Автореферат и диссертация по медицине (14.00.31) на тему:Влияние некоторых цефалоспоринов на микрофлору и колонизационную резистентность кишечника

>л с о г з &

МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ СССР ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ АНТИБИОТИКОВ

На правах рукописи

УДК 615.332:577.182.62

ЛАПЧИНСКАЯ

Андриана Владимировна

ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ ЦЕФАЛО-ПОРИНОВ НА МИКРОФЛОРУ И КОЛОНИЗАЦИОННУЮ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ КИШЕЧНИКА

(Экспериментальное исследование) 14.00.31 — Химиотерапия и антибиотики

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1990

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследо:;ател!-с;<о институте антибиотиков Министерства медицинской промышлс! ности СССР.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Б. А. Шендеров

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор В. М. Бондаренко

доктор медицинских наук Н. Н. Лизько

Ведущая организация: 2-й Московский ордена Ленина госуда] ственный медицинский институт им. Н. И. Пирогова.

Защита состоится « » ¿¿е'^/Р' 1990 г. в/^7 часов ^

заседании Специализированного совета Д 098.03.01 при Всесою ном научно-исследовательском институте антибиотиков по адрес 113105, Москва, Нагатинская ул., За.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИА. Автореферат разослан « 1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат медицинских наук

С. М. Кузнецо

■■'У;'"*)

I

■ / ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

I

'ТяЦиЯ I

"Актуальность проблемы. В последнее десятилетие цефалоспорино-э. антибиотики занимают все большее место в химиотерагтии и профи-ктике бактериальных инфекций. Освоение отечественной промышлен-стью производства этих химиопрепаратов и вовлечение в технологи-ский процесс все больного количества работающих выдвинуло в ка-стве важной задачи сохранение здоровья и поддернание высокой тру-способности лиц, занятых в их производстве- Это тем более необхо-мо в связи с тем, что действующее в СССР санитарное законодатель-во предусматривает обязательную токсикологическую паспортизацию ех соединений, используемых или внедряемых в промышленность.

Многолетние клинические наблюдения, а также экспериментальные следования, проведенные в нашей стране и за рубежом, показали, о одним из ранних проявлений негативного эффекта длительного при-некия антибиотиков является нарушение нормальной микрофлоры чело-ка л дшзотных. Учитывая многообразие функций, выполняемых нор-льной микрофлорой, не приходится сомневаться, что микрозкологиче-ие нарушения, вызываемые антибиотиками, могут привести к серьез-м последствиям как функционального, так и структурного характера.

Целенаправленные исследования по оценке действия цефалоспори-вых антибиотиков и некоторых их полупродуктов на нормальную мик-флору кишечника, применительно к задачам токсикологического экс-рпмента, до настоящего времени выполнялись в недостаточном объ-е. Так, но ясно, какие группы микроорганизмов в кишечнике претер-вают изменения под.действием цефалоспоринов, не выявлены фазы и рмы реагирования микрофлоры на их длительное или кратковременное трагастральное и ингаляционное-воздействие. Не выявлена инюорма-.вность того пли иного метода оценки колонизационной резистентно-'И кишечника, а такяе возможность коррекции микроэкологических на-шений, вызываемых этими антибиотиками. Исследования в этих на-1авлениях будут способствовать расширению представлений о характе-' действия цефалоспоринов и некоторых их полупродуктов на макроор-1низм и его нормальную микрофлору, что позволит разработать меро-)иятия по профилактике и лечению-дисбиозов, вызываемых этими анти-ютиками.

Работа выполнена в рамках отраслевого плана развития науки и 1ХНШШ на 1980-1982 гг. раздел 08 "Научно-исследовательские и тех-1логические работы по охране труда, технике безопасности и пропз-»дственной санитарии" и Всесоюзной программы С-23 "Разработать и гедрпть в практику здравоохранения эффективные меры борьбы и про-

филактики внутрибольничных инфекции и сепсиса" (1984-1956 гг.).

Цель и задачи работы» Основной целью работы являлось выявлею возможности использования микроэкологической системы кишечника кш тест-объекта для разработки новых, дополнительных критериев оценю опасности цефалоспориновых антибиотиков и некоторых полупродуктов их синтеза применительно к промышленной токсикологии.

Для достижения этой цели решались следущие задачи:

- проследить сезонность колебаний количественного состава не! торых представителей аэробной и анаэробной микрофлоры толстой кпш на модели белых крыс различных линий;

- унифицировать методику изучения микроэкологического статусг и колонизационной резистентности толстой кишки экспериментальных животных; дать анализ информативности различным методам оценки кoJ низационной резистентности;

- выявить микробиологические критерии дисбактериоза кпшечникг вызываемого цефалексином, цефотаксимом и некоторыми полупродуктами их синтеза при интрагастральном и ингаляционном воздействии;

- исследовать возможность профилактики развития дисбактериозг вызываемого цефалексином, при сочетанном введении антибиотика с л< вамнзолом или мурамилдипептидом.

Остите положения, вшосштш на защиту. Разработка матодиче-ских подходов бактериологического изучения мшфобной экологии тол< той кишки и оценка колонизационной резистентности кишечника применительно к задачам токсикологического эксперимента по гигиеническ! му нормированию веществ, обладаэдах антимикробной активностью.

