Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Влияние озонированного физраствора на состояние иммунитета у больных раком молочной железы

На правах рукописи

МИХАЙЛОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

ВЛИЯНИЕ ОЗОНИРОВАННОГО ФИЗРАСТВОРА НА СОСТОЯНИЕ ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.03.09 -клиническая иммунология, аллергология 14.01.12- онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2010

003492529

Работа выполнена в ГОУ ВПО Нижегородской государственной медицинской академии

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Новиков Виктор Владимирович доктор медицинских наук, профессор Алясова Анна Валерьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Евсегнеева Ирина Валентиновна доктор медицинских наук, профессор Шишкин Юрий Владимирович

Ведущая организация: ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Росмедтехнологий.

Защита диссертации состоится «_»_2010 г. в _часов на

заседании диссертационного совета Д.208.040.08 при ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова по адресу: 119991, Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова ( 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49 ).

Автореферат разослан « ^ » 2010

года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Миронов Андрей Юрьевич

Актуальность проблемы. Рак молочной железы занимает первое место по распространенности среди онкологических заболеваний у женщин репродуктивного возраста и третье место среди общей популяции населения, уступая по частоте только злокачественным новообразованиям легких и желудка. В России эта форма рака занимает 3-е место среди причин смерти женского населения (после болезней системы кровообращения и несчастных случаев) во всех возрастных группах, составляя в среднем 2,2%, а в возрасте 35-54 лет - 7,7% (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2008; Колядина И.В., 2009; РеЕгат М., й а1., 2007; Ра1теп Ь., 2008). По данным ВОЗ ежегодное число вновь зарегистрированных случаев рака молочной железы в мире приближается к миллиону. За последние 10 лет ежегодный прирост заболеваемости составил 5,8%, причем наиболее высокие уровни заболеваемости отмечены в возрастных группах старше 60 лет. Ежедневно в России регистрируется 102 женщины с впервые установленным диагнозом РМЖ, причем у 56% из них отмечаются III-IV стадии заболевания. Около 30% больных от всех зарегистрированных случаев РМЖ погибают от основного заболевания в течение 10 лет (Ввозный Э.К. и др., 1996; Хайленко В.А. и др., 2005).

Частота встречаемости рака молочной железы, его многообразие, длительная и часто стойкая нетрудоспособность больных, трудности в лечении данной патологии определяют актуальность, медико-социальную значимость заболевания, обусловливают необходимость поиска новых дополнительных методов его лечения и профилактики.

Более 70% женщин, страдающих раком молочной железы, получают комплексное лечение (Гене Г.П. и др., 2003; Давыдов М.И., Летягин В.П., 2007). Важнейшими его компонентами являются лекарственная терапия и лучевая терапия. Дальнейшая разработка и совершенствование принципов ведения больных раком молочной железы и их реабилитация невозможны без углубленного изучения патогенеза опухолевого роста. В настоящее время важная роль в патогенезе злокачественных новообразований отводится нарушениям функционирования иммунной системы организма. Существует

множество лекарственных иммуномодулирующих препаратов, использование которых в клинике сопряжено со значительными трудностями: их дороговизна и выраженные побочные явления в ходе лечения. В то же время остаются мало изученными немедикаментозные методы коррекции иммунной системы. Одним из таких методов является применение озонированного физиологического раствора (Алясова A.B. и др., 2006), влияние которого на показатели иммунной системы мало изучено. Представляется целесообразным исследовать действие озонированного физраствора на иммунный статус больных раком молочной железы.

Цель. Исследовать механизмы влияния низких терапевтических концентраций озона на состояние иммунитета у больных раком молочной железы.

Задачи:

1. Изучить популяционный состав мононуклеарных клеток периферической крови больных, получавших наряду со стандартной терапией низкие терапевтические дозы озона.

2. Определить характер изменения сывороточного содержания растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы у больных, получавших озонированный физраствор.

3. Выявить особенности клеточного иммунитета больных, имеющих разные сроки выживаемости и частоту встречаемости рецидивов.

Научная новизна. Впервые представлены и охарактеризованы пусковые механизмы действия низких терапевтических концентраций озона на организм человека, связанные с его влиянием на процессы Fas-зависимого апоптоза иммуноцитов. Впервые выявлено, что низкие терапевтические концентрации озона нормализуют у больных раком молочной железы повышенную сывороточную концентрацию растворимого Fas антигена и растворимых

молекул HLA I класса, обеспечивая более эффективную работу противоопухолевого клеточного иммунитета, клинически что проявляется в возрастании эффективности противоопухолевой терапии, увеличении продолжительности жизни и в повышении качества жизни больных, достоверно меньшей частоте встречаемости лейкопений. Обнаружено нормализующее влияние озонотерапии на повышенное относительное содержание Fas+ мононуклеарных клеток периферической крови, количество которых не возрастает в еще большей степени, как это впервые показано для CD71+ клеток, а снижается. Выявлен специфический характер действия озонотерапии, приводящий и к активации иммунной системы, и к ограничению Fas-зависимой инициации апоптоза иммунокомпетентных клеток.

Практическая значимость работы. Применение озонотерапии в составе комплексного лечения позволяет увеличить общую и безрецидивную выживаемость пациенток и улучшить качество их жизни, уменьшает выраженность побочных токсических эффектов противоопухолевой терапии и позволяет проводить ее с запланированной интенсивностью.

Выявлено потенцирующее действие озонированного физраствора в отношении противоопухолевого эффекта цитостатиков, одним из механизмов которого является торможение CD95+ -опосредованного апоптоза активированных Т- и В-лимфоцитов.

