Автореферат и диссертация по медицине (14.00.32) на тему:Влияние нормобарической гипоксии и реоксигенации на внутриклеточный рН и уровень АФК в культивируемом эндотелии человека и фагоцитах мышей

На правах рукописи

Гальчук

Сергей Васильевич

ВЛИЯНИЕ НОРМОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ И РЕОКСИГЕНАЦИИ НА ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ рН И УРОВЕНЬ АФК В КУЛЬТИВИРУЕМОМ ЭНДОТЕЛИИ ЧЕЛОВЕКА И ФАГОЦИТАХ

МЫШЕЙ

14.00.32 - авиационная, космическая и морская медицина, 03.00.02 - биофизика.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2005

Работа выполнена в Государственном научном центре РФ - Институте медико-биологических проблем РАН и на кафедре биофизики биологического факультета

МГУ им. М. В. Ломоносова.

Научные руководители:

доктор медицинских наук Буравкова Людмила Борисовна кандидат биологических наук Туровецкий Валерий Борисович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Павлов Борис Николаевич доктор медицинских наук Северин Александр Евгеньевич

Ведущая организация:

ГУ Научно-исследовательский Институт общей патологии и патофизиологии РАМН.

Защита диссертации состоится «g?» Об 2005 года в_часов на заседании

диссертационного совета K002.ll 1.01 в Государственном научном центре РФ -Институте медико-биологических проблем РАН по адресу 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - Института медико-биологических проблем РАН.

Автореферат разослан «/У » РГ 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И.П. Пономарева.

6597

Общая характеристика работы

Актуальность исследования

Гипоксия - широко распространенное явление, возникающее как в условиях дефицита кислорода во внешней среде, так и в результате различных патологических состояний, связанных с нарушением функций дыхательной, сердечно-сосудистой систем, а также транспортной функции крови. Несмотря, на многолетнюю историю вопроса, интерес к данной проблеме не ослабевает, более того, в последнее время появляется все больше работ, посвященных клеточным механизмам гипоксических состояний (Полякова И.А., Лейкина М.И., 1994, Самойлов М.О., Семенов Д.Г., 1999, Shinetti M.L., Sbarbat R., 1989, Narasimham L., Parinandi, Viswanathan N., 2002, Лукьянова Л.Д., 2000).

Важнейшей задачей в клинической практике является купирование постгипоксических состояний, адаптация организма к гипоксии. Особенно необходимо это в тех областях жизнедеятельности человека, где существует риск воздействия экзогенной гипоксии. Как правило, такой риск обусловлен профессиональной деятельностью, и возникновение гипоксических условий является чрезвычайным происшествием в результате отказа или технической неисправности систем жизнеобеспечения. Гипоксия в данных условиях может протекать с различной скоростью, вызывая тяжелые физиологические нарушения. Космонавты, летчики, подводники, пожарники, шахтеры - это основная группа риска.

В последнее время активно рассматривается возможность создания газовых дыхательных смесей с использованием индифферентного газа аргона в качестве газа-разбавителя кислорода. Такие дыхательные смеси в условиях недостатка кислорода в окружающей среде снижают негативное воздействие гипоксии и позволяют человеку в этих условиях более длительное время сохранить концентрацию внимания и адекватность действий. В частности, было показано (Павлов Б.Н., и др., 2000, Солдатов П.Э., и др., 2000), что присутствие Аг в дыхательных газовых смесях оказывает положительное действие на переносимость организмом гипоксии по целому ряду параметров, что, по мнению авторов, связано с его физиологической активностью, влияющей на внутриклеточный метаболизм.

Физиологические эффекты индифферентных газов, таких как N2, Не, Н2, активно изучаются в условиях повышенного давления газовой среды, где их использование обусловлено необходимостью купирования азотного наркоза, нервного синдрома высоких давлений, декомпрессионной болезни (Смолин В.В., и др., 1999,2005, Bennett 1984, 2002). Аргон, обычно не используют в практике глубоководных водолазных спусков, поскольку плотность этого газа больше плотности азота, что может создать проблемы в функционировании дыхательной системы при высоком давлении газовой

|РОС. «АЦ„М„ 01.НАЯ ,

6НМНОТЕМ i

- -

среды. Его наркотическая способность выше, чем у азота, и при повышении давления уже до одной атмосферы он вызывает наркотический эффект у человека и млекопитающих (Лазарев Н.В., 1941-1944, Смолин В.В., Рапопорт K.M., 1968). Выраженных физиологических эффектов индифферентных газов (за исключением ксенона и криптона) при нормальном давлении не зафиксировано, хотя показано, например, что замена азота на гелий в дыхательной газовой смеси приводит к изменению функций легких (Bennett Р.В., Hayward А., 1976).

Таким образом, вопрос о том, какой вклад вносят индифферентные газы в течение физиологических процессов при гипоксии, остается открытым. Немногочисленные данные по этой проблеме получены при исследованиях, проводимых на целом организме, и в силу такого подхода во многом отражают не только эффекты влияния гипоксии, создаваемой при помощи индифферентных газов, но и весь спектр физиологических реакций в этих условиях. Исследования в этой области на уровне клетки немногочисленны и зачастую противоречивы (David A., Lawrence R., 1983, Schinetti M.L., Sbarbati R., 1989, Schäfer С., Ladilov Y. V., Siegmund В., 2000).

Такая ситуация обусловлена рядом причин.

Во-первых, наблюдаемые на определенных клетках изменения могут быть специфическими только для данного типа клеток, не позволяя дать оценку полученных эффектов для клеточного уровня в целом. Поэтому очень важен сам выбор того или иного типа клеток. На наш взгляд, для изучения влияния гипоксии in vitro наиболее адекватным выбором был бы выбор тех клеток, которые в силу своих функциональных особенностей или принадлежности к тем или иным органам и тканям сталкиваются с условиями гипоксии наиболее часто и, соответственно, обладают механизмами коррекции своих функций, адаптации к этим условиям (например, клетки эндотелия и имуннокомпетентные клетки).

Во-вторых, условия создания гипоксии, используемые в экспериментальных работах, значительно разнятся. Необходимо отметить, что важен не только сам метод дезоксигенации, но и контроль других внешних параметров, которые при определенных условия могут влиять на клетку не менее активно, чем снижение парциального уровня кислорода в среде.

И, наконец, необходимо учитывать разнообразие изучаемых внутриклеточных параметров и методов их исследования. По всей видимости, при изучении влияния гипоксии in vitro, измеряемые внутриклеточные параметры должны быть одинаково "показательны" для любого клеточного типа, в какой-то мере носить интегральный характер, отражая состояние внутриклеточных систем и функциональный статус клетки. В полной мере к таким параметрам можно отнести систему внутриклеточной рН-регуляции, систему регуляции активных форм

кислорода, которая в последнее время все чаще рассматривается, как вполне самостоятельная полноценная мессенджерная система, играющая важную роль в клеточной физиологии при различных экстремальных состояниях, в том числе и таких, как гипоксия и реоксигенация.

Нельзя не остановиться и на таком важном для живых систем процессе, как реоксигенация. Во многих случаях восстановление парциального давления кислорода в тканях несет не менее повреждающий эффект, чем сама гипоксия. Именно поэтому важно знать механизмы и динамику этого повреждения для выработки оптимальной тактики и стратегии выхода из постгипоксических состояний.

Таким образом, выбор наиболее адекватных типов клеток, исследуемых параметров, методических подходов для моделирования процессов гипоксии и реоксигенации in vitro с использованием индифферентных газов, применение достижений современной науки и техники, дающих качественно новые возможности для проведения исследований на уровне клетки могут пролить свет на многие аспекты в данном научном направлении.

Цель исследования

Целью работы явилось исследование влияния нормобарической гипоксии, создаваемой при помощи аргона или азота, на изменения внутриклеточного рН и уровня активных форм кислорода в перитонеальных макрофагах мышей и эндотелиальных клетках человека.