Научная новизна работы".' Разработана унифицированная методика оценки количественного состава аэробной.и анаэробной микрофлоры толстой кишки для целой токсикологического изучения и гигиеническ< го нормирования антибиотиков.

Разработан метод оценки колонизационной резистентности, основанный на изучении-динамики изменения фаготипов кишечных палочок, естественно попадавдих в толстый кишечник экспериментальных животных.

С применением унифицированного комплекса методов выявлены фа: и формы реагирования микрофлоры кишечника на воздействие цефалосш ринов. Показателями дисбактериоза при воздействии цефалоспоринов являлись: резкое возрастание содержания в фекалиях црамногативных аэробных бактерий, клостридий и антибиотикорезистентных аэробных бактерий. Выявлена фазность изменений в составе микрофлоры: наиболее выраженные изменения наблюдались в первые трое суток от иомен-введения антибиотиков, нормализация полностью происходила к 30 да

эсстановительного периода.

Методом сканирующей электронной микроскопии изучено состояние аопленки, выстилающей слизистую слепой кишки, при воздействии цефа-эксина.

Разработан метод in vitro оценки антагонистической актнвно-ти содержимого толстого кжпечника в отношении потенциально патогенах бактерий.

Показано, что сочетанное применение цефалексина с левамизолом ли мурамилдипептидом приводило к менее вырааенным количественным зменениям в составе микрофлоры и сокращению сроков воссталовитель-:ого периода.

Практическая значимость. На основании полученных данных разра-отаны методические подходы бактериологического изучения микробной кологии толстой кишки и оценки колонизационной резистентности ключника в условиях токсикологического эксперимента по гигиеническо-¡у нормировании веществ, обладаниях антимикробной активностью.

Материалы легли в основу Методических указаний "Поставка ис-.'ледований по обоснованию предельно-допустимых концентраций антибиотиков в воздухе рабочей зоны", M., МЗ СССР, Л 5051-89.

Проведено токсикологическое изучение и установлены предсльно-;опустимыо концентрации в воздухе рабочей зоны для антибиотиков це-ралоспориновой группы (ГОСТ 12.1.005-88) и ориентировочные безопас-шз уровни воздействия для ряда полупродукта синтеза цефалексина. Разработаны гигиенические рекомендации по безопасному ведению тех-юлогического процесса, которые включены в технологические регламенты на производство цефалексина, цефалотина п цефотакспма.

Апробация работы. Основгага положения диссертационной работы яредставлены на Всесоюзном семинаре "Проблемы взаимодействия x:imuo-гералевтических агентов и нормальной микрофлоры человека и глвотных" (Москва, 1986), Всесоюзном семинаре "Вопросы антибактериальной терапии инфекционных осложнение в неинфекционной клинике" (Москва, 1987), 15-ом Международном конгрессе по химиотерапии (Турция, Стамбул, 1987), Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы стандартизации лабораторных яивотных для медико-биологических исследований" (Москва, 1988), Всесоюзном семинаре "Современные проблемы ан-тибиотикорезистентности" (Москва, 1988), Всесоюзном семинаре "Колонизационная резистентность и хпмиотерапевтические антибактериальные препараты" (Москва, 1988), Всесоюзной конференции "Наука и производство в решении комплексной проблемы "Антибиотики" (Москва, 1989)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 24 печатных работы.

Структура п объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (3 главы), опйсания экспериментальной части (4 главы), обсуждения'результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста,' иллюстрирована рисунками и ЛЗ таблицами. Слисок ли тературы содержитл7^/ наименований;' в том число У^«¿"зарубежных авторов.

ЭНСПЕРИМЕЗТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и метода исследования . Все исследования проведены о использованием цефалексина,' цефо таксима и 4-х подуцродуктов синтеза цефалексина, подученных в яабс ратории технологии подусинтетических антибиотиков ВНИИА.

В работе использованы: в. eubtilis AJTCC 6633 (коллекция шщр организмов ВНИИА.) ;' S. aureus 209-р реп t- oefr • S. epiderai die metr t rifr j Pseudomonas aeruginosa etrry rif1

Bacillus subtills ,'var ctrr J E. ooli £ -62,'RH la

ampr j Klebsiella o^öytooa -3, аирг у oanr ■ (музей Лабора тории промышленной гигиены н экологической микробиологии); кишэчни Тчфаги - Т2, Т4, Tg, Tg,' Т7 (институт Общей генетики АМН.СССР). .'■ Исследования проведены на белых крысах-самках (беопородаые, "л нии Вистар и Фишер) массой 180-220 г," подученных из питомника "Сто бовая" и института эпидемиологии и микробиологии им. Н.в.Гаыанеи. Антимикробные препараты вводили животным двумя способами: интрагас рально через зонд и в условиях ингаляционной затравки. Контроль за содержанием цефалексина,г его полупродуктов и цефотаксима в воздуха затравочных камер осуществлялся спектрофотометриче'окиы (Чурагулова Н.К., 1986) и гравиметрическим методами.' ' •

В качестве материала для исследований использованы свежевыделенные фекалии или содержимое олепой кишки животных, взятые в рдно и тоже время, до приема пищи. . ■ ч

Все микробиологические манипуляции проводились о. использовакв еы правил стерильвооти; при разведении материала, таи где это неоС ходило, использовались овежередуцированные растворы тиогликолевогс буфора. В работе попользованы наборы сухих питательных сред, отечес венного производства, а также фирм "Merk" и "Serva" . '

Все выросшие колонии из максимальных разведений подвергала ми роокоппрованшэ. Идентификацию аэробных грамнегативных бактерий осу щзствляли по методике, описанной Leime-tt в.н. * I9S0. При иде тификадии стафилококков основывались на 1шроокошаг,1.поведе

нии на маннитно-солевом агаре,', на тестах коагуляции кроличьей плаз мы и продукции дезоксирибокуклеазы. Фекальные стрептококка определ ■ - -б- - ' - i".