Показана возможность использования мониторинга сывороточного уровня растворимого CD38 антигена для прогнозирования общей и безрецидивной выживаемости больных.

Положения, выносимые на защиту:

1. Низкие терапевтические концентрации озона способствуют нормализации уровня растворимого Fas антигена и молекул HLA I класса в сыворотке крови больных раком молочной железы.

2. Применение озонотерапии на фоне комплексного лечения приводит к

повышению в крови относительного содержания мононуклеарных клеток, несущих активационные антигены (CD71+, CD38+, CD50+, HLA-I+) на фоне нормализации повышенного уровня CD95+ клеток. 3. Использование озонированного физиологического раствора приводит не только к активации иммунной системы больных, но и ограничивает Fas-зависимый апоптоз иммунокомпетентных клеток, что потенцирует эффективность противоопухолевой терапии.

Внедрение. По результатам работы опубликовано информационно-методическое письмо, предназначенное для врачей-онкологов, терапевтов, хирургов, гинекологов.

Апробация работы. Результаты работы представлены на X Всероссийском онкологическом конгрессе (Москва, 2006), 18-ой Международной конференции по озотерапии (Гавана, 2007), на заседаниях Нижегородского общества рентгенологов и онкологов в 2007, 2008 гг., на VII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественнные противоопухолевые препараты» (Москва, 2008).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 41 таблицу, 10 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, двух глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Список литературы содержит 52 отечественных и 152 иностранных источников.

Материалы и методы. В работе использованы образцы крови 158 больных раком молочной железы (РЖМ) в возрасте 35-65 лет, проходивших лечение на базе Нижегородского областного онкологического диспансера, с гистологически подтвержденным диагнозом заболевания, и их амбулаторные карты. На основании клинико-инструмен-тального обследования больных и с учетом шспсирургической классификации РМЖ у 73 больных (46,2%) была зарегитрирована III стадия, у 85

больных (53,8%) - IV стадия процесса.

Использование озонированного физиологического раствора на фоне комплексного и комбинированного лечения явилось одним из компонентов системы индивидуально-интегративной восстановительной терапии больных раком молочной железы. Пациентки были разделены на 6 групп:

1 группа - 48 женщин, страдающих местнорасиространеиным (МР) или метастатическим (МТ) РМЖ, получивших адъювантные или лечебные курсы полихимиотерапии (ПХТ) в сочетании с озонированным физиологическим раствором;

2 группа - 54 больных МР и МТ РМЖ, получавших только адъювантные и лечебные курсы ПХТ;

3 группа - 15 больных МР и МТ РМЖ, получавших адъювантные и лечебные курсы ПХТ и неозонированный физиологический раствор;

4 группа - 16 женщин, страдающих МР РМЖ, получавших неоадъювантную ПХТ и озонированный физиологический раствор (ОФР);

5 группа - 15 больных МР РМЖ, получавших только неоадъювантную ПХТ;

6 группа - 10 больных МР РМЖ, получавших неоадъювантную ПХТ и неозонированный физиологический раствор (НФР);

Первая-третья, четвертая-шестая группы были сопоставимы по возрасту, сопутствующей патологии и размеру первичного очага.

Применялись внутривенные инфузии ОФР, концентрация озона в озоно-кислородной смеси подбиралась индивидуально, на основании предварительно полученных анализов гемограммы, иммунного статуса, антиоксидантной системы защиты (АСЗ) и перекисного окисления липидов (ПОЛ). Для получения озона использовался серийный отечественный озонатор фирмы «Квазар» (Н.Новгород). Применялась методика введения ОФР на фоне ПХТ, разработанная сотрудниками Нижегородской государственной медицинской академии (патент на изобретение «Способ лечения местнораспространенного рака молочной железы в

предоперационном периоде (варианты)» № 2207862 от 10.07.03).

Контрольную группу составили образцы крови 30 здоровых женщин, сопоставимых по возрасту с обследованными больными. Все образцы крови были получены из Железнодорожной станции переливания крови г. Нижнего Новгорода вне периода эпидемии гриппа и протестированы на отсутствие маркеров вирусных гепатитов В и С, сифилиса и ВИЧ-инфекции.

Иммунофенотипирование мононуклеарных клеток периферической крови проводили в реакции непрямой иммунофлуоресценции с помощью моноклональных антител (МКА)ИКО-160 против CD95 (Fas) антигена, ИКО-20 против CD38 антигена, МКА ИКО-бО против CD50 антигена, МКА ИКО-53 против альфа-цепи молекул HLA I класса и МКА ИКО-92 против CD71 антигена.

Сывороточное содержание растворимых CD95, CD50 и CD38 антигенов определяли иммуноферментным методом с помощью поликлональных антител против поверхностных антигенов мононуклеарных клеток периферической крови человека и меченых пероксидазой хрена МКА ИКО-160, МКА ИКО-бО и МКА ИКО-20, соответственно. Для определения сывороточного уровня растворимых антигенов главного комплекса гистосовместимости I класса использовали МКА ИКО-53 против альфа-цепи молекул HLA I класса и меченые пероксидазой корня хрена МКА ИКО-216 против ß2-M и кро глобул и на. Моноклональные антитела были получены в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН, г. Москва (Барышников А.Ю.).

Математическая обработка результатов исследования осуществлялась с применением пакетов статистических программ STADIA 4.51 и пакета STATISTICA 5.0. Использовались параметрические и непараметрические критерии. При проведении множественных сравнений учитывалась поправка Бонферрони. Различия считались достоверными при р<0,05.