Задачи исследования

1. Разработать на базе метода микрофлуориметрического анализа одиночных клеток программно-аппаратную исследовательскую систему для изучения эффектов гипоксии и реоксигенации in vitro.

2. Изучить влияние гипоксии и реоксигенации на целостность плазматических мембран перитонеальных макрофагов мышей и эндотелиальных клеток человека.

3. Исследовать влияние гипоксии и реоксигенации на динамику внутриклеточного уровня активных форм кислорода (АФК) перитонеальных макрофагов мышей и культуры эндотелиальных клеток.

4. Изучить влияние гипоксии, создаваемой при помощи индифферентных газов (аргона и азота), и последующей реоксигенации на внутриклеточный рН перитонеальных макрофагов мышей и эндотелиальных клеток человека.

5. Сравнить реакции клеток по изучаемым параметрам in vitro на гипоксические условия при использовании азота и аргона.

Научная новизна

В исследованиях на культивируемых клетках человека и животных в условиях посюянного мониторинга и автоматической коррекции физических и химических факторов среды инкубации впервые изучена динамика изменения внутриклеточного рН и внутриклеточного уровня активных форм кислорода при постепенном изменении парциального давления кислорода в среде. Показано повышение внутриклеточного рН и АФК в перитонеальных макрофагах и культивируемых эндотелиальных клетках человека в условиях нарастающей гипоксии.

Выявлена различная устойчивость эндотелиальных клеток человека и фагоцитов мышей к воздействию гипоксии и реоксигенации, оцениваемая по целостности плазматических мембран клеток.

Впервые показаны различия в динамике изменений внутриклеточных параметров в зависимости от использованного индифферентного газа для создания гипоксии in vitro.

Практическая значимость работы

Результаты проведенных исследований имеют важное значение для понимания механизмов формирования биологического ответа организма на уровне клетки при действии гипоксии и реоксигенации. Полученные данные должны быть учтены при анализе и купировании постгипоксических состояний, а также адаптации к гипоксии.

Разработанная программно-аппаратная исследовательская система для проведения исследований in vitro в условиях изменения парциального давления кислорода в среде может быть использована в работах, целью которых является изучение различных физико-химических параметров клетки. Система обладает достаточной гибкостью для широкого моделирования экспериментальных условий при изменении внешних физико-химических факторов и оценки изменения внутриклеточных параметров с помощью микрофлуориметрии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Созданная программно-аппаратная система позволяет моделировать условия гипоксии и реоксигенации in vitro, проводить изучение внутриклеточных параметров с использованием флуоресцентных зондов.

2. Гипоксия и реоксигенация приводят к повышению уровня внутриклеточных АФК перитонеальных макрофагов и эндотелиальных клеток человека, и оказывает выраженное цитотоксическое действие на культивируемый эндотелий.

3. Постепенно нарастающая нормобарическая гипоксия приводит к повышению внутриклеточного рН культивируемых эндотелиальных

клеток человека и перитонеальных макрофагов мышей. Последующая реоксигенация сопровождается снижением уровня pHi до конгрольного значения в обоих типах клеток. 4. Изменение внутриклеточного рН в макрофагах не связано с работой №+/Н+-обменника, нарушением процессов окислительного фосфорилирования, процессов гликолиза.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ. Материалы исследований доложены и обсуждены на конференциях молодых ученых, посвященных Дню космонавтики (2001-2003 гг.), Российской конференции «Организм и окружающая среда: жизнеобеспечение и защита человека в экстремальных условиях» (2000 г.), на X международном симпозиуме «Околого-физиологические проблемы адаптации» (2001 г.), на XII конференции по космической биологии и авиакосмической медицине (2002 г.), на 3-й Всероссийской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (2002 г.). Диссертация апробирована на кафедре биофизики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБН РАН.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, трех глав ("Обзор литературы", "Материалы и методы ", "Результаты и обсуждение"), выводов, списка литературы. Диссертация содержит 131 машинописных страниц, иллюстрирована 29 рисунками, 2 таблицами, 9 схемами, 2 фотографиями. Список литературы включает 147 работ, из них 55 отечественных и 92 зарубежных авторов.

Содержание работы Материалы и методы

Объекты исследований.

В качестве основных объектов исследований в работе использовали перитонеальные макрофаги белых беспородных мышей-самцов и культивируемые эндотелиальные клетки пупочной вены человека.

Подготовка препаратов клеток к измерениям.

Для выделения перитонеальных макрофагов мышам после цервикальной дислокации вводили в брюшную полость 2 мл раствора Хенкса (содержавшего 10 мМ HEPES, рН 7,2; Sigma). Затем извлекали иеритонеальную жидкость, обогащенную макрофагами. Кошроль содержания неповрежденных клеток осущест&тяли с использованием перекрестной окраски клеток бромистым этидием

(4 мкг/мл; Sigma) и флуоресцеиндиацетатом (5 мкг/мл; Sigma) Концентрацию клеток в суспензии доводили раствором Хенкса до величины 106 клеток в 1 мл раствора. Небольшие объемы суспензии (20 мкл) наносили на покровные стекла, инкубировали 45 мин во влажной камере, а затем промывали раствором Хенкса для удаления не прикрепившихся клеток. Полученные таким образом препараты макрофа! ов, прикрепленных к покровным стеклам, использовали в экспериментах.

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека были выделены и культивированы Мерзликиной Н.В. в группе "Клеточная физиология" ГНЦ РФ ИМБП PAII. В экспериментах использовали монослойные культуры третьего -четвертого пассажа. За час перед экспериментом среду культивирования заменяли на раствор Хенкса. Контроль содержания неповрежденных клеток проводили таким же образом, как и макрофагов.

Микрофлуориметрический анализ одиночных клеток с использованием флуоресцентных зондов.

Измерение внутриклеточного pH

Определение внутриклеточного pH проводили с использованием модифицированного варианта микрофлуориметрического метода (Heiple J.M., Taylor D.L., 1982) на серийно выпускаемом люминесценшом микроскопе марки "Люмам" - ИЗ, оснащенном фотометрической насадкой ФМЭЛ-IA с набором интерференционных светофильтров, фотоумножителем ФЭУ-79 и цифровым вольтметром Щ-4300, и с использованием разработанной нами системы "GFAOC ASMR" (АСМИ - автомашзированная система микрофлуориметрических исследований). Возбуждение флуоресценции осуществляли с использованием 1алогенной лампы накаливания KIM 9-70 и комбинации стеклянных светофильтров ФС 1-4 и СЗС 21-2 в классическом варианте микрофлуоримегрии и с использование светодиода "СД 1124" при использовании системы

Интенсивности флуоресценции клеток в двух узких полосах спектра излучения флуоресцеина регистрировали, используя встроенные в насадку ФМЭЛ-1А интерференционные светофильтры с максимумами пропускания в >., = 520 нм и Х2 = 567 нм (рис 1) Диаметр фотометрируемого участка препарата составлял 12,5 мкм Кроме этого использовали видеокамеру и систему синхронною детектирования АСМИ. Систематический контроль за постоянством параметров оптического тракта микроскопа, системы усиления и pei истрации сигнала проводили с использованием технического эталона из стекла ЖС-19. Для введение в клетки флуоресцен шого рН-индикатора - флуоресцеина их инкубировали с ФДА (в конечной концентрации 5 ми/мл) в течение 15 мин. После отмывки от несвязавшегося красителя покровные стекла помещали в специально изготовленную камеру, заполняли ее раствором Хенкса и проводили измерения интенсивности флуоресценции отдельных клеток. Для определения величины внутриклеточного pH пользовались калибровочной кривой, представлявшей собой график зависимости параметра К (отношение II к 12) от значения pH, исследуемых клеток (Литинская Л.Л., Векслер A.M., 1984).