по способности к росту в присутствии азида натрия, на основании кроскопии, негативной реакции на каталазу. Принадлежность микроор-.низмов к виду Candida а1Мсапзоценивали по образованию септирован-го псевдомицелия на среде с Твином-80, а также по тесту " gemr-ьо " с бычьей сывороткой.

Идентификацию лактобацилл осуществляли на основе способности к юту на среде НРС-4 или селективной среде для лактобацилл (Тюрин .В., Шендеров Б.А.', 1989), отсутствия роста на среде ША, негатив-й реакции на каталазу. Облигатно -анаэробные бактерии подвергали [кроскопии и проверяли на отсутствие роста в аэробных условиях, шзнаком принадлежности грамотрицателышх анаэробных палочек к роду otaroides слуяил их рост па анаэробной среде с канамицином и шкомицином. Микроорганизмы, образующие быстрое почернение при рос-I на среде Вильсона-Блера, относились Hai.ni к роду Clostridium

Определение чувствительности к слтибактериальным препарата'.: юводили методом диффузии в агар согласно инструктивным Методически указаниям (М., 1984).

Используемые методы оценки колонизационной резистентности сличали метод нагрузочных проб с ивдикаторным ига'лмом стафилококка . S. aureus 209-?, репг ,cefr )•

Для фаготилированпя килечных палочек использовали модифицпро-1ЯЯЫЙ На'.Ш МЭТОД бИОТИЛИроваПИЯ, ПрОДЛССОНШЙ V-п der 7?aaij et al.,

[972.

Антагонистическую а.'й'ивяость сухарной анаэробно:} флоры фекалий зучали по методу Boriello S.P. , 1986, в собственной модификации.

Определение бота-асдартилкгиципа осуществляли методом высоко-эльтнрго фореза на бумаге ( Welling o.ff. , 1979) в модификации рапезова Е.В., 1983. '

Выделение энтероцптов для определения адгезивной способности актерий к .эпителиальным.клеткам кишечника проводили методом "пер-атки" (Газите И.К.,1971). .

Исследование морфологии биоплешш, выстилащей проксимальную асть внутренней поверхности слепой киши, осуществляли с использованием электронного микроскопа jsli -35 (Фирма js-ol , Япо1шя)при -нструментальном увеличении 5-10 тыс.

Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли утем вычисления коэффициентов Фишера, Стьюдента с использованием Ш СИ-4. Результаты считались достоверными при значении р< 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛВДОВАШ

Микрофлора толстой 'кишки интактных животных раэяптале линий. Отсутствие целостных представлений о влиянии цефалоспориновых антибиотиков и их полупродуктов на микробиоценоз толстой кишки в значительной степени обусловлено широкой разнородностью экспериментальных подходов, используемых различными авторами (Трахтенберг И.Ц., II др., 1978, ЛИЗЬКО H.H., 1983, Van der Waaij, 1986, ITord C.E. , 1987, Шендеров Б.А., 1987).

В связи с этим, задачей начального этапа исследований являлос] создание унифицированного подхода к анализу основных показателей микробиоценоза толстой кишки экспериментальных животных. С этой целью мы провели сравнительное изучение состава аэробной и анаэробной микрофлоры различных биотопов кишечника белых пнтактных крыс в зависимости от линейной принадлежности животных и сезона года. На рис.1 представлены результаты бактериологических исследований, свидетельствующий о наличии сезонных колебаний в составе аэробной и анаэробной микрофлоры в фекалиях штактных беспородных животных.

Состав микрофлоры толстой кишки зависит от линейной принадлежности животных. Показано отсутствие значимых различий в количестве всех изученных групп микроорганизмов в содержимом слепой кишки и свежевыделенных фекалиях (табл.).

Таким образом, в результате проведения данной серии экспериментов, нам удалось получить сведения о физиологических колебаниях в составе микрофлоры толстой кишки в зависимости от сезона обследования и линейной принадлежности животных, а также о репрезентативности фекальной флоры при изучении микробиоценоза кишечника. Эти данные включены нами в методические рекомендации и должны учитыват: ся при проведении токсикологических экспериментов.

Отработав методологию бактериологического изучения экологии толстой кишки, мы "приступили к решению одной из основных задач исследования - анализу эффекта цефалексина на состав микрофлоры и колонизационную резистентность толстой кишки.

Влияние цефалексина на состав микрофлоры' толстой кишки белых крыс. Эксперимент проведен в условиях однократного (доза 200Шг/кг или ежедневного (доза 800 ыг/кг) в течение 14 дней ннтрагастрально го введения цефалексина.

Как показали наши исследования, антибиотик в испытанных дозах и при различных режимах введения, вызывал однонаправленные изменения количественного и качественного состава микрофлоры толстой киш кп. На 2-7-е сутки после введения цефалексина как в дозе 2000мг/кг так и в дозе 800 мг/кг (рис.2) наиболее характерными проявлениями

количьово анаэробов

кммчьст&о АЭРОБОВ

КИШЬЧНЫХ

ПАЛОЧЕК

РП _

; -

1 г

-

¡Е

=

1 -

[ 1 -

;

/

/ ?

