Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние супериндуктора цитохрома Р4501А1,2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина на пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов

На правах рукописи

Сибиряк Дарья Сергеевна

ВЛИЯНИЕ СУПЕРИНДУКТОРА ЦИТОХРОМА Р4501А1 2,3,7,8 -ТЕТРАХЛОРДИБЕНЗО-р-ДИОКСИНА НА ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ И АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2005

Работа выполнена в институте иммунологии и физиологии УрО РАН

Научный руководитель:

Академик РАН, доктор медицинских наук,

профессор Черешнев Валерий Александрович

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Теплова Светлана Николаевна

Доктор медицинских наук Родионов Сергей Юрьевич

Ведущая организация: ГНЦ Институт иммунологии МЗ и СР РФ.

Защита состоится « Ж» ¿¿/ОМ2005года в /О часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия МЗ и СР РФ", по адресу: 450092, г. Челябинск, ул. Воровского, д. 64

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия МЗ и СР РФ", по адресу: 450092, г. Челябинск, ул. Воровского, д. 64

Автореферат разослан «___»

Ученый секретарь диссертационного совета,

Докчор медицинских наук,

Профессор

2005 г.

Телешева Л.Ф.

ÇLOQg-^ 5Ъ5О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Загрязнение окружающей среды ксенобиотиками является глобальной экологической проблемой, которая стоит в центре внимания исследователей во всех странах мира. Среди техногенных поллютантов наиболее серьезную опасность представляют полихлорированные дибензодиоксины и дибензофураны, объединяемые под названием диоксиноподобные суперэкотоксиканты [Федоров, 1993]. Основным и наиболее токсичным представителем этого класса веществ является 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксин (ТХДЦ), причем опасность этого соединения зависит не только от его острой токсичности, но и от крайне высокой способности к биоконцентрированию в живых системах, чрезвычайно длительному выведению из организма [Birnbaum et al., 2003]. Источниками ТХД Ц являются предприятия по переработке отходов, производство хлорорганических гербицидов и другая индустрия, где происходит хлорирование химических соединений, а поступление его в организм осуществляется по так называемым "пищевым путям" [Амирова, Круппов, 1998; Roeder et al., 1998]. Токсическое действие ТХДЦ на организм млекопитающих включает гепатотоксичность, генотоксичность и канцерогенность, иммунотоксичность, нарушения метаболизма стероидных гормонов, репродуктивной функции и пр. [DeVito, Birnbaum, 1995; Nilsson, Hakansson, 2002; Cole et al., 2003; Dioxines and Health, 2003; Birnbaum, 2000; Birnbaum et al., 2003; Matsumura, 2003]. Иммунная система традиционно считается основной мишенью токсического действия ТХДД. Результаты многочисленных экспериментальных исследований и ряда клинических наблюдений убедительно аргументируют способность ТХДД вмешиваться в процессы созревания и дифференцировки иммунокомпетентных клеток, реализацию их эффекторных функций, и, как следствие, нарушать антиинфекционную, противоопухолевую резистентность, индуцировать развитие аутоиммунных заболеваний [Pokrovsky et al., 1991; Vinies, 1996; Holladay, 1999; Amirova et al., 1999; Warren et al., 2000; Kerkvliet, 2002; Mimura, Fujii-Kuriyama, 2003].

Считается, что практически все проявления токсического эффекта ТХДД обусловлены его способностью высокоселективно связываться с "химическим сенсором" - арилуглеводородным рецептором (Ah-рецептором), лиганд-активируемым транскрипционным фактором, который относится к суперсемейству ядерных рецепторов и вызывать мощную индукцию изоформ цитохрома Р450 CYP1A1 и CYP1B1 [Okey et al., 1994; Nebert et al., 2004]. В свою очередь, Ah-рецептор-зависимые сигнальные системы тесно сопряжены с регуляцией клеточного цикла, синтезом цитокинов и факторов роста, а индуцируемые ТХДД изоформы цитохрома P450CYP1 Al hCYPIBI участвуют в биотрансформации множества би голекул, включая

стероидные гормоны, ретиноиды, эй як и соавт., 2003;

Hines et al., 2001; Nebert et al., 2001, 2004].

Несмотря на то, что внутриклеточная "мишень" воздействия ТХДД твердо установлена, механизмы развития иммунотоксичности и последствия воздействия высоких доз этого экотоксиканта на иммунную систему человека окончательно не ясны, и в работах, посвященных этой проблеме, представлены весьма противоречивые результаты [Игнатьева, 1997; Курчатова, 1999; Lu, Wu, 1985; Roumak et a!., 1992,1995; Neubert et al., 1991 - 2000; Lang et al, 1996; Sibiryak et al., 1998; Belles-Isles et al, 2000]. Существенно, что при изучении влияния ТХДД на лимфоидные клетки в системах in vitro, как правило, используются лимфобластоидные линии клеток, которые отличаются по реактивности и чувствительности к ксенобиотику от лимфоцитов доноров.

Программированная клеточная смерть путем апоптоза рассматривается, в настоящее время, как основной механизм поддержания иммунного гомеостаза, играющих ключевую роль в регуляции численности иммунокомпетентных клеток, их созревания и дифференцировки Т и В клеток, обеспечения адекватной силы и продолжительности иммунного ответа, сохранения аутотолерантности [Ярилин, 1999; Барышников, Шишкин, 2002; Krammer, 2000]. Нарушения апоптоза приводят к развитию иммунопатологии (апоптотического иммунодефицита) [Чередеев, Ковальчук, 1997; Ковальчук, Чередеев, 1999; Cheredeev, Kovalchuk, 1997]. Нарушения механизмов программированной клеточной смерти иммунокомпетентных клеток нередко лежат в основе иммунотоксичности ксенобиотиков [Имельбаева и соавт, 2000; Сибиряк, 2003; Сибиряк и соавт.; 2003]. На сегодняшний день результаты исследований, посвященных влиянию ТХДД на апоптоз лимфоидных и нелимфоидных клеток неоднозначны и нередко диаметрально противоположны - есть сведения об "апоптогенном" действии ТХДД fKamath et al, 1997; Hossain et al, 1998], о его способности ингибировать программированную клеточную смерть, или отсутствии влияния на этот процесс [Silverstone et al., 2000]. Выяснение характера влияния этого соединения на пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов представляется весьма важным не только для понимания механизмов иммунотоксичности экотоксикантов-индукторов цитохрома Р450, но и роли Ah-рецептор-зависимых сигнальных систем в регуляции реактивности иммунокомпетентных клеток.

Цель исследования:

Оценить влияние 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина на пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов периферической крови человека в системе in vitro во взаимосвязи с его специфическим эффектом, и на процессы позитивной и негативной активации клеток в лимфоидных органах экспериментальных животных

Задачи исследования:

- Изучить влияние 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина на

монооксигеназную активность цитохрома Р4501А1, пролиферативную активность, апоптоз лимфоцитов периферической крови человека при их стимуляции неспецифическими митогенами.

- Изучить влияние 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина на монооксигеназную активность цитохрома Р4501А1, пролиферативную активность и апоптоз Т лимфоцитов периферической крови человека при их физиологической стимуляции через Т- клеточный рецептор

- Изучить влияние 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина на активационно-индуцированную экспрессию Раз-рецептора и экспрессию белков-регуляторов апоптоза

- Изучить влияние 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина на чувствительность Т лимфоцитов периферической крови человека к рецепторно-индуцированному и нерецепторному апоптозу

- Изучить влияние 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина на пролиферативную активность и апоптоз в лимфоидных органах у крыс

Научная новизна:

Установлено, что ТХДД вызывает индукцию СУР1А1-зависимой монооксигеназной активности, ингибирует пролиферативную активность и активационный апоптоз лимфоцитов периферической крови человека, стимулированных смесью митогенов, увеличивает активационно-индуцированную экспрессию Раз-рецептора, причем характер влияния ТХДД на митогенез и апоптоз не зависит от уровня контаминации донора ксенотоксикантом.

Впервые установлено, что ТХДД вызывает индукцию СУР1А1 -зависимой монооксигеназной активности, усиливает экспрессию белка СУР1А1, ингибирует пролиферативную активность и активационный апоптоз Т лимфоцитов периферической крови человека стимулированных антиСОЗ МКА, не изменяет активационно-индуцированную экспрессию СЭ25 и С095 на С04+ и СЭ8+ лимфоцитах, вызывает гипоэкспресию Ьс1-2 в активированных лимфоцитах. Влияние ТХДД на митогенез лимфоцитов связано не только с индукцией СУР1А1, но и с прямым влиянием на ферментативную активность эффекторных каспаз.

Впервые обнаружено, что ТХДД повышает чувствительность активированных через Т-клеточный рецептор лимфоцитов периферической крови человека к рецепторному (Рая-индуцировашгому) апоптозу, но снижает их чувствительность к апоптозу, индуцированному нерецепторным сигналом (камптотецином).

Установлено, что ТХДД, при введении в дозе, обеспечивающей основной токсикологический эффект (индукцию СУР1А1), воздействует на органы иммунной системы, характеризующиеся высоким "митотическим" потенциалом (тимус, костный мозг), где проявляет отчетливое антипролиферативное, а в

тимусе и апоптогенное действие. В селезенке, лимфатических узлах и периферической крови антипролиферативный эффект отсутствует, однако он проявляется при индукции митогенеза клеток, что сопровождается и параллельным снижением интенсивности активационного апоптоза.

Научно-практическая значимость работы:

Полученные данные способствуют расширению знаний о механизмах иммунотоксического действия ксенобиотиков-индукторов цитохрома Р4501А1, а также механизмах участия Ah-рецептор-зависимых сигнальных систем в регуляции пролиферативной активности и апоптоза иммунокомпетентных клеток.

Внедрение результатов исследования:

Материалы диссертационной работы внедрены в учебный процесс при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре иммунологии ЧелГМА. Предлагаемые автором методические подходы к оценке пролиферативной активности и апоптоза используются в научной работе отдела иммунологии ГУЗ "Всероссийский центр глазной и пластической хирургии" МЗ и CP РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксин нарушает нормальную реактивность лимфоцитов периферической крови человека при их стимуляции лектинами и через Т клеточный рецептор, что выражается в антипролиферативном эффекте, угнетении индуцированного активацией апоптоза и сопровождается относительной гиперэкспрессией Fas рецептора, гипоэкспресией bcl-2, гиперэкспрессией р53. Эти нарушения связаны как с внутриклеточной индукцией цитохрома Р450 CYP1A1, так и с непосредственным влиянием на ферментативную активность эффекторных каспаз.

2. 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксин повышает чувствительность активированных Т лимфоцитов периферической крови человека к рецепторно-индуцированному (Fas-индуцированному) апоптозу, но снижает чувствительность к апоптозу, индуцированному нерецепторным сигналом (подавлением активности топоизомеразы I). Повышение чувствительности активированных клеток к рецепторному апоптозу может лежать в основе вызываемого ТХДД иммунодефицита.

3. 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксин, при введении крысам в дозе, обеспечивающей индукцию CYP1A1 печени, проявляет антипролиферативное и апоптогенное действие на тимус, антипролиферативное воздействие на костный мозг, а во вторичных лимфоидных органах антипролиферативный эффект проявляется лишь при индукции митогенеза клеток.