Оценка изменения содержания АФК в клетках

Принцип метода измерения АФК основан на способности витального флюорохрома 2,7-дихлорфлуоресцин-диацетата (2,7-ДХФ-ДА) накапливаться внутри клетки и после взаимодействия с внутриклеточными АФК превращаться в 2,7-дихлорфлуоресцеин (ДХФ) (Бизюкин A.B., Коркина Л.Г., 1995). В экспериментах с использованием 2,7-ДХФ-ДА клетки предварительно инкубировали с красителем в течении 30 мин при конечной концентрации флуоресцентного зонда 5 мкМ. Время эксперимента отсчитывали от момента завершения 30-минутной инкубации клепок с 2,7-ДХФ-ДА, и, не отмывая, начинали фотометрировать. Изменение уровня АФК в клетках рассчитывали как отношение интенсивности флуоресценции клеток в опыте к интенсивное ги флуоресценции контрольных клеток и представляли в процентах.

Выявление клеток с поврежденной плазматической мембраной.

Выявление клеток с поврежденной плазматической мембраной осуществляли с использованием перекрестного теста с одновременной окраской клеток бромистым этидием (5 мкг/мл) и флуоресцеиндиацетатом (5 мкг/мл) (Dankberg F., Persidsky M.D., 1976). Уже через 5 мин инкубации клеток с флуорохромами в поле зрения люминесцентного микроскопа легко идентифицируются клетки с поврежденной и неповрежденной плазматической мембраной, имеющие ярко-красную и зеленую флуоресценцию соответственно.

Статистическая обработка данных.

Результаты исследований представляли в виде средних значений изучаемых параметров, полученных не менее чем в пяти раздельных сериях эксперименшв. Полученные данные обрабатывали статистически. Достоверность различий между средними значениями исследуемых параметров оценивали с использованием критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Программно-аппаратная автоматизированная система микрофлуориметрических исследований.

Для достижения основной цели исследования в соответствии с поставленными задачами была разработана программно-аппаратная исследовательская система в целях изучения эффектов гипоксии и реоксигенации in vitro - "АСМИ - автоматизированная система микрофлуориметрических исследований". В качестве базового метода ири разработке системы был использован метод микрофлуориметрического анализа одиночных клеток. Система предназначена для автоматического получения, хранения и полномасштабного анализа данных измерений внутриклеточных параметров, автоматического контроля и коррекции параметров среды инкубации.

Условно систему можно разделить на два основных блока -аппаратный и программный, каждый из которых имеет свою иерархическую

структуру со строго определенными взаимосвязями между элементами внутри блока и системы в целом. Общая схема системы представлена на рисунке 1.

Рис 1. Программно-аппаратная исследовательская система (АСМИ).

1. Люминесцентный микроскоп

2 Герметичная проточно-инкубационная камера

3. Цифровая видеокамера

4 Двухканачьная фотометрическая насадка с системой синхронного детектирования

5. Газовые баллоны, компрессор

6 Перистальтический насос

7. рН электрод

8. р(?2 эчектрод

9. Термодатчик, другие датчики

10 Компьютер, электронные узчы сопряжения системы, программное обеспечение

Основные функции аппаратной части системы сводятся к мониторингу и коррекции условий инкубации. На программную часть возложены функции сбора, анализа данных, управления системой в целом.

IAFC (Image analysis of fluorescent cells) является основной аналитической программой системы АСМИ и предназначена для анализа изображения флуоресцирующих клеток. Программа содержит целый ряд процедур и функций для изучения внутриклеточных параметров с использованием флуоресцентных зондов (рис. 2). По завершении работы система формирует подробный отчет о работе, а проанализированный материал сохраняет в виде сводных таблиц, гистограмм, графиков.

Разработанная программно-аппаратная исследовательская система для изучения эффектов гипоксии и реоксигенации in vitro позволила наиболее

адекватно проводить эксперименты в соответствии с определенными в работе задачами.

Рис. 2. Сканографическая реконструкция (топографическое представление (один из этапов анализа клетки)

Изучение содержания кислорода в среде инкубации при продувке аргона, азота или воздуха над поверхностью раствора.

На первом этапе экспериментов была изучена кинетика вытеснения кислорода из раствора (рис. 3), отражающая процесс насыщения среды аргоном или азотом при продувке газа над поверхностью раствора.

Продувка индифферентного газа приводила к постепенному снижению содержания 02 в среде инкубации, которое достигало к 60-й минуте продувки уровня, составлявшего около 15 % от исходного. Перевод системы из гипоксических условий в условия реоксигенации при продувке воздухом сопровождался постепенным восстановлением уровня кислорода, который к концу эксперимента достигал 78 % в случае азота и 65 % в случае аргона. Достоверных различий между влиянием аргона и азота на динамику вытеснение кислорода из инкубационного раствора на стадии гипоксии не наблюдалось. На стадии реоксигенации отмечалась тенденция более интенсивного восстановления уровня кислорода в среде при использовании азота для создания гипоксических условий. Полученные результаты позволили разработать схему дальнейших исследований.

Рис 3. Изменение содержания 02 в инкубационной среде при продувке индифферентных газов или воздуха над поверхностью раствора

По оси абсцисс время продувки, мин, по оси ординат - изменение содержания О2 в инкубационной среде (раствор Хенкса, рН 7 2) в опыте по сравнению с контрочем, % Стрелкой указан момент перевода системы из гипоксическихусчовий вусчовия реоксигенации

Исследование влияния гипоксии и реоксигенации на целостность клеточных мембран перитонеальных макрофагов и эндотелиальных клеток. Как известно, образование значительных количеств АФК и вызванные ими процессы перекисного окисления липидов (Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я., 1989) приводят, в конечном счете, к нарушению структуры плазматических мембран клеток. В этой связи было изучено влияние гипоксии и реоксигенации на целостность плазматических мембран перитонеальных макрофагов и эндотелиальных клеток человека.

В исследованиях, проводимых на культуре эндотелия, на обеих стадиях эксперимента наблюдалось нарастание числа клеток с поврежденной мембраной (рис. 4). На рисунке показано что, в течение 60 минут гипоксии этот процесс был медленным. Перевод системы в состояние реоксигенации вызывает быстрый рост числа поврежденных клеюк, достигающий примерно 60 % в первые 30 минут воздействия. Выраженность повреждающего эффекта снижается в последующие 30 мин инкубации. При этом эффекты гипоксии и реоксигенации практически не различалась при использовании Аг или N2.

Рис. 4 Влияние гипоксии и реоксигенации на целостность плазматических мембран эндотелиальных клетках человека.

По оси абсцисс - время инкубации клеток (мин) при продувке над поверхностью раствора аргона wm азота (гипоксия) или воздуха (реоксигенация), по оси ординат -изменение относительного содержания клеток с поврежденной плазматической мембраной в изучаемой популяции эндотелиальных кчеток (Р, %) Стрелкой указан момент перевода системы из гипоксических условий в условия реоксигенации

В отличие от эндотелиальных клеток создаваемые экспериментальные воздействия не вызывали повреждения плазматических мембран фагоцитов.

Таким образом, обнаружено существенное различие в действии гипоксии и последующей реоксигенации in vitro на целостность плазматических мембран исследованных клеточных типов. Создаваемые экспериментальные условия вызывали существенное увеличение относительного числа поврежденных клеток в культуре эндотелия, в то время как перитонеальные макрофаги успешно переживали создаваемые условия окислительного стресса. Вероятно, такая разница в наблюдаемых эффектах обусловлена наличием у них более мощной антиоксидантной системы.

Необходимо также отметить, что популяция клеток, пережившая экспериментальные воздействия, оставалась жизнеспособной еще в течение достаточно продолжительного времени - до 6 часов. Это, по всей видимости, свидетельствует о нормализации метаболических процессов и восс1ановлении функционального статуса клеток. Мы также полагаем, чю более высокая устойчивость фагоцитов к гипоксии и реоксигенации может быть объяснена не только более мощной системой антиоксидантной защиты, но и, возможно, наличием ряда механизмов, регулирующих их метаболические процессы в этих условиях, которые могли сложиться эволюционно (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989), так как именно этот

клеточный тип наиболее часто сталкивается в норме с тканевой гипоксией и нормально функционирует в этих условиях, что, видимо, и определяет его функциональную значимость для организма.

