в нервной ткани способно влиять на продолжительность жизни [Morley J.F., Morimoto R.I., 2004; Kappeler L. et al., 2008; Holzenberger M., 2009]. Большинство клеток нервной системы являются постмитотическими, поэтому восстановление нервной ткани после повреждений происходит медленнее, чем в других тканях. Кроме того, нервная система обладает высокой метаболической активностью, поэтому с возрастом в нервных клетках накапливается большое количество повреждений [Cortopassi G.A. et al., 1992; Hamilton M.L. et al., 2001].

Старение мозга приводит к развитию нейрологических заболеваний, которые ускоряют и усугубляют процесс старения [Lee С.К. et al., 2000]. Таким образом, функционирование нервной системы влияет на процессы старения и продолжительность жизни.

Полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют о том, что конститутивная сверхэкспрессия гена D-GADD45 в нервной системе приводит к продлению жизни Drosophila melanogaster как по сравнению с особями родительских линий (до 77 %), так и по сравнению с аутбредным долгоживущим генотипом (до 17 %), полученным в результате скрещивания линии дикого типа Canton-S с драйверной линией GAL4-1407. При этом наблюдали достоверное увеличение не только медианной, но и максимальной

продолжительности жизни, что свидетельствует об увеличении порога потенциально возможной длительности жизни и замедлении старения. Тем не менее, эффект продления жизни проявляется в большей степени по сравнению с особями родительских линий, чем с аутбредными особями, полученными в результате скрещивания линии дикого типа Canton-S с драйверной линией. Это свидетельствует о частичном вкладе гетерозиса в увеличение продолжительности жизни дрозофил с конститутивной сверхэкспрессией D-GADD45 (особи со сверхэкспрессией D-GADD45 были получены в результате скрещивания линии UAS-D-GADD45 с линией GAL4-1407). На изменение продолжительности неконтролируемое влияние мог также оказывать генетический фон. Поэтому была изучена продолжительность жизни у потомков скрещивания самок линии UAS-D-GADD45 и'самцов линии ELAV с мифепристон-индуцибельным драйвером GAL4 в нервной системе. Использование кондиционного драйвера позволило контролировать не только ткань, но и стадию индукции экспрессии трансгена, а также исключить влияние на продолжительность жизни неодинакового генетического фона Кроме того, известно, что мифепристон не оказывает существенного влияния на продолжительность жизни Drosophila melanogaster [Ford D. et al., 2007]. Обнаружено, что продолжительность жизни особей с кондиционной сверхэкспрессией D-GADD45 в нервной системе была выше по сравнению с особями с таким же генотипом, содержащимися на среде без мифепристона (до 42 %). Таким образом, эффект продления жизни обусловлен сверхэкспрессией гена D-GADD45 вне зависимости от гетерозиса и генетического фона. При этом для увеличения продолжительности жизни достаточно сверхактивировать D-GADD45 в нервной системе только на стадии имаго, а не в течение всей жизни животных.

Далее изучили влияние отсроченной мифепристон индуцибельной сверхэкспрессии гена D-GADD45 в нервной системе. Для этого в питательную среду дрозофил добавляли мифепристон начиная с 30 сут жизни. Этот возраст соответствует началу массового вымирания особей Drosophila melanogaster в экспериментальных условиях. Показано, что отсроченная кондиционная сверхактивация D-GADD45 в нервной системе также увеличивает продолжительность жизни Drosophila melanogaster, но в меньшей степени, чем при конститутивной сверхэкспрессии и кондиционной сверхэкспрессии, начиная с первого дня жизни имаго. Следовательно, эффект продления жизни зависит от возраста начала сверхактивации гена D-GADD45 - чем раньше она индуцируется, тем более существенного позитивного эффекта можно достичь.

Стоит отметить, что продление жизни при сверхэкспрессии D-GADD45 в большей степени проявляется у самцов, чем у самок. Экспрессия данного гена у самцов со сверхактивацией D-GADD45 также была выше в 3-10 раз по сравнению с особями без сверхэкспрессии, тогда как у самок - всего в 2-3 раза. Таким образом, чем больше была увеличена экспрессия гена D-GADD45, тем больший эффект продления жизни мы наблюдали.