г

/ / / / / г

/ / / /

н / / / / /

ЛАКТОЭОНЕГ. ГГШ)ТП,'УШЬ-№11 БАКТЕРИЙ

ЛАКТОБАЦИАА ЭНТЕРОКОККОВ СТАФИЮК0КК0&

1

"с/

1 /

/

1 /

Ь /

/ / / /

I

1Ш - ЗИМА УЛ -ВЕСНА - ЛЕТО

ЕПП - осень

I

Рис. I. Содержание некоторых кишечных аэробных и анаэробных бактерий в различные сроки обследования.

КОЛИЧЕСТВО АЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИИ В ФЕКАЛИЯХ ИНТАКТНЫХ КРЫС РАЗЛИЧНЫХ ЛИНИЙ {СРВДНЕГОДОШЕ ПОКАЗАТЕЛИ)

Линия Биотоп I животных!кишечника

Количество микроорганизмов ( 1б КОЕ/г )

ЕИСТАР

ФИШЕР

толстая кишка

!слепая ¡кишка

толстая кишка

БЕСПО- |толстая РОДНЫЕ ;кишка

аэроб-анаэ-ные робные бактерии бактерии

7,78± 0,12

?,23± 0,08

7,91 0,11

9,0± 0,06

6,45± 0,11

9,1± 0,05

6,79± 0,08

8,76± .0,05

гкишеч- аэро^--! ста1р-"; стреп- "' лакто-" ны8 ные | лококки;тококки'бациллы палочки грамот1-: |

рица- . ; !.

тельные! I :

бактерии*

.6,52± 0,2

6,-15± 0,25

4,7± 0,03

6,13± 0,07

клост-ридии

4,38± 0,28

4,72± 0,3

4,88± 0,2

4,0± 0,3

1,45± 0,15

4,12± 0,04

3,3% 14,42± 0,14 ;0,12

7Д4± 0,19

|8,24± |0,29

6,8± 0,17

¡0,27

6,Е± 0,11

5.1±

;.0,16

!

:7,97± 0,07

грамот- грамполо-рица- Iжительные тельные ;неспоро-неспоро-: носные носные ;анаэроб-анаэроб-; ные бак-ные бак- терии терии

<2,0

<2,0

8,43± 0,13

8,75* 0,14

7,92± 0,13

2,0 9,04± 7,92±

0,08 0,13

2,81± !-0,26

г - бактерии,' выросшие на среде Плоскирева.

__m

.

у

___

> —'

1

лос/it отмены Антиенотао»

60ССТИН08И-ТЕЛЬНЫЙ ПЕРИОД

Ц1РИОДЫ ОБСЛЕДОВАНИЯ

____

1«/»

I

ФОН 1ХЕА(М 2НСДСМ' 1нип*

ПОСАЕ ОТМ5НЫ * АНТИМОТИКО»

&0ССПН01.

мриол Периоды обсаедовани

• |(Е«ААЕКСИН

.__« КОНТКЛЬ

Рис. 2. Динамика изменения количественного содержания некоторых представителей . кишечной микрофлоры под влиянием цефалексина.

а - стафилококки, д - лактобациллы, ч

б - стрептококки, е - общее количество

в - кишечные палочки, анаэробных бактерю

г - другие условно-па- к - клостридии .

тогенные бактерии, •

юсбактериоза являлось возрастание числа клостпидий и условно-пато-'енных бактерий." Среда последних преобладали грамотрицательные бак-•ерии (клебсиеллы, протеи, псевдомонады и ацинетобактер).. Одновре-шнно с этим резко падало содержание лактобацилл. Действие на стафилококки, фекальные стрептококки и бактероиды проявлялось в некото-юм уменьшении их количества в первые дни от начала введения анти-¡иотика. На фоне продолжающегося введения цефалексина в дозе 800 tr/кт набладалаоь тенденция к восстановлению содержания лактобацилл, ¡тафилококков, энтерококков и бактероидов к концу 2-ой недели.

Сравнительное изучение содержания чувствительных и устойчивых ; цефалексину микроорганизмов в фекалиях опытных и контрольных ютннх показало, что ухе со 2-го дня введения антибиотика наблюдаюсь возрастание пропорции антибиотикорезистенткых штаммов. При »том установлено, что формирование антибиотикорезистентных штаммов ) фекалиях и сроки их персистенции в кишечнике в большей степени 1ависели от первоначальной дозы антибиотика; нежели от длительности юздействия».

Согласно сущеотвущим представлениям в кишечном микробиоценозе ! Bemrell j.a.у 1Э84)помимо прооветной существует и пристеночная Жукозная) микрофлора," которая локализована в виде микроколопий в (уцийовой полисахарлдаой пленке,' внстилащей слизистую кишечника. 1ащящанная планкой экзополисахаридов, цриотеночная микрофлора более готойчива по сравнению'О прооветной к действию различных неблаго-гриятных факторов; ■ ■ .

