Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на адгезию и агрегацию тромбоцитов при различных скоростных параметрах движения крови и при изменении рН

На правах рукописи

БУДНИК Иван Александрович

ВЛИЯНИЕ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА АДГЕЗИЮ И АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СКОРОСТНЫХ ПАРАМЕТРАХ ДВИЖЕНИЯ КРОВИ И ПРИ ИЗМЕНЕНИИ рН

14.00.16 — патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□03065548

Саратов - 2007

003065548

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Брилль Григорий Ефимович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Пучиньян Даниил Миронович, доктор медицинских наук, профессор Белов Лев Георгиевич

Ведущая организация — ФГУ «Государственный научный центр лазерной медицины Росздрава»

Зашита состоится « jO » 2007 г. в /Л час

на заседании диссертационного совета íf208 094 03 при ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава» (410012, г Саратов, ул Б Казачья, 112)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава»

Автореферат разослан «_ f» СвКШЛ/pJU 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент

Бабиченко Н Е

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ) в настоящее время находит широкое применение в различных областях практического здравоохранения как в России, так и за рубежом Многолетний опыт использования НИЛИ убедительно свидетельствует о его высокой терапевтической эффективности в лечении целого ряда заболеваний и патологических процессов [Корочкин И M и др , 1988, Бабушкина Г В , Картелишев А В , 1998, Ковалева Т В , 2001, 2002, Амиров H Б , Абдрахманова А И , 2002, Белов В В , Лозовая Л П, Аксенов В В , 2005, КемаловРФ, 2006, Ohshiro 1 , Calderhead RG, 1988, Ad N, Orón U, 2001, Yaakobi T et al, 2001, Lampl Y, 2007] На сегодняшний день сам факт позитивного воздействия НИЛИ не вызывает сомнений, однако вопрос о молекулярно-клеточных событиях, лежащих в его основе, по-прежнему остается предметом дискуссии теоретиков и клиницистов

Одним из наиболее удобных объектов для исследования закономерностей, лежащих в основе лазерного биоэффекга, являются тромбоциты Это связано с простотой изоляции кровяных пластинок, а также с существованием большого числа методов, позволяющих детально изучить их функциональное состояние С другой стороны, исследование влияния НИЛИ на тромбоциты имеет и большое прикладное значение, поскольку нарушения тромбоцитарного звена системы гемостаза играют заметную роль в патогенезе многих форм патологии, в том числе атеросклероза, ишемической болезни сердца, инсульта, сахарного диабета, ангифосфолипидно!о синдрома и др [Femberg WM, Bruck DC, 1991, Castelli W P, 1996, Zeller JA, Tschoepe D, Kessler С, 1999, Libby Р, 2000, Sobol А В, Watala С, 2000, de Groot PG, Derksen RH, 2005, Vega-Ostertag M E , Pierangeh S S , 2007]

Имеющиеся в литературе сведения о характере и механизмах воздействия НИЛИ на кровяные пластинки носят фрагментарный характер и во многом противоречивы Существуют значительные трудности в сопоставлении резульгатов, полученных разными авторами, что связано, с одной стороны, с особенностями использованных биообъектов, с другой — с применением различных источников лазерного излучения, доз и режимов фотовоздействия [Беспалова Т А , 1997, Брилль А Г, 1998, Спасов А А, Недогода В В , Куаме Конан, 1998а, 19986, Arora RR, Mueller H S , Smha A К, 1993, Olban M et al, 1998, Brill AG et al, 2000] В связи с этим возникает необходимость исследования влияния различных видов НИЛИ на функции тромбоцитов в стандартных условиях эксперимента, что сделает сравнительный анализ полученных результатов более корректным.

При движении форменных элементов в потоке крови они испытывают воздействие напряжения сдвига, которое является важным фактором в регуляции функции тромбоцитов [Ikeda Y et al, 1991, Kroll M H et al, 1996, Ruggeri Z M , 1997, Savage В , Sixma J J , Ruggeri Z M , 2002, Sadler J E , 2005, Denis С V , Wagner D D , 2007] Вместе с тем особенности фотореактивности кровяных пластинок, находящихся в различных гидродинамических условиях практически не исследованы

НИЛИ хорошо зарекомендовало себя при лечении многих заболеваний и патологических процессов, в патогенезе которых существенная роль принадлежит нарушениям кислотно-щелочного баланса [Мусиенко Ю И., Нечипуренко Н.И , Камышников В С, 2003; Мусиенко Ю И, 2005, Ререкин И А, 2007, Al-Watban F А , Zhang X Y., 2004, Byrnes KR et al, 2004, Bayat M et al, 2005, Hawkms D, Houreld N, Abrahamse H, 2005] Однако модификация функции кровяных пластинок в условиях ацидоза и алкалоза до сих пор не являлась предметом глубокого изучения

Цель исследования

Изучить влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на функции тромбоцитов при различных скоростях с-двига, а также при негазовых формах нарушений кислотно-щелочного баланса

Задачи исследования

1 Изучить влияние НИЛИ с различной длиной волны на адгезию и агрегацию тромбоцитов при низкой (200 с"1) и высокой (1 800 с-1) скоростях сдвига

2 Проанализировать влияние НИЛИ на характер и эффективность сдвиговой регуляции функции тромбоцитов

3 Исследовать специфичность и временную динамику реакции тромбоцитов на фотовоздействие при различных скоростных параметрах движения крови

4 Изучить влияние НИЛИ на агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ, адреналином и коллагеном

5 Исследовать агрегацию тромбоцитов при негазовых формах нарушения кислотно-щелочного баланса

6 Изучить влияние НИЛИ на агрегационную функцию тромбоцитов в условиях нарушения кислотно-щелочного баланса.

Научная новизна

Впервые выявлены особенности реакции кровяных пластинок, находящихся в различных гидродинамических условиях, на воздействие НИЛИ красной, инфракрасной и синей областей спектра. Показана зависимость характера отклика тромбоцитов от дозы и режима лазерного облучения Выявлена определённая временная динамика реализации фотоэффекта. Установлено влияние НИЛИ на эффективность сдвиговой регуляции функции тромбоцитов Изучены возможности лазерной модификации агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ, адреналином и коллагеном

Впервые исследованы функциональные особенности кровяных пластинок в условиях ацидоза и алкалоза и установлена зависимость фотореактивности тромбоцитов от величины средового pH Доказана возможность коррекции агрегационной функции тромбоцитов, нарушенной в условиях ацидоза и алкалоза, под влиянием НИЛИ

Обнаружено новое биологическое явление — периодические изменения адгезивных и агрегационных свойств кровяных пластинок в цельной крови и обогащенной тромбоцитами плазме in vitro

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом научной деятельности СГМУ Номер государственной регистрации — 02 03042330329

Практическая значимость

Установленные в работе закономерности влияния НИЛИ различных спектральных диапазонов на функции тромбоцитов могут служить теоретическим обоснованием выбора того или иного вида лазерного излучения с целью оптимизации лазерной терапии

Новые сведения о лазерной модификации сдвиговой регуляции функции тромбоцитов, являются основанием для разработки новых подходов к лазеротерапии, учитывающих различную фотореактивность кровяных пластинок, находящихся в различных отделах сосудистого русла

Обнаруженные особенности фотореактивности тромбоцитов в условиях ацидоза или алкалоза, а также возможности лазерной коррекции функции тромбоцитов, измененной при нарушениях кислотно-щелочного баланса, могут быть учтены при оптимизации существующих методов лазеротерапии и способов лазерной коррекции нарушений громбоцитарного звена системы гемостаза.

Полученные данные о наличии периодических изменений адгезивных и агрегационных свойств тромбоцитов могут служить ориентиром для разработки тестов, основанных на многократных последовательных измерениях параметров функции тромбоцитов в клинике, с целью выявления десинхроноза, который может явиться предиктором различных форм паюлогии и иметь как диа! ностическое, так и прогностическое значение

Основные положения, выносимые на защиту

1 Предварительное облучение цельной крови человека in vitro светом красного, инфракрасного и синего лазеров оказывает модифицирующее влияние на функцию тромбоцитов, зависящее от длины волны, дозы облучения и скоростных параметров движения крови

2 Под влиянием НИЛИ изменяется эффективность сдвиговой регуляции функции тромбоцитов

3 Характер и временная динамика отклика тромбоцитов на воздействие сдвигового сигнала в значительной мере определяются длиной волны излучения

4 НИЛИ красной области спектра оказывает модулирующее влияние на агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ, адреналином и коллагеном

5 При декомпенсированных негазовых формах нарушений кислотно-щелочного баланса происходит угнетение агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ, адреналином и коллагеном

6 НИЛИ оказывает корригирующий эффект в отношении АДФ- и адреналин-индуцированной агрегации кровяных пластинок, нарушенной в условиях ацидоза и алкалоза

7 Существует автоколебательный процесс, модифицирующий функцию тромбоцитов в цельной крови в условиях m vitro

Внедрение

Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс на кафедре патологической физиологии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава» По материалам диссертации внедрены четыре рационализаторских предложения

Апробация диссертации

Результаты диссертационного исследования доложены и обсуждены на научных конференциях кафедры патологической физиологии (2006-2007 гг ), на совместном заседании кафедр патологической физиологии и нормальной физиологии Саратовского государственного медицинского университета (2007 г ) Фрагменты работы представлялись на 66, 67 и 68-й научно-практических конференциях студентов и молодых специалистов Саратовского государственного медицинского университета «Молодые ученые — здравоохранению региона» (Саратов, 2005, 2006, 2007), на III осенней научно-практической конференции студентов и молодых ученых Саратовского государственного медицинского университета «Молодежь и наука итоги и перспективы» (Саратов, 2005), на 65-й научно-практической конференции молодых ученых и студентов Волгоградского государственного медицинского университета «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2007), на XXIII, XXIV и XXVII Международных научно-практических конференциях «Применение лазеров в медицине и биологии» (Николаев, 2005, -Ялта, 2005, Харьков, 2007), на 19-м Международном Конгрессе по тромбозу (19th International Congress on Thrombosis, Tel-Aviv, Israel, 2006), на VI Международной конференции «Гемореология и микроциркуляция» (Ярославль, 2007), на XXI Конгрессе Международного общества по тромбозу и гемостазу (XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Geneva, Switzerland, 2007).