Увеличение продолжительности жизни организмов при снижении экспрессии определенных генов сопровождается уменьшением плодовитости, нарушением метаболизма и задержкой развития, изменением нервно-мышечной активности [Friedman D.B., Johnson Т.Е., 1988; Guarente L., Kenyon С., 2000; Tatar M. et al., 2001; Giannakou M.E. et al., 2004; Kenyon C., 2005; Slack С. et al., 2010]. Наши данные о плодовитости и нервно-мышечной активности дрозофил со сверхэкспрессией гена D-GADD45 в нервной системе показывают, что увеличение их продолжительности жизни не сопровождается снижением изученных показателей, а в некоторых случаях сочетается с позитивными эффектами. Например, увеличивается фекундность самок и фертильность самцов по сравнению с особями родительских линий, повышается спонтанная нервно-мышечная активность по сравнению с особями без сверхэкспрессии.

Мы предположили, что эффект продления жизни при сверхэкспрессии гена D-GADD45 в нервной системе может быть обусловлен несколькими возможными процессами. Во-первых, сверхэкспрессия D-GADD45 могла привести к более эффективному обнаружению и устранению спонтанных повреждений ДНК, вызванных физиологическими процессами и факторами среды. Во-вторых, вследствие повышенной чувствительности к индукции апоптоза могла произойти селекция нейробластов, наиболее устойчивых к повреждению ДНК. Полученные нами данные показали, что в нейробластах личинок Drosophila melanogaster со сверхэкспрессией D-GADD45 снижается уровень повреждений ДНК в двух повторностях, что говорит в пользу первого предположения. В то же время частота апоптоза в нейробластах личинок со сверхэкспрессией D-GADD45 и без сверхэкспрессии достоверно не различается.

Увеличение продолжительности жизни, как правило, сопряжено с увеличением устойчивости живых организмов к различным видам стресса [Gilad G.M. et al., 1987; Sohal R.S. et al., 1990; Lithgow G.L. et al., 1995; Murakami S., Johnson Т.Е., 1996; Lin Y.J. et al., 1998; Kapahi P. et al., 1999; Guarente L., Kenyon C., 2000; Fabrizio P. et al., 2001; Landis G.N. et al., 2003; Morley J.F., Morimoto R.I., 2004; Morrow G. et al., 2004; Brown-Borg H.M., 2006; Masse I. et al., 2008; Ungvari Z. et al., 2008; Labinskyy N. et al., 2009; Perez V.l. et al., 2009; Amrit F.R. et al., 2010; Slack С. et al., 2010]. Поскольку гены семейства Gadd45 вовлечены в механизмы ответа на экзогенные и эндогенные факторы, мы предположили, что сверхэкспрессия D-GADD45 в нервной системе повысит устойчивость особей Drosophila melanogaster к различным видам стресса. Для этого мух подвергали интенсивному воздействию индуктора свободных радикалов параквата (оксидативному стрессу), гипертермии и голоданию.

Известно, что оксидативный стресс значительно ускоряет старение [Hardy К. et al., 2005]. Взаимодействие активных форм кислорода с нуклеиновыми кислотами приводит к образованию широкого спектра повреждений, включая модификации Сахаров, разрывы цепей и аддукты оснований [Souza-Pinto N.C. et al., 1999]. Ключевую функцию в ответе на оксидативный стресс выполняют механизмы эксцизионной репарации ДНК. Белки GADD45 могут повышать устойчивость к оксидативному стрессу через

активацию этих механизмов [Smith M.L. et ai., 1994; Chang H.C. et al., 2003; Vairapandi M., 2004; Le May N. et al., 2010; Ma D.K. et al., 2010] или через INK зависимый путь долгожительства, который индуцируется в ответ на повышение уровня прооксидантов [Alemán, M.J. et al., 2005; Zhu N. et al., 2009]. Сверхэкспрессия D-GADD45 повысила устойчивость к действию параквата по сравнению с особями родительских линий UAS-D-GADD45, GAL4-1407 и ELA V.