Изучение влияния гипоксии и реоксигенации на содержание активных форм кислорода в перитонеальных макрофагах и эндотелиальных клетках.

Значительный интерес при изучении механизмов действия на клетку изменения содержания во внеклеточной среде кислорода представляет анализ содержания в клетке активных форм кислорода. Этот интерес обусловлен, с одной стороны, предполагаемым участием АФК в регуляции функциональной активности клеток, а с другой, хорошо известной ролью АФК в реализации деструктивного действия на клетку многих повреждающих факторов. В литературе имеются многочисленные указания на участие АФК и систем антиокислительной защиты в механизмах формирования ответов клетки на действие гипоксии и реоксигенации (БсЫпеШ М.Ь., е1 а!., 1989, Полякова И.А., Лейкина М.И., 1994, Нагая^Иат Ь., е1 а1„ 2002).

В связи с вышесказанным на следующем этапе работы было исследовано влияние гипоксии, создаваемой при помощи индифферентных газов, и последующей реоксигенации на внутриклеточный уровень АФК перитонеальных макрофагов и культивируемых эндотелиальных клеток пупочной вены человека. Как видно на рис. 5, при создании в инкубационной камере условий гипоксии происходит нарастание уровня внутриклеточных АФК в макрофагах. После 90-минутной экспозиции клеток в гипоксических условиях уровень внутриклеточных АФК фагоцитов превышал исходный более чем на 40 %. Значительно динамичнее происходило изменение изучаемого параметра на стадии реоксигенации. Так, лишь за первые 30 минут реоксигенации внутриклеточная концентрация активных форм кислорода перитонеальных макрофагов повышалась еще на 80 %, а к концу эксперимента превосходила базальный уровень более чем в 2,5 раза

В исследованиях влияния гипоксии и реоксигенации на уровень внутриклеточных АФК эндотелиальных клеток были получены результаты во многом сходные с описанными выше. Было выявлено (рис. 6), что постепенное возрастание уровня АФК в гипоксических условиях резко ускоряется в течение первых 30 мин реоксигенации, возможно, за счет значительного повышения содержания Ог Стабилизация уровня АФК в последующие 30 мин инкубации, по-видимому, была связана со стабилизацией систем, регулирующих генерацию и/или разрушение АФК в клетке. Так, гипоксия приводила к повышению уровня АФК эндотелиальных клеток на 30 %, в первые 30 мин реоксигенации - еще на 50 %, после чего уровень активных форм кислорода стабилизировался на достигнутом значении и сохранялся неизменным до конца эксперимента.

Рис 5. Влияние гипоксии и реоксигенации на содержание активных форм кислорода в перитонеальных макрофагах мышей

По оси абсцисс - время инкубации клеток (мин) при продувке над поверхностью раствора аргона или а юта (гипоксия) или воздуха (реоксигенация) по оси ординат -изменение содержания активных форм кислорода (АФК) в макрофагах в опыте по сравнению с контролем, % Стрелкой указан момент перевода системы из гипоксических условий в условия реоксигенации

Таким образом, характер изменений уровня внутриклеточных АФК при гипоксии и реоксигенации для обоих клеточных типов был сходным. Гипоксия, создаваемая при помощи аргона или азота, вызывала незначительное повышение внутриклеточной концентрации активных форм кислорода как в случае клеток-фагоцитов, так и в случае культуры эндотелиальных клеток человека, Реоксигенация сопровождалась резким повышением уровня внутриклеточных АФК, особенно в первые полчаса. Однако в дальнейшем уровень активных форм кислорода для эндотелия оставался фактически постоянным, а для макрофагов характерным было продолжение нарастания АФК, хотя процесс был менее динамичен, чем в первые 30 минут реоксигенации.

Необходимо отметить, что в условиях гипоксии не было обнаружено существенной разницы в действии газов на изучаемый параметр. Однако на стадии реоксигенации выраженность наблюдаемых эффектов была больше при использовании аргона для создания гипоксии.

Полученные экспериментальные данные объясняются, по-видимому, гем, что, гипоксия, как известно (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972, Осипов А.Н., и др., 1990), может стимулировать 1енерацию свободных

радикалов кислорода, приводящую к перекисиому окислению ненасыщенных

Рис 6 Влияние гипоксии и реоксигенации на содержание активных форм кислорода в эндотелиальных клетках человека.

По оси абсцисс - время инкубации клеток (мин) при продувке над поверхностью раствора аргона или азота (гипоксия) или во ¡духа (реоксигенация), по оси ординат -изменение содержания активных форм кислорода в эндотелии в опыте по сравнению с контро1ем (АФК, %) Стрелкой указан момент перевода системы из гипоксических условий в условия реоксигенации

Причиной этого может быть то, что при снижении концентрации Ог происходит активация ряда внутриклеточных процессов, приводящая к шестикратному увеличению мощности ксантиноксидазы - фермента, окисляющего ксантин и гипоксантин молекулярным кислородом, что сопровождается образованием О2- и НгСЬ- Кроме того, показано, что в условиях гипоксии происходит снижение активности одного из важнейших ферментов антиоксидантной защиты клетки - супероксиддисмутазы и повышение содержания продукта перекисного окисления лигшдов -малонового диальдегида. Повышение же концентрации основного реагента на стадии реоксигенации должно приводить к интенсификации протекающих реакций.

Однако в последние годы все чаще появляются данные, свидетельствующие о том, что активные формы кислорода играют в клетке не только деструктивную роль, участвуя в реализации повреждающего действия ряда факторов и патологических состояний организма, но и наряду с такими известными внутриклеточными посредниками, как Са2+, Н+ и цАМФ, участвуют, по-видимому, в регуляции клеточных функций в норме (Скулачёв В.П., 1996, Михайлов В.Ф., и др., 2003). Для клеток-фагоцитов способность к

генерации АФК определяет их функциональный статус как клеток первого звена иммунного ответа.

Известна способность к генерации АФК в норме и для других клеточных типов, в том числе для эндотелия, хотя и менее выраженная по сравнению с макрофагами. В этом контексте представляется интересной гипотеза, высказанная рядом авторов. Было показано, что гипоксия (аналогично гистамину) стимулирует продукцию инозитол-1,4,5-трифосфата в эндотелиальных клетках (Буравкова Л.Б., и др., 1990). На сегодняшний день механизмы активации фосфоинозитидного обмена в клетках при действии гипоксии неизвестны. Предполагается (ОаУ1е8 Р., \iaddalo И., 1985), что одним из претендентов на роль такого механизма может являться кислородзависимая модификация мембранных структур. На основе имеющихся в литературе данных, было высказано предположение, что в результате генерации в условиях гипоксии свободных радикалов Ог и вызванного ими перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот мембранных липидов (8сЫпеШ М.Ь., ЯЬагЬай И., 1989) происходят изменения структуры клеточной мембраны, приводящие к входу в клетку Са2+ и повышению его внутриклеточной концентрации (0£а\уа 8., е1 а1., 1990). Это, в свою очередь, может привести к активации Са2+-чувствительного фосфоинозитид-специфическош фермента - фосфолипазы С, что служит причиной активации обмена фосфоинозитидов Предполагается также, что зависимая от гипоксии активация фосфоинозитидного обмена должна стимулировать освобождение Са2+ из внутриклеточных депо (через инозитолтрифосфаг) и активировать протеинкиназу С (через диацилглицерол) (Ткачук В.А., Буравкова Л.Б., 1997). Таким образом, АФК, вероятно, могут выступать в качестве первого активирующего звена ряда метаболических процессов клетки, приводящих к повышению ее функциональной активности. В этом случае полученные нами данные о влиянии гипоксии на внутриклеточный рН могут также являться косвенным подтверждением изложенной выше гипотезы, так как повышение внутриклеточного протонного градиента наиболее часто связывают с усилением метаболических процессов и повышением функционального статуса клетки. С этой точки зрения, увеличение внутриклеточного пула АФК на стадии гипоксии может рассматриваться не только как патологическое явление, но и как нормальный функциональный клеточный ответ на изменяющиеся условия. Патогенность же активных форм кислорода, по всей видимости, определяется балансом процессов их генерации и деактивации и/или выходом их во внеклеточную среду.