Апробация работы:

Результаты диссертационной работы доложены на Международном Конгрессе "DIOXIN'2000" (Монтеррей, США, 2000), XI-м Международном Конгрессе иммунологов (Стокгольм, Швеция, 2001), 1-м Съезде иммунологов

Урала (Екатеринбург, 1999 г.), V Всероссийском Форуме "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге (С.-Пб. 2002 г.), 3-м съезде иммунологов Урала (Челябинск, 2003 г.), Объединенном иммунологическом Форуме (Екатеринбург, 2004), 19-м Европейском рабочем Совещании по метаболизму лекарств (DMW-2004, Анталья, Турция, 2004).

Публикации:

По материалам диссертационной работы опубликовано 12 научных работ.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 138 страницах, иллюстрирована 10 таблицами и 27 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, раздела, отражающего результаты собственных исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Список литературы включает 222 источника (17 отечественных и 205 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Объектом исследования in vitro явились лимфоциты периферической крови условно-здоровых доноров (51 человек в возрасте от 20 до 40 лет, из них 31 женщина и 20 мужчин). Все обследуемые были поставлены в известность о проводимом исследовании и дали свое согласие на участие в нем. Исследования in vivo выполнено на 50 половозрелых крысах-самцах WAG/Rij массой 120 -150 г. При работе с крысами соблюдались Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных.

Мононуклеары периферической крови выделяли методом градиентного центрифугирования [Boyum, 1968]. Суспензии клеток лимфоидных органов крыс получали стандартным способом - кусочки органа (тимус, селезенка), цельный лимфоузел или костный мозг, полученный путем "вымывания" из бедренной кости, помещали в фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБР, рН 7.2), осторожно измельчали в стеклянном гомогенизаторе, фильтровали через капроновый фильтр, отмывали и ресуспендировали в ФСБР, содержащем 20% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma). Концентрация клеток составляла 2 - 5 х 106 кл/мл. Все процедуры приготовления клеточных взвесей производили при 4°С.В качестве питательной среды для культивирования мононуклеаров периферической крови использовали среду RPM1-1640 (Sigma), содержащую 5% инакгивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma) и 50 мкг/мл гентамицина сульфата (Sigma). Суспензию клеток от каждого донора разделяли на 4 части, которые помещали в пластиковые флаконы для культивирования клеток объемом 25 см3 (Costar). Для стимуляции митогенеза первоначально использовали смесь митогенов - 10 мкг/мл РНА-Р (Difco) и 5 мкг/мл PWM (Sigma), а также антиСОЗ МКА (2.5 мкг/мл), клон ICO-90 (Институт

экспериментальной онкологии и терапии опухолей ВОНЦ РАМН). 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксин (ТХДД, Cambridge Labs.), разводили DMSO (Sigma) и добавляли в опытные, нестимулированные и стимулированные культуры, так, чтобы конечная концентрация составила 10 пМ (стандартно используемая при работе in vitro доза соединения, обеспечивающая индукцию CYP1A1, но не оказывающая токсического действия на клетки). Конечная концентрация DMSO составляла не более 0.4%. В контрольные, нестимулированные и стимулированные культуры, добавляли DMSO в конечной концентрации 0.4%. Культивирование клеток осуществляли в С02-инкубаторе (Juan) в течение 72-х часов (37°С, 5% С02). Жизнеспособность клеток в культурах оценивали стандартным методом суправитального окрашивания 0.2% раствором трипанового синего.

Оценку пролиферативной активности лимфоцитов осуществляли морфологически [Самойлина, 1970] или стандартным радиометрическим методом [Найт, 1990].

Оценку структуры клеточного цикла осуществляли методом метахроматического окрашивания акридиновым оранжевым [Darzynkiewicz, 1994]. Относительное содержание ДНК (FL1) и РНК (FL3) оценивали на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (BD) в рамках программного обеспечения CellQuest. При установке калибровочных параметров использовались неокрашенные клетки, обработанные последовательно гипотоническим и фосфатно-цитратным буфером. При установке параметров усиления в процессе цитофлюорометрии окрашенных клеток и анализе регионов, соответствующих той или иной фазе клеточного цикла ориентировались на рекомендации авторов метода [Darzynkiewicz, 1994; Darzynkiewicz et al., 1997].

Для оценки апоптоза лимфоцитов применялись разные методические подходы, что позволило идентифицировать ранние и терминальные этапы этого процесса. Для выявления лимфоцитов с морфологическими признаками фрагментации ядра (терминальная'фаза апоптоза) использовали окрашивание Hoechst 33342 (конечная концентрация красителя 1 шМ, 10 мин) [Sibiryak et al., 1999]. Подсчет апоптотирующих клеток на флуоресцентном микроскопе МБИ-15А (длина волны возбуждения флюоресценции 360 нм, эмиссии - 470 нм). Апоптотирующими считали клетки с фрагментированными ядрами (3 и более фрагмента). Подсчитывали не менее 200 клеток в различных полях зрения. Идентификацию клеток с разрывами ДНК (DNA strand brakes) осуществляли иммуногистохимически TUNF.L-методом (Terminal deoxynucleotidyl Transferase Nick-End Labeling), используя стандартную тест систему TACS1MTdT in situ-Fluorescein Kit (R&D Systems, Cat# TA4627).

Активность каспаз (Css) в лизатах лимфоцитов (5 х 106 клеток) оценивали фпюорометрическим методом [Nicholson, et al, 1995], первоначально используя стандартную тест-систему FluorAce™ Apopain Assay Kit (BioRad), а затем

реактивы готовили самостоятельно и использовали коммерческие субстраты. В качестве флюорогенного субстрата для оценки суммарной активности эффекторных каспаз (Css 3, -7, -10) использовали Ac-DEVD-AFC (Asp-Glu-Val-Asp) (BioRad), в качестве субстрата Cs 8 - Ac-LETD-AFC (Ile-Glu-Thr-Asp) (BioRad), в качестве субстрата Cs 9 -Ac-LEHD-AFC (He-Glu-THr-Asp) (BioRad), Лизирующй буфер: 10 mM HEPES, pH 7.4, 2 шМ EDTA, 0.1% CHAPS, 5 шМ DTT, 1 шМ PMSF, 10 mg/мл пепстатина A, 10 mg/мл апротинина, 10 mg/мл леупептина; реакционная система -10 mM HEPES-буфера, pH 7.4,2 mM EDTA, 0.1 % CHAPS, 5 mM DTT, 20 мкл лизата клеток, 5 мкл 5.5 mM флюорогенного субстрата (конечная концентрация ~ 27.5 шМ). Флюоресценцию (А возб. 390 ± 10 нм,Я эмиссии 510 ± 5 нм) измеряли на флюориметре Versa Fluor V1.3 (BioRad) до и после одночасовой инкубации при комнатной температуре. Ферментативную активность Css выражали в условных единицах флюоресценции субстрата Л S = [S(t) - B(t)] - [S^t^ - B(t0)]/ At, где: S - сигнал измеряемого образца на момент времени t, В - сигнал реагент-бланка на момент времени t, t - время завершения измерения, t0- время начала измерения, At = (t -10).

Процедуру окрашивания клеток иодистым пропидием осуществляли стандартным методом (ускоренный вариант окрашивания) [Nicoletti, 1999]. Цитофлюорометрию осуществляли на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (BD), в рамках программного обеспечения CellQuest. Оценивалась величина гиподиплоидного (суб-Gl/GO) пика.

Оценку экспрессии Fas рецептора (CD95) на лимфоцитах первоначально осуществляли непрямым иммунофлюоресцентным методом с использованием в качестве "первых" антител мышиных моноклональных антител против Fas-рецептора человека клона DX2, IgGl (Caltag Lab.), а в качестве "вторых" антител FITC-меченые (Fab-2)" - фрагменты козьих антител против IgG мыши (ISN Biomedicals Inc.). Процедуру окрашивания проводили стандартным методом, и учет результатов осуществляли на флуоресцентном микроскопе МБИ15А. В дальнейшем оценку мембранной экспрессии CD95, CD25, CD4, CD8 на лимфоцитах человека и экспрессии CD3, CD4, CD8, CD25 на лимфоцитах крысы осуществляли методом одно- и двухпараметрического прямого иммунофлюоресцентного окрашивания и последующей оценкой результатов на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (BD). Использовались мышиные моноклональные антитела против дифференцировочных антигенов человека: антиС095-РЕ, антиСП25-РЕ, aHraCD4-FITC, aHTHCD8-FITC и соответствующие изотипические контроли (все реагенты фирмы Caltag Lab.) и панель мышиных моноклональных антител (Caltag Lab.) против поверхностных антигенов лимфоцитов крысы (анти CD3-FITC, анти CD4-PE, анти CD8-PE, анти CD25-РЕ) и соответствующие изотипические контроли. При окрашивании клеток применяли коммерческий лизирующий/фиксирующий раствор CalLyse (Caltag), раствор CellWash (BD) для отмывания клеток. Анализ данных осуществляли в

рамках программного обеспечения CellQuest (BD).

Содержания лимфоцитов, экспрессирующих белки bcl-2 и р53, определяли иммуногистохимическим методом, используя моноклональные антитела против bcl-2 (клон 124, DAKO) и моноклональные антитела против р53 (клон 118, DAKO). В качестве "визуализирующих" систем использовали ENVision™+System/HRP Rabbit DAB+ (DAKO) или NOVOSTAIN UNIVERSAL QUICK KIT (NOVO CASTRA). Процедуру фиксации и окрашивания клеток осуществляли согласно требованиями фирм-производителей антител и "визуализирующих" систем. Подсчет' процентного содержания антигенреактивных клеток осуществляли на световом микроскопе JENAMED 2, при этом подсчитывалось не менее 300 клеток в 10 полях зрения.

Интенсивность экспрессии белков bel- 2 и р53 осуществляли методом Вестерн-блот анализа. Для идентификации белков использовали моноклональные антитела против bcl-2 человека NCL-L-bcl-2 (NOVO CASTRA) и NCL-L-p53-D07 (NOVO CASTRA). При проведении процедуры Вестерн-блота применяли реагенты фирмы BîoRad и стандартные буферные системы. На первом этапе осуществляли электрофоретическое разделение белков лизатов лимфоцитов (10 мкл лизата на лунку) в 10% готовых акриламидных гелях (BioRad) в редуцирующих условиях. Электрофорез осуществляли в модуле MiniProtean Cell (BioRad). Электротрансфер белков на нитроцеллюлозные мембраны проводили, используя Mini Trans-Blot Cell модуль (BioRad) (100 в, 90 мин, 4°С). Мембраны блокировали 2% обезжиренным молоком (BioRad), обрабатывали "первыми" антителами в разведении 1:100, промывали, и далее, для визуализации результатов блота, использовали систему NOVOSTAIN UNIVERSAL QUICK KIT (NOVO CASTRA). Для амплификации окрашивания к раствору субстрата (5 мг/мл 3,3-диаминобензидина, 1 ng/мл Н202) добавляли ионы кобальта (0.1% СоС1э). Результаты Вестерн-блота оценивали с помощью программы TotalLab v 1.0 (Amersham).