Основным последствием действия высоких температур является повреждение белков. Известно, что в ответе на высокие температуры играют роль митоген-активируемые протеинкиназы JNK и р38, которые фосфорилируют транскрипционный фактор HSF-1 и белки теплового шока [Rattan S.I.S. et al., 2004]. В свою очередь белки GADD45 регулируют активность митоген-активируемых протеинкиназ [Alemán M.J. et al., 2005; Peretz G. et al., 2007; Zhu N. et al., 2009]. Поэтому мы предположили, что сверхэкспрессия D-GADD45 через митоген-активируемые протеинкиназы может вызывать повышенную активность HSF-1 и белков теплового шока, способствуя стрессоустойчивости организма. Действительно, в большинстве вариантов эксперимента в условиях гипертермии при 35 °С наблюдали увеличение выживаемости у особей с конститутивной и кондиционной сверхэкспрессией гена D-GADD45 в нервной системе по сравнению особями без сверхактивации.

Чрезмерное снижение потребления пищи вызывает оксидативный стресс и нарушение работы механизмов репарации ДНК [Heininger К., 2002]. Возможно, сверхэкспрессия гена D-GADD45 способна снижать данное негативное влияние и приводить к повышению стрессоустойчивости. В нашем эксперименте показано увлечение устойчивости к голоданию у самцов со сверхэкспрессией D-GADD45 по сравнению с особями без сверхэкспрессии. В то же время у самок со сверхэкспрессией D-GADD45 в большинстве вариантов эксперимента наблюдали снижение устойчивости к голоданию.

Полученные данные свидетельствуют о том, что сверхэкспрессия гена D-GADD45 в нервной системе Drosophila melanogasíer значительно продлевает жизнь животных без снижения плодовитости и нервно-мышечной активности, что связано с более эффективным обнаружением и устранением спонтанных повреждений ДНК. Кроме того, в условиях интенсивного стресса (оксидативного стресса, гипертермии, голодания) у особей со сверхэкспрессией гена D-GADD45 в большинстве случаев происходит повышение выживаемости.

ВЫВОДЫ

1. Выявлено 10-кратное снижение спонтанной активности гена 0-СА0045 у старых дрозофил линии дикого типа СаЫоп-Б по сравнению с молодыми.

2. Показано достоверное увеличение медианной (на 3-102%) и максимальной (на 5-59 %) продолжительности жизни у самцов и самок БгозорЫ1а melanogaster с конститутивной, кондиционной и отсроченной кондиционной сверхэкспрессией гена В-САВ045 в нервной системе по сравнению с особями без сверхэкспрессии. Наибольший эффект продления жизни наблюдали при сверхэкспрессии гена Б-СА0045 на ранних стадиях развития.

3. Конститутивная и кондиционная сверхэкспрессия гена 0-СА0045 в нервной системе либо не приводила к достоверным различиям, либо увеличивала показатели плодовитости (фекундность самок и фертильность самцов) и нервно-мышечной активности (отрицательный геотаксис и спонтанную нервно-мышечную активность).

4. Обнаружено достоверное снижение (на 21-27 %) уровня повреждений ДНК в нейробластах личинок третьего возраста с конститутивной и кондиционной сверхэкспрессией гена в нервной системе по сравнению с особями без сверхэкспрессии. Следовательно, эффект продления жизни в связи со сверхэкспрессией гена 0-СА0Б45 может быть результатом повышения эффективности обнаружения и устранения спонтанных повреждений ДНК. Достоверных различий в частоте апоптоза выявлено не было.

5. В большинстве вариантов эксперимента особи с конститутивной и кондиционной сверхэкспрессией гена О-0АйО45 в нервной системе были более устойчивы к действию стресс-факторов (окислительному стрессу, гипертемии, голоданию) (в 1.6-166 раз), чем особи без сверхэкспрессии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, включенных в Перечень ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации

1. Москалев A.A. Влияние гамма-излучения в малых дозах на продолжительность жизни у мутантов дрозофилы по распознаванию и репарации повреждений ДНК / A.A. Москалев, E.H. Плюснина, В.Г. Зайнуллин // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2007. - Т. 47, № 5. - С. 586-588.

2. Москалев A.A. Рецессивная леталь в локусе 6D1-7A2 Х-хромосомы приводит в гетерозиготе к увеличению продолжительности жизни Drosophila melanogaster / A.A. Москалев, E.H. Плюснина // Успехи геронтологии. - 2007. -Т. 20, №4.-С. 36-39.