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, в которой описываются материалы и методы исследования, четырех глав, отражающих результаты собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического списка, включающего 50 отечественных и 369 зарубежных источников Диссертация изложена на 321 странице, включает 51 таблицу и 65 рисунков

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на крови 156 здоровых доноров обоего пола в возрасте 20-50 лет Венозную кровь, стабилизированную 3,8 % раствором трехзамещенною цитрата натрия (9 1), собирали в полипропиленовую пробирку и использовали через 60 мин после взятия Обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) получали центрифугированием цельной цитратной крови (800 об/мин) в течение 7 мин Бедную тромбоцитами плазму получали повторным центрифугированием остатка того же образца крови (3000 об/мин) в течение 15 мин

Адгезию и агрегацию тромбоцитов исследовали с помощью прибора "Cone and Plate(let) Analyzer" (Matis Medical Ltd, Израиль) Образцы цельной крови в объеме 130 мкл помещали на дно полистиреновой ячейки и подвергали воздействию скорости сдвига 200 или 1 800 с 1 в течение 2 мин Далее ячейку отмывали от крови фосфатным буфером (рН 7,4), адгезированные объекты обрабатывали красителем May-Grunwald и исследовали под микроскопом «БИОЛАМ» П2-1 (ОАО «ЛОМО», Россия), оснащенным CCD-камерой Полученное изображение обрабагывали с помощью программы имидж-анализа Регистрировали два показателя (1) площадь покрытия ячейки адгезированными объектами (в процентах от общей площади ячейки) и (2) средний размер адгезированных частиц (в мкм2) Для оценки эффективное га сдвиговой регуляции функции тромбоцитов для каждого показагеля производили расчет индексов сдвиговой регуляции (ИСРпл и ИСРразм), представляющих собой отношение значения исследуемого параметра при высокой скорости сдвига к его значению при низкой скорости сдвига [Брилль Г Е, Г'аспарян Л В , 2004]

Агрегацию кровяных пластинок в ОТП исследовали на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов "BIOLA" LA 230 (НПФ «БИОЛА», Россия) В качестве индукторов агрегации тромбоцитов использовали АДФ (5,0 и 0,73 мкМ), адреналин (5,5 и 2,5 мкМ), ристоцетин (1,5 мг/мл), коллаген (5,0, 1,25 и 0,625 мкг/мл) и арахидоновую кислоту (1,5 мМ) ("DiaMed AG", Швейцария) Агрегометрию проводили в условиях термостатирования (37 °С) и непрерывного перемешивания образцов ОТП магнитной мешалкой со скоростью 800 об/мин

Связывание фибриногена и экспрессию Р-селектина на мембране тромбоцитов изучали методом проточной цитометрии на приборе EPICS XL Coulter Flow Cytometer ("Coulter", США) с аргоновым лазером (488 нм) с использованием FITC-конъюгированных моноклональных антител против фибриногена ("Dako", Дания) и CD62P ("Becton Dickinson", США) соответственно Оценивали два параметра процент флюоресцирующих клеток и средний уровень флюоресценции (в условных единицах)

В работе использована полупроводниковая лазерная установка «Азор-2К-02» (ООО «Азор», г Москва), генерирующая излучение в красной (к = 0,65 мкм, 19 мВт) или инфракрасной (к = 0,98 мкм, 36 мВт) облас!ях спектра, а также экспериментальная лазерная установка, излучающая свет в синей области спектра (X - 0,46 мкм, 29 мВт)

В опытах по изучению влияния НИЛИ на адгезию и агрегацию тромбоцитов облучение цельной крови проводили в течение 2, 4, 6 или 8 мин Соответственно доза фотовоздействия в пересчёте на 1 мл крови составила для

7

красного лазера 3,8, 9,7, 20,1 и 43,4 Дж, для инфракрасного — 7,2, 18,4, 38,1 и 82,3 Дж и для синего — 5,8, 14,8, 30,7 и 66,3 Дж Функцию кровяных пластинок исследовали сразу после окончания облучения

В опытах по изучению специфичности и временной динамики влияния НИЛИ на функции тромбоцитов мощность красного, инфракрасного и синего лазеров уменьшали до 10 мВт Облучение проводили в течение 20 мин При этом доза фотовоздействия составила 15 Дж на 1 мл крови Исследования начинали сразу после окончания фотовоздействия, а также через 10,20 и 30 мин При изучении периодической функции тромбоцитов исследования проводили каждые 10 мин в течение 2-4 часов Использовали Клексан (эноксапарин натрия) — 5 ЕД/мл, 2',5-ADP и 2MeS-ADP (блокаюры P2Yr и Р2У12-рецепторов АДФ) — 10 мкМ

При исследовании агрегации тромбоцитов проводили облучение ОТП светом красного лазера в течение 20 мин При этом экспозиционная доза составила 78 Дж на 1 мл ОТП Агрегацию тромбоцитов изучали сразу по окончании облучения

Декомпенсированный негазовый ацидоз моделировали добавлением к 1 мл ОТП 50 или 100 мкл 0,1 М раствора соляной кислоты При этом рН ОТП снижался соответственно до 7,2 (умеренный ацидоз) и 7,0 (тяжелый ацидоз) Декомпенсированный негазовый алкалоз моделировали добавлением к 1 мл ОТП 25 или 50 мкл 0,1 М раствора гидроксида натрия При этом рН ОТП повышался соответственно до 7,7 (умеренный алкалоз) и 8,0 (тяжелый алкалоз) Значения рН ОТП контролировали с помощью рН-метра-термометра «Нитрон-рН» (НПП «Биомер», Россия), оснащенного стеклянным комбинированным элекгродом ЭСК-10614 со встроенным одноюиочевым электродом сравнения (НПО «Измерительная техника ИТ», Россия)

Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью пакета прикладных программ STATISTIC A (StatSoft Inc, USA, версия 6) Применялись следующие методы критерий Шапиро-Уилка, критерий Диксона, критерий Левена, критерий Стьюдента, критерий Стьюдента в аппроксимации Сатгертвайта, однофакторный дисперсионный анализ, критерий Ньюмена-Кейлса, парный критерий Стьюдента и критерий Уилкоксона (W) для парных сравнений Рассчитывался коэффициент корреляции Пирсона (г) Уровень значимости а, принятый в исследовании, равен 0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние НИЛИ на адгезию и агрегацию тромбоцитов цельной крови в условиях низкой и высокой скорости сдвига

При низкой скорости сдвига (200 с"1) в контрольных образцах крови площадь, занимаемая объектами на полистирене, составила 8,3 + 1,2 %, средний размер адгезированных частиц был равен 26,9 ± 1,8 мкм2 Облучение крови светом красного лазера в малой дозе (3,8 Дж) вызывало статистически значимое уменьшение площади покрытия ячейки в среднем на 14% (Р = 0,045) При увеличении дозы облучения заметных изменений данного показателя не

обнаруживалось Облучение крови инфракрасным и синим лазером при всех использованных дозах фотовоздействия не оказывало существенного влияния на площадь покрытия ячейки Размер тромбоцитарных агрегатов, фиксировавшихся на полистирене, не отличался от контрольных значений ни при одном из использованных видов лазерно1 о воздействия

В процессе фотовоздействия происходило изменение силы связи между показателями площади и размера при низкой скорости сдвига если в контроле коэффициент корреляции г составлял 0,57 (Р = 0,014), то после воздействия красного лазера г равнялся 0,58 (Р = 0,008), синего — 0,69 (/'<0,001) и инфракрасного — 0,72 (Р < 0,001) Следовательно, при лазерном облучении степень связи между параметрами, характеризующими адгезию и агрегацию пластинок, в условиях низкой скорости сдвига несколько возрастала

При высокой скорости сдвига (1 800 с"1) в контрольных образцах крови площадь покрытия ячейки составила 7,8 ± 2,4 %, средний размер адгезирован-ных частиц был равен 49,0 ± 9,0 мкм2 В этих условиях воздействие красного лазерного света было эффективным только в максимальной использованной дозе (43,4 Дж) и выражалось в снижении обоих показателей площадь покрытия ячейки уменьшалась в среднем на 37 % (Р = 0,024), размер адгезированных частиц уменьшался на 41 % (Р< 0,001) по сравнению с контролем Излучение инфракрасного лазера в малых дозах (7,2 и 18,4 Дж) вызывало существенные изменения только площади, занимаемой осевшими частицами данный параметр возрастал в среднем на 49 % (Р = 0,016) и 53 % (Р = 0,014) соответственно При последующем увеличении дозы площадь покрытия ячейки не отличалась от контроля Однако при использовании инфракрасного свега в максимальной дозе (82,3 Дж) происходило снижение среднего размера осевших частиц по сравнению с контролем на 26 % (Р = 0,041) Воздействие на кровь светом синего лазера было эффективным лишь в малой дозе (5,8 Дж) и заключалось в увеличении площади, занимаемой адгезированными объектами, на 60 % (Р = 0,020) относительно контроля Размер тромбоцитарных агрегатов не изменялся во всем диапазоне использованных доз синего лазерною излучения

После фотовоздействия изменялась теснота связи между показателями адгезии и агрегации тромбоцитов при высокой скорости сдвига Если в контроле коэффициент корреляции г составил 0,83 (Р < 0,001), то после облучения светом красного лазера г равнялся 0,74 (Р = 0,004), синего — 0,29 (Р = 0,119) и инфракрасного — 0,66 (Р < 0,001) Следовательно, при облучении крови инфракрасным лазером корреляционная связь между величиной площади адгезии и размером агрегатов ослабевает, а при воздействии синего лазера — практически исчезает

Таким образом, реакция кровяных пластинок на лазерное облучение зависит не только от паттерна фотовоздействия, но и от скоростных параметров движения крови Установленные особенности фотореактивности кровяных пластинок, находящихся в различных гидродинамических условиях, позволяют предположить неоднотипность биолог ического ответа при облучении крови, находящейся в венозном и артериальном отделах сосудистого русла

Влияние НИЛИ на эффективность сдвиговой регуляции функции тромбоцитов

В контрольных образцах крови увеличение скорости сдвига с 200 до 1 800 с-1 не приводило к заметному изменению площади, занимаемой осевшими частицами на полистирене, т е ИСРпл был близок к единице При этом, однако, происходило существенное увеличение размера агрегатов ИСРразм равнялся 1,82 (Р < 0,001), что указывает на усиление агрегационной способности тромбоцитов при повышении скорости движения крови