Вычисление значимости различий долей (процентов) производилось по методу углового преобразования Фишера.

Результаты н их обсуждение. Во всех обследованных группах больных раком молочной железы относительное содержание CD38+ клеток было повышено более чем в 2 раза в сравнении с нормой. Относительное содержание CD38+ мононуклеарных клеток снижалось после окончания терапии у больных, которые затем на протяжении трех лет имели прогрессирование заболевания. У больных, проживших без рецидивов 3 года после завершения лечения, содержание CD38+ клеток не изменялось. Снижение уровня тестированных клеток у больных с рецидивами свидетельствовало о развитии у них иммуносупрессии, что, вероятно, являлось одной из причин прогрессирования заболевания. Заметим, что прогрессирование во время терапии происходило преимущественно у больных, получавших полихимиотерапию без озонотерапии. Применение озонотерапии на фоне лекарственного лечения не сопровождалось прогрессированием опухолевого процесса. Это свидетельствует о положительном влиянии озонотерапии, в основе которого, вероятно, лежит активация иммунной системы.

Выявлено, что озонотерапия, проводимая на фоне полихимотерапии, вызывает уменьшение изначально повышенного относительного содержания Fas4 мононуклеарных клеток периферической крови (р<0,05) (Рис. 1). Известно, что экспрессия Fas антигена на мембране клеток приводит к потенциальной готовности последних к реализации апоптоза и, в конечном счете, может вызвать снижение количества активированных иммунокомпетентных клеток. Кроме того, Fas антиген относится к активационным антигенам. Он может появляться на мембране активированных Т-лимфоцитов и обеспечивать инициацию Fas-зависимого апоптоза. Уменьшение исходно увеличенного количества клеток, положительных по Fas антигену, приводит к нормализации относительного содержания лимфоцитов, потенциально подверженных Fas-опосредованному апоптозу. Озонированный физраствор оказывает, таким образом, модифицирующее действие на содержание потенциально способных к инициации апоптоза иммунокомпетентных клеток, создавая условия для

сохранения популяции эффекторных клеток, необходимых для реализации противоопухолевого клеточного иммунитета.

55 -| 50 -45 -40 -35 -30 25 -20 -15 -10 -5 -0 -

3 4 5

Группы больных

норма

Рис. 1. Относительное содержание С095+ мононуклеарных клеток периферической крови больных раком молочной железы до и после

терапии

М До лечения После лечения

* - статистически достоверные различия до и после терапии (р<0,05); ** - статистически достоверные различия между группами больных (р<0,05). ▲ - различия статистически достоверны по сравнению с контрольной группой (р<0,05);

А А- различия статистически достоверны по сравнению с контрольной группой (р<0,05).

Подтверждением вышеприведенного действия озонированного физиологического раствора на механизмы инициации апоптоза служит озонозависимый характер изменения содержания Fas+ клеток в крови больных, имевших и не имевших рецидивы на протяжении последующих трех лет жизни. Содержание Fas+ мононуклеарных клеток периферической крови у лиц, имевших трехлетнюю безрецидивную выживаемость, статистически достоверно снижалось после терапии с применением озона (табл. 1).

Таблица 1

Относительное содержание С095+ мононуклеарных клеток периферической крови у больных раком молочной железы в зависимости от наличия

рецидивов (%)

Сроки исследо вания Озонированный физиологический раствор и полихимиотерапия Полихимиотерапия

Отсутствие рецидивов, п=18 Наличие рецидивов п=28 Отсутствие рецидивов п=9 Наличие рецидивов, п=34 Прогрессирова ние в процессе лечения, п=11

До терапии 34,7 ± 1,1х 33,2 + 1,2х 34,1 ± 1,9х 32,2 ± 1,0х 30,8 + 0,8х

После терапии 26,4 ± 0,8* 27,3 ± 1,4* 28,8+2,6* 37,9+1,3*,*, (** 1-4,24,3-4) 34,5±0,9ХД (** 1-5,2-5,35,4-5)

* - различия достоверны в пределах одной группы (р<0,05),

** - различия достоверны при сравнении разных групп между собой (р<0,05).

х - различия достоверны при сравнении с группой здоровых лиц (р<0,05).

Заметим, что количество рецидивов у выживших в течение трех лет больных, получавших полихимотерапию и озонотерапию, было статистически достоверно меньше, чем у больных, не получавших озонированного физиологического раствора в процессе химиотерапии. Еще одним свидетельством нормализирующего действия озонотерапии на относительное содержание Fas+ клеток служат статистически достоверные различия в содержании этих клеток у больных, вышедших в ремиссию после лечения цитостатиками и озонированным физиолог ическим раствором, в сравнении с вышедшими в ремиссию больными, не получавшими озона (табл. 2). Если в первой группе больных терапия приводила к уменьшению количества Fas+ клеток в периферической крови, то во второй группе тестированный показатель не менялся. В тех случаях, когда у получавших полихимиотерпию и озонотерапию пациенток были зарегистрированы только

кратковременные ремиссии, относительное содержание Раэ* клеток также не менялось. Однако у больных, не получавших озонотерапии, кратковременные ремиссии были ассоциированы с тенденцией к повышению количества СБ95-антигенположительных клеток. Заметим, что при использовании цитостатиков в сочетании с озонотерагшей ремиссия была зарегистрирована намного чаще, чем после стандартной полихимиотерапии.