Окислительное CYP1 Al-зависимое деалкилирование этоксирезоруфина в лимфоцитах оценивали по методу Thompson и соавторов [1989]. Определение ЭРОД активности в микросомах печени крыс осуществляли по методу Pohl и Fouts [1980]. Микросомы печени получали методом низкоскоростного центрифугирования [Kamath, Rubin, 1972] в растворе 0.125 M сахарозы в присутствии ионов Сам. Определение внутриклеточного содержания белка CYP1A1 осуществляли иммуногистохимически, используя поликлональные антитела против CYP1A1 человека RDI-CYPlAlabr (RDI Research diagnostics) и визуализирующую систему NOVOSTAIN UNIVERSAL QUICK KIT (NOVO CASTRA). Подсчет процентного содержания антиген-реактивных клеток осуществляли на световом микроскопе JENAMED 2, при этом подсчитывалось не менее 300 клеток в 10 полях зрения.

Статистическую обработку результатов проводили стандартными методами

вариационной статистики в рамках программного обеспечения Statistica для Windows, версия 5.5. Для отвержения "нулевой" гипотезы использовались, в зависимости от характера распределения, параметрические t-критерии Стьюдента для независимых или сопряженных признаков (Р() или непараметрический критерии Манна-Уитни (Ру) и Вилкоксона (Pw). Различия между группами считались статистически значимыми при Р < 0.05. При Р < 0.1 различия считались статистически вероятными [Трахтенберг и соавт., 1991]. В большинстве таблиц данные представлены как М ± т, на графиках и диаграммах, как М ± SD.

Результаты исследования и их обсуждение

В первой серии экспериментов было изучено влияние ТХДД на пролиферативную активность, апоптоз, экспрессию ЭРОД (7-этоксирезоруфин-о-деэтилазной) активности и экспрессию Fas рецептора в культурах мононуклеаров периферической крови, стимулированных смесью митогенов (РИА, 10 мкг/мл и PWM, 5 мкг/мл). В культурах нестимулированных клеток ТХДД не вызывал статистически значимого изменения изучаемых показателей, хотя и наблюдалось незначительное усиление спонтанного митогенеза и увеличение ЭРОД активности в клетках. В культурах клеток стимулированных смесью митогенов пролиферативная активность возрастала в 22.3 раза, что сопровождалось активационным апоптозом (содержание клеток с признаками фрагментации ядра при окрашивании Hoechst 33342 составило в сгимулиронанных культурах 5.8 + 0.8%, против 3.4 + 0.6% в нестимулированных, Pw<0.002) и активационно-индуцированной экспрессией Fas рецептора (содержание CD95+ клеток составило в стимулированных культурах 33.7 -t 4.0 %, против 15.9 i 2.4% в нестимулированных, Pw<0.004). Мшогенез лимфоцитов приводил в существенному нарастанию ЭРОД активности, которая составила в стимулированных клетках 0.097+0.009 пмоль/мин/106 лимфоцитов против 0.052 ± 0.005 пмоль/мин/106 лимфоцитов в нестимулированных (Pw<0.002), что подтверждает тесную сопряженность механизмов регуляции транскрипции гена CYP1A1 с триггерными механизмами активации клетки [Nebert et al., 2000]. ТХДД вызывал более чем двукратную индукцию ЭРОД-активности в активированных лимфоцитах, незначительно (на 11%), но статистически значимо, угнетал митотическую активность клеток. В культурах стимулированных лимфоцитов, содержащих ТХДД, увеличивалось содержание погибших клеток (по тесту окрашивания трипановым синим), которое составило 90.2 ± 2.2%, против 93.2 ± 1.3% в контрльных культурах (Pw<0.005). В то же время интенсивность активационного апоптоза не только не увеличивалась, но статистически значимо снижалась и составила 4.1 ± 0.4% (Pw<0.044). При анализе активационно-индуцированной экспрессии Fas было обнаружено, что содержание CD95+ лимфоцитов в культурах, содержащих ТХДД, несмотря на угнетение митогенеза, возрастало (39.2 ± 4.2, Pw<0.007). Поскольку у лиц с

высоким уровнем контаминации ТХДД обнаруживается зависимость между реактивностью лимфоцитов и содержанием ксенотоксиканта в организме [H.H. Курчатова, 1999], был проведен корреляционный анализ между содержанием ТХДД в липидной фракции крови и показателями митогенеза в 72-часовых культурах. Статистических значимой взаимосвязи между уровнем контаминации организма ТХДД, который составил 15.50 ±2.18 ppt1, и показателями митотической активности клеток в присутствии экотоксиканта выявлено не было.

В следующей серии экспериментов (таблица 1) в качестве митогена использовались антиСОЗ МКА, обеспечивающие "физиологическую" активацию Т лимфоцитов через TCR, причем среди активируемых антиСОЗ МКА клеток большая часть идентифицируется как CD4+ Т лимфоциты [Gains et al., 1996]. Т лимфоциты играют ведущую роль в регуляции иммунореактивности и нормальный баланс между их позитивной и негативной активацией (апоптозом) является основной адекватного иммунного ответа [Чередеев, Ковальчук, 1999; Krammer, 2000]. Именно Th лимфоциты наиболее чувствительны к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды.

В этой серии экспериментов ТХДД вызывал статистически значимое нарастание ЭРОД активности в нестимулированных клетках, незначительно, но статистически значимо снижал их жизнеспособность, вызывал тенденции к увеличению спонтанного митогенеза и содержания лимфоцитов с маркируемыми разрывами ДНК.

Митогенез Т лимфоцитов, как и в первой серии экспериментов, приводил к существенному нарастанию CYP1 AI-зависимой ЭРОД активности и активационно-индуцированному апоптозу клеток. ТХДД вызывал мощную индукцию ЭРОД активности в стимулированных антиСОЗ МКА лимфоцитах, что сопровождалась резким, более чем 5-кратным, увеличением содержания иммунореактивного белка CYP1A1. ТХДД, незначительно, но статистически значимо снижал жизнеспособность клеток и вызывал угнетение митогенеза лимфоцитов, причем при детальном анализе структуры клеточного цикла (Рис 1) было выявлено, что арест клеточного цикла антиСОЗ-стимулированных Т лимфоцитов наблюдался уже при переходе из фазы покоя в пресинтетический период клеточного цикла (GO > Gl) - содержание лимфоцитов, находящихся в GO фазе клеточного цикла значимо нарастало, а содержание клеток, находящихся в пресинтетической фазе (Gl фазе), равно как и суммарное содержание лимфоцитов, находящихся в S+G2+M фазах снижалось. Содержание лимфоцитов в терминальной фазе апоптоза, тестируемое окраской Hoechst 33342 имело тенденцию к снижению (что было подтверждено и при цитофлюорометрии окрашенных иодистым пропидием клеток), а при идентификации апоптотирующих клеток TUNEL-методом и методом метахроматического окрашивания АО (апоптоз в Gl фазе) значимо снижалось. Отсутствие достоверных различий при идентификации терминальных фаз апоптоза и

Влияние 2,3,7,8 - тетрахлордибензо-р-диоксина на жизнеспособность клеток, митотическую активность и апоптоз, экспрессию СУР1А1-зависимой ЭРОД активности в 72-часовых культурах лимфоцитов, стимулированных антиСОЗ МКА

Условия культивирования Жизнеспособность, % (п = 22) Пролифера- тивная активность имп./мин/104 лимфоцитов (п = 22) Индекс стимуляции РБТЛ Содержание апоптотирующих лимфоцитов, % Экспрессия ЭРОД активности, пмоль/мин/ 10® лимфоцитов (п = 18)

Окраска НоесЬэ! 33342 (п = 14) ТШЕЬ метод (п = 7)

антиСОЗ МКА ТХДД

- - 96.810.7 2534 ±380 5.911.2 5.311.3 0.002 ± 0.0007

- + 95.3 + 0.8 Рт = 0.031* 2727 ±294 5.211.6 7.1 13.4 0.00310.0008 = 0.005*

+ - 96.0+1.6 29845±3562 15.3±1.9 7.212.0 13.112.4 Р№ - 0.028# 0.06610.012 Р№ = 0.001#

4- + 95.0 ±0.8 Рг = 0.036* 26881±3873 Ры = 0.036* 13.212.0 Р* = 0.05* 6.311.1 10.212.7 = 0.028* 0.14010.017 Р№ = 0.0001*

Данные представлены, как Мк т

Рл - парный критерий Вилкоксона, 1?- парный критерий Стьюдента * - в сравнении с культурами, не содержащими ТХДД № - в сравнении с нестимулированными культурами

достоверные различия, полученные при анализе более ранних фаз апоптоза закономерны. Одной из причин этого может быть то, что в использованной культуре мононуклеаров присутствуют фагоцитирующие клетки, поглощающие образующиеся апоптосомы, а также увеличение числа некротических клеток не являются противоречием. Дисбаланс или арест клеточного цикла приводит к значительным нарушениям морфологии и биохимизма клеток, нарушению проницаемости клеточной мембран, вторичному некрозу или гибели, характер которой сложно идентифицируется [Vermes et al, 1997]. Описана также интернуклеосомная деградация клеток без последующей фрагментации ДНК и других признаков апоптоза [Schwärt L. et al, 1993; Ueda et al, 1995; Zamai et al, 1996].

|i

щ _*-M>tt 1ХИ

%

НМЛ e*M*«nc

90 |

» ТХДД

ГМЛ «NiMW Ан«н("Г» КП.А

Ш

4 4 . j

Ою'цЖ'ьНй'лbo ioV>

МЫ в«***«*

Amu fTH MVA * ТХЛД

Рисунок1. Влияние ТХДД на структуру клеточного цикла нестимулированных и стимулированных антиСйЗ МКА лимфоцитов периферической крови 1доровых доноров. По оси ординат относительное содержание клеток, находящихся в той, или иной фазе клеточного цикла, %; по оси абсцисс фазы клеточного цикла Цитофпюорограммы иллюстрируют данные типичного эксперимента 005 (п 10)

Ключевым механизмом реализации программы апоптоза является активация каскада цитозольных аспарат-специфичных протеаз - каспаз (Cs) [Cryns, Yuan, 1998; Wolf, Green, 1999]. Митогенез лимфоцитов сопровождался закономерным нарастанием активности инициирующих и эффекторных Css (Рис 2).