Под влиянием НИЛИ появлялась чувствительность тромбоцитов к сдвиговому сигналу, оцениваемая по величине ИСРпл при воздействии красного света в максимальной использованной дозе (43,4 Дж), инфракрасного и синего — в малой дозе (7,2 и 5,8 Дж соответственно) Если для крови, облученной красным лазером, сдвиговый сигнал носил ингибиторный характер, то при облучении крови инфракрасным и синим лазером— стимуляторный

Эффективность сдвиговой регуляции агрегационной способности тромбоцитов (ИСРразм) снижалась под влиянием максимальных использованных доз красного и инфракрасного лазерного излучения (43,4 и 82,3 Дж соответственно), тогда как при воздействии синего лазера отмечалась тенденция к увеличению ИСРразм

Следовательно, после лазерного облучения крови изменяется реакция тромбоцитов на воздействие сдвиговых сил, и характер этих изменений зависит от длины волны и дозы излучения

Исследование специфичности и временной динамики влияния различных видов НИЛИ на функции тромбоцитов

Для выявления специфики биоэффектов, вызываемых светом красного, инфракрасного и синего лазеров, мы изучили зависимость адгезии и агрегации тромбоцитов цельной крови от длины волны излучения, уравняв параметры фотовоздействия по мощности (10 мВт), продолжительности (20 мин) и дозе (15 Дж) облучения Опыты выполнены при скорости сдвига 1 800 с-1

Сразу после прекращения облучения крови светом красного лазера площадь покрытия ячейки уменьшалась в среднем в 1,6 раза (/" = 0,013) Однако уже через 10 мин данный показатель превышал контрольное значение в 1,4 раза (Р = 0,010) Средний размер осевших объектов сразу после окончания облучения уменьшался в 1,6 раза (Р < 0,001). Однако спустя 10 мин данный показатель превышал его значение в контрольных образцах в 1,2 раза (Р = 0,038)

Через 1 и 10 мин после окончания облучения крови светом инфракрасного лазера наблюдалось возрастание площади покрытия в 1,3 раза (Р - 0,033) и в 1,5 раза (Р — 0,002) соответственно Средний размер адгезированных частиц сразу после прекращения облучения крови заметно возрастал и превышал уровень контроля в 1,8 раза (Р< 0,001) Спустя 10 мин после фотовоздействия данный показатель превышал контрольное значение только в 1,3 раза (Р< 0,001)

Сразу после окончания облучения крови светом синего лазера площадь, занимаемая осевшими на полистирене частицами, не отличалась от контроль-

ного значения. Через 10 мин после окончания фотовоздей ав ия происходило увеличение данного параметра в 1,5 раза (Р = 0,001) Средний размер агрегатов, фиксировавшихся на полистирене, сразу после прекращения фотоэкспозиции не отличался от контроля Однако спустя 10 мин данный параметр возрастал в 1,7 раза (Р< 0,001)

При всех использованных видах НИЛИ спустя 20 и 30 мин после окончания фотовоздействия оба исследованных показателя не отличались от контроля

Таким образом, облучение цельной крови низкоинтенсивными лазерами с различной длиной волны при стандартизации дозы облучения вызывает начальную разнонаправленную реакцию тромбоцитарной системы на сдвиговое воздействие, сменяющуюся весьма сходным интегральным ответом в виде увеличения площади покрытия ячейки и среднего размера адгезированных объектов

Периодические изменения адгезии и агрегации кровяных плас ганок

При изучении временной динамики реализации лазерного эффекта на функцию тромбоцитов в цельной крови автор столкнулся с неизвестным до настоящего времени явлением, изучение которого не мошо быть изначально включено в программу исследования в контрольных (необлученных) пробах, зарегистрированных с 10-минутными интервалами, были обнаружены существенные (в 2-3 раза) различия показателей, характеризующих адгезию и агрегацию кровяных пластинок на полистирене при высокой скорости сдвига В то же время результаты измерений, сделанных через 60, 100 и 140 мин после экстракции крови, у каждого взятого в отдельности донора практически совпадали

При графическом представлении временной динамики изучаемых показателей, стало очевидно, что они изменяются во времени с отчетливой периодичностью (рис 1) Выраженные колебания площади покрытия ячейки и среднего размера адгезированных частиц выявлялись у каждого обследованного донора Средние значения осцилляторного периода для показателей площади и размера

Время после взятия крови, мин

Рис. 1. Периодические изменения среднего размера агрегатов в крови донора К при высокой скорости сдвига (1 800 с"1)

практически совпадали и составляли около 35 мин. Амплитуда цикла (разность максимального и минимального значения показателя в пределах одного цикла) для площади покрытия равнялась 6,6 ± 2,7 % (Р < 0,001), для среднего размера объектов — 52,2 ± 18,9 мкм2 (Р < 0,001)

С целью уточнения условий проявления периодических изменений функции тромбоцитов был проведён ряд аналитических серий экспериментов антикоагулянт цитрат натрия был заменен на Клексан, использованы низкая скорость сдвига, блокаторы пуриновых рецепторов тромбоцитов и НИЛИ

Поскольку периодические изменения адгезии и агрегации тромбоцитов были обнаружены при высокой скорости сдвига, т е в условиях, приводящих к активации механизмов, зависимых от фактора фон Виллебранда было

решено вместо трехзамещенного цитрата натрия в качестве антикоагулянта использовать эноксапарин натрия (Клексан), представляющий собой низкомолекулярный гепарин, способный связываться с плазменным vWF Исследование функции тромбоцитов в крови, стабилизированной Клексаном проводили при скорости сдвига 1 800 с-1 Опыты показали, что, по сравнению с нитратной кровью, в крови, обработанной Клексаном, более чем в два раза снижались мезор и амплитуда кривых, отражающих временную динамику изменения как показателя площади, занимаемой частицами на полистирене, так и показателя размера адгезированных объектов (Р < 0,001). При этом продолжительноегь периода колебаний этих параметров не отличалась от таковой в цитратной крови, что свидетельствует о сохранении ритма периодических изменений адгезивных и агрегационных свойств кровяных пластинок Результаты данной серии опытов указывают на заинтересованность в реализации изучаемого феномена

С целью уточнения этого положения мы выполнили серию экспериментов на цитратной крови при низкой скорости сдвига (200 с-1), когда не принимает участия в адгезии тромбоцитов на полистирене Оказалось, что в этих условиях изменения показателей адгезии и агрегации тромбоцитов цельной цитратной крови не имели периодического характера, что также является основанием предполагать заинтересованность скоростьзависимых механизмов, в том числе и в исследуемом процессе

Для выяснения роли АДФ и активируемых этим агонистом сигнальных путей в реализации периодических изменений адгезивно-агрегационных свойств кровяных пластинок были использованы специфические блокаторы пуриновых рецепторов, которые добавляли в цельную цитратную кровь, исследовавшуюся затем в условиях высокой скорости сдвига. При этом были зарегистрированы низкоамплитудные кривые, не содержащие какие-либо упорядоченные циклы Эти данные указывают на заинтересованность АДФ и сопряженных с ним внутриклеточных процессов в реализации изучаемой периодичности

Воздействие НИЛИ красной, инфракрасной и синей областей спектра (15 Дж/мл) не модифицировало периодические изменения функции тромбоцитов в цельной цитратной крови, выявляемые при скорости сдвига 1 800 сн

Далее мы исследовали временную организацию функции тромбоцитов при другом методическом подходе — агрегометрии Оказалось, что при использовании в качестве агонистов АДФ, адреналина, ристоцетина и арахидоновой

кислоты имеется аналогичная временная динамика изменения агрегационной способности тромбоцитов в ОТП Продолжительность периода изменения максимальной степени агрегации и максимального размера тромбоцитарных микроагрегатов во всех случаях составляла 35-40 мин, хотя амплшудные характеристики колебаний этих показателей во многом зависели о г вида использованного агреганта

Поскольку адгезия и агрегация тромбоцитов реализуются за счет связывания их рецепторов с определенными лигандами, мы провели серии опытов с использованием меченных FITC моноклональных антител против фибриногена и Р-селектина При этом было установлено, что процент флюоресцирующих клеток и средний уровень флюоресценции тромбоцитов в покоящейся крови изменяются во времени с периодом около 35 мин Отчетливая временная динамика экспрессии тромбоцитарных рецепторов, определяет потенциальную способность кровяных пластинок отвечать на действие того или иного активирующего стимула

Учитывая, что выявленные колебания функции тромбоцитов не затухают в течение четырехчасового эксперимента, наблюдаются в отсутствие связи с внешними индуцирующими воздействиями, не зависят от пола, возраста и групповой принадлежности крови, можно прийти к выводу, что обнаруженная периодичность представляет собой устойчивую биологическую функцию, является отражением внутренней динамики тромбоцитарной системы и свидетельствует о наличии автоколебательного процесса, модулирующего функции кровяных пластинок в условиях т vitro Одним из возможных механизмов обнаруженных автоколебаний являются периодические изменения состояния мембранных тромбоцитарных рецепторов

Влияние НИЛИ красной области спектра на агрегацию тромбоцитов, индуцированную различными агонистами

АДФ Предварительное лазерное облучение образцов ОТП существенно не отражалось на АДФ-индуцированной (5,0 мкМ) агрегации тромбоцитов, оцениваемой по изменению светопропускания, но в то же время приводило к снижению максимального размера микроагрегатов и максимальной скорости его увеличения на 29 и 37% (Р < 0,001) соответственно, что свидетельствует об изменении кинетики начальных этапов агрегационного ответа

Если АДФ добавляли в конечной концентрации 0,73 мкМ, то в облученной ОТП обнаруживалось увеличение максимальной степени агрегации кровяных пластинок в 2,2 раза (Р < 0,001) и максимальной скорости агрегации тромбоцитов в 1,9 раза (Р < 0,001) При этом максимальный размер тромбоцитарных микроагрегатов уменьшался в 1,7 раза (Р < 0,001), максимальная скорость увеличения его размера снижалась вдвое (Р < 0,001) Следовательно, вызываемое НИЛИ изменение кинетики начальных этапов агрегатообразования в данном случае сочетается с усилением общего агрегационного ответа

Адреналин В данной серии агонист использовался в конечной концентрации 5,5 мкМ В облученной ОТП установлено увеличение максимальной скорости начальной агрегации тромбоцитов в 2,3 раза (Р < 0,001) и максимальной скорости агрегации в 1,4 раза (Р < 0,001) В то же время