Таблица 2

Относительное содержание СБ95+ мононуклеарных клеток в зависимости от длительности периода ремиссии заболевания

Сроки исследов ания Озонированный физиологический раствор и полихимиотерапия Полихимиотерапия

Длитель ная ремиссия, п=35 Короткая ремиссия, п=11 Длитель ная ремиссия, п=9 Корот кая ремиссия, п=34 Профессиро вание в процессе лечения, п=11

До терапии 34,7±2,Г 33,8+2,4х 32,9±1,4Х 31,0±4,5Х 30,8±0,8Х

После терапии 26,4+0,9* 31,5+1,2х' (**1-2) 32,7+2,5 х-(**1-3) 33,512,1х-(**1-4) 34,5+ ,9х,*, (** 1-5)

* - различия достоверны в пределах одной группы (р<0,05),

** - различия достоверны при сравнении разных групп между собой (р<0,05).

В скобках приведены номера групп.

х - различия достоверны при сравнении с группой здоровых лиц (р<0,05).

Таким образом, нормализация относительного содержания Раз+ клеток происходила только при применении полихимиотерапии, дополняемой озонотерапией. Кроме того, данная схема лечения сопровождалась менее частыми рецидивами и более частыми выходами в ремиссию, чем стандартная полихимиотерапия больных.

Изучено влияние полихимиотерапии и терапии озонированным физиологическим раствором на относительное содержание в крови мононуклеарных клеток, несущих на мембране CD50 и CD71 антигены, а также на относительное количество выявляемых в реакции непрямой иммунофлуоресценции мононуклеарных клеток, положительных по антигенам HLA I класса. Озонотерапия вызывала статистически достоверное повышение относительного содержания CD50+ клеток у больных, проживших 3 года и более. Статистически достоверное повышение относительного содержания CD50+ клеток было выявлено также при анализе показателей иммунограмм больных, получавших в составе комплексного лечения озонотерапию, вышедших затем в ремиссию заболевания и не имевших рецидивов. Стандартная полихимиотерапия такими изменениями в уровне тестированных клеток не сопровождалась.

Исследование относительного содержания мононуклеарных клеток, на мембране которых в реакции непрямой иммунофлуоресценции с помощью люминесцентной микроскопии выявлялись молекулы HLA I класса, показало, что терапия во всех случаях приводила к небольшому, но статистически достоверному повышению количества HLA-I+ клеток. Подобный эффект, по-видимому, связан с действием стандартной полихимиотерапии и не является отражением влияния озонотерапии на состояние иммунной системы. Обнаружено, что у больных, живущих три и более года после завершения лечения, включающего озонотерапию, происходило статистически достоверное повышение относительного содержания CD71+ мононуклеарных клеток периферической крови.

Таким образом, наряду с изменением относительного количества Fas+ мононуклеарных клеток периферической крови, применение у больных раком молочной железы цитостатиков и озонотерапии приводило к повышению уровня CD50+ и CD71+ клеток. Известно, что мембранный CD50 антиген участвует в инициации иммунного ответа на стадии формировании адгезивных взаимодействий между клетками и образования иммунного синапса (Woska J.R.

et al., 1998; Bleijs D.A. et al., 2001). В свою очередь, CD71 антиген является рецептором трансферрина на клетках и служит активационным маркером лимфоцитов или активационным антигеном, появляясь на поверхности клетки в результате ее активации (Barclay A.N. et al., ] 993).

Повышение количества CD50+ клеток в крови онкологических больных под воздействием озонированного физиологического раствора свидетельствует о его влиянии на этап инициации адаптивного противоопухолевого иммунного ответа. Результатом такого воздействия является повышение количества активированных лимфоцитов, что отражается в обнаруженном нами увеличенном уровне CD71+ клеток. Необходимо отметить, что кроме CD71 антигена существует несколько других активационных антигенов, в том числе и Fas антиген. Однако в условиях воздействия озонированного физиологического раствора количество Fas+ клеток не возрастает, как это показано для CD71+ клеток, а снижается. Различия в направленности изменений экспрессии активационных антигенов CD71 и CD95 вероятно обусловлены специфическим характером действия озонотерапии, приводящей, с одной стороны, к активации иммунной системы, а, с другой - к ограничению Fas-зависимой инициации апоптоза иммунокомпетентных клеток.

Наряду с определением популяционного состава мононуклеарных клеток периферической крови больных исследован сывороточный уровень растворимых форм ряда мембранных антигенов клеток иммунной системы. Сывороточное содержание растворимых CD38 и CD50 антигенов во всех группах больных раком молочной железы статистически достоверно повышалось или имело выраженную тенденцию к повышению до и после лечения по сравнению с контролем. Однако, достоверных различий между больными, получавшими и не получавшими озонированный раствор, не было выявлено. Тем не менее, обнаружено, что у больных с рецидивами на протяжении трех лет после проведенной терапии, имело место более

U/ml

1 2 3 4 5 6 норма

Группы больных

Рис. 2. Изменение сывороточного содержания растворимого С038

антигена у больных раком молочной железы до и после терапии

И До лечения ¡^ После лечения * - статистически достоверные различия по сравнению с нормой (р<0,05).

Таблица 3

Сывороточное содержание растворимого С 1)38 антигена

в зависимости от исхода заболевания, ll/ml

Сроки тестирова ния Озонированный физиологический раствор и полихимиотерапия Полихимиотерапия

Выживаемость

более 3 лет, п=22 менее 3 лет, п=26 более 3 лет, п=9 менее 3 лет, п=45

До терапии 623,9± 118,6* 675,4+ 114,5* 645,9+126,2* 677,5+124,7*

После терапии 573,2±84,3* 830,2±112,2*, (**1-2) 750,9+194,3* 873,7±148,2*, (**1-4)

* - различия достоверны при сравнении с показателями здоровых лиц, (р<0,05),

** - различия достоверны при сравнении разных групп между собой, (р<0,05). высокое сывороточное содержание растворимого СБ38 антигена в

сравнении с безрецидивными больными независимо от примененной схемы лечения (рис. 2, табл. 3).