3. Плюснина E.H. Геропротективные эффекты активации в нервной системе Drosophila melanogaster гена репарации ДНК D-GADD45 / E.H. Плюснина, М.В. Шапошников, A.A. Москалев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011. - Т. 152, № 9. - С. 310-314.

4. Gadd45 proteins: Relevance to aging, longevity, and age-related pathologies /

A.A. Moskalev, Z. Smit-McBride, M.V. Shaposhnikov, E.N. Plyusnina, A. Zhavoronkov, A. Budovsky, R. Tacutu, V.E. Fraifeld // Aging Research Reviews. -2011.-In press.

5. Moskalev A.A. Radiation hormesis and radioadaptive response in Drosophila melanogaster flies with different genetic backgrounds: the role of cellular stressresistance mechanisms / A.A. Moskalev, E.N. Plyusnina, M.V. Shaposhnikov // Biogerontology. - 2011. -Vol. 12,№3.-P. 253-263.

6. Plyusnina E.N. Increase of Drosophila melanogaster lifespan due to D-GADD45 overexpression in the nervous system / E.N. Plyusnina, M.V. Shaposhnikov, A.A. Moskalev // Biogerontology. - 2011. - Vol. 12 , № 3. - P. 211226.

7. Shaposhnikov M. V. Effects of PARP-1 overexpression and pharmacological inhibition of NF-кВ on the lifespan of Drosophila melanogaster / M.V. Shaposhnikov, A.A. Moskalev, E.N. Plyusnina // Advances of Gerontology. - 2011. - Vol. 24, №3,- P. 405-419.

Материалы и тезисы докладов

8. Влияние сверхэкспрессии гена D-GADD45 на продолжительность жизни Drosophila melanogaster / E.H. Плюснина, Д.О. Чернышова, И.О. Велепжанинов,

B.Н. Мезенцева, A.A. Москалев // Генетика продолжительности жизни и старения: Тезисы докладов Международной конференции. - Сыктывкар, 2010. -С. 14-15.

9. Плюснина E.H. Адаптивный ответ у особей Drosophila melanogaster со сверхэкспрессией гена D-GADD45 при воздействии ионизирующей радиации / E.H. Плюснина, A.A. Москалев // Актуальные проблемы биологии и экологии: Материалы докладов XVI Всероссийской молодежной научной конференции. -Сыктывкар, 2009. - С. 166-169.

10. Плюснина E.H. Эффекты действия ионизирующей радиации у особей Drosophila melanogaster со сверхэкспрессией гена D-GADD45 / E.H. Плюснина

// Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды: Материалы Международной конференции. - Сыктывкар,

2009.-С. 94-97.

11. Чернышова Д.О. Возраст зависимое изменение экспрессии генов стресс-ответа у особей Drosophila melanogaster в условиях хронического гамма-облучения / Д.О. Чернышова, E.H. Плюснина, A.A. Москалев // Физиология человека и животных: от эксперимента к практике: X Молодежная научная конференция Института физиологии Коми НЦ УрО РАН. - Сыктывкар, 2011.— С. 240-243.

12. Чернышова Д.О. Возраст-зависимое изменение физиологических показателей (плодовитости, нервно-мышечной активности) у особей Drosophila melanogaster со сверхэкспрессией гена D-GADD45 / Д.О. Чернышова, E.H. Плюснина, A.A. Москалев // Физиология человека и животных: от эксперимента к практике: IX Молодежная научная конференция Института физиологии Коми НЦ УрО РАН. - Сыктывкар, 2010. - С. 194-197.

13. Moskalev A.A. The influence of low dose gamma-irradiation on life span of Drosophila mutants with GADD45 overexpression / A.A. Moskalev, E.N. Plyusnina II Abstract Book of the 37th Annual Meeting of the European Radiation Research Society. - Prague, Czech Republic, 2009. - P. 110.

14. Moskalev A. Radiation hormesis and radioadaptive response in Drosophila melanogaster flies with different genetic backgrounds: the role of cellular stressresistance mechanisms / A. Moskalev, E. Plyusnina, M. Shaposhnikov // Program guide and Book of abstract of 14th International Congress of Radiation Research Incorporating 57th Annual meeting of the Radiation research Society. - Warszawa, Poland, 2011.-P. 74.