Рисунок 8. Влияние ТХДД на активность инициирующих и эффекторных каспаз в 72-часовых культурах стимулированных антиСйЗ МКА лимфоцитов периферической крови здоровых доноров. По оси ординат: ферментативная активность (изменение флюоресценции субстрата dS за единицу времени dt), по оси абсцисс. I -нестимулированные лимфоциты; 2 - нестимулированные лимфоциты f ТХДД, 3 антиСDi-стимулированные лимфоциты; 4 - антиСйЗ-стимулированные лимфоциты + ТХДД * - достоверные различия с культурами, не содержащими ТХДД (Рн, < 0.05); # -достоверные различи с нестимулированными культурами (Р№ < 0 05)

В культурах стимулированных лимфоцитов активность Cs8 возрастала более чем в 36 раз, суммарная активность Cs 3,7,10 возрастала в 3.7 раз, а активность Cs9 возрастала лишь в 1.5 раза, и статистически значимых различий с нестимулированными клетками не было. Это неудивительно, т.к. активация каскада Cs8 > Cs3 не обязательно сопряжена исключительно с процессом апоптоза в активированных лимфоцитах, процессинг Cs3 является нормальным и необходимым компонентом активации всех популяций Т лимфоцитов стимуляции TCR, [Miossec et al., 1997; Wilhelm et al., 1998; Alam et al., 1999]. Интересно и то, что если активность Cs 8 в покоящихся лимфоцитах почти не идентифицировалась, то активность Cs 9 была довольно высока. Полученные данные свидетельствуют о преобладающих механизмах рецепторно-опосредованного апоптоза в активированных через TCR Т лимфоцитах. ТХДД незначительно увеличивал активности инициирующих и эффекторных Css в покоящихся лимфоцитах, хотя статистически достоверных различий не выявлялось. В то же время, ТХДД существенно уменьшал активность Cs8 и суммарную активность Css 3,7,10 в антиСОЗ-стимулированных Т лимфоцитах

- активность Сэ8 снижалась на 56.4%, а Сбб 3,7, 10 на 40%. Активность Се 9 снижалась лишь на 19% и статистически значимых различий выявлено не было. Таким образом, судя по полученным данным, ТХДД на фоне активации лимфоцитов угнетал преимущественно апоптоз, ассоциированный с мембранными сигнальными системами. В то же время "двойственная" роль каскада Сев > СяЗ, который участвует и в реализации митогенеза, и в реализации апоптоза, объясняет несоответствие между умеренным снижением содержания апоптотирующих лимфоцитов идентифицируемых другими методами, и выраженной депрессией активности Свв. Добавление в культуру селективного антагониста АЬ-рецептора а-нафтофлавона (за 24 часа до окончания культивирования, конечная концентрации 1 шМ) достоверно снижало индуцированную ТХДД экспрессию иммунореактивного белка СУР1А1, митогенный ответ лимфоцитов, а активность эффекторных Сбб хотя и повышалась, но оставалась ниже таковой в контрольных культурах. Этот факт свидетельствует о том, что влияние ТХДД на пролиферативную активность и апоптоз антиСВЗ-стимулированных клеток связано не только с опосредованными через АЬ-рецептор эффектами, что подтвердилось при изучение прямого влияния ТХДД на СБ-зависимый аспарат-специфичный протеолиз. ТХДД (10 пМ) статистически значимо ингибировал ферментативную активность СбЗ при непосредственном добавлении в реакционную систему. Известно, что блокада СэЗ при добавлении Х-МАТ) к культурам митотически активных клеток блокирует и митогенез [А1аш е1 а1., 1999].

) Как и в случае стимуляции лимфоцитов смесью митогенов, ТХДД не только не вызывал угнетения активационно-индуцированной экспрессии Рак-рецептора на активированных антиСБЗ МКА СП4+ Т хелперах, и СГ)8+ цитотоксических Т лимфоцитах (Рис 3). Более того, прослеживалась тенденция к ее усилению. В равной мере это касалось и экспрессии другого активационного антигена -рецептора к 1Ь2. Таким образом, ТХДД, несмотря на угнетение митогенеза, вызывал неадекватно высокую экспрессию активационных антигенов на мембране лимфоцитов, что хорошо согласуется с результатами, полученными при иммунотропных эффектов другого индуктора цитохрома Р450 -бенз[а]пирена [М^гтзк!, 1993]. Одновременно, ТХДД вызывал гипоэкспрессию антиапоптогенного белка Ьс1-2 в активированных лимфоцитах и снижал содержание лимфоцитов, экспрессирующих этот белок, причем этот эффект устраняется а-нафтофлавоном (Рис 4). Это неудивительно, поскольку Ьс1-2 и цитохром Р450 играют оппозитную роль в регуляции оксидантного статуса клетки [ПтНпеу, 2000; Шс1етап е1 а!., 2003]. Несмотря на ингибицию апоптоза, ТХДД вызывал гиперэкспрессию р53. Этот факт не противоречив, так как р53 не обязательно индуцирует апоптоз, но способен блокировать циклин-зависимые киназы и вызывать лишь арест клеточного цикла [А£аг\\'а1 et а!., 1998].

к,; . t — _ . * во

Рисунок 3. Цитофпюорограммы, иллюстрирующие влияние ТХДД па экспрессию активационных антигенов (CD25 и CD95) на С 1)4+ и CDS+ Т-лимфоцитах в 72-часовых культурахмононуклеаров периферической крови здорового донора. Питания файлов цитофлюорограмм control - нестимулировинные клетки, TCDD нестимушрованные клетки + ТХДД; artuCDiMabi - клетки стимулированные антиСОЗ МКА, antiCDiMabs + TCDD - клетки стимулированные anmuCD3 МКА + ТХДД Две нижние цитофлюорограммы иллюстрируют митогенез клеток, где R2 - покоящитеся клетки, КЗ властные формы

Рисунок 4 Влияние ТХДД на экспрессию белка Ъс1-2 в покоящихся и стимулированных антиСОЗ МКА лимфоцитах периферической крови здоровых доноров (п = 5) По оси ординат• Интенсивность экспрессии, уел ед ; по оси абсцисс 1 - контрольные покоящиеся лимфоциты; 2 - покоящиеся лимфоциты + ТХДД; 3 - контрольные стимулированные анти CD3 МКА лимфоциты, 4 - стимулированные анти CD3 МКА лимфоциты > ТХДД, 5 -стимулированные анти CD3 МКА лимфоциты 1 ТХДД + а-Нафтофяавон

Наиболее существенным представляется то, что вызываемые ТХДД нарушения пролиферативного ответа лимфоцитов, экспрессии рецепторного аппарата и белков регуляторов апоптоза приводят к изменению ответа клетки на апоптогенный сигнал. ТХДД резко усиливал апоптоз активированных Т лимфоцитов, индуцированный полуагонистическими aHTHFas МКА, т.е. апоптоз инициируемый физиологическим сигналом через Fas-рецептор (Таблица 2). Этот эффект был связан с индукцией CYP1A1, поскольку ингибировался а-нафтофлавоном. По нашему мнению, существенное значение в повышении чувствительности к рецепторному апоптозу имеет гипоэкспрсссия bcl-2. Напротив, при индукции нерецепторного апоптоза ингибитором топоизомеразы I кампотецином, ТХДД ингибировал апоптоз (Таблица 3). Это связано с антипролиферативный эффектом ТХДД - вещества, блокирующие митотический цикл при переходе из GO в GI фазу и ингибиторы циклин-зависимых киназ снижают чувствительность клеток к ингибиторам топоизомеразы [Park et al., 1997].

Полученные результаты весьма важны для интерпретации механизмов развития вторичной иммунологической недостаточности, вызываемой ТХДД. Гиперреактивность рецепторных механизмов апоптоза, а следовательно и активационно-индуцированной клеточной смерти которая реализуется по Fas-зависимому механизму fSharma et al., 1999], может приводить к угнетению клональной экспансии Т лимфоцитов и усилению их делеции в ответ на антигенный стимул и формированию иммунологической недостаточности.

Влияние 2,3,7,8 - тетрахлордибензо-рдиоксина на чувствительность нестимулированных и стимулированных антиСБЗ МКА лимфоцитов периферической крови человека к РаБ-индуцированному апоптозу

Условия культивирования Суммарная активность эффекторных каспаз 3,7,10 (по скорости расщепления флюорогенного субстрата Ас-ОЕУО-АРС), ёБ/Л (п = 8) Содержание клеток с маркируемым разрывами ДНК (ТиМХ-метод), % (п = 6)

аСЭЗ МКА ТХДД Неиндуциро- ванный контроль Индукция антиРаБ МКА % изменения Неиндуциро- ванный контроль Индукция антиРаэ МКА % изменения

- - 1.410.4 1.910.5 Р№= 0.018# 52118 4.5 1 1.3 4.811.3 12 ± 8

- + 1.510.4 2.0 10.6 0.076# 67129 5.413.1 6.013.4 20+12

+ - 5.811.5 6.811.8 Ри'= 0.012# 1613 11.6 + 2.4 14.812.7 0.028# 35118

+ + 3.9 ± 1.2 6.311.6 Рч=0.012# 107129 Р^ 0.012* 8.411.7 13.612.5 0.028# 67114 Руг= 0.028*

Данные представлены, как М± т Ру - парный критерий Вилкоксона * - в сравнении с культурами, не содержащими ТХДД Ь - в сравнении с неиндуцированным контролем

Влияние 2,3,7,8 - тетрахлордибензо-р-диоксина на чувствительность нестимулированных н стимулированных анти-СОЗ МКА лимфоцитов периферической крови человека к ингибитору топоизомеразы I камптотецину (1 тМ).

Условия культивирования Суммарная активность эффекторных каспаз 3,7,10 (по скорости расщепления флюорогенного субстрата Ас-ВЕУО-АРС), аБ/с1г (п = 5) Относительное содержание клеток в суб-С1Л30 пике (М1) при окрашивании йодистым пропидием,%(п = 7)

аСОЗ МКА ТХДД Неиндуциро -ванный контроль Камптотецин % изменения Неиндуциро- ванный контроль Камптотецин % изменения

- - 7.8 ± 1.9 7.1 ± 1. 0 1.8 ±0.4 2.3 ± 0.6 28.1 ± 14.6

- + 7.4 ±2.0 9.9 ±2.2 33.3 ± 14.3 2.1 ±0.6 2.9 ± 0.4 16.0 ±8.0

+ - 12.1 =с 1.7 14.2 ± 1.6 Рчг=0.012# 18.9 ±4.2 3.4 ±0.6 5.4 ± 1.3 0.012# 57.2 ± 18.4

+ + 9.4 ± 0.3 10.9 ±0.5 16.3 ±6.2 3.0 ±0.8 4.6 ±1.4 30.2 ± 18.9

Данные представлены, как Мк т

Ру - парный критерий Вилкоксона

4 - в сравнении с неиндуцированным контролем

Полученные нами в модельной системе активированных Т лимфоцитов результаты хорошо согласуются с данными других исследователей -иммуносупрессивный эффект ТХДД не идентифицировался у мышей, дефектных по сжиеме Fas/FasL [Camacho et al., 2001; Dearstyne, Kerkliet, 2002].

Цитохром P450 является "химическим сенсором", контролирующим функционирование клеток иммунной системы в окружающей среде низкомолекулярных химических соединений [Ковалев и соавт.,1994; Сибиряк и соавт., 2003]. С этих позиций антипролиферативное действие ТХДД и повышенную реактивность на апоптогенный сигнал можно рассматривать как адаптивную, защитную реакцию клеток в условиях сверхиндукции цитохрома Р450.