У больных раком молочной железы выявлено также повышение сывороточного содержания растворимого CD95 антигена (Рис. 3), что соответствует литературным данным (Новиков В.В., Алясова A.B., Уткин О.В. и др., 2005). Применение озонированного физиологического раствора совместно с полихимиотерапией, проводимой с лечебной или адъювантной целью, у больных, страдающих раком молочной железы, сопровождалось тенденцией к нормализации после курса лечения среднего сывороточного уровня sFas антигена. У пациенток, получавших только адъювантные и лечебные курсы полихимиотерапии, имела место не нормализация, а повышение концентрации s-формы Fas антигена.

Такой же характер изменения содержания растворимого белка прослеживался в сыворотке крови больных, получавших адъювантные и лечебные курсы цитостатической терапии и неозонированный физиологический раствор. В сыворотке крови больных, получавших озонотерапию и имевших рецидивы на протяжении последующих трех лет жизни, прослеживалась тенденция к снижению содержания sFas антигена, уровень sFas антигена после лечения не отличался от нормы. В то же время в сыворотке крови больных, получавших стандартную полихимиотерапию и имевших рецидивы на протяжении трех лет жизни, содержание sFas антигена после завершения лечения оставалось достоверно выше нормы (р<0,05).

Снижение избыточного, относительно показателей здоровых лиц, содержания sFas антигена можно рассматривать в качестве положительного эффекта действия озонированного физиологического раствора. Известно, что растворимый Fas антиген способен ингибировать Fas-зависимый апоптоз иммунокомпетентных клеток (HosakaN.,1998; Hiromatsu Y. et al., 1999).

U/ml

1 2 3 4 5 6 норма

Группы больных

Рис. 3. Сывороточное содержание растворимой формы СБ95 антигена

у больных раком молочной железы до и после терапии

¡И До лечения ££ После лечения

• - достоверность различий между группами (р<0,05); ▲ - различия достоверны до и после терапии (р<0,05);

* - различия достоверны по сравнению с нормой (р<0,05).

Одновременно, повышенная концентрация «Рае антигена является одним из факторов, обеспечивающих уход опухолевых клеток от иммунного надзора, путем блокады цитотоксического действия РаьР-положительных Т-лимфоцитов. Коррекция повышенной концентрации б Раз антигена обеспечивает, таким образом, нормализацию подавленных при формировании опухоли иммунных реакций, создавая условия для более полноценной реализации механизмов противоопухолевого иммунитета, потенцируя цитотоксическое действие химиопрепаратов и обеспечивая более эффективную терапию онкологических больных.

В пользу высказанного механизма действия озонированного физиологического раствора могут служить достоверно более высокие показатели выживаемости в группах больных, получавших ОФР. У больных,

проживших 3 года с момента окончания тестирования, выявлена нормализация сывороточного уровня sFas антигена после курса лечения с применением химиопрепаратов и озонированного физиологического раствора. Подобным образом нормализовался уровень sFas антигена и у больных, проживших 3 года с момента окончания исследования, но не получавших озонотерапию. Однако в этом случае не было выявлено статистически достоверных различий между концентрациями sFas антигена до и после лечения. Это свидетельствует о более выраженной нормализации сывороточного содержания sFas антигена после совместного применения химиотерапии и озонотерапии. Заметим, что клинически эти различия были ассоциированы со статистически достоверно более высоким показателем трехлетней выживаемости больных (табл. 4).

Таблица 4

Сывороточное содержание растворимого CD95 антигена

при разных сроках выживаемости, (U/ml)

Сроки тестирова ния Озонированный физиологический раствор и полихимиотерапия Полихимиотерапия

Выживаемость

более 3 лет, п=22 менее 3 лет, п=26 более 3 лет, п=9 менее 3 лет, п=45

До терапии 690,7 ±148,Г 743,4 ± 180,8х 695,2 ± 264,5х 1018,8 ±240,7"

После терапии 357,7 ±94,8* 479,2 ± 120,8 411,6± 101,5 1371,5 ± 254,8*, (** 1-4,2-4,3-4)

* - различия достоверны в пределах одной группы (р<0,05),

** - различия достоверны при сравнении разных групп между собой, (р<0,05).

В скобках приведены номера групп.

х - различия достоверны при сравнении с показателями здоровых лиц, (Р<0,05).

Наряду с изменением сывороточной концентрации растворимого Fas

антигена у больных, получавших озонированный физиологический раствор в сочетании с полихимиотерапией, обнаружена нормализация изначально повышенного сывороточного уровня растворимых молекул НЬА 1 класса (Рис. 4).

U/ml

1 2 3 4 5 6 норма

Группы больных

Рис. 4. Изменение сывороточного содержания растворимых молекул HLA I класса у больных раком молочной железы

* - статистически достоверные различия в сравнении с нормой (р<0,05) Д До лечения ^ После лечения

Химиотерапия, не сопровождавшаяся озонотерапией, вызывала не снижение, а нарастание концентрации молекул sHLA-I. Их содержание было статистически достоверно выше уровня, характерного для больных, получивших озонотерапию и ПХТ, и выше нормы.