13

максимальный размер образующихся микроагрегатов, напротив, уменьшался в 1,5 раза (Р < 0,001), максимальная скорость увеличения размера микроагрегатов снижалась в 1,3 раза (Р = 0,017) В этой ситуации можно предположить быстрое формирование под влиянием адреналина крупных тромбоцитарных конгломератов, вызывающих существенное просветление ОТП

Коллаген При использовании коллагена в дозе 5,0 мкг/мл в пробах, подвергнутых предварительному фотовоздействию, уменьшалось время достижения максимальной скорости агрегации на 17 % (Р < 0,001) Максимальный размер микроагрегатов и максимальная скорость его увеличения также уменьшались — на 39 и 19 %(Р< 0,001) соответственно Время образования микроагрегатов максимального размера уменьшалось на 13 % (Р < 0,001)

При концентрации коллагена 1,25 мкг/мл в облученных образах наблюдалось возрастание максимальной степени агрегации тромбоцитов на 23 % (Р < 0,001), максимальной скорости агрегации — на 43 % (Р < 0,001) Время достижения максимальной скорости агрегации укорачивалось на 16 % (Р < 0,001) При этом максимальный размер микроагрегатов уменьшался на 30 % (Р — 0,001), максимальная скорость образования микроагрегатов снижалась на 50 % (Р = 0,004) Время достижения максимального размера тромбоцитарных микроагрегатов уменьшалось на 16 %(Р = 0,004)

Если коллаген использовался в конечной концентрации 0,625 мкг/мл, в контрольных пробах агрегационный ответ тромбоцитов был крайне слабым. На это указывали необычно низкие значения параметров светопропускания, а также исключительно малый размер микроагрегатов При этом в облучённых пробах ОТП обнаруживалась выраженная ответная реакция тромбоцитарной системы, которая проявлялась в резком увеличении всех параметров как макро-, так и микроагрегации Максимальная степень агрегации тромбоцитов увеличивалась в пять раз (Р < 0,001), максимальная скорости агрегации — в 7,6 раза (Р < 0,001) Время достижения максимальной скорости агрегации тромбоцитов уменьшалось в 1,5 раза (Р < 0,001) Максимальный размер микроагрегатов после фотовоздействия увеличивался в 1,5 раза (Р = 0,003), максимальная скорость укрупнения микроагрегатов возрастала в 2,2 раза (Р = 0,010) Время достижения максимального размера тромбоцитарных микроагрегатов уменьшалось в 1,5 раза (Р = 0,003)

Таким образом, НИЛИ оказывает стимулирующее влияние на агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ, адреналином и коллагеном, что верифицируется как по изменению светопропускания ОТП, так и по изменению размера микроагрегатов

Изменение агрегации тромбоцитов в условиях ацидоза

АДФ (5,0 мкМ) В условиях умеренного ацидоза амплитуда первой волны агрегации кровяных пластинок уменьшалась в 1,4 раза {Р = 0,018) При этом максимальная скорость первой волны агрегации снижалась в 2,2 раза (Р < 0,001) Временной интервал от момента добавления АДФ до начала второй волны агрегации увеличивался в 1,5 раза (Р < 0,001) Максимальная степень агрегации уменьшалась в 1,2 раза (Р = 0,024). Максимальная скорость второй волны агрегации кровяных пластинок существенно не изменялась (Р = 0,163)

14

Максимальный размер тромбоцитарных микроагрегатов также не претерпевал заметных изменений (Р = 0,271) В то же время максимальная скорость увеличения размера микроагрегатов снижалась в 1,4 раза (Р < 0,001)

При тяжелом ацидозе показатели АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов изменялись следующим образом Амплитуда первой волны агрегации кровяных пластинок снижалась относительно контроля в 3,1 раза (Р < 0,001), максимальная скорость первой волны агрегации тромбоцитов уменьшалась в 2,7 раза (Р < 0,001) Время начала второй волны агрегации увеличивалось в 1,6 раза (Р < 0,001) Максимальная степень агрегации кровяных пластинок была в 2,7 раза меньше (Р < 0,001), чем в контроле Максимальная скорость второй волны агрегации тромбоцитов снижалась в 1,7 раза (Р - 0,036) Максимальный размер тромбоцитарных микроагрегатов уменьшался в 1,6 раза (Р = 0,003) Максимальная скорость увеличения размера микроагрегатов кровяных пластинок снижалась в 1,9 раза (Р < 0,001)

Адреналин (2,5 мкМ) В условиях умеренного ацидоза степень начальной агрегации тромбоцитов уменьшалась в 1,6 раза (Р < 0,001) Скорость начальной агрегации снижалась в 1,5 раза (Р < 0,001) Период времени до начала второго подъёма на агрегатограмме увеличивался в 1,3 раза (Р < 0,001) Максимальная степень агрегации уменьшалась в 1,2 раза (Р = 0,001) Максимальная скорость агрегации статистически значимо не изменялась (Р = 0,086) Максимальный размер громбоцитарных микроагрегатов и максимальная скорость его увеличения существенных изменений при умеренном ацидозе не претерпевали

При более тяжелом ацидотическом сдвиге рН степень начальной адреналин-индуцированной агрегации кровяных пластинок уменьшалась в 2,3 раза (Р < 0,001), скорость начальной агрегации — в 3,2 раза (Р < 0,001). Время начала второго подъема на агрегатограмме в этих условиях превышало контрольное значение в 1,8 раза (Р < 0,001) Максимальная степень агрегации тромбоцитов снижалась в 1,4 раза (Р < 0,001), максимальная скорость агрегации оказывалась в 1,6 раза меньше по сравнению с уровнем контроля (Р = 0,004) Максимальный размер тромбоцитарных микроагрегатов уменьшался в 1,4 раза (Р = 0,008) Максимальная скорость увеличения их размера снижалась в 2,4 раза по сравнению с ее значением в интактных пробах (Р < 0,001)

В целом, при сопоставлении изменений агрегационного ответа тромбоцитов на АДФ и адреналин, возникающих в условиях ацидоза, можно отметить однонаправленность и стадийность изменений основных показателей макро- и микроагрегации кровяных пластинок по мере увеличения выраженности ацидоза

Коллаген (1,25 мкг/мл). Снижение рН ОТП до 7,2 не приводило к существенным изменениям коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов Однако в условиях тяжелого ацидоза (рН 7,0) кровяные пластинки вовсе не отвечали на добавление коллагена Ареактивность сохранялась и при двукратном увеличении конечной концентрации данного агреганта (до 2,5 мкг/мл), что свидетельствует о стойком угнетении агрегационной функции тромбоцитов

Изменение агрегации тромбоцитов в условиях алкалоза

АДФ (5,0 мкМ) При умеренном алкалозе (рН 7,7) амплитуда первой волны агрегации кровяных пластинок по сравнению с контролем уменьшалась в 1,5 раза (Р = 0,010) При этом максимальная скорость первой волны агрегации снижалась в 1,6 раза (Р = 0,003) Временной интервал от момента добавления АДФ в кювету с ОТП до начала второй волны агрегации удлинялся в 1,6 раза (Р< 0,001) Максимальная степень агрегации тромбоцитов в этих условиях уменьшалась в 1,4 раза (Р < 0,001) Максимальная скорость второй волны агрегации снижалась также в 1,4 раза (Р = 0,046) Максимальный размер тромбоцитарных микроагрегатов уменьшался в 1,8 раза (Р < 0,001) Максимальная скорость увеличения размера микроагрегатов снижалась вдвое (Р < 0,001)

В условиях тяжелого алкалоза (рН 8,0) амплитуда первой волны агрегации кровяных пластинок уменьшалась относительно контроля в 1,5 раза (Р = 0,017) Максимальная скорость первой волны агрегации снижалась в 1,9 раза (Р = 0,001) Период времени от момента добавления агониста до начала второй волны агрегации превышал контрольное значение в 1,7 раза (Р < 0,001) Максимальная степень агрегации кровяных пластинок уменьшалась в 1,4 раза по сравнению с контролем (Р < 0,001) Максимальная скорость второй волны агрегации тромбоцитов снижалась в 1,8 раза (Р = 0,013) Максимальный размер тромбоцитарных микроагрегатов и максимальная скорость увеличения их размера снижались в одинаковой степени — в 2,5 раза (Р < 0,001).

Таким образом, степень угнетения агрегационного ответа тромбоцитов на АДФ мало зависит от степени выраженности алкалоза в пределах изученных нами границ изменений рН Можно отметить лишь некоторую тенденцию к удалению значений показателей от контрольного уровня при повышении рН с 7,7 до 8,0 Снижение интегрального ответа тромбоцитарной системы на АДФ сопровождается уменьшением показателей размера микроагрегатов кровяных пластинок

Адреналин (2,5 мкМ) При умеренном повышении рН степень начальной агрегации тромбоцитов существенно не изменялась В то же время скорость начальной реакции кровяных пластинок на адреналин достоверно снижалась в 1,2 раза (Р — 0,035) Отмечалась тенденция к увеличению времени начала второго подъема на агрегатограмме (Р = 0,067) Максимальная степень агрегации тромбоцитов при этом уменьшалась в 1,3 раза (Р < 0,001) Максимальная скорость агрегационного ответа снижалась в 1,5 раза (Р = 0,002) Показатели, характеризующие процесс начального образования тромбоцитарных микроагрегатов, от контроля не отличались

При рН 8,0 (тяжелый алкалоз) адреналин-индуцированная агрегация тромбоцитов изменялась следующим образом Амплитуда начального агрегационного ответа по сравнению с контролем уменьшалась в 1,6 раза (Р < 0,001) При этом скорость начальной агрегации тромбоцитов снижалась в 1,5 раза (Р< 0,001) Второй подъем на агрегатограмме начинался в 1,4 раза позднее (Р < 0,001), чем в интактных образцах Максимальная амплитуда агрегатограмм была меньше контрольного значения в 1,6 раза (Р = 0,002) Максимальная скорость агрегации тромбоцитов при тяжёлом алкалозе резко снижалась и была в 3,6 раза ниже (Р < 0,001) по сравнению с интактными пробами Максимальный

16

размер тромбоцитарных микроагрегатов уменьшался в 1,3 раза (Р = 0,010) В то же время максимальная скорость увеличения размера микроагрегатов не претерпевала существенных изменений

Таким образом, повышение рН охражается, прежде всего, на показателях адреналин-индуцированной макроагрегации кровяных пластинок, тогда как показатели микроагрегации, отражающие кинетику начальных этапов агрегато-образования, оказались наиболее устойчивыми к повышению рН