Методом сканирующей электронной шгоросЕОгтиу нами было показа-ïo, что цефалексин при интрагастрадьном введении,' вызывал глубокие шенания в биопленке, выстилащей слизистую слепой кишки. 7 интак-гных животных Зиопленка првдотавлана в вида мощного складчатого об->аЗования, в толща которого содержатся различные по морфологии бактериальные формы.4 У опытных, животных биопленка отсутствовала на 5олыаом протяжении,' на отдельных участках слизистой кишки видны ос-гатки мукознбго слоя о небольшим количеством.нитевидных с заостреп-шыи концами бактерий"; Пооладниа обнаруживались не во всех полях ¡рения." При макроскопическом исследовании слизистой слепой кишки «началось истонченность станки, а также легкость ей повреждения 1ри механическом воздействии.

. ■ Влияние цефалексина на колонизационную резистентность толстой шшки белых крыс. Одной из важнейших функций нормальной микрофлоры шпечника является обеспечение устойчивости этой области к колонизации посторонними микроорганизмами (Чахава О.В., 1987, Иендеров S.A., 1988). Этот эффект нормальной микрофлоры носит название коло-

кпзационной резистентности.* Выявленные наш изменения микробного состава толстой кишки и повреждение биопленки -послужили основанием детального изучения влияния цефалексина на эту важнейшую функцию нормальной микрофлоры.- С этой целью мы провели эксперименты по оценке колонизационной резистентности толстой кишки крыс," получавших це-фалексин, используя два критерия: длительность персистенции в толстом кишечнике экзогенных индикаторных ыикроорганизыов,' а также характеристику фаготилов кишечных палочек;' естественно попадакцзх в организм с водой и пищей.

Проведенные эксперименты показала,' что крысы,' получавшие цофа-лексин в течение 14 дней в дозе 800 иг/кг к инфицированные внутриже-дудочным введением индикаторной культуры золотистого стафилококка в дозе IQ9 КОЕ, сохраняли указанный микроорганизм до 30 дня наблюдения, в то время как у интактных животных длительность персистенции индикаторного штамма не превышала 7 дней.'

Еа рис.3 приведены результаты исследования спектра фаготилов кишечных палочек, обнаруживаемых в'испражнениях животных-; получавших цефалексин однократно в дозо 2000 иг/кг к контрольных животных. Были изучены 320 штаммов е.coli в отношении чувствительности к 5-ти кишечным Т-фагаы. У интактных животных в.толстой книге обнаружит -' лись кишечные палочки,' представленные в-шл> различными фагоЕарианТа-ни. Как правило; выявлялся какой-то один типичный фаговариант; названный'нами "характеристическим","1 который присутствовал в фекалиях на протяжении всего периода наблюдения (45 дней и более). После введения цефалексина спектр обнаруживаемых феготидов кишечных палочек • в целом по группе расширялся до 12. При этом отмечалось исчезновение характеристического фаговарианта и появление в кишечном содержимом других фаготилов, ранее отсутствующих, сроки сохранения которых колебались от 7 до 14 дней. В аналогичных исследованиях Van der wáaij с соавторами было показано; что у животных и людей, получавших пшро-коспекторные антибиотики заметно расширялось число биохимических вариантов энтеробактерий, присутствующих в кишечном содержимом, что расценивается этими авторами как четкий показатель снижения колонизационной резистентности. Учитывая эти данные, а также результаты собственных исследований, считаем возможным рекомендовать метод фа-готипирования энтеробактерий как показатель состояния колонизационной резистентности толстой кишки.

Ряд авторов ( Welling g.w. , 1979, Чахава O.B., 1985, llorín к», 1987) рекомендует в качестве биохимического показателя состояния, колонизационной резистентности определять ß -аспартплгли-цин,который разрушается нормальной кишечной микрофлорой конвенционаш ных животных; но постоянно присутствует в содержимом кишачника без-

ИНТАКТНЫХ -номера животнмх-2

§

чя I

»2345 1X345 1 2. а 4 5 12345 12345 12545 12345

Период схаедомния ; неаеая

После одноразовой дозы цгсалексмна (2г/кг)

-номера жи&отных-

\ 1 г. 3 4 5 6 7

-- •

У V г ~-Г-9 Г Г 1

Рис. 3. ¿аговар'ианты килечных палочек, изолированных от контрольных и ..¡ыа;алс улвотных.

Условные обозначения фаговариантов £.со& :

1 - устойчивако всем Т-фагам

2 - чувствителенак Т4, Т5 фагш<1

3 - чувст. к фагу - Т^.

- " - - Тк,

45 -б -7 -

а -

9 -10-

11-

12-

- То

"Т2 "Т2

-Т6

- Т.

- То

2' Ч> хб

2' М'

микробных животных. Проведенные наш исследования на выявили наш* чпя этого пептида в кишечника животных'; подвергавшихся воздействию цсфалексина. Возможно, что изменения колонизационной резнетентнооти вызванные цефалексином в условиях настоящего эксперимента,* но столь глубоки; как это наблюдается при назначении широкоспекторных антиби отиков, на которых отрабатывался вышеуказанный биохимический тест.