При анализе влияния ТХДД на пролиферативную активность и апоптоз в лимфоидных органов в системе in vivo ТХД Д вводили однократно крысам WAG/ Rij в дозе, обеспечивающей мощную индукцию цитохрома Р4501 Al (5 мкг/кг), что было документировано резким увеличением ЭРОД активности в микросомах печени (ЭРОД активность в колнтрольной группе составила 11.6 ± 3.0 пмоль/мг белка/мин, в опытной - 91.0 ± 1.0 пмоль/мг белка/мин, Р < 0.001). На 4 сутки оценивали пролиферативную активность и апоптоз в лимфоидных органах, используя метод метахромагического окрашивания клеток акридиновым оранжевым с последующей проточной цитофлюорометрией. Полученные результаты свидетельствовали о преобладающем воздействии ТХДД на лимфоидные ткани, характеризующиеся "митотическим" потенциалом. В тимусе ксенотоксикант проявлял отчетливое антипролиферативное и апоптогенное действие (Рис 5), в костном мозге - антипролиферативный эффект (в опытной группе значимо снижалось содержание S+G2+M клеток), во вторичных лимфоидных органах (селезенка, лимфоузлы и периферическая кровь) - не влиял на пролиферативную активность и апоптоз клеток. В периферической крови ТХДД не вызывал существенных изменений субпопуляционной структуры Т лимфоциюв (содержания CD3+CD4^ и CD3+CD8+ лимфоцитов). В то же время, ТХДД значимо ингибировал пролиферативный ответ регионарных лимфоузловых лимфоцитов (и активационный апоптоз) при индукции митогенеза in situ путем субплантарного введения 20 мкг СопА. Так, в контрольной группе, спустя 24 часа после инокуляции СопА содержание S+G2^M клеток в регионарном лимфоузле составило 1.13 ± 0.93%, против 0.70 ± 0.68% в нестимулированном лимфоузле (Pf для сопряженных признаков =^0.009); содержание апоптотирующих клеток составило 5.21 ± 4.52 %, против 2.80 и- 2.3 % в нестимулированном лимфоузле (Рт=0.01). В диоксиновой группе, содержание S+G2+M клеток в активированном лимфоузле составило 0.77 ± 0.56%, против 0.64 ± 0.51 % в нестимулированном лимфоузле; содержание апоптотирующих клеток составило 4.21 ± 3.18 %, против 3.76 ± 2.4 % в нестимулированном. Угнтение митогенеза, однако, не сопровождалось

угнетением активационно-индуцированной экспрессии СО25 на СОЗ+ Т лимфоцитах. Судя по результатам, активированные клетки наиболее чувствительны к воздействию экотоксиканта, что подтверждают результаты исследователей, использовавших другие методические подходы [Ргург^е^ч'сг а!., 1998; ЫеЬке с1 а1., 2001].

80 70 60 60 40 30 20 10 0

ЕЗ Контроль (п = 26) □ ТХДЩп = 2Б)

1

ш

ео

01

¿ро

Рисунок 18. Структура клеточного цикла и апонтоз тимоцитов при воздействии ТХДД. По оси ординат относительное содержание клеток, находящихся в той или иной фазе клеточного цикла и апоптотирующих клеток, %, по оси абсцисс фазы клеточного цикла и апоптоз

Таким образом, супериндуктор цитохрома Р4501А1 ТХДД, изменяет реактивность иммунокомпетентных клеток и адекватный баланс между позитивной и негативной их активацией. Угнетая пролиферативный ответ лимфоцитов и интенсивность активационного апоптоза, ТХДД увеличивает интенсивность рецепторного апоптоза, что может быть связано с нарушением рецепции апоптогенного сигнала, механизмов регуляции апоптоза. Причем, эти эффекты связаны не только с внутриклеточной индукцией цитохрома Р450, но и с прямым влиянием на процессинг апоптогенного сигнала.

Иммунная система является индикаторной системой экологического неблагополучия, наиболее чутко реагирующей на воздействие неблагоприятных факторов [Черешнев, 2004]. В первую очередь это касается техногенных ксенобиотиков-поллютантов, число которых постоянно возрастает. Механизмы формирования экологически обусловленных иммунодефицитных состояний (ЭОВИДС) зависят с одной стороны от специфической биологической активности соединения, с другой, - от последствий взаимодействия этого соединения с "химическим сенсором" - системой цитохром Р450-зависимых монооксигеназ. В настоящее время предполагают, что основная мишень действия

ТХДД, - АЬ-Я и контролируемые этим транскрипционным фактором гены (в первую очередь СУР1А1), являются основной системой, контролирующей внутриклеточный сигналлинг при клеточном стрессе [КеЬеЛ е1 а1., 2001; Ма1зишига, 2003]. Вскрытие этих механизмов позволит глубже понять патогенез формирования индуцированной ксенобиотиками иммунологической недостаточности, а следовательно будет в значительной мере способствовать разработке адекватных мер профилактики и терапии

ВЫВОДЫ

1. Супериндуктор цитохрома Р4501А12,3,7,8 - тетрахлордибензо-р-диоксин изменяет нормальную реактивность лимфоцитов, нарушая процессы позитивной и негативной активации, что может лежать в основе вызываемой этим поллкп антом иммунологической недостаточности.

2. В культуре мононуклеаров периферической крови человека 2,3,7,8 -тетрахлордибензо-р-диоксин вызывает индукцию СУР1А1-зависимой этоксирезоруфин-О-деэтилазной активности в лимфоцитах, подавляет индуцированную смесью митогенов (ФГА + МЛ) пролиферацию лимфоцитов, снижает интенсивность активационного апоптоза, но не влияет на активационно-индуцированную экспрессию Раз-рецептора. Эффект ТХДД не зависит от уровня контаминации донора экотоксикантом.

3. В культуре мононуклеаров периферической крови человека стимулированных антиСВЗ моноклональными антителами 2,3,7,8 -тетрахлордибензо-р-диоксин вызывает индукцию этоксирезоруфин-О-деэтилазной активности и экспрессии белка СУР1А1 в лимфоцитах, подавляет пролиферативный ответ Т лимфоцитов на этапе перехода клеток из пресинтетической фазы в 01 фазу клеточного цикла, ингибирует акгивационный апоптоз. Эти эффекты связаны как с индукцией цитохром Р450, так и с прямым влиянием на процессинг активационного сигнала (активность СвЗ).

4. 2,3,7,8 - тетрахлордибензо-р-диоксин не угнетает активационно-индуцированную экспрессию Раз-рецептора и рецептора к 1Ь-2 на СБ4^ и СЭ8-Т лимфоцитах (вызывает относительную гиперэкспрессию активационных антигенов).

5. 2,3,7,8 - тетрахлордибензо-р-диоксин снижает экспрессию белка Ьс1-2 в лимфоцитах и содержание Ьс1-2+ Т лимфоцитов при их активации, но, несмотря на угнетение апоптоза, вызывает увеличение экспрессии белка р53.

6. 2,3,7,8 - тетрахлордибензо-р-диоксин повышает чувствительность активированных Т лимфоцитов периферической крови к рецепторному (РаБ-индуцированному) апоптозу, но снижает чувствительность клеток к апоптогенному действию ингибитора топоизомеразы I камптотецина.

7. У экспериментальных животных 2,3,7,8 - тетрахлордибензо-р-диоксин преимущественно воздействует на лимфоидные органы с высоким митотическим

потенциалом, проявляя антипролиферативное и апоптогенное действие (тимус) или антипролиферативное действие (костный мозг). Иммунотоксический эффект ТХДД во вторичных лимфоидных органах проявляется при активации клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Sibiryak D. The influence of 2,3,7,8-tetrachlordibenzo-p-dioxine (TCDD) on the EROD-activity, mitogenic response, cell viability, apoptosis and Fas-receptor expression in the mitogen-stimulated human peripheral blood lymphocyte cultures / D. Sibiryak, S. Sibiryak, N. Kurchatova, R. Yusopova, Z. Amirova, E. Kruglov // Organohalogen Compounds. - 2000. - Vol.49. - P. 97 - 100.

2. Sibiryak S. The 2,3,7,8-tetrachlordibenzo-p-dioxine enhances the receptor-mediated apoptosis of the peripheral blood T lymphocytes / N. Kurchatova, R. Yusopova , D. Sibiryak, N. Ahmatova // Russian J. Immunol. - 2001 - 6 (4) - P. 412 -414.

3. Sibiryak D.. The cytochrome P4501A1 induction suppresses the activated T-lympocyte apoptosis but enhances the Fas-mediated apoptosis / D. Sibiryak, S. Sibiryak, N. Kurchatova, R. Yusopova // Scand. J. Immunol. - 2001. - Vol. 54, Suppl.l. - W 1.18

4. Сибиряк С.В. Повышение чувствительности лимфоцитов к FAS-зависимому апоптозу при воздействии индуктора цитохрома Р4501А1 2,3,7,8 -тетрахлордибензо-р-диоксина (ТХДД)/ С.В. Сибиряк, Д.С. Сибиряк, Н.Н. Курчатова, Р.Ш. Юсупова // Иммунология Урала-2001 - №1(1) 16 - 17.

5. Сибиряк С.В. Оценка активности каспазы 3 в активированных Т-лимфоцитах как способ характеристики их реактивности в клинических и экспериментальных условиях (тезисы)/ С.В. Сибиряк, Н.Н. Курчатова, Р.Ш. Юсупова, Д.С. Сибиряк, U.K. Ахматова // Медицинская иммунология - 2001 т.4, № 2. - С. 153-154

6. Сибиряк Д.С. Чувствительность лимфоцитов к FAS-зависимому апоптозу при воздействии Ah-зависимого индуктора цитохрома Р4501А1 тетрахлордибензодиоксина/Д.С. Сибиряк, С.В. Сибиряк, Н.Н. Курчатова, Р.Ш. Юсупова // Медицинская иммунология. - 2002 - т.4, № 2. - С. 336.

7. Сибиряк Д.С. Индукция апоптоза в активированных лимфоцитах приводит к супрессии CYP1А1-зависимой монооксигеназной активности/ Д.С. Сибиряк, Н.Н. Курчатова, С.В. Сибиряк // Тез. докл. 5-го Конгресса РААКИ "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии" 12 - 14 ноября 2002 года, М., С. 142.

8. Sibiryak S.. Detection ofAnti-CD3 mAbs-induced mitogenesis and caspase 3 activity as a method for the evaluation ofT-cell reactivity in clinical and experimental investigation/ S. Sibiryak, N. Kurchatova, R. Yusopova, D. Sibiryak,N. Ahmatova //

Rus. J. Immunol. - 2002. - Vol. 7 (3). - P.265 - 267.

9. Сибиряк Д.С. Изменение структуры клеточного цикла и апопгоз лимфоцитов периферической крови при воздействии 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина/Д.С. Сибиряк, Н.Н. Курчатова, С.В. Сибиряк//Иммунология Урала

- 2003- № 1 -С. 111 - 112.

10.Сибиряк Д.С. Влияние супериндуктора циюхрома Р4501А1 на пролиферативную активность и апоптоз клеток в лимфоидных органах // Rus. J. Immunol. - Тез. докл. Объединенного Иммунол. Форума 31.05 - 04.06. 2004., Екатеринбург. - Vol. 9. - Suppl. 1. - P. 23.

11. Сибиряк Д.С., Влияние 2378-тетрахлордибензо-р-диоксина на пролиферативную активность и апоптоз в лимфоидных органах крыс // Вестник Уральской медицинской академической науки/ Д.С. Сибиряк, С В. Сибиряк -2004. -№2.-С.45-48.

12. Sibiryak D. Influence of 2378-tetrachlordibenzo-p-dioxine (TCDD) on the lymphoid cells proliferation and apoptosis in the WAG/RiJ rats // Abstr. 19th European Workshop on Drug Metabolism, DMW-2004, October 03-08 2004. - Antalya, Turkey.

- P. 90.