Коллаген (1,25 мкг/мл) При умеренном алкалозе максимальная степень агрегации кровяных пластинок существенно не отличалась от контроля, а при тяжелом алкалозе наблюдалось выраженное снижение данного показателя -в 1,6 раза (Р < 0,001) Максимальный размер тромбоцитарных микроагрегатов достоверно изменялся уже при умеренном сдвиге рН в щелочную сторону и был меньше его значения в контроле в 1,4 раза (Р - 0,006), а при тяжелом алкалозе— в 1,5 раза (Р ~ 0,004) Несмотря на отсутствие статистически значимых межгрупповых различий по остальным исследованным показателям (максимальная скорость агрегации тромбоцитов и время ее достижения, а также максимальная скорость увеличения размера микроагрегатов и время достижения их максимального размера), имела место отчетливая тенденция к увеличению их отклонения от контрольного уровня по мере нарастания выраженности алкалоза Таким образом, как при снижении, так и при повышении рН ОТП происходит уменьшение выраженности агрегационного ответа тромбоцитов на АДФ, адреналин и коллаген Создается впечатление, что агрегация тромбоцитов более чувствительна к снижению рН, нежели к его повышению, что особенно ярко проявляется для коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов

Влияние НИЛИ красной области спектра на агрегацию тромбоцитов в условиях ацидоза

АДФ (5,0 мкМ) В условиях умеренного ацидоза облучение ОТП светом красного лазера приводило к полному восстановлению амплитуды первой волны АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов Максимальная скорость первой волны агрегации, несмотря на отчетливую тенденцию к нормализации, после фотовоздействия контрольного уровня не достигала и была в 1,6 раза меньше по сравнению с интактными образцами (Р = 0,005) Время начала второй волны агрегации тромбоцитов в облученных пробах уменьшалось и отличалось от его значения в контроле только в 1,3 раза (Р ■= 0,030) Максимальная степень агрегации тромбоцитов, максимальная скорость второй волны агрегации и максимальный размер тромбоцитарных микроагрегатов после фотовоздействия полностью возвращались к контрольному уровню Максимальная скорость увеличения размера микроагрегатов после фотовоздействия исходного значения не достигала, но отличалась от него только в 1,2 раза (Р = 0,037), т е в меньшей степени по сравнению с необлученными образцами

Измененные в условиях тяжелого ацидоза амплитуда и максимальная скорость первой волны агрегации тромбоцитов, несмотря на наличие явной тенденции к восстановлению, в облученных пробах контрольного уровня не достигали и были ниже него в 1,6 раза (Р = 0,006) и в 2,1 (Р < 0,001) раза соответственно (рис 2) Период времени от момента добавления АДФ до начала

17

4 5 6 Время, мин

Рис. 2. Лазерная коррекция АДФ-индуцированной (5,0 мкМ) агрегации тромбоцитов, изменённой в условиях тяжёлого ацидоза.

второй волны агрегации тромбоцитов под действием ПИЛИ укорачивался и в результате проnosг&апся только о 13 рача больше, чем в контроле (Р — 0,017). Максимальная степень агрегации тромбоцитов, сниженная в условиях тяжёлого ацидоза, после облучения ОТП светом красного лазера увеличивалась, но тем не менее была и 1,4 раза меньше по сравнению с контролем {/' < 0,001), Максимальная скорость второй волны агрегации кровяных пластинок и максимальный размер фомбоцитарных микроагрегатов в облученных пробах восстанавливались полностью. Максимальная скорость увеличения размера микроагрегатов после фотовоздействия контро.илого уровня не достигала, но обличалась от него лишь в 1,4 раза (Р < 0,001).

ÁúpenO-Пт (2,5 мкМ). В условиях умеренного ацидоза под влиянием красного лазерного излучения амплитуда начальной адреналин-инлуцированний агрегации тромбоцитов возрастала, но не достигала контрольного уровня, оставаясь сниженной в 1,2 раза (Р = 0,031). При этом скорость начальной агрегации кровяных пластинок практически не изменялась и была в 1,4 раза меньше по сравнению с интактными образцами (Р < 0.001). Время начала второго подъёма на arpeгатограмме, хотя и уменьшалось после лазерного облучення, но оставалось больше его значении в контроле в 1,1 раза (Р = 0,043), Максимальная степень агрегации кровяных пластинок, сниженная в условиях умеренного ацидоза, после фото воздействия полностью нормализовалась. Для показателя максимальной скорости второй волны агрегации кровяных пластинок корригирующий эффект красного лазерного излучения был наиболее выраженным. Сниженный при ацидозе, после фото воздействия данный параметр не только достигал контрольного уровня, но даже превышал его в 1,2 раза (Р ~ 0,039), т.е. восстановление данного показателя происходило с гицер-

1К

компенсацией При этом показатели максимального размера и максимальной скорости увеличения размера микроагрегатов, напротив, уменьшались и были соответственно в 1,3 раза (Р = 0,003) и 1,4 раза (Р = 0,004) меньше по сравнению с интактными образцами

Сниженная в условиях тяжелого ацидоза амплитуда начальной агрегации тромбоцитов, хотя и имела тенденцию к нормализации под влиянием красного лазерного излучения, однако полностью не восстанавливалась Данный показатель оставался ниже контрольного уровня в 1,8 раза (Р < 0,001) Максимальная скорость первой волны агрегации кровяных пластинок, сниженная в условиях тяжелого ацидоза, после фотовоздействия контрольного уровня не достигала и была в 2,5 раза меньше по сравнению с интактными пробами (Р < 0,001), несмотря на тенденцию к восстановлению данного параметра. Время начала второго подъёма на агрегатограмме в обученных пробах приближалось к контрольным значениям, однако коррекция была неполной, и данный показатель оставался в 1,5 раза увеличенным по сравнению с контролем (Р < 0,001) Максимальная скорость агрегации кровяных пластинок нормализовалась полностью и от контроля не отличалась (Р = 0,209) В то же время в облученных образцах максимальный размер тромбоцитарных микроагрегатов уменьшался и был в 2,1 раза меньше относительно контроля (Р < 0,001) Максимальная скорость увеличения размера микроагрегатов также снижалась и была в 3,2 раза меньше по сравнению с интактными пробами (Р < 0,001)

Таким образом, НИЛИ красной области спектра оказывает отчетливое корригирующее влияние на АДФ- и адреналин-индуцированную агрегацию тромбоцитов, подавленную в условиях декомпенсированного негазового ацидоза вне зависимости от степени его тяжести При умеренном ацидозе отмечается полная нормализация, а при тяжелом ацидозе — отчетливая тенденция к нормализации основных показателей агрегации тромбоцитов, индуцированной как АДФ, так и адреналином Корригирующее действие НИЛИ сочетается с увеличением показателей микроагрегации при использовании АДФ и с их уменьшением при использовании адреналина Иными словами, выявляется некоторая специфичность фотоэффекта в отношении кинетики начальных этапов агонист-индуцированной агрегации кровяных пластинок.

Коллаген (1,25 мкг/мл) Сниженная в условиях умеренно выраженного ацидоза максимальная степень агрегации тромбоцитов после фотовоздействия уменьшалась еще на 31 % по сравнению с необлучёнными образцами (Р < 0,001) При этом максимальная скорость агрегации снижалась на 63 % (Р < 0,001) Время достижения максимальной скорости агрегации после лазерного облучения увеличивалось на 36 % (Р < 0,001) Максимальный размер микроагрегатов в облученных пробах уменьшался на 37 % (Р < 0,001) Максимальная скорость образования микроагрегатов после облучения ОТП светом красного лазера снижалась на 75 % по сравнению с необлученными пробами (Р < 0,001) После лазерного воздействия наблюдалось увеличение времени достижения максимального размера тромбоцитарных микроагрегатов на 50 % (Р < 0,001)

При тяжелом ацидозе коллаген-индуцированная агрегация тромбоцитов полностью подавлялась Лазерное излучение в этих условиях не приводило к восстановлению агрегационной способности кровяных пластинок

Влияние НИЛИ красной области спектра на агрегацию тромбоцитов в условиях алкалоза

АДФ (5,0 мкМ) Под влиянием лазерного излучения происходила полная нормализация сниженной в условиях умеренного алкалоза (рН 7,7) амплитуды первой волны АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов (Р = 0,176) При этом максимальная скорость первой волны агрегации, несмотря на тенденцию к нормализации, контрольного уровня не достигала и была в 1,4 раза меньше по сравнению с интактными образцами (Р = 0,023) Период времени от момента добавления АДФ до начала второй волны агрегации тромбоцитов, при выраженной тенденции к восстановлению, исходного значения в облученных образцах не достигал и был в 1,4 раза более продолжительным, чем в контроле (Р < 0,001) Максимальная амплитуда агрегации тромбоцитов, сниженная при умеренном повышении рН, после облучения ОТП светом красного лазера возрастала и была меньше её контрольного значения лишь в 1,1 раза (Р = 0,003) Максимальная скорость второй волны агрегации кровяных пластинок восстанавливалась полностью Максимальный размер тромбоцитарных микроагрегатов и максимальная скорость увеличения их размера в облученных образцах составляли в 2,9 раза меньше по сравнению с контролем (Р < 0,001)

Сниженная в условиях тяжелого алкалоза амплитуда первой волны АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов под влиянием НИЛИ полностью нормализовалась При этом максимальная скорость первой волны агрегации имела явную тенденцию к восстановлению, однако контрольного уровня не достигала и оставалась сниженной в 1,4 раза (Р = 0,034) Время начала второй волны агрегации тромбоцитов исходного значения в облученных пробах также не достигало и было в 1,4 раза больше, чем в интакгных образцах ( Р < 0,001), т е отличалось от контроля в меньшей степени, чем в необлученных пробах с повышенным рН Максимальная степень агрегации тромбоцитов, сниженная при значительном алкалозе, после облучения ОТП светом красного лазера была только в 1,1 раза меньше по сравнению с контролем (Р < 0,001) Различий максимальной скорости второй волны агрегации кровяных пластинок между облученными образцами с алкалозом и контрольными пробами выявлено не было Максимальный размер тромбоцитарных микроагрегатов и максимальная скорость увеличения их размера после фотовоздействия были снижены в 3,7 раза по сравнению с их значениями в интактных пробах (Р < 0,001)