Известно; что представители нормальной микрофлоры в процессе своего метаболизма образуют комплекс соединений (антибиотикиi токсины", кислоты," перекиси и др.); способных подавлять рост чужеродных бактерий"- СКуааева МЛ>., 1985, Таым А.О., 1987). В связи о отиы ' представляло интерес оценить, каким образом введение цефалексина отражается на антагонистической активности фекальной микрофлоры в отношении граьшоложительшгх и грамотрицательных бактерий»

С этой целью индикаторные пташы стафилококков, кишечных палочек, клабсиелл,- псевдомонад и бацилл; добавляли к свежевнделеншы фекалиям интактных и получавших цефалексин животных и после суточной инкубации в анаэробных условиях проводили подсчет числа жизнеспособных клеток этих бактерий"» .'•'.'•■...•..

' Как видно на рис.4, испражнения интактных животных in vitro -практически полностью элиминировали внесенные в них индикаторные бактерии. В то же время фекалии опытных крыс обладали значительно меньшим ингибиторныы эффектом в отношении этих микроорганизмов » Исключение составляли лишь, кишечные палочки; которые в значительно меньшей степени,' по сравнению с другими нвдвкаторными микроорганизмами, подавлялись нормофлорой; Однако и в данном оду чае У животные получавших цефалексин, антагонистическая аятшзность микрофлоры была ниже по сравнению с ингактнша животными*

В сложной совокупности механизмов, придапцих стабильность нормальной микрофлоре и обеспечивавдих предотвращение заседания кишечг ника хозяина посторонними микроорганизмами, определенную роль играют процессы адгезии микроорганизмов ж энтероцвтам (Брилис В.И., 1986, Горская Е.Ы., 1987). Элементами; ответственными за специфическую адгезию являются, с одной стороны, поверхностные структуры бактерий, содержащие гликолшвды, а о другой - рецепторы (гликопротеи-ны) мембран эпителиальных клеток.1

Мы попытались ответить на вопрос; приводит ли введение цефалексина к изменению адгези,12упцеа способности антероцитов животных. С этой целью мы исследовали в опытах in vitro адгезию цефалекси-норезистентных штаммов клабсиелг; клоачных палочек и стафилококков к энтер9цатам опытных и контрольных животных. Было показано; что фиксирупцая способность внтероцитов крас; получавших цефалексин, в

1,-5-2,0 раза больше; чем таковая у интактных животных.

.-■'*" ■/'■■

н ^Аитчппм^"

9,0 8.0 ю «.О 5,0 4.0 3.0 2.0 1,0

(Рб.аиего$п05а-5) (Е.соН, 3-62) (КГохуксз-Э) (Bc.suM.iUs) ер!с1егш1с115-?)

Рис. 4. 'Антагонистическая активность фекалий в отношении

условно-патогенных бактерий у интактных и получавших , цефалексин I 1Ш мг/кг х 10 дней ) животных.

Г~1 - исходное количество индикаторных микроорганизмов,

1ШШ - количество микробных клеток после контакта с фекалиями контрольных крыс,

1 ■•.'.■;:| - тоже после контакта с фекалиями опытных крыс.

Таким образом, ыоено предположить, что снижение колонизационной резистентности толстой кишки крыс может быть связано как о уменьшением антагонистической активности микроорганизмов, присутсз вувдих в фекалиях, так и с изменением поверхностных структур энте-роцитов у опытных животных.

Влияние песбалексина в комбинации с левамизолом или мурашvnu-пептидом на состав микрофлоры толстой кишки белых крыс» В настояце время доказано, что состав микрофлоры желудочно-кишечного такта нг ходатся под регулирующим контролем иммунных механизмов хозяина (Пь риг Л.А., 1983, William В. , 1983, Herman P. et al. , 1984). В связи с этим мы предприняли попытку уменьшить степень выраженное: дисбиотических изменений, обусловленных введением цефалексина; одновременным введением этого антибиотика с левамизолом или мурамил-дапептидом. Иммуномодуляторы использовались в дозах 2,5 и 0,5 мг/я соответственно, орально, начиная с 7-го дня введения цефалексина i: протяжении 4-х дней. Оценку эффекта указанных препаратов проводила на 2,7 и 30 дни после отмены, путем сравнения количественного содержания в фекалиях аэробных и анаэробных микроорганизмов.- Результаты этой серии экспериментов (рис.5) показали потенциальную способность левамизола и в большей степени мурамилдипептида при их оральном назначении снижать дисбиотический эффект цефалексина на состав микрофлоры толстой кишки. Однако • для детализации этого эффекта иммуномодуляторов и установления оптимальных схем их назначе ния тробуется дополнительные исследования;

Влияние пеФотакспма и полупродуктов синтеза цефалексина на сс став мпкройлоры толстой кишки белых крыс. Одной из задач, настоящег исследования являлось использование разработанной нами схемы выявления дисбиоза в токсикологических экспериментах при установлении порогов антимикробного действия с целью гигиенического нормирована Известно, что в условиях производства поступление ксенобиотиков i организм работащих происходит, в основном, через органы дыхания, связи с чем мы изучали дисбиотический эффект веществ при ингаляционной затравке животных в пылевых затравочных камерах. Исследована подлежали антибиотик цефотаксим - цефалоспорин Ш поколения, а тает некоторые полупродукты синтеза цефалекоина, которые в условиях про изводства могут поступать в воздух производственных Помещений в ви де аэрозолей дезинтеграции.

В литературе имеются указания, что цефотаксим при парентераль ном введении способен вмешиваться в микробную экологию кишечника, что, вероятно, обусловлено его частичной экскрецией с желчью в желудочно-кишечный тракт.