Известно, что растворимые молекулы HLA 1 класса, взаимодействуя с мембранным CD8 антигеном, вызывают апоптоз цитотоксических Т-лимфоцитов. Инициация апоптоза осуществляется через индукцию аутосекреции растворимого Fas-лиганда. Последний вызывает Fas-

зависимую гибель активированных Fas-положительных цитотоксических Т-лимфоцитов, несущих на мембране CD8 антиген. Кроме того, растворимые молекулы sHLA-I способны вызывать апоптотическую гибель натуральных киллеров, которые, подобно С08-положительным цитотоксическим Т-лимфоцитам, служат важными эффекторами противоопухолевого иммунитета (Zavazara N., Kronke М., 1996). Снижение сывороточной концентрации растворимых молекул HLA I класса при использовании озонированного физиологического раствора является, таким образом, звеном механизма нормализации апоптотических процессов, касающихся активированных Т-клеток.

Таблица 5

Содержание растворимых молекул HLA-I у больных с разными сроками выживаемости, U/ml

Сроки тестирова ния Озонированный физиологический раствор и полихимиотерапия Полихимиотерапия

Выживаемость

более 3 лет, п=22 менее 3 лет, п=26 более 3 лет, п=9 менее 3 лет, п=45

До терапии 1250,5±110,9х 1166,1±194,7 1128,3± 186,1 1245,6±270,6Х

После терапии 969,3±101,9* 1570,1±308,8", (**1-2) 1618,1±356,6Х ,(**1-3) 1738,8±340,5Х, (**1-4)

* - различия достоверны в пределах одной группы (р<0,05),

** — различия достоверны при сравнении групп между собой, (р<0,05).

В скобках приведены номера групп.

х - различия достоверны при сравнении с показателями здоровых лиц, (р<0,05).

У женщин, достигших трехлетней ремиссии и получавших озонированный физраствор, имела место нормализация уровня молекул бНЬА-!. Заметим, что у больных, получавших озонотерапию, но проживших

менее трех лет, сывороточный уровень молекул эНЬА-1 повышался. У больных, не получавших озонотерапию, содержание молекул бНЬА-! статистически достоверно увеличивалось, независимо от сроков выживаемости (табл. 5).

Таким образом, применение озонированною физиологического раствора сопровождалось изменениями, свидетельствующими о коррекции механизмов инициации программированной гибели эффекторных клеток иммунной системы, приводящими к нормализации клеточного противоопухолевого иммунитета, что способствовало более эффективной полихимиотерапии.

ВЫВОДЫ

1. Озонотерапия больных раком молочной железы совместно с полихимиотерапией приводит к нормализации изначально повышенного сывороточного уровня растворимого СЭ95 антигена и растворимых молекул НЬА I класса, что можно рассматривать в качестве положительного эффекта действия озонированного физиологического раствора.

2. Использование озонотерапии в составе комплексного лечения приводит к снижению до уровня нормы изначально повышенного содержания С095+ мононуклеарных клеток периферической крови и повышению относительного содержания С071+ клеток и С050+ клеток, что свидетельствует об инициации противоопухолевого иммунитета и ограничении числа иммунокомпетентных клеток, потенциально подверженных Раз-зависимому апоптозу.

3. Применение озонированного физиологического раствора на фоне полихимиотерапии не оказывает влияния на сывороточное содержание растворимых молекул С038 и С050 у больных раком молочной железы. У больных раком молочной железы, проживших менее трех лет, относительное содержание СБ38+ клеток снижается после терапии независимо от примененных схем лечения, что указывает на возможное прогностическое

значение данного показателя, отражающего уровень активизации иммунной системы.

4. Исследование относительного содержания мононуклеарных клеток периферической крови, на мембране которых в реакции непрямой иммунофлуоресценции с помощью люминесцентной микроскопии выявляются молекулы НЬА I класса, показало, что как озонотерапия на фоне полихимиотерапии, так и стандартная полихимиотерапия сопровождаются повышением количества НЬА-Г клеток.

5. Достижение трехлетней выживаемости пациенток, получавших в составе комплексного лечения озонированный физиологический раствор, сопровождается достоверным повышением относительного количества СБ71+ и С050+ мононуклеарных клеток периферической крови, что не наблюдается у больных, проживших менее трех лет.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Включение озонированного физиологического раствора с низкими терапевтическими концентрациями озона (100-200мкг/л) в состав комплексного лечения больных раком молочной железы позволяет улучшить качество жизни больных, уменьшить токсичность и повысить эффективность цитостатиков, создать оптимальные условия для проведения химиотерапии, что в конечном итоге проявляется увеличением общей и безрецидивной выживаемости пациенток.

Сывороточное содержание растворимого СБ38 антигена и относительное количество СБ38+ мононуклеарных клеток периферической крови может быть использовано в качестве прогностического показателя продолжительности жизни больных раком молочной железы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алясова A.B., Конторщикова К.Н., Новиков В.В., Михайлова Е.М., Барышников А.Ю., Караулов A.B. Модуляция сывороточного уровня растворимого CD95 антигена и содержания CD95+ клеток крови при введении озонированного физраствора больным раком молочной железы. //Материалы X Всероссийского онкологического конгресса, 2006. С. 166166.

2. Алясова A.B., Конторщикова К.Н., Новиков В.В., Михайлова Е.М., Барышников А.Ю., Караулов A.B. Влияние озонотерапии на сывороточный уровень растворимого CD95 антигена и содержание CD95+ клеток при раке молочной железы. // Российский биотерапевтический журнал, 2006, № 3. Т. 5, С. 5-10.