ДЛЯ ЗАМЕТОК

»

<

>«

I

N

Сибиряк Дарья Сергеевна

ВЛИЯНИЕ СУПЕРИНДУКТОРА ЦИТОХРОМА Р4501А1 2,3,7,8 -ТЕТРАХЛОРДИБЕНЗО-Р-ДЖЖСИНА НА ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ И АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук 14.00.36 - аллергология и иммунология

Формат 60x84/16 Гарнитура Times New Roman. Бумага офсетная. Тираж 100 экз. Заказ № 48. Отпечатано в дизайн-отделе ВЦГиПХ

93e 5

РНБ Русский фонд

2006-4 5350

*

í

Актуальность работы

Загрязнение окружающей среды ксенобиотиками является глобальной экологической проблемой, которая стоит в центре внимания исследователей во всех странах мира. Среди техногенных поллютантов наиболее серьезную опасность представляют полихлорированные дибензодиоксины и дибензофураны, объединяемые под названием диоксиноподобные суперэкотоксиканты [Федоров 1993]. Основным и наиболее токсичным представителем этого класса веществ является 2,3,7,8-тетрахлордибензо-/?-диоксин (ТХДД), причем опасность этого соединения зависит не только от его острой токсичности, но и от крайне высокой способности к биоконцентрированию в живых системах, чрезвычайно длительному выведению из организма [Birnbaum et al., 2003]. Источниками ТХДД являются предприятия по переработке отходов, производство хлорорганических гербицидов и другая индустрия, где происходит хлорирование химических соединений, а поступление его в организм осуществляется по т.н. "пищевым путям" [Амирова, Круглов, 1998; Roeder et al., 1998]. Токсическое действие ТХДД на организм млекопитающих включает гепатотоксичность, генотоксичность и канцерогенность, иммунотоксичность, нарушения метаболизма стероидных гормонов, репродуктивной функции и пр. [DeVito, Birnbaum, 1995; Nilsson, Hakansson, 2002; Cole et al., 2003; Dioxines and Health, 2003; Birnbaum, 2000; Birnbaum et al., 2003; Matsumura, 2003]. Иммунная система традиционно считается основной мишенью токсического действия ТХДД. Результаты многочисленных экспериментальных исследований и ряда клинических наблюдений, убедительно аргументируют способность ТХДД вмешиваться в процессы созревания и дифференцировки иммунокомпетентных клеток, реализацию их эффекторных функций, и, как следствие, нарушать антиинфекционную, противовирусную и противоопухолевую резистентность, индуцировать развитие аутоиммунных заболеваний [Pokrovsky et al., 1991; Vinies, 1996; Holladay, 1999; Amirova et al., 1999; Warren et al., 2000; Kerkvliet, 2002; Mimura, Fujii-Kuriyama, 2003].

Считается, что практически все проявления токсического эффекта ТХДД обусловлены его способностью высокоселективно связываться с "химическим сенсором" - арилуглеводородным рецептором (Ah-рецептором), лиганд-активируемым транскрипционным фактором, который относится к суперсемейству ядерных рецепторов и вызывать мощную индукцию изоформ цитохрома Р450 СYP1А1 hCYPIBI [Okeyetal., 1994; Nebert et al., 2004]. В свою очередь, Ah-рецептор-зависимые сигнальные системы тесно сопряжены с регуляцией клеточного цикла, синтезом цитокинов и факторов роста, а индуцируемые ТХДД изоформы цитохрома Р450 CYP1A1 и CYP1B1 участвуют в биотрансформации множества биологически активных молекул, включая стероидные гормоны, ретиноиды, эйкозаноиды и пр. [Сибиряк и соавт., 2003; Hines et al., 2001; Nebert et al., 2001, 2004].

Несмотря на то, что внутриклеточная "мишень" воздействия ТХДД твердо установлена, механизмы развития иммунотоксичности и последствия воздействия высоких доз этого экотоксиканта на иммунную систему человека окончательно не ясны, и в работах, посвященных этой проблеме, представлены весьма противоречивые результаты [Игнатьева, 1997; Курчатова, 1999; Lu, Wu, 1985; Roumak et al., 1992, 1995; Neubert et al., 1991- 2000; Lang et al., 1996; Sibiryak et al., 1998; Belles-Isles et al., 2000]. Существенно, что при изучении влияния ТХДД на лимфоидные клетки в системах in vitro, как правило, используются лимфобластоидные линии клеток, которые отличаются по реактивности и чувствительности к ксенобиотику от лимфоцитов доноров.

Программированная клеточная смерть путем апоптоза рассматривается, в настоящее время, как основной механизм поддержания иммунного гомеостаза, играющих ключевую роль в регуляции численности иммунокомпетентных клеток, их созревания и дифференцировки Т и В клеток, обеспечения адекватной силы и продолжительности иммунного ответа, сохранения аутотолерантности [Ярилин, 1999; Барышников, Шишкин, 2002; Krammer, 2000]. Нарушения апоптоза приводят к развитию иммунопатологии (апоптотического иммунодефицита) [Чередеев, Ковальчук, 1997; Ковальчук, Чередеев, 1999; Cheredeev, Kovalchuk, 1997]. Нарушения механизмов программированной клеточной смерти иммунокомпетентных клеток нередко лежат в основе иммунотоксичности ксенобиотиков [Имельбаева и соавт., 2000; Сибиряк, 2003; Сибиряк и соавт.; 2003]. На сегодняшний день результаты исследований, посвященных влиянию ТХДД на апоптоз лимфоидных и нелимфоидных клеток неоднозначны и нередко диаметрально противоположны - есть сведения об "апоптогенном" действии ТХДД [Kamath et al., 1997; Hossain et al., 1998], о его способности ингибировать программированную клеточную смерть, или отсутствии влияния на этот процесс [Silverstone et al., 2000]. Выяснение характера влияния этого соединения на пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов представляется весьма важным не только для понимания механизмов иммунотоксичности экотоксикантов-индукторов цитохрома Р450, но и роли Ah-рецептор-зависимых сигнальных систем в регуляции реактивности иммунокомпетентных клеток.

Цель исследования:

Оценить влияние 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина на пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов периферической крови человека в системе in vitro во взаимосвязи с его специфическим эффектом, и на процессы позитивной и негативной активации клеток в лимфоидных органах экспериментальных животных

Задачи исследования:

1. Изучить влияние 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина на монооксигеназную активность цитохромаР4501 А1, пролиферативную активность, апоптоз лимфоцитов периферической крови человека при их стимуляции неспецифическими митогенами.

2. Изучить влияние 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина на монооксигеназную активность цитохрома Р4501А1, пролиферативную активность и апоптоз Т лимфоцитов периферической крови человека при их физиологической стимуляции через Т- клеточный рецептор

3. Изучить влияние 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина на активационно-индуцированную экспрессию Fas-рецептора и экспрессию белков-регуляторов апоптоза

4. Изучить влияние 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина на чувствительность Т лимфоцитов периферической крови человека к рецепторно-индуцированному и нерецепторному апоптозу

5. Изучить влияние 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина на пролиферативную активность и апоптоз в лимфоидных органах у крыс

Научная новизна:

Установлено, что ТХДД вызывает индукцию CYP1 А1-зависимой монооксигеназной активности, ингибирует пролиферативную активность и активационный апоптоз лимфоцитов периферической крови человека, стимулированных смесыо мито генов, увеличивает активационно-индуцированную экспрессию Fas-рецептора, причем характер влияния ТХДД на митогенез и апоптоз не зависит от уровня контаминации донора ксенотоксикантом.

Впервые установлено, что ТХДД вызывает индукцию СYP1A1-зависимой монооксигеназной активности, усиливает экспрессию белка CYP1А1, ингибирует пролиферативную активность и активационный апоптоз Т лимфоцитов периферической крови человека стимулированных антиСОЗ МКА, не изменяет активационно-индуцированную экспрессию CD25 и CD95 на CD4+ и CD8+ лимфоцитах, вызывает гипоэкспресию bcl-2 в активированных лимфоцитах. Влияния ТХДД на митогенез лимфоцитов связано не только с индукцией CYP1А1, но и с прямым влиянием на ферментативную активность эффекторных каспаз.

Впервые обнаружено, что ТХД Д повышает чувствительность активированных через Т-клеточный рецептор лимфоцитов периферической крови человека к рецепторному (Fas-индуцированному) апоптозу, но снижает их чувствительность к апоптозу, индуцированному нерецепторным сигналом (камптотецином).

Установлено, что ТХДД, при введении в дозе, обеспечивающей основной токсикологический эффект (индукцию CYP1A1), воздействует на органы иммунной системы, характеризующиеся высоким "митотическим" потенциалом (тимус, костный мозг), где проявляет отчетливое антипролиферативное, а в тимусе и апоптогенное действие. В селезенке, лимфатических узлах и периферической крови антипролиферативный эффект отсутствует, однако он проявляется при индукции митогенеза клеток, что сопровождается и параллельным снижением интенсивности активационного апоптоза.

Научно-практическая значимость работы:

Полученные данные способствуют расширению знаний о механизмах иммунотоксического действия ксенобиотиков-индукторов цитохрома Р4501А1, а также механизмах участия Ah-рецептор-зависимых сигнальных систем в регуляции пролиферативной активности и апоптоза иммунокомпетентных клеток.

Внедрение результатов исследования:

Материалы диссертационной работы внедрены в учебный процесс при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре иммунологии ЧелГМА.

Предлагаемые автором методические подходы к оценке пролиферативной активности и апоптоза используются в научной работе отдела иммунологии ГУЗ "Всероссийский центр глазной и пластической хирургии" МЗ РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксин нарушает нормальную реактивность лимфоцитов периферической крови человека при их стимуляции лектинами и через Т клеточный рецептор, что выражается в антипролиферативном эффекте, угнетении индуцированного активацией апоптоза и сопровождается относительной гиперэкспрессией Fas рецептора, гипоэкспресией bcl-2, гиперэкспрессией р53. Эти нарушения связаны как с внутриклеточной индукцией цитохрома Р450 CYP1А1, так и с непосредственным влиянием на ферментативную активность эффекторных каспаз.

2. 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксин повышает чувствительность активированных Т лимфоцитов периферической крови человека к рецепторно-индуцированному (Fas-индуцированному) апоптозу, но снижает чувствительность к апоптозу, индуцированному нерецепторным сигналом (подавлением активности топоизомеразы I). Повышение чувствительности активированных клеток к рецепторному апоптозу может лежать в основе вызываемого ТХДД иммунодефицита.

3. 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксин, при введении крысам в дозе, обеспечивающей индукцию CYP1A1 печени, проявляет антипролиферативное и апоптогенное действие на тимус, антипролиферативное воздействие на костный мозг, а в периферических лимфоидных органах антипролиферативный эффект проявляется лишь при индукции митогенеза клеток.

Апробация работы:

Результаты диссертационной работы доложены на Международном Конгрессе

DIOXIN'2000" (Монтеррей, США, 2000), XI-м Международном Конгрессе иммунологов (Стокгольм, Швеция, 2001), 1-м Съезде иммунологов Урала (Екатеринбург, 1999 г.), 3-м съезде иммунологов Урала (Челябинск, 2003 г.), V Всероссийском Форуме "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге (С.-Пб. 2002 г.), Объединенном иммунологическом Форуме (Екатеринбург, 2004), 19-м Европейском рабочем Совещании по метаболизму лекарств (DMW-2004, Анталья, Турция, 2004).

Публикации:

По материалам диссертационной работы опубликовано 12 работ в центральной печати, из них тезисов докладов на конференциях - 9, статей - 3.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 138 страницах, иллюстрирована 10 таблицами и 27 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, раздела, отражающего результаты собственных исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Список литературы включает 222 источника (17 отечественных и 205 зарубежных).