КОЕД

5.0 40 АО 3.0

У

£ Ю[/» 50

8.0

5.0 зКСЕ/г

«.о

9.0

4,0 3,0

1,0 М

13КСЕ/г

'.О о

I

Условно-патогенные микро-органи5мы

1

Лактобацшы

"Ч0 _____

---и* 'ц:--^

Аэроны ,

устойчивые к цефалексину

———-

I «М «I —

х^ *"-"*-цтлекскн ♦ деьамясл

x »»

■

Аназро«ы, УстойнигыЕ к цгоалексину

Каостридии

1 1 ... . зо день

Рис. 5. Влияние одновременного введения цефалексина с иымуно-модулятораыи на микрофлорутолстой кишки белых крыс.

Как показали ияпта исследования, у животных, подвергавшихся ш галяционной затравке цефотаксимом в концентрации 6,2 мг/м3, через 20 часов после воздействия, наблюдалось снижение числа кишечных к лочек, стафилококков,1 общего количества анаэробных бактерий, лактс бацилл. На фоне угнетения нормальной микрофлоры происходило активное заселение кишечника устойчивой к цефотаксиму грамположительно! кокковой флорой. Степень выраженности дисбиотических изменений бш пропорциональна концентрации антибиотика во вдыхаемом воздухе. Порог антимикробного действия цефотаксима при ингаляционном воздейс' вии установлен на уровне 6,2ыг/м3. Концентрация 0,6 мг/м3 оказалась недействующей в условиях однократного ингаляционного воздейс

ВИЯ.

Основными полупродуктами синтеза цефалаксина являются 4 соеда нения. Структурное ядро сульфоксида бензилпенициллина (СфБП) и ме: нольного сольвата сульфоксида бензилпенициллина (МСфШ) представл! но 6-аминопенициллановой кислотой, входящей в состав пенициллина ] всех его синтетических производных. Два других полупродукта - 7—ф< нилдезацетоксицефалоспорановая кислота (7-ФДЦК) и 7-аминодезацето] сицёфалоспорановая кислота (7-АДЦК) имеют общее отруктурное ядро i цефалексином.

Как показали наши исследования,- указанные полупродукты при ш галяционном введении оказывали определенный повреждающий эффект а микрофлору толстой кишки. В целом, характер этих изменений был сх< жим с действием пенициллина и цефалексина, по был выражен в ыеньп степени. Пороги антимикробного дейотвия при однократном икгаляцио: ном воздействии установлены для. СфШ на уровне 16, ШфШ - 12, 7-ЩЩК - 18 и 7-АДЩ .- 16 мг/м3.

Параллельно с изучением специфического антимикробного действ: было исследовано общетоксическое действие цефотаксима и полупроду; тов синтеза цефалекоина (функциональное состояние почек, печени, морфологический состав периферической кровк). При этом было установлено, что пороги общетоксического действия всех изученных веществ были значительно выше соответствующих порогов антимикробног действия. Полученные нами данные имеют принципиальное значение да промышленной токсикологии. Во-первых, они дают основание ргкоменд вать при установлении гигиенических стандартов для веществ, облад пщх антимикробной активностью',• изучение состояния микробной эколо гни кишечника, как высокочувствительного показателя токсического фокта ксенобиотиков на макроорганизм, и, во-вторых, в случае высо кой специфичности действия (шрокая зона антимикробного эффекта), позволяют нормировать их только по специфическому показателю. Пол

энные нами экспериментальные данные по дасбиотическим эффектам зученных препаратов' были использованы при обосновании гигиениче-ешх стандартов на цефотаксиы, цефалексин и полупродукты.его синте-а.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методические подходы бактериологического изуче-ия микробной экологии толстой кишки и одепки колонизационной резис-ентности кишечника примеш1тельно к задачам токсикологического экс-еримента по гигиеничес кому нормированию веществ, обладающих анти-икробной активностью.

2. С применением унифицированного комплекса методов установле-а однотипность воздействия цефалексина, цефотакскма и 4-х полупро-уктов синтеза цефалексина на состав аэробной и анаэробной ыикрофло-ы толстой кишки при различных путях введения. Степень выраженности небаланса кишечной микрофлоры зависела от действующей дозы (кон-рнтрацип) препаратов.

3. Показателями дасбпоза толстой кишки при воздействии цефало-поринов являются резкое подавление пристеночной флоры вплоть до .одной редукции биоплетл, а также изменения з просгзтной микрофло-ie,- характеризующиеся резким возрастанием содержания в фекалиях ■рсмотрлцателышх аэробных бактерий, длострядай и апткбиотпкорозис-:снтных аэробных б-лсторий. Еылзлзпа фазнссгь реакции микрофлоры: юибйлзо выражоппыз игмзпзпжя г-аблпдалпсь в порг-'з трое сутск от мо-:зн?а згэдогпя аптпблотлпа, ncpr.a.tHcanjn ."лгхофлоры толстой ::г™::< юлгостьэ происходила л СО длэ госстапогптзлзпого периода.

4. 2£с:.:ялсзспыЗ агалпз колоплзацпенлей рззпсгс:~псстл з услоп:»-гг гоздэйстгля цефалезедпа доказал, что под глнлппси антибиотика фопеходат уволаченио сроков псрспстзпцнл з толстой к:илкэ пндикатср-юго ггга:л:а стафилококка^ зечезновонао "характеристических" фагова-зиантов е. coll , увеличение числа транзиторпых фаговариантов; ос-габление антагонистической активности содержимого толстой кишки в >тнопзшш различных аэробных гра^долежптелыйг и t-рамотрзцателышх гсловно-патогошшх бактерий; повкгзппе адгезарущих свойств энтероптоз.