3. Михайлова Е.М. Апоптоз в интернете. // Нижегородский медицинский журнал, 2006, №8. С. 276-279.

4. Алясова A.B., Конторщикова К.Н., Новиков В.В., Михайлова Е.М., Барышников А.Ю., Караулов A.B. Динамика сывороточной концентрации растворимого CD95 антигена и содержания CD95+ клеток у больных раком молочной железы под влиянием озонотерапии. // Общая реаниматология, 2006, Т. 2, №4/1. С. 243-246.

5. C.Kontorschikova, A.AIasova, V.Novikov, E.Mikhailova, A.Baryshnikov. Effect of ozonated saline on serum level of CD95 soluble antigen with breast cancer. // Материалы 18 Международной конференции по озонотерапии, Гавана, 2007. С. 45-45.

6. Новиков ВВ., Алясова A.B., Конторщикова К.Н., Михайлова Е.М., Барышников А.Ю., Караулов A.B. Молекулярно-иммунологические механизмы терапевтического действия озона при раке молочной железы. II Вестник Нижегородского университета им. Н.И.Лобачевского, 2007, № 5. С.68-74.

7. Алясова A.B., Пегов Р.Г., Михайлова Е.М., Новиков В.В., Барышников А.Ю.

Содержание растворимой формы молекул HLA I класса в сыворотке крови больных раком молочной железы и легкого. // Российский биотерапевтический журнал, 2008, № 1.Т. 7, С.3-3.

8. Алясова A.B., Пегов Р.Г., Михайлова Е.М., Новиков В.В., Барышников А.Ю. Растворимые молекулы HLA I класса в сыворотке крови больных раком молочной железы и легкого. // Нижегородский медицинский журнал, 2008, №4. С. 98-103.

9. Михайлова Е.М. Влияние озонотерапии на некоторые показатели иммунного статуса больных раком молочной железы. // Информационно-методическое письмо, Н.Новгород, 2009,17 С.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АСЗ - антиоксидантная система защиты МКА - моноклональные антитела МР - местнораспространенный МТ - метастатический

НФР - неозонированный физиологический раствор

ОФР - озонированный физиологический раствор

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПТХ - полихимиотерапия

РМЖ - рак молочной железы

Fas антиген - CD95 антиген

HLA-I - молекулы гистосовместимости I класса

s-форма - растворимая форма антигена

Подписано в печать 28.01.2010 г. Гарнитура Тайме. Печать RISO RZ 570 ЕР. Усл.печ.л.1,0. Заказ № 234. Тираж 100 экз.

Отпечатано ООО «Стимул-СТ» 603155, г.Нижний Новгород, ул.Трудовая,6 Тел.:436-86-40

Актуальность проблемы. Рак молочной железы занимает первое место по распространенности среди всех онкологических заболеваний у женщин репродуктивного возраста и третье место среди общей популяции всего населения, уступая по частоте лишь злокачественным новообразованиям легких и желудка. В России эта форма рака занимает 3-е место среди всех причин смерти женского населения (после болезней системы кровообращения и несчастных случаев) во всех возрастных группах, составляя в среднем 2,2%, а в возрасте 35-54 лет - 7,7% (Трапезников H.H., 1998; Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2008; Колядина И.В., 2009; Pegram М. et al., 2007; Palmeri L., 2008). По данным ВОЗ ежегодное число вновь зарегистрированных случаев рака молочной железы в мире приближается к миллиону. За последние 10 лет ежегодный прирост заболеваемости составляет 5,8%, причем наиболее высокие уровни заболеваемости и прироста отмечены в возрастных группах старше 60 лет. Ежедневно в России регистрируется 102 женщины с впервые установленным диагнозом РМЖ, причем у 56% из них отмечаются III-IV стадии заболевания. Около 30% больных от всех зарегистрированных случаев РМЖ погибают от основного заболевания в течение 10 лет (Возный Э.К. и др., 1996; Хайленко В.А. и др., 2005).

Частота встречаемости рака молочной железы, его многообразие, длительная и часто стойкая нетрудоспособность больных, трудности в лечении данной патологии определяют актуальность, медико-социальную значимость заболевания, обусловливают необходимость поиска новых дополнительных методов его лечения и профилактики.

Более 70% женщин, страдающих раком молочной железы, получают комплексное лечение (Гене Г.П. и др., 2003; Давыдов М.И., Летягин В.П., 2007). Важнейшими его компонентами являются лекарственная терапия и лучевая терапия. Дальнейшая разработка и совершенствование принципов ведения больных раком молочной железы и их реабилитация невозможны без углубленного изучения патогенеза опухолевого роста. В настоящее время важная роль в патогенезе злокачественных новообразований! отводится нарушениям функционирования иммунной системы организма. Существует множество лекарственных иммуиомодулирующих препаратов, использование которых в клинике сопряжено со значительными трудностями: их дороговизна и выраженные побочные явления в ходе лечения. В то же время остаются мало изученными немедикаментозные методы коррекции иммунной системы. Одним из таких методов является применение озонированного физиологического раствора (Алясова A.B. и др., 2006), влияние которого на показатели иммунной системы мало изучено. Представляется целесообразным исследовать действие озонированного физраствора на иммунный статус больных раком молочной железы.

Цель исследования. Исследовать механизмы влияния низких терапевтических концентраций озона на состояние иммунитета у больных раком молочной железы.

Задачи:

1. Изучить популяционный состав мононуклеарных клеток периферической крови больных, получавших наряду со стандартной терапией низкие терапевтические дозы озона.