Исследование влияния гипоксии и реоксигенации на внутриклеточный рН перитонеальных макрофагов мышей и культуры эндотелиальных клеток.

Как известно, ионы Н+ наряду с ионами Са2+, цАМФ и другими

биологическими медиаторами играют важную роль в регуляции функционально-метаболической активности клеток. При этом в области физиологического диапазона значений возрастание внутриклеточного рН сопровождается повышением уровня клеточной активности, тогда как уменьшение pHi связано с ее снижением. Развитие многих клеточных патологий связано с необратимым изменением внутриклеточного рН, выходящим за пределы области физиологических значений. Многочисленные литературные данные убедительно свидетельствуют об активном участии системы внутриклеточной рН-регуляции в реализации функционально-метаболических ответов клеток на действие гипоксии и реоксигенации in vitro (Sha'afi R.I., Naccache P.H., 1983).

В этой связи на следующем этапе исследований было изучено влияние гипоксии, создаваемой при помощи индифферентных газов и последующей реоксигенации, на внутриклеточный рН перитонеальных макрофагов мышей и культуры эндотелиальных клеток человека. В контрольных условиях изменения внутриклеточного рН не превышало 0,05 ед. в течение 4 часов. Исходный pHi составлял (7,15-7,25 ед.). Данные, представленные на рис. 7, показывают, что инкубация макрофагов в условиях снижения содержания 02 в среде, над поверхностью которой продувался индифферентный газ (Аг или N2), приводила к постепенному возрастанию внутриклеточного рН, уровень которого к 90-й минуте достигал примерно 0,4 ед. При переводе системы в условия реоксигенации (нормоксии) и постепенного восстановления исходного уровня 02 после небольшого подъема наблюдается обратная тенденция в смещении протонного градиента. К концу эксперимента (180 мин) уровень внутриклеточного рН макрофагов достоверно не отличался от исходного.

Изучение влияния гипоксии на внутриклеточный рН культивируемых эндотелиальных клеток показало, что характер изменений этого параметра имеет такую же направленность и выраженность (рис. 8), как и в случае перитонеальных макрофагов. Несмотря на более короткое время экспозиции эндотелиальных клеток в условиях гипоксии и реоксигенации, гипоксия сопровождается повышением внутриклеточного рН и к 60-й минуте pHi достигает примерно 0,5 ед. Реоксигенация, как и в случае клеток фагоцитов, вызывала снижение pHi эндотелия до уровня контроля.

Таким образом, кратковременная нормобарическая гипоксия, создаваемая при помощи индифферентных газов, вызывает повышение внутриклеточного рН перитонеальных макрофагов мышей и эндотелиальных клеток человека. Последующая реоксигенации сопровождается снижением уровня pHi до исходных характерных значений обоих типов клеток. В ходе экспериментов не было обнаружено достоверных различий в выраженности эффектов влияния газов - аргона или азота - на изучаемый параметр.

Рис 7. Влияние гипоксии и реоксигенации на внутриклеточный рН перитонеальных макрофагов мышей.

По оси абсцисс - время инкубации клеток (мин) при продувке над поверхностью раствора аргона или азота (гипоксия) или воздуха (реоксигенация), по оси ординат -изменение внутриклеточного рН макрофагов в опыте по сравнению с контролем (ApHi). Стрелкой указан момент перевода системы из гипоксических условий в условия реоксигенации

Полученные нами результаты о влиянии гипоксии, создаваемой при помощи индифферентных газов на внутриклеточный рН, не во всем совпадают с данными, имеющимися в литературе. Так, в работах Орлова Л.Л., Шилова A.M. (1987), Matsuda N., Mori Т. (1995), Bertoni A., Adrian S. (1993), указывается на противоположную тенденцию изменения протонного градиента - закисление в условиях гипоксии. По всей видимости, такое противоречие обусловлено не только использованием различных методических подходов, объектов исследований, но и условиями создания гипоксии и реоксигенации. При этом можно отметить несколько принципиальных факторов- постоянный визуальный контроль изучаемого объекта (то есть измерения проводились исключительно на жизнеспособных клетках); постоянный контроль в ходе эксперимента внешних параметров, таких как температура, давление, рО?, рН инкубационной среды и т.д И, наконец, сам способ изменения газового состава среды: в работе условия нормобарической гипоксии создавались постепенно, что позволяло изучаемой клеточной популяции наиболее адекватно отреагировать на внешний раздражитель и вовремя перестроить свой метаболизм наиболее оптимальным образом.

Рис. 8. Влияние гипоксии и реоксигенации на внутриклеточный рН эндотелиальных клеток человека.

По оси абсцисс - время инкубации клеток (мин) при продувке над поверхностью раствора аргона или азота (гипоксия) или воздуха (реоксигенация), по оси ординат -изменение внутриклеточного рН клеток в опыте по сравнению с контролем (АрН1). Стречкой указан чомент перевода системы из гипоксических условий в условия реоксигенации

Для объяснения наблюдаемого эффекта влияния гипоксии и реоксигенации на внутриклеточный рН и оценки участия систем регуляции нами были проведены дополнительные исследования на перитонеальных макрофагах мышей вследствие их лучшей устойчивости к гипоксическим воздействиям.

В последнее время наибольшее внимание исследователей привлекают две клеточные системы рН-регуляции: обмен катионов Ыа+/Н+ и встречный сопряженный обмен анионов С1 /НСОз. В обоих случаях для транспорта ионов используется энергия неравновесного распределения ионов между клеткой и средой.

Проведенные эксперименты, в которых на фоне гипоксии в среду добавлялся селективный блокатор Ыа+/Н+ - антипортера - амилорид (ЭИПА), не выявили достоверных различий в выраженности эффекта подщелачивания по сравнению с таковыми в отсутствии блокатора. Это, по всей видимости, свидетельствует об отсутствии непосредственной связи между работой №+/Н+ обменника и механизмом, лежащим в основе наблюдаемого эффекта при изменении содержания кислорода в среде.

Нами также рассматривалась возможность влияния транспорта бикарбонатов в данных условиях на систему внутриклеточной рН-регуляции.

Достаточно правомочным основанием к такому рассмотрению, на наш взгляд, может быть изменение концентрации углекислого газа в среде инкубации. Так, продувка газов над поверхностью раствора, сопровождающаяся насыщением среды индифферентным газом и "обеднением" другими газами, в том числе С02, могла бы приводить к изменению состояния бикарбонатной буферной системы и вследствие этого к защелачиванию внутриклеточного содержимого. Однако в этом случае неизбежно происходило бы и изменение pH среды, чего в ходе экспериментов не наблюдалось. Максимальное отклонение pH среды во всех экспериментах составляло не более 0,015 ед. Косвенным подтверждением непричастности СГ/НСОз обмена к наблюдаемому эффекту подщелачивания могут служить проведенные нами эксперименты, в которых инкубационная среда содержала достаточно мощный бикарбонатный буфер.

Таким образом, нам не удалось обнаружить непосредственной связи между наблюдаемым эффектом увеличения pHi при гипоксии и работой Na+/H+ и СГ/НСО-f обмена. Однако полностью исключить их влияние на систему внутриклеточной pH регуляции в рассматриваемых условиях нельзя. Данные, полученные в работе (Schäfer С., et al., 2000) убедительно свидетельствуют о том, что активность рассмотренных систем рН-регуляции, находится в тесной взаимосвязи и большинство эффектов, реализуемых ими, имеют сложную причинно-следственную связь с определенным разрешением во времени и внутриклеточном пространстве.