Адреналин (2,5 мкМ) В результате фотовоздействия происходила полная коррекция всех сниженных в условиях умеренного алкалоза показателей, характеризующих адреналин-индуцированную макроагрегацию кровяных пластинок степени начального агрегационного ответа, скорости начальной агрегации, времени начала второго подъема на агрегатограмме, максимальной степени и максимальной скорости агрегации тромбоцитов При этом в облученных образцах отмечалось снижение показателей микроагрегации тромбоцитов По сравнению с интактными образцами максимальный размер микроагрегатов был меньше в 1,7 раза (Р < 0,001), а максимальная скорость увеличения их размера — в 1,3 раза (Р = 0,016)

Несколько иная картина имела место после облучения ОТП, на которой моделировалась ситуация тяжелого алкалоза Степень начальной адреналин-

20

индуцированной агрегации и время начала второго подъема на агрегатограмме под влиянием фотовоздействия восстанавливались полностью Для показателя скорости начальной агрегации кровяных пластинок, сниженной при тяжелом алкалозе, отмечалась явная тенденция к повышению данный показатель различался с контролем лишь в 1,3 раза (Р < 0,001) Сниженные в условиях тяжелого алкалоза максимальная степень и максимальная скорость агрегации тромбоцитов после фотовоздействия также возрастали, однако, несмотря на выраженную тенденцию к восстановлению, исходного уровня не достигали и различались с контролем в 1,2 и 2,2 раза соответственно (Р < 0,001) Вместе с тем максимальный размер тромбоцитарных микроагрегатов и максимальная скорость их увеличения уменьшались и были в 1,6 раза меньше по сравнению с необлученными образцами (Р < 0,001 и Р = 0,002 соответственно)

Таким образом, при исследовании влияния НИЛИ красной области спектра на функции тромбоцитов, нарушенные при декомпенсированном негазовом алкалозе, был установлен выраженный корригирующий эффект фотовоздействия в отношении АДФ- и адреналин-индуцированной агрегации Наиболее ярко результат лазерного облучения проявился при умеренном алкалозе для адреналин-индуцированной агрегации При использовании фотовоздействия в условиях алкалоза описанные изменения агрегации тромбоцитов сопровождались снижением параметров, характеризующих образование микроагрегатов

Коллаген (1,25 мкг/мл) Как было отмечено ранее, умеренное повышение рН не приводит к серьезным нарушениям коллаген-индуцированной агрегации Статистически значимые изменения наблюдались только для показателя максимального размера микроагрегатов при наличии лишь тенденции к снижению остальных исследованных параметров В этих условиях красное лазерное излучение не вызывало существенных изменений показателей коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов

При тяжелом алкалозе облучение ОТП светом красного лазера приводило к еще большему уменьшению максимальной амплитуды агрегации кровяных пластинок — в среднем на 32 % (Р < 0,001) Максимальная скорость агрегации, имевшая явную тенденцию к снижению при алкалозе, после облучения снижалась в среднем на 42 % (Р < 0,001) При этом время достижения максимальной скорости агрегации тромбоцитов практически не изменялось Максимальный размер тромбоцитарных микроагрегатов после лазерного воздействия уменьшался в среднем на 19 % (Р < 0,001) Максимальная скорость увеличения размера микроагрегатов после экспозиции снижалась в среднем на 26 % (Р < 0,001) Время достижения максимального размера микроагрегатов, после лазерного облучения существенных изменений не претерпевал (Р = 0,196) Таким образом, показано корригирующее влияние НИЛИ на функцию тромбоцитов как при уменьшен™, так и при увеличении рН ОТП Следовательно, эффект НИЛИ носит корригирующий характер, не зависящий от направленности изменения рН в данной системе Установленная возможность лазерной коррекции агрегационной функции тромбоцитов может служить обоснованием использования НИЛИ в комплексной терапии состояний, сопровождающихся нарушениями кислотно-щелочного баланса.

выводы

1 Предварительное облучение цельной крови человека in vitro светом красного, инфракрасного и синего лазеров оказывает модифицирующее влияние на функцию тромбоцитов, зависящее от длины волны, дозы облучения и скоростных параметров движения крови НИЛИ в широком диапазоне доз практически не влияет на адгезию и агрегацию тромбоцитов, исследуемые при низкой скорости сдвига При высокой скорости сдвша в крови, облученной красным светом (43,4 Дж), отмечается угнетение агрегационной функции тромбоцитов, в крови, подвергнутой инфракрасному лазерному облучению, — усиление адгезии (в дозе 7,2 и 18,4 Дж) и угнетение агрегации пластинок (в дозе 82,3 Дж), в крови, облученной синим лазером (5,8 Дж), — стимуляция адгезии тромбоцитов

2 Под влиянием НИЛИ изменяется эффективность сдвиговой регуляции функции тромбоцитов Чувствительность кровяных пластинок к сдвиговому сигналу, оцениваемая по величине ИСРпл, отсутствует в контроле, но появляется в образцах крови, предварительно облученных светом красного (43,4 Дж), инфракрасного (7,2 Дж) или синего (5,8 Дж) лазеров После облучения крови светом красного лазера сдвиговый сигнал носит ингибиторный характер, инфракрасного и синего лазеров — стимуляторныи В контрольных образцах крови сдвиговый сигнал приводит к усилению агрегационной способности тромбоцитов Под влиянием красного (43,4 Дж) и инфракрасного (82,3 Дж) лазерного облучения ИСРразм снижается, а при воздействии синего лазера— (5,8 Дж) увеличивается

3 Влияние НИЛИ на характер отклика тромбоцитов на воздействие сдвигового сигнала в значительной мере определяется длиной волны излучения Переход в область высокой скорости сдвига крови, предварительно подвергнутой действию НИЛИ с различной длиной волны (0,65, 0,98 и 0,54 мкм) в одной и той же дозе (15 Дж), вызывает неоднотипную ответную реакцию кровяных пластинок В крови, облучённой красным светом, происходит начальное угнетение адгезии и агрегации тромбоцитов, сменяющееся усилением их функции В крови, облученной инфракрасным или синим лазером, стимулируются адгезивная и агрегационная функции тромбоцитов Спустя 10 мин после завершения фотоэкспозиции в крови, облученной светом каждого из трех типов лазеров, повышение скорости сдвига оказывает однотипное активирующее влияние на функции кровяных пластинок

4 НИЛИ красной области спектра не оказывает заметного влияния на агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ в конечной концентрации 5,0 мкМ, стимулирует агрегацию, вызванную низкой концентрацией АДФ (0,73 мкМ), и в обоих случаях влияет на кинетику начальных эталов формирования микроагрегатов, вызывая уменьшение их размера и максимальной скорости образования Красный свет вызывает отчетливое усиление агрегаци-онного ответа кровяных пластинок на адреналин (5,5 мкМ), сочетающееся с угнетением начального образования тромбоцитарных микроа1 регатов Эффект НИЛИ на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов зависит от дозы агониста при концентрации коллагена 5,0 мкг/мл излучение красного лазера не оказывает влияния на агрегационный ответ и уменьшает образование микро-

22

агрегатов, при концентрации 1,25 мкг/мл лазерное излучение стимулирует агрегацию тромбоцитов, также снижая размер и скорость образования микроагрегатов, при концентрации 0,625 мкг/мл НИЛИ вызывает выраженную стимуляцию макро- и микроагрегации кровяных пластинок

5 При декомпенсированном негазовом ацидозе происходит угнетение агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ, адреналином и коллагеном Степень угнетения arpei ационной способности тромбоцитов зависит от величины ацидотического сдвига НИЛИ красной области спектра оказывает отчетливое корригирующее влияние на АДФ- и адреналин-индуцированную агрегацию кровяных пластинок при умеренно выраженном (рН 7,2) и тяжелом (рН 7,0) ацидозе, причем влияние лазерного света оказывается более эффективным при значительном нарушении кислотно-щелочного баланса В условиях умеренного ацидоза излучение красного лазера оказывает угнетающий эффект как на макро-, так и на микроагрегацию кровяных пластинок, индуцированную коллзденом При тяжелом ацидозе коллаген-индуцированная агрегация тромбоцитов полностью подавляется Лазерное излучение в этих условиях не приводит к восстановлению агрегационной способности кровяных пластинок

6 При декомпенсированном негазовом алкалозе происходит угнетение агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ, адреналином и коллагеном Под влиянием НИЛИ красной области спектра отмечается отчетливая тенденция к нормализации АДФ- и адреналин-индуцированной агрегации кровяных пластинок, нарушенной в условиях алкалоза При тяжелом алкалозе НИЛИ красной области спектра оказывает угнетающее влияние на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов

7 Обнаружено неизвестное ранее биологическое явление наличие автоколебательного процесса, модифицирующего функции тромбоцитов в условиях in vitro Период колебаний значений показателей, характеризующих адгезивную и агрегационную функции тромбоцитов, составляет около 35 мин Выявленная периодичность сохраняется при облучении крови светом красного, инфракрасного или синего лазеров, угнетается эноксапарином натрия и полностью подавляется при низкой скорости сдвига и блокаде P2Yi- и Р2У]2-рецепторов тромбоцитов В основе периодических колебаний функции тромбоцитов лежат циклические изменения экспрессии мембранных тромбо-цитарных рецепторов аНЬрЗ и Р-селектина

Практические рекомендации

1 При разработке оптимальных методов лазерной терапии необходимо учитывать различное поведение кровяных пластинок облученной крови при низкой и высокой скоростях сдвига, характерных для венозного и артериального отделов сосудистого русла

2 НИЛИ красной области спектра может быть апробировано в клинической практике для коррекции нарушений функции тромбоцитов при заболеваниях, сопровождающихся изменениями кислотно-щелочного баланса

3 Наличие временной организации функции кровяных пластинок следует учитывать при последовательных определениях показателей функции тромбоцитов в целях диагностики патологических состояний, сопровождающихся

23

нарушением тромбоцитарного звена системы гемостаза, и контроля за

эффективностью терапии

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Будник, И А. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на дезагрегацию тромбоцитов и динамику размера агрегатов / И А Будник, Г Е Брилль, JIВ Гаспарян // Молодые ученые — здравоохранению региона Материалы 65-й юбилейной науч -практ конф студентов и молодых специалистов Саратовского ГМУ — Саратов, 2004 — С 94-95

2 Будник, И А Способ изучения реакции тромбоцитов на изменение скорости сдвига / И А Будник // Медицина Экология — 2004 Материалы второй осенней науч -практ конф студентов, молодых ученых и специалистов Саратовского ГМУ — Саратов, 2004 — С 24-25