5. Сочетаппоэ прзменэнпз цефалексина с левамизолсм или мура-шддалептидом способствовало ослаблению дисбиотических эффектов ан-габиотика, что подтверждалось менее выраженными количественными изменениями в составе макрофлоры л сокращением сроков восстановительного периода.

Список основных работ, опубликованных пй теме диссертации*.

1. Лапчинская A.B., Шендеров ЪЛ., Горская E.J4., Чахава О.В. - Количественные и качественные изменения микрофлоры кишечника крыс под влиянием эритромицина и цефалексина - В сб.: Актуальные проблемы нозокомиалышх инфекций и лекарственной устойчивости микроорганизмов, Тезисы докладов, II., 1986, стр. 142-143.

2. Лапчинская A.B., Шендеров Б.А., Чахава О.В., Горская Е.Ы., Тра-пезов Е.В. - Изменение микрофлоры толстой кишки крыс при оральном введении цефалексина и эритромицина - Антибиотике е ыедициЕ екая биотехнология, 1987, К 3, стр. 202-206.

3. Прохорова И.И.,' Ануфриева Р.Г., Бару Р.В., Лапчинская A.B., Зельцер И.8., Шендеров Б.А. - Оценка антимикробного действия веществ с целью гигиенического нормирования - Антибиотики и медицинская биотехнология, 1987, Я 3, стр. 199-202.

4. Горская Е.М., Лапчинская A.B., Чахава О.В., Шендеров Б.А., Тра-пезов Е.В. - Адгезивная способность представителей кишечной микрофлоры при непрерывном и дробном оральном введении цефалек-,сина и эритромицина - Антибиотики и медицинская биотехнология, 1987, Ji 3, стр. 206-210.

5.' Лапчинская A.B., Заславская П.Л., Шендеров Б.А. - Микробиологические и морфологические изменения толстого кишзчника белых крыс под влиянием цефалексина - В сб.: Вопросы антибактериальной терапии инфекционных осложнений в неинфокционной клинике, М., 1987, стр. 54-55.

6. Лапчинская A.B. - Цефалексин и колонизационная резистентность желудочно-кишечного тракта - В сб.': Колонизационная резистентность и химиотерапевтические антибактериальные препараты,-част! I, Ы., 1988, стр. 57-58.

7. Шендеров Б.А., Ануфриева Р.Г., Бару Р.В., Зельцер И.З., Лапчинская A.B., Прохорова И.И. - Нормальная микрофлора как потенциальный источник формирования и распространения антибиотикоуо-тойчивых микроорганизмов - В сб.: Современные проблемы антибио-тикорезистентности, Ц., 1988, стр. 54-56.

8. Лапчинская A.B. - Метод фаготипирования E.coli в оценке колонизационной резистентности кишечника животных - Антибиотики и микроэкология человека и животных - Труда института, М., 1988, стр. 89-92.

9. Шендеров Б.А., Лапчинская A.B., Зельцер И.З. - Ускоренные методы изучения некоторых параметров токсикометрии антибиотиков при их гигиеническом нормировании - В сб.: Ускоренные методы санитарно-гигиенического нормирования вредных веществ в воздухе ра-

бочей зоны, 1988, Ереван.

10. Прохорова И. И., Зельцер И. 3., Ануфриева Р. Г., Лапчинская А. В. — Критерии нормы количественного содержания микроорганизмов в толстом кишечнике белых крыс и их применение в токсикологическом эксперименте— В сб.: Актуальные вопросы стандартизации лабораторных животных для медико-биологических исследовании, М., 1988, ч. II, стр. 50—52.

11. Лапчинская А. В., Заславская П. Л., Шендеров Б. А., Навашин С. М.— Влияние цефалексина на колонизационную резистентность толстой кишки экспериментальных животных — Антибиотики и химиотерапия, 1989, № 2, стр. 116—120.

12. Горская Е. М., Манохина И. М., Богатырева М. Г., Лапчинская А. В., Наумов А. А. — Адгезивные и колонизирующие свойства бактерий при экспериментальном дисбактериозе кишечника — В сб.: XVIII съезд Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И. И. Мечникова, Алма-Ата, 1989.

13. Шендеров Б. А., Зельцер И. 3., Прохорова И. И., Ануфриева Р. Г., Лапчинская А. В., Бару Р. В. — Методические указания «Постановка исследо-ний по обоснованию предельно-допустимых концентраций антибиотиков в воздухе рабочей зоны», М., МЗ СССР, № 5051—89.

14. В. A. Shenderov, R. G. Anufrieva, J. Z. Zeltser, S. D. Mitrochin, A. V. Lap-chinskaj, J. J. Prochorova — Gastrointestinal microflora and antibiotic toxicology— Gnotobiology and its applicatins. Proc. of the IX th Inter. Sympos. on Gnotobiology, 1987, Versailles, France.

15. B. A. Shenderov, R. G. Anufrieva, A. V. Lapchinskaj, S. D. Mitrochin — Antibiotic effect on intestina! colonization resistance in experimental animals— Abstr. 15 th Congress Chemotherapy, Istambul, 1987, p. 232.