Как известно, одной из основных функций кислорода в клетке является его участие в клеточном дыхании. Суть данного процесса заключается в окислении субстратов дыхания, сопряженного с образованием протонного потенциала, который используется преимущественно для синтеза АТФ. В этой связи для объяснения наблюдаемого эффекта повышения pHi, индуцируемого гипоксией, создаваемой при помощи индифферентных газов, нами было изучено влияние разных типов ингибиторов энергетического метаболизма на величину внутриклеточного pH макрофагов.

Полученные результаты были сопоставлены с данными, полученными в контрольных сериях (в отсутствие ингибитора) (рис. 9, кривая 1). Как видно из представленных данных (рис. 9, кривая 2), инкубация клеток в присутствии антимицина А - ингибитора электронного транспорта в средней части дыхательной цепи митохондрий, не приводит в первые 30 мин к достоверным изменениям pHi. Однако увеличение времени инкубации макрофагов до 45 и 60 мин сопровождается выраженным снижением их внутриклеточного pH примерно на 0,09 ед. и 0,33 ед. соответственно.

Рис 9 Влияние ингибиторов энергообмена на внутриклеточный рН перитонеальных макрофагов мышей.

По оси абсцисс - время (мин) от момента добавления к клеткам ингибитора по оси ординат изменение вечичины рШ макрофагов по сравнению с исходным уровнен параметра в момент «О» (Ар№) Контроль (1) изменение рШ макрофагов в отсутствие ингибитора, антимицин А (2) - ингибитор транспорта электронов в дыхательной цепи митохондрий, УССР (3) разобщитель окислительного фосфорилирования в митохондриях, йодацетамид и 2-дезокси-О-глюкоза (4) - ингибиторы гликолитической активности кчепюк

Подкисление внутриклеточного содержимого наблюдалось и при инкубации клеток с разобщителем митохондриального окисления, и фосфорилирования РССР (рис. 9, кривая 3). Однако в этом случае выраженность подкисляющего эффекта агента к 45-й минуте была существенно (более чем в 5 раз) выше, чем при ингибирование электронного транспорта в миюхондриях Оценка дальнейших изменений р!П при действии разобщителя оказалась невозможной из-за массового повреждения плазматических мембран макрофагов и обусловленной этим утечкой флуоресцентного рН-индикатора флуоресцеина из клеток.

Иная картина имела место при ингибировании в макрофагах гликолитической активности, играющей значительную роль в их энергетике (Каган В.Е., и др., 1985). В результате введения в среду инкубации йодацетамида и 2-дезокси-Б-глюкозы (рис. 9, кривая 4). В этом случае величина рН1 практически не отличалась от контроля (рис. 9, кривая 1).

Полученные на изолированных перитонеальных макрофагах мышей данные о снижении их внутриклеточного рН при блокировании митохондриального электронного транспорта или разобщении окисления и фосфорилирования хорошо согласуются с результатами, полученными ранее

другими исследователями (Лейкина М.И., Литинская Л.Л., 1996) на разных типах клеток. Наши исследования показали также, что иш-ибирование гликолитической активности макрофагов не приводит к изменению их рН1 в изученных временных интервалах.

В сходных экспериментальных условиях был проведен ингибиторный анализ на фоне гипоксии (рис. 10). Сопоставление результатов, полученных в ходе этих экспериментов, с контрольной группой показало, что действие ингибиторов митохондриального электронного транспорта, а также разобщителей окисления и фосфорилирования вызывает определенную модификацию эффекта подщелачивания. Так, введение в среду инкубации РССР на фоне гипоксии приводило, к изменению направленности эффекта, вызывая незначительное, но достоверное подкисление, составлявшее около 0,087 ед. рН к 25-й минуте инкубации. Однако, к 45-й минуте гипоксии уровень внутриклеточного рН возрастал до 0,2 ед., приобретая характерную тенденцию, наблюдавшуюся в экспериментах без ингибиторов. Ипгибирование дыхания митохондрий в этих условиях при помощи антимицина А приводило к снижению подщелачивающего эффекта в начальной стадии гипоксии. К концу эксперимента, как и в случае с РССР, выраженность эффекта восстанавливалась. Ингабирование гликолитической активности макрофагов в этих условиях не вызывало сколько-нибудь существенных изменений в рН-ответе исследуемой популяции на действие гипоксии. Необходимо отметить, что достоверных различий в величине наблюдаемого параметра при использовании аргона или азота для создания условий гипоксии не наблюдалось.

Анализ полученных данных позволяет сделать следующие выводы. Влияние различных типов ингибиторов энергетического метаболизма на фоне гипоксии, создаваемой при помощи индифферентных газов, не приводит к купированию эффекта подщелачивания, значительно снижая его выраженность на начальной стадии гипоксии, фактически не затрагивая его терминальную часть. Таким образом, создаваемые в работе условия нормобарической гипоксии не приводили к существенному изменению энергетического метаболизма изучаемых клеточных популяций.

Внутриклеточные процессы, приводящие к повышению уровня прогонного градиента при нормобарической гипоксии, создаваемой с использованием индифферентных газов, по всей видимости, являются относительно независимыми как от энергетического метаболизма клетки, так и от гликолитической активности.

Полученные нами результаты и данные литературы о влиянии гипоксии на состояние внутриклеточной системы регуляции рН не позволяют выявить четкую причинно-следственную связь событий, происходящих в клетке в условиях гипоксии.

Рис 10 Влияние энергетических ингибиторов на характер рШ-ответа макрофагов при действии гипоксии, создаваемой с помощью азота (А) и аргона (Б).

По оси абсцисс время (мин) от начала продувки индифферентного газа над поверхностью инкубационного раствора с клетками, по оси ординат -- изменение вечичины рШ макрофагов по сравнению с контролем (без продувки) (АрЩ

Авторы большинства работ, в которых при действии гипоксии наблюдалось внутриклеточное закисление, связывают это с тем, что недостаток 02, блокируя электронный транспорт в дыхательной цепи митохондрий, приводит к снижению содержания в клетке АТФ и усилению анаэробного гликолиза, что, по их мнению, приводит к накоплению в клетках лактата и снижению рНь Это подкисление цитоплазмы, как полагают,

становится одним из основных факторов повреждающего действия гипоксии на клетки. Существует также мнение, что снижение внутриклеточного рН при гипоксии может быть связано не только с накоплением в клетках лактата, но и со снижением эффективности окислительного фосфорилирования и с изменением внутриклеточного содержания Са2+ (Clark I., Hunt N.H., 1983). Более того, строгий количественный анализ реакций, протекающих при гликолизе и функционировании дыхательной цепи митохондрий, проведенный рядом авторов (Davies P., el al., 1985), привел их к заключению, что основной причиной закисления клетки при анаэробиозе является не накопление лактата, а нескомпенсированный гидролиз АТФ.

Здесь необходимо отметить, что высказанные выше предположения о возможном влиянии гипоксии на внутриклеточный рН в основном рассматриваются исключительно в деструктивном действии гипоксии на клетку, с серьезными нарушениями внутриклеточных процессов окислительного фосфорилирования. Однако в нашей работе создаваемые условия гипоксии не приводили к сколько-нибудь серьезным нарушениям в данной области клеточного метаболизма. При этом экспериментальную стадию гипоксии успешно переживала большая часть клеток.