3 Будник, И А Влияние излучения инфракрасного лазера на адгезию и агрегацию тромбоцитов при высокой скорости сдвига / И А Будник // Молодежь и наука итоги и перспективы Материалы III осенней науч.-практ конф студентов и молодых ученых — Саратов, 2005 — С 25-26

4 Будник, И А Лазерная модификация межклеточных взаимодействий / Г Е Брилль, И А Будник, Л В Гаспарян // Применение лазеров в медицине и биологии Материалы XXIV Международной науч -практ. конф — Ялта, 2005 - С 112-113

5 Будник, И А Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на адгезию и агрегацию тромбоцитов при высокой скорости сдвига / И А Будник, Н В Полутова // Молодые ученые — здравоохранению региона Материалы 66-й науч -практ конф студентов и молодых специалистов Саратовского ГМУ. — Саратов, 2005 — С 86

6 Будник, И А. Влияние излучения красного лазера на адгезию и агрегацию тромбоцитов на полистирене при высокой скорости сдвига / ГЕ Брилль, И А Будник, Л В Гаспарян // Применение лазеров в медицине и биологии Материалы XXIV Международной науч-практ конф — Ялта, 2005 — С 110-111

7 Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на ад1езию и агрегацию тромбоцитов на полистирене при высокой скорости сдвига / ГЕ Брилль, И А Будник, Л В Гаспарян и др // Применение лазеров в медицине и биологии Материалы XXIII Международной науч -практ конф — Николаев, 2005 — С 70-71

8. Будник, И А Автоколебательный процесс, модифицирующий функцию тромбоцитов в цельной крови in vitro / Г Е Брилль, И.А Будник, Л В. Гаспарян // Современные наукоемкие технологии — 2006. — № 3 — С 12-17

9 Будник, И А Влияние низкоингенсивного лазерного излучения на адгезию и агрегацию тромбоцитов на полистирене при высокой скорости сдвига / Г Е Брилль, И А Будник, Л В Гаспарян // Лазерная медицина — 2006 — Т 10, вып 1 —С 51-54

10 Будник, И А Модификация периодических колебаний адгезии тромбоцитов на полистирене / И А Будник // Молодые ученые — здравоохранению региона Материалы 67-й весенней науч -практ конф студентов и молодых специалистов Саратовского ГМУ —Саратов, 2006 —С 117

11 Будник, И А Периодические изменения адгезии тромбоцитов на полистирене при высокой скорости сдвига / И.А Будник // Молодые учёные — здравоохранению региона ' Материалы 67-й весенней науч-практ конф студентов и молодых специалистов Саратовского ГМУ — Саратов, 2006 — С 117-118.

12 Будник, И А Автоколебания, модулирующие функции тромбоцитов / И А Будник, Г Е Брилль // Гемореология и микроциркуляция (от молекулярных мишеней к органным и системным изменениям) Материалы VI Международной конференции — Ярославль, 2007 — С 129

13 Будник, И А Влияние различных видов лазерного излучения на адгезию тромбоцитов на полистирене при низкой скорости сдвига / И А Будник, М О Дуганова // Молодые ученые — здравоохранению региона Материалы 68-й науч -практ конф студентов и молодых ученых Саратовского ГМУ — Саратов, 2007 — С 133-134

14 Будник, И А Влияние различных видов лазерного излучения на адгезию тромбоцитов на полистирене при различных скоростях сдвига / Г Е Брилль, И А Будник, JIВ Гаспарян // Применение лазеров в медицине и биологии Материалы XXVII Международной науч -практ конф — Харьков, 2007 — С 89 92

15 Будник, И А Модификация реакции тромбоцитов на адреналин низкоинтенсивным лазерным излучением // Г Е Брилль, И А Будник, JIB Гаспарян // Применение лазеров в медицине и биологии Материалы XXVII Международной науч -практ. конф — Харьков, 2007 — С. 87—89

16 Будник, И.А Периодические изменения адгезивно-агрегационных свойств тромбоцитов / И.А Будник // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины Материалы 65-й юбилейной науч-практ конф молодых ученых и студентов с междунар участ Волгоградского ГМУ — Волгоград, 2007 — С 7

17 Budnik, I A Periodic changes in platelet response to adenosine diphosphate and ristocetin / GE Brill, IA Budnik, LV Gasparyan // Pathophysiol Haemost Thromb —2006 — Vol 35 — P A37

18 Helium-Neon laser radiation inhibits platelet functions ш vitro / GE Brill, IA Budnik, A G. Brill et al // Pathophysiol Haemost Thromb — 2006 — Vol 35 —P A37

19 Budnik, IA Red laser radiation increases platelet response to ADP /1A Budmk, G E Brill, L V Gasparyan // J Thromb Haemost — 2007 — Vol 5, s 2 — P P-M-280

Подписано к печати 31 08 2007 г Формат 60x84/16 Бумага офсетная Печать офсетная Гарнитура «Тайме» Усл-печ л 1 Тираж 100 Заказ № 153

Отпечатано с оригинал-макета в ООО «Принт-Клуб» 410026, г Саратов, ул Московская, 160 Тел (845-2)507-888

Низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ) в настоящее время находит широкое применение в различных областях практического здравоохранения как в России, так и за рубежом. Многолетний опыт использования НИЛИ убедительно свидетельствует о его высокой терапевтической эффективности в лечении целого ряда заболеваний и патологических процессов [Корочкин ИМ. и др., 1988; Бабушкина Г.В., Картелишев A.B., 1998; Амиров Н.Б., Ковалёва Т.В., 2001, 2002; Абдрахманова А.И., 2002; Белов В.В., Лозовая Л.П., Аксёнов В.В., 2005; Кемалов Р.Ф., 2006; Ohshiro Т, Calderhead R.G., 1988; Ad N., Oron U., 2001; Yaakobi T. et al., 2001; Lampl Y., 2007]. На сегодняшний день сам факт позитивного воздействия НИЛИ не вызывает сомнений, однако вопрос о молекулярно-клеточных событиях, лежащих в его основе, по-прежнему остаётся предметом дискуссии теоретиков и клиницистов.

Одним из наиболее удобных объектов для исследования закономерностей, лежащих в основе лазерного биоэффекта, являются тромбоциты. Это связано с простотой изоляции кровяных пластинок, а также с существованием большого числа методов, позволяющих детально изучить их функциональное состояние. С другой стороны, исследование влияния НИЛИ на тромбоциты имеет и большое прикладное значение, поскольку нарушения тромбоцитарного звена системы гемостаза играют заметную роль в патогенезе многих форм патологии, в том числе атеросклероза, ишемической болезни сердца, инсульта, сахарного диабета, антифосфолипидного синдрома и др. [Feinberg W.M., Bruck D.C., 1991; Castelli W.P., 1996; Zeller J.A., Tschoepe D., Kessler С., 1999; Libby P., 2000; Sobol A.B., Watala C., 2000; de Groot P.G., Derksen R.H., 2005; Vega-Ostertag M.E., Pierangeli S.S., 2007].

Имеющиеся в литературе сведения о характере и механизмах воздействия НИЛИ на кровяные пластинки носят фрагментарный характер и во многом противоречивы. Существуют значительные трудности в сопоставлении результатов, полученных разными авторами, что связано, с одной стороны, с особенностями использованных биообъектов, с другой — с применением различных источников лазерного излучения, доз и режимов фотовоздействия [Беспалова Т.А., 1997; Брилль А.Г., 1998; Спасов A.A., Недогода В.В., Куаме Конан, 1998а, 19986; Arora R.R., Mueller H.S., Sinha А.К., 1993; Olban M. et al., 1998; Brill A.G. et al., 2000]. В связи с этим возникает необходимость исследования влияния различных видов НИЛИ на функции тромбоцитов в стандартных условиях эксперимента, что сделает сравнительный анализ полученных результатов более корректным.

При движении форменных элементов в потоке крови они испытывают воздействие напряжения сдвига, которое является важным фактором в регуляции функции тромбоцитов [Ikeda Y. et al., 1991; Kroll M.H. et al., 1996; Ruggeri Z.M., 1997; Savage В., Sixma J.J., Ruggeri Z.M., 2002; Sadler J.E., 2005; Denis C.V., Wagner D.D., 2007]. Вместе с тем особенности фотореактивности кровяных пластинок, находящихся в различных гидродинамических условиях практически не исследованы.

НИЛИ хорошо зарекомендовало себя при лечении многих заболеваний и патологических процессов, в патогенезе которых существенная роль принадлежит нарушениям кислотно-щелочного баланса [Мусиенко Ю.И., Нечипуренко Н.И., Камышников B.C., 2003; Мусиенко Ю.И., 2005; Ререкин И.А, 2007; Al-Watban F.A., Zhang X.Y., 2004; Byrnes K.R. et al., 2004; Bayat M. et al., 2005; Hawkins D., Houreld N., Abrahamse H., 2005]. Однако модификация функции кровяных пластинок в условиях ацидоза и алкалоза до сих пор не являлась предметом глубокого изучения.

Цель исследования

Изучить влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на функции тромбоцитов при различных скоростях сдвига, а также при негазовых формах нарушений кислотно-щелочного баланса.

Задачи исследования

1. Изучить влияние НИЛИ с различной длиной волны на адгезию и агрегацию тромбоцитов при низкой (200 с-1) и высокой (1 800 с-1) скоростях сдвига.

2. Проанализировать влияние НИЛИ на характер и эффективность сдвиговой регуляции функции тромбоцитов.

3. Исследовать специфичность и временную динамику реакции тромбоцитов на фотовоздействие при различных скоростных параметрах движения крови.

4. Изучить влияние НИЛИ на агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ, адреналином и коллагеном.

5. Исследовать агрегацию тромбоцитов при негазовых формах нарушения кислотно-щелочного баланса.

6. Изучить влияние НИЛИ на агрегационную функцию тромбоцитов в условиях нарушения кислотно-щелочного баланса.

Научная новизна

Впервые выявлены особенности реакции кровяных пластинок, находящихся в различных гидродинамических условиях, на воздействие НИЛИ красной, инфракрасной и синей областей спектра. Показана зависимость характера отклика тромбоцитов от дозы и режима лазерного облучения. Выявлена определённая временная динамика реализации фотоэффекта. Установлено влияние НИЛИ на эффективность сдвиговой регуляции функции тромбоцитов. Изучены возможности лазерной модификации агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ, адреналином и коллагеном.