15. Plusnina E.N. Role of genes in DNA damage recognition and repair in Drosophila melanogaster life span regulation in response to low dose irradiation / E.N. Plusnina // Crimean Meeting: Third International Conference, dedicated to N.W. Timofeeff-Ressovsky "Modern Problems of Genetics, Radiobiology, Radioecology and Evolution"; Third Readings after V.l. Korogodin & V.A. Shevchenko; NATO Advanced Research Workshop «Radiobiological Issues Pertaining to Environmental Security and Ecoterrorism»: Abstr., Papers by Young Scientists. - Dubna: JINR,

2010.-P. 197-199.

16. Role of DNA repair and DNA damage response genes in Drosophila melanogaster low dose irradiation effects on lifespan / A.A. Moskalev, E.N. Plyusnina, M.V. Shaposhnikov, E.V. Romanova II The proceedings of the 26th ISTC-Korea workshop on Advanced Nuclear Materials, Materials Evaluation and Radiation Biology. - Daejeon, South Korea, 2011.-P. 136-139.

17. The effects of DNA damage response and repair genes overexpression on Drosophila melanogaster lifespan / A. Moskalev, M. Shaposhnikov, E. Plyusnina, A. Danilov // Rejuvenation Research. - 2011. - Vol. 14, № SI. - P. S-33.

ПЛЮСНИНА Екатерина Николаевна ВЛИЯНИЕ СВЕРХЭКСПРЕССИИ ГЕНА D-GADD45 В НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ DROSOPHILA MELANOGASTER НА ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ, ВОЗРАСТ-ЗАВИСИМЫЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ И СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТЬ // Автореф. дис. канд. биол. наук 14.01.30 - СПб., 2011. 26 с. Подписано в печать «20» октября 2011. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ ¿£. Отпечатано с готового оригинал-макета ЗАО "Принт-Экспресс" 197376, С.-Петербург, ул. Большая Монетная, 5, лит. А

Актуальность исследования

Старение представляет собой закономерный разрушительный процесс, при котором происходит снижение адаптационных возможностей организма и увеличение вероятности его смерти [БЭС, 1995]. Скорость старения определяется способностью организма эффективно отвечать на воздействие внешнесредовых и физиологических факторов, которая обусловлена механизмами- обеспечения стрессоустойчивости. Долгоживущие особи разных видов имеют повышенную устойчивость к действию стресс-факторов [Sohal R.S. et al., 1990; Landis G.N. et al., 2003; Hyun M. et al., 2008; Amrit F.R. et al., 2010]. В то же время короткоживущие мутанты различных модельных организмов, напротив, гиперчувствительны к стрессовым воздействиям [Москалев А.А. и др., 2007; Morrow G. et al., 2004; Vermeulen С J>. et al., 2005; Moskalev A. et al., 2009; Zhao B. et al., 2009].

Важнейшим механизмом, определяющим стрессоустойчивость клетки и организма в целом, является распознавание повреждений' и репарация» ДНК. Известно, что мутации генов репарации ДНК значительно снижают продолжительность жизни и стрессоустойчивость у животных [Москалев А.А. и др., 2007; de Boer J. et al., 2002; Zhao B. et al., 2009]. У человека наследственные синдромы, ассоциированные с преждевременным старением, (синдром Вернера, синдром Ротмунда-Томпсона, синдром Блума, синдром Хатчинсона-Джилфорда, пигментная ксеродерма, трихотиодистрофия, атаксия-телеангиэктазия, синдром Коккейна, анемия Фанкони) обусловлены мутациями в генах, кодирующих ферменты репарации ДНК [Mallery D.L. et al., 1998; Lehmann A.R., 2003; Opresko P.L. et al., 2003; von Kobbe C. et al., 2004; Cleaver J.E., 2005; Navarro C.L. et al., 2006; Scaffidi P., Misteli Т., 2006]. Также показано, что с возрастом происходит снижение эффективности работы систем распознавания повреждений и репарации ДНК. С одной стороны, это связано со снижением экспрессии генов ключевых ферментов, ответственных за устранение повреждений ДНК [Soerensen М. et al., 2009; Zhang L. et al., 2010]. С другой стороны, при старении сами репарационные системы могут подвергаться ошибкам, приводя к увеличению вероятности возникновения мутаций