Мы полагаем, что наблюдаемые эффекты действия гипоксии, создаваемой в нашей работе, вероятно, отражают процессы клеточной адаптации к изменяющемся условиям. Для поддержания стационарного состояния живая система использует принцип обратной связи, или динамической аутостабилизации, что позволяет ей выбирать гот режим скоростей и ту направленность обменных реакций, которые обеспечивают оптимальный вариант приспособления к внешней среде. С этой точки зрения, наблюдаемый нами эффект действия гипоксии и реоксигенации на внутриклеточный рН вполне может быть охарактеризован как адаптационный или приспособительный, а механизм, лежащий в его основе, вероятно, является следствием работы всех внутриклеточных систем в данных условиях и вряд ли может быть связан с определенной клеточной структурой или одной специфичной регуляторной системой. Мы полагаем, что важным является понимание адаптации живой клетки как следствия физико-химической гетерогенности организации ее цитоплазмы, а разделение взаимодействующих субстратов при помощи мембран - важнейшим принципом организации живой системы, наиболее полно проявляющимся во время осуществления защитно-приспособительных реакциях. В этом контексте ультраструктурный анализ клетки на предмет изучаемого параметра или исследование топографического распределения параметра в пределах одной клетки и его изменение во времени является наиболее перспективным подходом в этой области исследований.

Выводы

1. На базе метода микрофлуориметрического анализа одиночных клеток разработана программно-аппаратная исследовательская система для изучения эффектов гипоксии и реоксигенации in vitro.

2. Показано, что 90-минутная гипоксия in vitro приводит к повышению на 0,4 ед. внутриклеточного рН перитонеальных макрофагов мышей. Последующая 90-минутная реоксигенация сопровождается снижением величины pHi до уровня контроля.

3. Обнаружено, что в условиях гипоксии и реоксигенации изменения внутриклеточного рН эндотелиальных клеток оказываются сходными с таковыми, наблюдавшимися на макрофагах и достоверно не различаются по величине.

4. Показано, что 90-минутная гипоксия сопровождается повышением уровня внутриклеточных АФК в макрофагах. Последующая реоксигенация приводит к более интенсивному нарастанию уровня АФК, который к концу инкубации клеток превосходит исходный уровень более чем в 2,5 раза.

5. Обнаружено, что в условиях гипоксии и реоксигенации изменения уровня АФК в эндотелиальных клетках имеют сходный характер с таковыми, имеющими место в макрофагах, однако менее выражены.

6. Показано, что в условиях гипоксии и реоксигенации не происходит увеличения содержания в популяции макрофагов клеток с поврежденной мембраной. В то же время в популяции эндотелиальных клеток в этих условиях повышение содержания клеток с поврежденной плазматической мембраной более выражено на стадии реоксигенации

7. Не выявлено существенных различий в выраженности эффектов, наблюдаемых на макрофагах и эндотелии при использовании аргона и азота для создания гипоксии.

8. Показано, что действие ингибиторов и разобщителей дыхательной цепи митохондрий и ингибирование гликолиза не приводят к изменению эффекта внутриклеточного подщелачивания, вызываемого инкубацией макрофагов в гипоксических условиях, создаваемых при помощи индифферентных газов.

9. Показано, что присутствие в инкубационной среде бикарбоната, а также ингибирование Na+/H+-o6Mena макрофагов этилизопропиламилоридом не влияет на выраженность изменений внутриклеточного рН и АФК при действии гипоксии и реоксигенации.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Исследование УФ- индуцированных клеточных эффектов перитонеальных макрофагов при действии индифферентных газов in vitro // Тезисы Российской конференции "Организм и окружающая среда:

жизнеобеспечение и зашита человека в экстремальных условиях." 2000, С.106-108 (соавт. Туровецкий В.Б., Андреев А.И., Буравкова Л.Б.).

2. Влияние аргона и азота на перитонеальные макрофаги мышей и их устойчивость к повреждающему действию УФ-облучения in vitro // Авиакосмическая и экологическая медицина. 2001. Т. 35. № 3. С. 39-43 (соавт. Туровецкий В.Б., Андреев А.И., Буравкова Л.Б ).

3. Клеточные эффекты краткосрочной гипоксии и реоксигенации // Материалы X Международного симпозиума «Эколого-физиологические проблемы адаптации». 2001. М., С. 121-123 (соавт. Буравкова Л.Б., Туровецкий В.Б.).

4. Модификация ряда функциональных и физико-химических параметров эндотелиальных клеток в условиях гипоксии и реоксигенации // Материалы XII Конференции по космической биологии и авиакосмической медицине. М., 2002. С. 108 (соавт. Туровецкий В.Б., Рудаковский М.Л, Буравкова Л.Б.).

5. Microfluorimetry of cultured endothelial cclls during hypoxia and reoxygenation // Abstract on Joint Congress of Cell Pathology, Heraclion, Greece, 2002. P. 64 (соавт. Buravkova L.B., Turovetsky V.B.).

6. Автоматизация системы сбора и анализа данных микрофлуориметрических измерений in vitro // Тезисы конференции молодых ученых и студентов, посвященной Дню космонавтики. М., 2002. С. 4.

7. Влияние гипоксии и реоксигенации на уровень активных форм кислорода в клетках // Материалы 3-й Всероссийской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция». М., 2002. С. 34-35 (соава. Туровецкий В.Б., Буравкова Л.Б.).

8. Действие краткосрочной гипоксии и реоксигенации на перитонеальные макрофаги мышей in vitro // Российский физиологический журнал им. Сеченова. 2003. Т. 89. № 3. С. 329-338 (соавт. Туровецкий В.Б., Буравкова Л.Б., Рубин А.Б.).

9. Влияние серотонина на гидролитическую активность и внутриклеточный рП перитонеальных макрофагов мышей // Вестник Московского университета 2003. Сер. 16. Биолог. № 2. С. 27-29 (соавт. Туровецкий В.Б., Пастушкова Л.Х., Андреев А.И., Буравкова Л.Б.).

10. Микрофлуориметрический анализ одиночных клеток : перспективы развития // Тезисы конференции молодых ученых и студентов, посвященной Дню космонавтики. М., 2003. С. 10-11

11. Влияние измененного содержания кислорода на культивируемый эндотелий: роль индифферентных газов // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2004. Т. 90. № 8 (Приложение). С. 328-329 (соавт. Буравкова Л.Б.).

12. Post-hypoxic oxidative stress after radicle protrusion as a possible cause for the production of abnormal seedlings in pea. Seed Sci. & Technol. 2004. 32, P. 283296 (соавт. Veselova T.V., Veselovsky V.A., Turovetsky V.B., Vanyushin B.F., Aleksandrushkina N.I., Rubin A.B.).

Типография ООО «Телер» 127299 Москва, ул. Космонавта Волкова, 12 Лицензия на полиграфическую деятельность ПД № 00595

Подписано в печать 18.05.2005 г. Формат 60x90 1/16. Тираж 100 экз. Бумага «Снегурочка» 1,5 печ.л. Заказ № П 432

î;H 1 о 8 9 И

РНБ Русский фонд

2006-4 6597

Гипоксия - широко распространенное явление, возникающее как в условиях дефицита кислорода во внешней среде, так и в результате различных патологических состояний, связанных с нарушением функций дыхательной, сердечно-сосудистой систем, а также транспортной функции крови [1]. Несмотря, на многолетнюю историю вопроса, интерес к данной проблеме не ослабевает, более того в последнее время появляется все больше работ, посвященных клеточным механизмам гипоксических состояний [2,3,4,5].

Важнейшей задачей в клинической практике является купирование постгипоксических состояний, адаптация организма к гипоксии, особенно в тех областях жизнедеятельности человека, где существует риск воздействия экзогенной гипоксии. Как правило, такой риск обусловлен профессиональной деятельностью, и возникновение гипоксических условий является чрезвычайным происшествием в результате отказа или технической неисправности систем жизнеобеспечения. Гипоксия в данных условиях может протекать с различной скоростью, вызывая тяжелые физиологические нарушения. Космонавты, летчики, подводники, пожарники, шахтеры - это основная группа риска.