Впервые исследованы функциональные особенности кровяных пластинок в условиях ацидоза и алкалоза и установлена зависимость фотореактивности тромбоцитов от величины средового рН. Доказана возможность коррекции агрегационной функции тромбоцитов, нарушенной в условиях ацидоза и алкалоза, под влиянием НИЛИ.

Обнаружено новое биологическое явление — периодические изменения адгезивных и агрегационных свойств кровяных пластинок в цельной крови и обогащенной тромбоцитами плазме in vitro.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом научной деятельности СГМУ. Номер государственной регистрации — 02.03042330329.

Практическая значимость

Установленные в работе закономерности влияния НИЛИ различных спектральных диапазонов на функции тромбоцитов могут служить теоретическим обоснованием выбора того или иного вида лазерного излучения с целью оптимизации лазерной терапии.

Новые сведения о лазерной модификации сдвиговой регуляции функции тромбоцитов, являются основанием для разработки новых подходов к лазеротерапии, учитывающих различную фотореактивность кровяных пластинок, находящихся в различных отделах сосудистого русла.

Обнаруженные особенности фотореактивности тромбоцитов в условиях ацидоза или алкалоза, а также возможности лазерной коррекции функции тромбоцитов, изменённой при нарушениях кислотно-щелочного баланса, могут быть учтены при оптимизации существующих методов лазеротерапии и способов лазерной коррекции нарушений тромбоцитарного звена системы гемостаза.

Полученные данные о наличии периодических изменений адгезивных и агрегационных свойств тромбоцитов могут служить ориентиром для разработки тестов, основанных на многократных последовательных измерениях параметров функции тромбоцитов в клинике, с целью выявления десинхроноза, который может явиться предиктором различных форм патологии и иметь как диагностическое, так и прогностическое значение.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Предварительное облучение цельной крови человека in vitro светом красного, инфракрасного и синего лазеров оказывает модифицирующее влияние на функцию тромбоцитов, зависящее от длины волны, дозы облучения и скоростных параметров движения крови.

2. Под влиянием НИЛИ изменяется эффективность сдвиговой регуляции функции тромбоцитов. г

3. Характер и временная динамика отклика тромбоцитов на воздействие сдвигового сигнала в значительной мере определяются длиной волны излучения.

4. НИЛИ красной области спектра оказывает модулирующее влияние на агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ, адреналином и коллагеном.

5. При декомпенсированных негазовых формах нарушений кислотно-щелочного баланса происходит угнетение агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ, адреналином и коллагеном.

6. НИЛИ оказывает корригирующий эффект в отношении АДФ- и адреналин-индуцированной агрегации кровяных пластинок, нарушенной в условиях ацидоза и алкалоза.

7. Существует автоколебательный процесс, модифицирующий функцию тромбоцитов в цельной крови в условиях in vitro.

Внедрение

Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс на кафедре патологической физиологии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава». По материалам диссертации внедрены четыре рационализаторских предложения.

Апробация диссертации

Результаты диссертационного исследования доложены и обсуждены на научных конференциях кафедры патологической физиологии (2006-2007 гг.), на совместном заседании кафедр патологической физиологии и нормальной физиологии Саратовского государственного медицинского университета (2007 г.). Фрагменты работы представлялись на 66, 67 и 68-й научно-практических конференциях студентов и молодых специалистов Саратовского государственного медицинского университета «Молодые учёные — здравоохранению региона» (Саратов, 2005, 2006, 2007), на III осенней научно-практической конференции студентов и молодых учёных Саратовского государственного медицинского университета «Молодёжь и наука: итоги и перспективы» (Саратов, 2005), на 65-й научно-практической конференции молодых учёных и студентов Волгоградского государственного медицинского университета «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2007), на XXIII, XXIV и XXVII Международных научно-практических конференциях «Применение лазеров в медицине и биологии» (Николаев, 2005; Ялта, 2005; Харьков, 2007), на 19-м tVi

Международном Конгрессе по тромбозу (19 International Congress on Thrombosis, Tel-Aviv, Israel, 2006), на VI Международной конференции «Гемореология и микроциркуляция» (Ярославль, 2007), на XXI Конгрессе Международного общества по тромбозу и гемостазу (XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Geneva, Switzerland, 2007).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 19 работ, в том числе три в зарубежной печати.

ВЫВОДЫ

1. Предварительное облучение цельной крови человека in vitro светом красного, инфракрасного и синего лазеров оказывает модифицирующее влияние на функцию тромбоцитов, зависящее от длины волны, дозы облучения и скоростных параметров движения крови. НИЛИ в широком диапазоне доз практически не влияет на адгезию и агрегацию тромбоцитов, исследуемые при низкой скорости сдвига. При высокой скорости сдвига в крови, облучённой красным светом (43,4 Дж), отмечается угнетение агрегационной функции тромбоцитов; в крови, подвергнутой инфракрасному лазерному облучению, — усиление адгезии (в дозе 7,2 и 18,4 Дж) и угнетение агрегации пластинок (в дозе 82,3 Дж); в крови, облучённой синим лазером (5,8 Дж), — стимуляция адгезии тромбоцитов.

2. Под влиянием НИЛИ изменяется эффективность сдвиговой регуляции функции тромбоцитов. Чувствительность кровяных пластинок к сдвиговому сигналу, оцениваемая по величине ИСРпл, отсутствует в контроле, но появляется в образцах крови, предварительно облучённых светом красного (43,4 Дж), инфракрасного (7,2 Дж) или синего (5,8 Дж) лазеров. После облучения крови светом красного лазера сдвиговый сигнал носит ингибитор-ный характер, инфракрасного и синего лазеров — стимуляторный. В контрольных образцах крови сдвиговый сигнал приводит к усилению агрегационной способности тромбоцитов. Под влиянием красного (43,4 Дж) и инфракрасного (82,3 Дж) лазерного облучения ИСРразм снижается, а при воздействии синего лазера — (5,8 Дж) увеличивается.

3. Влияние НИЛИ на характер отклика тромбоцитов на воздействие сдвигового сигнала в значительной мере определяется длиной волны излучения. Переход в область высокой скорости сдвига крови, предварительно подвергнутой действию НИЛИ с различной длиной волны (0,65, 0,98 и 0,54 мкм) в одной и той же дозе (15 Дж), вызывает неоднотипную ответную реакцию кровяных пластинок. В крови, облучённой красным светом, происходит начальное угнетение адгезии и агрегации тромбоцитов, сменяющееся усилением их функции. В крови, облучённой инфракрасным или синим лазером, стимулируются адгезивная и агрегационная функции тромбоцитов. Спустя 10 мин после завершения фотоэкспозиции в крови, облучённой светом каждого из трёх типов лазеров, повышение скорости сдвига оказывает однотипное активирующее влияние на функции кровяных пластинок.

4. НИЛИ красной области спектра не оказывает заметного влияния на агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ в конечной концентрации 5,0 мкМ, стимулирует агрегацию, вызванную низкой концентрацией АДФ (0,73 мкМ), и в обоих случаях влияет на кинетику начальных этапов формирования микроагрегатов, вызывая уменьшение их размера и максимальной скорости образования. Красный свет вызывает отчётливое усиление агрегационного ответа кровяных пластинок на адреналин (5,5 мкМ), сочетающееся с угнетением начального образования тромбоцитарных микроагрегатов. Эффект НИЛИ на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов зависит от дозы агониста: при концентрации коллагена 5,0 мкг/мл излучение красного лазера не оказывает влияния на агрегационный ответ и уменьшает образование микроагрегатов; при концентрации 1,25 мкг/мл лазерное излучение стимулирует агрегацию тромбоцитов, также снижая размер и скорость образования микроагрегатов; при концентрации 0,625 мкг/мл НИЛИ вызывает выраженную стимуляцию макро- и микроагрегации кровяных пластинок.

5. При декомпенсированном негазовом ацидозе происходит угнетение агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ, адреналином и коллагеном. Степень угнетения агрегационной способности тромбоцитов зависит от величины ацидотического сдвига. НИЛИ красной области спектра оказывает отчётливое корригирующее влияние на АДФ- и адреналин-индуцированную агрегацию кровяных пластинок при умеренно выраженном (рН 7,2) и тяжёлом (рН 7,0) ацидозе, причём влияние лазерного света оказывается более эффективным при значительном нарушении кислотно-щелочного баланса. В условиях умеренного ацидоза излучение красного лазера оказывает угнетающий эффект как на макро-, так и на микроагрегацию кровяных пластинок, индуцированную коллагеном. При тяжёлом ацидозе коллаген-индуцированная агрегация тромбоцитов полностью подавляется. Лазерное излучение в этих условиях не приводит к восстановлению агрегационной способности кровяных пластинок.

6. При декомпенсированном негазовом алкалозе происходит угнетение агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ, адреналином и коллагеном. Под влиянием НИЛИ красной области спектра отмечается отчётливая тенденция к нормализации АДФ- и адреналин-индуцированной агрегации кровяных пластинок, нарушенной в условиях алкалоза. При тяжёлом алкалозе НИЛИ красной области спектра оказывает угнетающее влияние на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов.

7. Обнаружено неизвестное ранее биологическое явление: наличие автоколебательного процесса, модифицирующего функции тромбоцитов в условиях in vitro. Период колебаний значений показателей, характеризующих адгезивную и агрегационную функции тромбоцитов, составляет около 35 мин. Выявленная периодичность сохраняется при облучении крови светом красного, инфракрасного или синего лазеров, угнетается эноксапарином натрия и полностью подавляется при низкой скорости сдвига и блокаде P2Yr и Р2У]2-рецепторов тромбоцитов. В основе периодических колебаний функции тромбоцитов лежат циклические изменения экспрессии мембранных тромбоцитарных рецепторов allbp3 и Р-селектина.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При разработке оптимальных методов лазерной терапии необходимо учитывать различное поведение кровяных пластинок облучённой крови при низкой и высокой скоростях сдвига, характерных для венозного и артериального отделов сосудистого русла.

2. НИЛИ красной области спектра может быть апробировано в клинической практике для коррекции нарушений функции тромбоцитов при заболеваниях, сопровождающихся изменениями кислотно-щелочного баланса.

3. Наличие временной организации функции кровяных пластинок следует учитывать при последовательных определениях показателей функции тромбоцитов в целях диагностики патологических состояний, сопровождающихся нарушением тромбоцитарного звена системы гемостаза, и контроля за эффективностью терапии.