выводы

1. Супериндуктор цитохрома Р4501А1 2,3,7,8 - тетрахлордибензо-р-диоксин изменяет нормальную реактивность лимфоцитов, нарушая процессы позитивной и негативной активации, что может лежать в основе вызываемой этим поллютантом иммунологической недостаточности.

2. В культуре мононуклеаров периферической крови человека 2,3,7,8 -тетрахлордибензо-р-диоксин (ТХДД) вызывает индукцию CYP1A1-зависимой этоксирезоруфин-О-деэтилазной активности в лимфоцитах, подавляет индуцированную смесью митогенов (ФГА + MJI) пролиферацию лимфоцитов, снижает интенсивность активационного апоптоза, но не влияет на активационно-индуцированную экспрессию Fas-рецептора. Эффект ТХДД не зависит от уровня контаминации донора экотоксикантом.

3. В культуре мононуклеаров периферической крови человека стимулированных антиСЭЗ моноклональными антителами 2,3,7,8 -тетрахлордибензо-р-диоксин вызывает индукцию этоксирезоруфин-О-деэтилазной активности и экспрессии белка CYP1A1 в лимфоцитах, подавляет пролиферативный ответ Т лимфоцитов на этапе перехода клеток из пресинтетической фазы в G1 фазу клеточного цикла, ингибирует активационный апоптоз. Эти эффекты связаны как с индукцией цитохрома Р450, так и с прямым влиянием на процессинг активационного сигнала (активность Cs3).

4. 2,3,7,8 - тетрахлордибензо-р-диоксин не угнетает активационно-индуцированную экспрессию Fas-рецептора и рецептора к IL-2 на CD4+ и CD8+ Т лимфоцитах (вызывает относительную гиперэкспрессию активационных антигенов).

5. 2,3,7,8 - тетрахлордибензо-р-диоксин снижает экспрессию белка bcl-2 в лимфоцитах и содержание bcl-2+ Т лимфоцитов при их активации, но, несмотря на угнетение апоптоза, вызывает увеличение экспрессии белка р53.

6. 2,3,7,8 - тетрахлордибензо-р-диоксин повышает чувствительность активированных Т лимфоцитов периферической крови к рецепторному (Fas-индуцированному) апоптозу, но снижает чувствительность клеток к апоптогенному действию ингибитора топоизомеразы I камптотецина.

7. У экспериментальных животных 2,3,7,8 - тетрахлордибензо-р-диоксин преимущественно воздействует на лимфоидные органы с высоким митотическим потенциалом, проявляя антипролиферативное и апоптогенное действие (тимус) или антипролиферативное действие (костный мозг). Иммунотоксический эффект ТХДД в периферических лимфоидных органах проявляется при активации клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Среди созданных человеком техногенных поллютантов, полихлорированные дибензодиоксины и дибензофураны и, в первую, очередь, тетрахлордибензо-р-диоксин считаются наиболее опасными [Федоров, 1993; Galio et al., 1991; Birnbaum et al., 2004]. ТХДД и родственные ему соединения являются высокоселективными лигандами арилуглеводородного (Ah) рецептора - лиганд-активируемого транскрипционного фактора, относящегося к суперсемейству ядерных orphan-рецепторов [Giguere, 1999]. Взаимодействие комплекса Ah-рецептор-лиганд с соответствующим отвечающим мотивом ДНК приводит к активации транскрипции ряда генов, в первую очередь генов изоформ цитохрома Р450- CYP1A1, CYP1А2, СYP1В1. Последствия этой индукции - изменение биотрансформации эндогенных липофильных биорегуляторных молекул, изменения редокс-статуса клеток, изменению активности внутриклеточных сигнальных систем, и транскрипционных факторов [Nebert et al., 2001]. Обнаружено, что AhR может образовывать гетеродимеры с другими регуляторными белками [Ge, Elferink, 1998; Tian et al., 1999]. Именно благодаря вмешательству в интимные механизмы поддержания внутри- и внеклеточного гомеостаза, ТХДД обладает столь широким спектром токсических эффектов - иммунотоксичностью, гепатотоксичностыо, дерматотоксичностью, канцерогенностью, токсическим влиянием на эндокринную систему и пр. Важно, что ТХДД, единожды попав в организм, затем длительно воздействует на биологический объект — период полувыведения это соединения, в зависимости от вида, колеблется от 10 до 20 лет.

Иммунная система (особенно развивающихся организмов) крайне чувствительна к ТХДД. Традиционно считается, что ТХДД вызывает иммуносупрессию. При введении экспериментальным животным ТХДД угнетает гуморальный и клеточный иммунные ответы, антибактериальную и противовирусную резистентность, а у людей, подвергшихся воздействию ТХДД, по данным ряда авторов, снижается антиинфекционная и противоопухолевая резистентность, развиваются аутоиммунные процессы, т.е. формируется вторичная иммунологическая недостаточность [Сибиряк и соавт., 2003]. Несмотря на многочисленные экспериментальные исследования, проводимые в когортах лиц, подвергшихся воздействию высоких концентраций ТХДД, механизмы воздействия ТХДД на иммунную систему остаются малопонятными. Это касается, в частности, влияния ТХДД на ключевые процессы, определяющие реактивность иммунокомпетентных клеток, - их позитивную и негативную активацию, т.е. пролиферацию и апоптоз. Баланс между этими процессами - ключевой принцип функционирования иммунной системы, - созревания и дифференцировки иммунокомпетентных клеток, регуляции силы и продолжительности иммунного ответа, поддержания аутотолерантности [Ярилин, 1996; Чередеев, Ковальчук, 1997; Krammer, 2000].

В отношении антипролиферативного эффекта ТХДД у исследователей сложилось достаточно единодушное мнение. Напротив, о характере влияния этого соединения на апоптоз клеток существуют полярные точки зрения, - ряд авторов описывает апоптогенный эффект ТХДД, другие - антиапоптогенный. Это связано, в частности, с использованием различных экспериментальных моделей, а характер влияния ТХДД на различные клетки может быть неодинаков. Так, описано, что ТХДД вызывает апоптоз клеток лимфобластоидных линий. Характер влияния ТХДД на лимфоциты периферической крови в условиях их физиологической стимуляции остается неизвестен. Сложность интерпретации результатов заключается еще и в том, что одни и те же рецепторы и сигнальные системы ответственны и за проведение апоптогенного стимула, и за проведение сигнала к митогенезу.

В первой серии экспериментов была использована традиционная модельная система, которая используется для оценки митогенеза и ииндуцибельности CYP1А1 в лимфоцитах-стимуляция клеток смесью митогенов (ФГА + MJT). ТХДЦ во всех экспериментах использовали в конечной концентрации 10 пМ, которая стандартно применяется в экспериментах in vitro и не оказывает прямого токсического действия на клетки. Обнаруженный в эксперименте характер реагирования лимфоцитов периферической крови здоровых доноров не отличался от результатов, описываемых другими исследователями - экспрессия CYP1A1-зависимой ЭРОД активности в покоящихся клетках была низкой, но нарастала при митогенезе клеток. При стимуляции митогенами нарастала активационно-индуцированная экспрессия Fas-рецептора и интенсивность активационного апоптоза. ТХДД мало влиял на покоящиеся клетки, но вызвал мощную индукцию CYP1A1, угнетал митогенез и активационный апоптоз, но активационно-индуцированная экспрессия Fas-рецептора оставалась неизменной. Причем характер изменения показателей митогенеза, ииндуцибельности CYP1A1 не зависел от уровня фоновой контаминации организма ТХДД, которую оценивали с помощью высокоэффективной хромато-масс спектрометрии.

Аналогичные результаты были получены и при анализе влияния ТХДД на митогенез периферических Т лимфоцитов при их физиологической активации через TCR с помощью анти CD3 МКА. Как и в первой серии экспериментов, ТХДД вызывал массивную индукцию CYP1А1, тестируемую по специфической ЭРОД активности, что сопровождалось резким увеличением содержания белка CYP1A1 в лимфоцитах. ТХДД мало изменял функциональное состояние нестимулированных лимфоцитов, снижая жизнеспособность клеток в культуре, и одновременно вызывая тенденцию к усилению их пролиферативной активности и, соответственно, активационного апоптоза. Этот эффект был нестабилен, воспроизводим не у всех доноров и ни один из использованных методических подходов не позволил получить статистически значимых различий.

Напротив, в культурах стимулированных антиСЭЗ МКА Т лимфоцитов, ТХДД проявлял отчетливое антипролиферативное действие, что было установлено как при использовании традиционного радиометрического метода, так и при анализе клеточного цикла с помощью проточной цитофлюорометрии. В клетках, подвергнутых воздействию диоксина нарастало содержание GO клеток и значимо снижалось содержание клеток, находящихся в G1 фазе клеточного цикла и митотически активных клеток. Это свидетельсвовало о том, что ТХДД действует уже на этапе перехода из пресинтетической фазы цикла. Наряду с ингибицией митогенеза, ТХДД вызывал угнетение интенсивности апоптоза, причем статистически достоверные различия были получены при оценке апоптоза методами, идентифицирующими апоптоз на этапе реализации эффекторных механизмов (интернуклеосомная деградация ДНК, выявляемая TUNEL-методом, метахроматическое окрашивание акридиновым оранжевым). При оценке терминальных фаз апоптоза (морфологическая оценка при окрашивании Hoechst 33342 и цитофлюорометрия окрашенных йодистым пропидием клеток) достоверных отличий получено не было. Одной из причин этого может быть то, что в использованной культуре мононуклеаров присутствуют фагоцитирующие клетки, поглощающие образующиеся апоптосомы. Кроме того, при окрашивании клеток йодистым пропидием, в анализируемый регион неизбежно попадают некротические клетки, число которых в присутствии ТХДД (судя по окрашиванию трипановым синим) статистически значимо нарастает. Последний факт не противоречив. Дисбаланс или арест клеточного цикла приводит к значительным нарушениям морфологии и биохимизма клеток, нарушению проницаемости клеточной мембран, вторичному некрозу или гибели, характер которой сложно идентифицируется [Shinohara, Nakano, 1993; Catchpoole, Stewart, 1993; Ueda et al., 1995; Vermes et al., 1997]. Кроме того, в литературе описана интернуклеосомная деградация клеток без последующей фрагментации ДНК и других признаков апоптоза [Schwart L. et al., 1993; Ueda et al., 1995; Zamai et al., 1996].

Анализ механизмов реализации апоптоза - внутриклеточной активности инициирующих и эффекторных Css показал, что митогенез лимфоцитов закономерно сопровождается повышением активности инициирующей Cs 8 и суммарной активности эффекторных Css 3, 7, 10, но не инициирующей Cs 9. Повышение активности Cs8 и Css 3,7,10 в митотически активных клетках связано не только с процессами апоптоза (судя по спектру активации Css - рецепторного). Наблюдения последних лет, свидетельствуют, что процессинг Cs3 необходим для митогенеза клетки, а блокада Cs3 ингибитором Z-VAD приводит к ингибированию митогенеза [Newton, Strasser, 2003].