В последнее время активно рассматривается возможность создания газовых дыхательных смесей, с использованием индифферентного газа аргон, в качестве газа разбавителя кислорода. Такие дыхательные смеси, в условиях недостатка кислорода в окружающей среде, снижают негативное воздействие гипоксии, и позволяют человеку в этих условиях более длительное время сохранить концентрацию внимания и адекватность г действий.В . .частности,. было показано [6,7] .что присутствие .Аг в дыхательных газовых смесях оказывает положительное действие на переносимость организмом гипоксии по целому ряду параметров, что, по мнению авторов, связано с его физиологической активностью, влияющей на внутриклеточный метаболизм.

Физиологические эффекты индифферентных газов, таких как N2, Не, Нг, активно изучаются в условиях повышенного давления газовой среды, где их использование обусловлено необходимостью купирования азотного наркоза, нервного синдрома, высоких давлений, декомпрессионной болезни [8,9,10]. Аргон, обычно не используют в практике глубоководных водолазных спусков, поскольку плотность этого газа больше плотности азота, что может создать проблемы в функционировании дыхательной системы при высоком давлении газовой среды. Его наркотическая способность выше, чем у азота и при повышении давления, уже до одной атмосферы вызывает наркотический эффект у человека и млекопитающих [11,12]. Выраженных физиологических эффектов индифферентных газов (за исключением ксенона и криптона) при нормальном давлении не зафиксировано, хотя показано, например, что замена азота на гелий в дыхательной газовой смеси приводит к изменению функций легких [13,14].

Таким образом, вопрос о том, какой вклад вносят индифферентные газы в течение физиологических процессов при гипоксии остается открытым. Немногочисленные данные по этой проблеме получены при исследованиях, проводимых на целом организме, и в силу такого подхода во многом отражают не только эффекты влияния гипоксии создаваемой при помощи индифферентных газов на человеческий организм, но и весь спектр физиологических реакций в этих условиях. Исследования в этой области на уровне клетки - немногочисленны и зачастую противоречивы [15,16,17]. Такая ситуация обусловлена рядом причин.

Во-первых, наблюдаемые на определенных клетках изменения могут быть" специфическими только для данного типа клеток, не позволяя- дать оценку полученных эффектов для клеточного уровня в целом. Поэтому очень важен сам выбор того или иного типа клеток. На наш взгляд, для изучения влияния гипоксии in vitro, наиболее адекватным выбором был бы выбор тех клеток, которые в силу своих функциональных особенностей или принадлежности к тем или иным: органам , и тканям, сталкиваются с условиями гипоксии наиболее часто и, соответственно,, обладают механизмами коррекции своих функций; адаптации к, этим; условиям, например, клетки эндотелия и имуннокомпетентные клетки.

Во-вторых, условия создания гипоксии, используемые в экспериментальных работах, значительно разнятся. Необходимо отметить, что важен не только сам; метод дезоксигенации, но и контроль, других внешних параметров, которые при* определенных условия могут влиять на-клетку не менее активно, чем? снижение парциального уровня; кислорода в среде.

И, наконец:, разнообразие изучаемых внутриклеточных параметров и методов; их исследования. По всей видимости, при изучении? влияния, гипоксии in vitro, исследуемые внутриклеточные параметры должны быть, одинаково; "показательны" для любого клеточного типа, в. какой-то мере носить интегральный характер, отражая состояние- внутриклеточных системна функциональный: статус клетки. В полной мере к таким можно отнести систему внутриклеточной рН-регуляции; систему регуляции активных форм; кислорода, которая в последнее время: все чаще рассматривается, как вполне самостоятельная; полноценная мессенджерная система; играющая важную роль, в; клеточной физиологии приг различных, экстремальных состояниях, в том числе и таких, как гипоксия и реоксигенация. Безусловно, чрезвычайно важен и сам; исследовательский, метод. Вероятно, он должен минимально влиять на- состояние внутриклеточных систем, как в процессе подготовки объектов к эксперименту, так и непосредственно во время измерений:

Микрофлуориметрический анализ^ одиночных клеток с помощью флуоресцентных зондов; в значительной; степени удовлетворяет описанным условиям, являясь высоко информативным, и в: значительной степени интактным по отношению к исследуемым клеткам.

Нельзя не остановится и на таком важном для живых систем процессе, как реоксигенация. Во многих случаях восстановление парциального давления кислорода в тканях несет не менее повреждающий эффект, чем сама гипоксия. Именно поэтому важно знать механизмы и динамику этого повреждения для выработки оптимальной тактики и стратегии выхода из постгипоксических состояний.

Таким образом, выбор наиболее адекватных типов клеток, исследуемых параметров, методических подходов для моделирования процессов гипоксии и реоксигенации in vitro с использованием индифферентных газов, применение достижений современной науки и техники, дающих качественно новые возможности, для проведения исследований на уровне клетки, может позволить пролить свет на многие аспекты в данном научном направлении.

В связи с выше изложенным в работе была поставлена следующая цель: исследовать влияние нормабарической гипоксии, создаваемой при помощи аргона или азота, иа изменения внутриклеточного рН и уровня активных форм кислорода в перитоиеальных макрофагах мышей и j и до тел и ал ьиых метках человека.

В работе были определены следующие основные задачи:

1. Разработать на базе метода микрофлуориметрического анализа одиночных клеток программно-аппаратную исследовательскую систему для изучения эффектов гипоксии и реоксигенации in vitro.

2. Изучить влияние гипоксии и реоксигенации на целостность плазматических мембран перитоиеальных макрофагов мышей и эндотелиальных клеток человека.

3. Исследовать влияние гипоксии и реоксигенации на динамику внутриклеточного уровня активных форм кислорода (АФК) перитонеальных макрофагов мышей и культуры эндотелиальных клеток.

4. Изучить влияние гипоксии, создаваемой при помощи индифферентных газов (аргона и азота), и последующей реоксигенации на внутриклеточный рН перитонеальных макрофагов мышей и эндотелиальных клеток человека.

5. Сравнить реакции клеток по изучаемым параметрам in vitro на гипоксические условия при использовании азота и аргона.

Выводы:

1. На базе метода микрофлуориметрического анализа одиночных клеток разработана программно-аппаратная исследовательская система для изучения эффектов гипоксии и реоксигенации in vitro.

2. Показано, что 90-минутная гипоксия in vitro приводит к повышению на 0,4 ед. внутриклеточного рН перитонеальных макрофагов мышей. Последующая 90-минутная реоксигенация сопровождается снижением величины pHi до уровня контроля.

3. Обнаружено, что в условиях гипоксии и реоксигенации изменения внутриклеточного рН эндотелиальных клеток оказываются сходными с таковыми, наблюдавшимися на макрофагах и достоверно не различаются по величине.

4. Показано, что 90-минутная гипоксия сопровождается повышением уровня внутриклеточных АФК в макрофагах. Последующая реоксигенация приводит к более интенсивному нарастанию уровня АФК, который к концу инкубации клеток превосходит исходный уровень более чем в 2,5 раза.

5. Обнаружено, что в условиях гипоксии и реоксигенации изменения уровня АФК в эндотелиальных клетках имеют сходный характер с таковыми, имеющими место в макрофагах, однако менее выражены.

6. Показано, что в условиях гипоксии и реоксигенации не происходит увеличения содержания в популяции макрофагов клеток с поврежденной мембраной. В то же время в популяции эндотелиальных клеток в этих условиях повышение содержания клеток с поврежденной плазматической мембраной более выражено на стадии реоксигенации.

7. Не выявлено существенных различий в выраженности эффектов, наблюдаемых на макрофагах и эндотелии при использовании аргона и азота для создания гипоксии.

8. Показано, что действие ингибиторов и разобщителей дыхательной цепи митохондрий и ингибирование гликолиза не приводят к изменению эффекта внутриклеточного подщелачивания, вызываемого инкубацией макрофагов в гипоксических условиях, создаваемых при помощи индифферентных газов.

9. Показано, что присутствие в инкубационной среде бикарбоната, а также ингибирование Na+/H+-o6MeHa макрофагов этилизопропиламилоридом не влияет на выраженность изменений внутриклеточного рН и АФК при действии гипоксии и реоксигеиации.