Анисимов В.Н., 2008]. Накапливающиеся с возрастом нарушения генетического материала могут затрагивать локусы генов, которые отвечают за функционирование систем клеточной защиты от стресса и обеспечение метаболизма, контроль клеточного цикла и клеточную гибель. В конечном итоге происходит возникновение связанных с возрастом патологий и старение организма [Анисимов В.Н., 2008; Zhang L. et al., 2010]. Однако прямым подтверждением геропротекторных свойств белков репарации ДНК может служить лишь увеличение продолжительности жизни организма-при сверхэкспрессии их генов. Тем не менее, подобного рода данные из литературных источников неизвестны.

Белки консервативного в эволюции семейства GADD45 (Growth Arrest and'DNA Damage-inducible) играют ключевую роль в ответе Hat повреждение ДНК и в репарации ДНК, в ряду от насекомых до человека [Liebermann D.A., Hoffman В., 2008]. У дрозофилы описан ортолог GADD45 - ген CGI1086; или D-GADD45 [Peretz G. et al., 2007]. Мы предположили, что1 сверхэкспрессия'гена D-GADD45 у особей Drosophila, melanogaster приведет к более эффективному устранению спонтанно возникающих повреждений ДНК и вызовет увеличение продолжительности жизни. Для проверки этой, гипотезы ген D-GADD45 сверхакгивировали в нервной* системе дрозофилы, поскольку нейрогуморальная регуляция гомеостаза детерминирует продолжительность жизни и процессы старения клеток и организма.

Цель исследованиям

Цель исследования заюночалась в изучении влияния сверхэкспрессии гена D-GADD45 в'нервной системе Drosophila melanogaster на продолжительность жизни, возрастзависимые физиологические показатели и стрессоустойчивость.

Задачи исследования

1. Изучить возрастзависимую динамику экспрессии гена D-GADD45 в нервной ткани.

2. Выявить действие сверхэкспрессии гена D-GADD45 в нервной системе на продолжительность жизни.

3. Оценить влияние сверхэкспрессии гена D-GADD45 в нервной системе на возрастзависимые физиологические показатели - плодовитость (фекундность самок и фертильность самцов) и нервно-мышечную активность (отрицательный геотаксис и спонтанную нервно-мышечную активность).

4. Оценить влияние сверхэкспрессии гена В-ОАВВ45 на уровень повреждений ДНК и частоту апоптоза в нервной ткани.

5. Исследовать изменение устойчивости к действию стресс-факторов (окислительному стрессу, , гипертермии, голоданию) в результате сверхэкспрессии гена В-САВВ45 в нервной системе.

Теоретическая значимость и научная новизна работы ;

Показано, что сверхэкспрессия гена В-ОАВВ4 ЗвнсрвнойсистемеВг ояорИНа те1апо%а81ег увеличивает продолжительность жизни без сниженияшлодовитости и N нервно-мышечнойгактивности. Это связано с более эффективным обнаружением и устранением повреждений; ДНК, так как уровень, повреждений; ДНК в нервной ткани у личинок третьего возраста со сверхэкспрессией гена В-САВВ45 достоверно снижен по сравнению с: особями без сверхэкспрессии. Кроме того, в большинстве-вариантов эксперименташаблюдали повышение стрессоустойчивости; у особей со. сверхэкспрессией гена В-САВВ45 в нервной системе. У старых дрозофил дикого типа выявлено существенное снижение спонтанной; активности гена- В-ОАВВ45: Таким образом;, впервые показаны вклад в регуляцию продолжительности. жизни и геропротекторная роль сверхактивации эволюционно консервативного' гена В-ОАВВ45, вовлеченного в ответ на повреждение; и репарацию ДНК. .