2. Определить характер изменения сывороточного содержания растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы у больных, получавших озонированный физраствор.

3. Выявить особенности клеточного иммунитета больных, имеющих разные сроки выживаемости и частоту встречаемости рецидивов.

Научная новизна. Впервые представлены и охарактеризованы пусковые механизмы действия низких терапевтических концентраций озона на организм человека, связанные с его влиянием на процессы Fas-зависимого апоптоза иммуноцитов. Впервые выявлено, что низкие терапевтические концентрации озона нормализуют у больных раком молочной железы повышенную сывороточную концентрацию растворимого Fas антигена и растворимых молекул HLA I класса, обеспечивая более эффективную работу противоопухолевого клеточного иммунитета, что проявляется в возрастании эффективности противоопухолевой терапии, увеличении продолжительности жизни и в повышении качества жизни больных, достоверно меньшей частоте встречаемости лейкопений. Обнаружено нормализующее влияние озонотерапии на повышенное относительное содержание Fas+ мононуклеарных клеток периферической крови, количество которых не возрастает в еще большей степени, как это впервые показано для CD71+ клеток, а снижается. Выявлен специфический характер действия озонотерапии, приводящий и к активации иммунной системы, и к ограничению

Fas-зависимой инициации апоптоза иммунокомпетентных клеток.

Практическая значимость работы. Применение озонотерапии в составе комплексного лечениия позволяет увеличить общую и безрецидивную выживаемость пациенток и улучшить качество их жизни, уменьшает выраженность побочных токсических эффектов противоопухолевой терапии и позволяет проводить ее с запланированной интенсивностью.

Выявлено потенцирующее действие ОФР в отношении противоопухолевого эффекта цитостатиков, одним из механизмов которого является торможение CD95+ -опосредованного апоптоза активированных Т- и В-лимфоцитов.

Показана возможность использования мониторинга сывороточного уровня растворимого CD38 антигена для прогнозирования общей и безрецидивной выживаемости больных.

Положения, выносимые на защиту:

1. Низкие терапевтические концентрации озона способствуют норхмализации уровня растворимого Fas антигена и молекул HLA I класса в сыворотке крови больных раком молочной железы.

2. Применение озоиотерапии на фоне комплексного лечения приводит к повышению в крови относительного содержания мононуклеарных клеток, несущих активационные антигены (CD71+, CD38+, CD50+, HLA-I+) на фоне нормализаций повышенного уровня CD95+ клеток.

3. Использование озонированного физиологического раствора приводит не только к активации иммунной системы больных, но и ограничивает Fas-зависимый апоптоз иммунокомпетентных клеток, что потенцирует эффективность противоопухолевой терапии.

Внедрение. По результатам работы опубликовано информационно-методическое письмо, предназначенное для врачей-онкологов, терапевтов, хирургов, гинекологов. Апробация работы. Результаты работы представлены на X Всероссийском онкологическом конгрессе, 2006, 18-ой Международной конференции по озотерапии, Гавана, 2007, на заседаниях Нижегородского общества рентгенологов и онкологов в 2007, 2008 гг, на VII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественнные противоопухолевые препараты», Москва, 2008.

6. ВЫВОДЫ

1. Озонотерапия больных раком молочной железы совместно с полихимиотерапией приводит к нормализации изначально повышенного сывороточного уровня растворимого СБ95 антигена и растворимых молекул НЬА I класса, что можно рассматривать в качестве положительного эффекта действия озонированного физиологического раствора.

2. Использование озонотсрапии в составе комплексного лечения приводит к снижению до уровня нормы изначально повышенного содержания СБ95+ мононукле-арных клеток периферической крови и повышению относительного содержания СБ71+ клеток и СБ50+ клеток, что свидетельствует об инициации противоопухолевого иммунитета и ограничении числа иммунокомпетентных клеток, потенциально подверженных Баз-зависимому апоптозу.

3. Применение озонированного физиологического раствора на фоне полихимиотерапии не оказывает влияния на сывороточное содержание растворимых молекул СБ38 и СБ50 у больных раком молочной железы. У больных раком молочной железы, проживших менее трех лет, относительное содержание СБ38+ клеток снижается после терапии независимо от примененных схем лечения, что указывает на возможное прогностическое значение данного показателя, отражающего уровень активизации иммунной системы.

4. Исследование относительного содержания мононуклеарных клеток периферической крови, на мембране которых в реакции непрямой иммунофлуоресценции с помощью люминесцентной микроскопии выявляются молекулы НЬА I класса, показало, что как озонотерапия на фоне полихимиотерапии, так и стандартная полихимиотерапия сопровождаются повышением количества НЬА-1+ клеток.

5. Достижение трехлетней выживаемости пациенток, получавших в составе комплексного лечения озонированный физиологический раствор, сопровождается достоверным повышением относительного количества СБ71+ и СБ50+ мононуклеарных клеток периферической крови, что не наблюдается у больных, проживших менее трех лет.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Включение озонированного физиологического раствора с низкими терапевтическими концентрациями озона (100-200мкг/л) в состав комплексного лечения больных раком молочной железы позволяет улучшить качество жизни больных, уменьшить токсичность и повысить эффективность цитостатиков, создать оптимальные условия для проведения химиотерапии, что в конечном итоге проявляется увеличением общей и безрецидивной выживаемости пациенток.

2. Сывороточное содержание растворимого СОЭ8 антигена и относительное количество СБ38+ мононуклеарных клеток периферической крови может быть использовано в качестве прогностического показателя продолжительности жизни больных раком молочной железы.