ТХДД существенно снижал степень активации Cs8 и Cs3 в митотически активных лимфоцитах. Добавление в культуру антагониста Ah-рецептора ?-нафтофлавона резко угнетало диоксиновую индукцию CYP1A1, полностью восстанавливало митогенез, но активность Cs3 восстанавливалась не полностью. Это закономерно, поскольку в следующем опыте был получен неожиданный факт, - прямое ингибиторное влияние ТХДД на активность Cs3. Судя по полученным данным, угнетение апоптоза, наблюдаемое в культурах, содержащих ТХДД, связано с антипролиферативным эффектом ксенотоксиканта, который, в свою очередь, связан как с внутриклеточной "сверхиндукцией CYP1A1", так и с нарушением "митотической" функции каскада Css. Для активационного апоптоза при лигировании TCR, как и при воздействии любого митогена, необходим не только "первичный сигнал", но и сопряженная активация митоген-активируемых киназ и циклин-зависимых киназ. обеспечивающих полноценную параллельную реализацию не только митогенеза, но и программы апоптоза [Costas et al., 1996; Cottrez et al., 1997; Harvey et al., 1998; Yahata et al., 1999; Zhu et al., 1999]. Ko-инкубация активированных митогенами клеток с агентами, нарушающими нормальное прохождение клеточного цикла, приводит не только к увеличению содержания некротических клеток, но снижению интенсивности апоптотической гибели [Fenech et al., 2000], что и наблюдалось в наших экспериментах. Существенно, что при анализе клеточного цикла было выявлена преимущественная ингибиция диоксином апоптоза в GO > G1 фазе, т.е. в момент "выбора клеткой" программы активации. Все это свидетельствует о глубоком нарушении процессов, лежащих в основе нормального реагирования лимфоцита на активирующий стимул, что необходимо для адекватной реактивности специфических механизмов иммунорезистентности.

Как и в случае стимуляции лимфоцитов смесью митогенов, ТХДД не только не вызывал угнетения активационно-индуцированной экспрессии Fas-рецептора на активированных антиСОЗ МКА Т клетках, но более того, прослеживалась тенденция к ее усилению. Это было характерно и для популяции CD4+ Т хелперов, и для CD8+ цитотоксических Т лимфоцитов. В равной мере это касалось и экспрессии другого активационного антигена - рецептора к IL2. Таким образом, можно полагать, что ТХДД, несмотря на угнетение митогенеза, вызывал неадекватно высокую экспрессию активационных антигенов на мембране лимфоцитов. Этот факт хорошо согласуется с "активированным типом" иммунного статуса у лиц, характеризующихся высоким уровнем контаминации ТХДД [Курчатова, 1996], а также с результатами, полученными при иммунотропных эффектов другого индуктора цитохрома Р450 - бенз[а]пирена [Mudzinski, 1993]. Анализируя влияние ТХДД на экспрессию основных белков регуляторов апоптоза было обнаружено, что ТХДД вызывает гипоэкспрессию антиапоптогенного белка bcl-2 и снижает содержание лимфоцитов, экспрессирующих этот белок, причем этот эффект устраняется а-нафтофлавоном. Это неудивительно, поскольку bcl-2 и цитохром Р450 играют оппозитную роль в регуляции оксидантного статуса клетки [Dmitriev, 2000; Hildeman et al., 2003]. В то же время, несмотря на ингибицию апоптоза, ТХДД вызывал гиперэкспрессию р53. Этот факт не противоречив, так как р53 не обязательно индуцирует апоптоз, но способен блокировать циклин-зависимые киназы и вызывать лишь арест клеточного цикла [Agarwal et al., 1998].

Наиболее существенным представляется то, что вызываемые ТХДД нарушения пролиферативного ответа лимфоцитов, экспрессии рецепторного аппарата и белков регуляторов апоптоза приводят к изменению ответа клетки на апоптогенный сигнал. ТХДД резко усиливал апоптоз активированных Т лимфоцитов, индуцированный полуагонистическими aimiFas МКА, т.е. апоптоз инициируемый физиологическим сигналом через Fas-рецептор. Этот эффект был связан с индукцией CYP1A1, поскольку ингибировался а-нафтофлавоном. По нашему мнению, существенное значение в повышении чувствительности к рецепторному апоптозу имеет гипоэкспрессия bcl-2. Напротив, при индукции нерецепторного апоптоза ингибитором топоизомеразы I кампотецином, ТХДД ингибировал апоптоз. Это связано с антипролиферативный эффектом ТХДД -вещества, блокирующие митотический цикл при переходе из G0 в G1 фазу и ингибиторы циклин-зависимых киназ снижают чувствительность клеток к ингибиторам топоизомеразы [Park et al., 1997] .

Полученные результаты весьма важны для интерпретации механизмов развития вторичной иммунологической недостаточности, вызываемой ТХДД. Гиперреактивность рецепторных механизмов апоптоза, а следовательно и активационно-индуцированной клеточной смерти которая реализуется по Fasзависимому механизму [Sharma et al., 1999], может приводить к угнетению клональной экспансии Т лимфоцитов и усилению их делеции в ответ на антигенный стимул и формированию иммунологической недостаточности. Полученные нами в модельной системе активированных Т лимфоцитов результаты хорошо согласуются с данными других исследователей - иммуносупрессивный эффект ТХДД не идентифицировался у мышей, дефектных по системе Fas/FasL [Camacho et al., 2001; Dearstyne, Kerkliet, 2002].

Отечественный иммунофармаколог И.Е. Ковалев предположил, что иммунная система и ферментная система биотрансформации ксенобиотиков тесно взаимосвязаны, и образуют единую систему иммуно-химического гомеостаза организма [Ковалев и соавт.,1994]., В самом деле, цитохром Р450 является "химическим сенсором", контролирующим функционирование клеток иммунной системы в окружающей среде низкомолекулярных химических соединений [Сибиряк и соавт., 2003]. С этих позиций антипролиферативное действие ТХДД и повышенную реактивность на апоптогенный сигнал можно рассматривать как адаптивную, защитную реакцию клеток в условиях сверхиндукции цитохрома Р450.

Нет ясности в вопросе о влиянии ТХДД на пролиферативную активность и апоптоз в лимфоидных органах [Carlstedt-Duke, 1979; Carver et al., 1994; Kamath et al., 1997; Staples et al., 1998; Silverstone et al., 2000]. Так, к примеру, несмотря на то, что атрофия тимуса является основным биоиндикатором токсического влияния ТХДД, механизмы ее развития остаются непонятными. В экспериментах на крысах WAG/Rij ТХДД вводили однократно в дозе, обеспечивающей мощную индукцию цитохрома Р4501А1, что было документировано резким увеличением ЭРОД активности в микросомах печени. На 4 сутки оценивали пролиферативную активность и апоптоз в лимфоидных органах, используя метод метахроматического окрашивания клеток акридиновым оранжевым с последующей проточной цитофлюорометрией. Полученные результаты свидетельствовали о преобладающем воздействии ТХДД на лимфоидные ткани, характеризующиеся "митотическим" потенциалом. В тимусе ксенотоксикант проявляет отчетливое антипролиферативное и апоптогенное действие, в костном мозге — антипролиферативный эффект, во периферических лимфоидных органах (селезенка, лимфоузлы и периферическая кровь) - не влияет на пролиферативную активность и апоптоз клеток. Судя по полученным данным, механизмы атрофии тимуса при воздействии ТХДД мало связаны с апоптогенным влиянием на тимоциты (корреляция между массой органа и интенсивностью апоптоза отсутствует), но в большей степени зависят от ингибирующего влияния соединения на пролиферативную активность тимоцитов. В периферической крови ТХДД не вызывает существенных изменений субпопуляционной структуры лимфоцитов (содержания CD3+CD4+ и CD3+CD8+ лимфоцитов). В то же время, ТХДД ингибировал пролиферативный ответ лимфоузловых лимфоцитов (и активационный апоптоз) в условиях индукции митогенеза (в лимфоузловой модельной системе in situ), что, однако, не сопровождалось угнетением активационно-индуцированной экспрессии CD25 на CD3+ Т лимфоцитах. Судя по результатам, активированные клетки наиболее чувствительны к воздействию экотоксиканта, что подтверждают результаты исследователей, использовавших другие методические подходы [Pryputniewicz et al., 1998; Liebke et al., 2001].

Таким образом, супериндуктор цитохрома Р4501А1 ТХДД, изменяет реактивность иммунокомпетентных клеток и адекватный баланс между позитивной и негативной их активацией. Угнетая пролиферативный ответ лимфоцитов и интенсивность активационного апоптоза, ТХДД увеличивает интенсивность рецепторного апоптоза, что может быть связано с нарушением рецепции апоптогенного сигнала, механизмов регуляции апоптоза. Причем, эти эффекты связаны не только с внутриклеточной индукцией цитохрома Р450, но и с прямым влиянием на процессинг апоптогенного сигнала.

В следующей серии экспериментов была осуществлена оценка влияния ТХДД на пролиферативную активность и апоптоз клеток лимфоидных органов при однократном введении токсиканта в дозе, обеспечивающей основной его эффект - массивную индукцию цитохрома Р450 CYP1A1. Последнее было документировано анализом ЭРОД активности в микросомах печени. Эти исследования показали, что мишенью воздействия ТХДД являются лимфоидные органы с высоким митотическим потенциалом, - тимус и костный мозг. В тимусе ТХДД проявлял и антипролиферативный (увеличивал содержание тимоцитов, находящихся в пресинтетической фазе клеточного цикла, снижал содержание G1-тимоцитов и митотически активных клеток), и апоптогенный эффекты. Последнее возможно связано с тем, что гибель тимоцитов в процессе селекции осуществляется, в том числе и по механизму Fas-зависимого апоптоза [Ярилин, 1999; Sharma et al., 1999]. В костном мозге ТХДД проявлял только антипролиферативное действие. Интересно, что, несмотря на угнетение пролиферативной активности клеток первичных лимфоиджных органов, существенного нарушения количественных показателей гемограммы и субпопуляционной структуры Т лимфоцитов периферической крови в данные сроки наблюдения (4-е сутки после введения ТХДД) мы не выявили, что можно обяснить мобилизацией компенсаторных механизмов. Клетки периферических лимфоидных органов были резистентны к воздействию экотоксиканта, однако, при активации клеток (введение митогена КонА в регионарный лимфоузел), ТХДД, как и в системе in vitro, проявлял иммунотоксический эффект, угнетая митогенный ответ лимфоцитов.

Иммунная система является индикаторной системой экологического неблагополучия, наиболее чутко реагирующей на воздействие неблагоприятных факторов [Черешнев, 2004]. В первую очередь это касается техногенных ксенобиотиков-поллютантов, число которых постоянно возрастает. Механизмы формирования экологически обусловленных иммунодефицитных состояний (ЭОВИДС) зависят с одной стороны от специфической биологической активности соединения, с другой, - от последствий взаимодействия этого соединения с "химическим сенсором" - системой цитохром Р450-зависимых монооксигеназ. В настоящее время предполагают, что основная мишень действия ТХДД, - Ah-R и контролируемые этим транскрипционным фактором гены (в первую очередь CYP1A1), являются основной системой, контролирующей внутриклеточныфй сигналлинг при клеточном стрессе [Nebert et al., 2001; Matsumura, 2003]. Вскрытие этих механизмов позволит глубже понять патогенез формирования индуцированной ксенобиотиками иммунологической недостаточности, а следовательно будет в значительной мере способствовать разработке адекватных мер профилактики и терапии