Практическая значимость работы

У млекопитающих и человека, присутствует группа ортологов гена В-ОАВВ45. Нарушение:их регуляции играет роль в патогенезе некоторых видов рака; атеросклерозе, нейродегенеративных. заболеваниях.- Выявленная нами геропротекторная роль активации гена: ОАОВ45" открывает перспективы разработки фармакологических препаратов,. направленных на профилактику и лечение возрастзависимых патологий у человека. Обнаруженный нами: факт, возрастзависимой динамики активности гена С А ИВ 4 5 позволяет использовать экспрессию данного гена в качестве биомаркера скорости старения при оценке биологического возраста организма и эффективности геропротекторной терапии.

Положения, выносимые на защиту

1. Сверхэкспрессия гена D-GADD45". в; нервной системе Drosophila melanogaster увеличивает продолжительность жизни без ухудшения возрастзависимых физиологических показателей - плодовитости и нервно-мышечной активности.

2. Наблюдаемые геропротекторные эффекты связаны с повышенною эффективностью обнаружения* и. устранения повреждений; ДНК в результате сверхактивации гена D-GADD45 в нервной системе.

3. Сверхэкспрессия гена D-GADD45 в нервной системе влияет на устойчивость к различным видам стресса.

Публикации

По материалам; диссертационной работы опубликовано; 17 работ; в том числе 7 статей в журналах, включенных, в Перечень ВЛК Министерства образования и науки РФ, 10 материалов и тезисов докладов.

Апробация?

Результаты работы докладывались, на; научньш конференциях молодых ученых Института биологии, и Института физиологии Коми/ НЦ1 УрО РАН? (Сыктывкар; 2009-2011), на международной5 конференции «Биологические эффекгы малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды» (Сыктывкар; 2009); 3.7th'' Annual Meeting;- of the. European* Radiation Research Society (Прага; Чехия;. 2009), 1-ой международной научной; конференции «Генетика продолжительности жизни и старения» (Сыктывкар^ 2010), международной конференция; «Современные проблемы генетики, радиобиологии; радиоэкологии и эволюции» (Алушта; 2010), 14th International! Congress: of Radiation Research (Варшава; Польша, 2011), 5th Strategies for. Engineered Negligible Senescence Conference: (Кембридж, Великобритания, 2011), 26 ISTC-Korea workshop on Advanced Nuclear Materials, Materials Evaluation and Radiation« Biology (Теджон, Южная Корея, 2011).

Связь с планом НИР

Исследования^проводились в течение 2008-2011 гг. в рамках бюджетных.тем отдела радиоэкологии Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Проведенные исследования были поддержаны грантом РФФИ на 2008-2010 гг., грантом Президиума РАН по целевым программам «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные науки - медицине» на 2009-2011 гг., Молодежным научным грантом УрО РАН на 2009 г. и 2010 г.

выводы

1. Выявлено 10-кратное снижение спонтанной активности гена у старых дрозофил линии дикого типа СаШоп-Я по сравнению с молодыми.

2. Показано достоверное увеличение медианной (на 3-102%) и максимальной (на 5-59 %) продолжительности жизни у самцов и самок Drosoph.Ua melanogaster с конститутивной, кондиционной и отсроченной кондиционной сверхэкспрессией гена в нервной системе по сравнению с особями без сверхэкспрессии. Наибольший эффект продления жизни наблюдали при сверхэкспрессии гена D-СА0045 на ранних стадиях развития.

3. Конститутивная и кондиционная сверхэкспрессия гена D-GADD45 в нервной системе либо не приводила к достоверным различиям, либо увеличивала показатели плодовитости (фекундность самок и фертильность самцов) и нервно-мышечной активности (отрицательный геотаксис и спонтанную нервно-мышечную активность).

4. Обнаружено достоверное снижение (на 21-27 %) уровня повреждений ДНК в нейробластах личинок третьего возраста' с конститутивной и кондиционной сверхэкспрессией гена D-GADD45 в нервной системе по сравнению с особями без сверхэкспрессии. Следовательно, эффект продления жизни в связи со сверхэкспрессией гена D-GADD45 может быть результатом повышения эффективности обнаружения и устранения спонтанных повреждений ДНК. Достоверных различий в частоте апоптоза выявлено не было.

5. В большинстве вариантов эксперимента особи с конститутивной и кондиционной сверхэкспрессией гена в нервной системе были более устойчивы к действию стресс-факторов (окислительному стрессу, гипертемии, голоданию) (в 1.6-166 раз), чем особи без сверхэкспрессии.