Автореферат и диссертация по медицине (14.00.32) на тему:Влияние измененной силы тяжести на динамику роста и некоторые функциональные характеристики культур инфузорий

Государственный научный центр Российской Федерации -Институт медико-биологических проблем

ВЛИЯНИЕ ИЗМЕНЕННОЙ СИЛЫ ТЯЯЕСТИ НА ДИНАМИКУ РОСТА И НЕКОТОРЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КУЛЬТУР ИНФУЗОРИЙ

14.00.32-авиационная, космическая и морская медицина 03.00.25-клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

ГАВРШ10ВА ОКСАНА НИКОЛАЕВЕ

Москва- 1996

^ (

Работа выполнена в Государственном научном центре Российски Федерации - Институте медико- биологических проблем

Научные руководители:

доктор биологических наук М.Г.Таирбеков

кандидат биологических наук Г.И.Сергеева

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук В.В.Антипов

кандидат биологических наук Ю.А.Лабас

Ведущее учреждение:

Биологический Институт Санкт-Петербургского Государственного Университета

Защита диссертации состоится "_" _1996г. в_

часов на заседании диссертационного совета К.074.31.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Государственном научном центре Российской Федерации- Институте медико- биологических проблем (123007. Москва. Хорошевское ш.,76-а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ПЩ РФ-Института медико-биологических проблем.

Автореферат разослан"_" _1996г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук

И.П.Пономарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность исследований. Изучение путей эволюционной адаптации гивых организмов к силс тяхссти имеет многовековую историю. Вместе с тем, в последние десятилетия в связи с освоением космического пространства появились новые аспекта отоЯ проблемы, которые заключаются не только в теоретическом осмыслении роли гравитационного фактора в эволюции хнзни на Земле, ко и в практической необходимости изучения механизмов влияния измененной силы тяжести, главным образом микрогразитацин. на гивые снстегш различных уровней организации. В центре внимания к этой проблеме находится клетка.

к настоящему времени Ш1еется достаточно экспер:менталь-ных данных, подтверздаюгзпх, что измените направления и величины вектора силы тяяеети оказывает влияние на структурно-функциональные и поведенческие характеристики клеток, функционирую:™« в культурах in vivo и in vitro. Однако, конкретные механизмы происходящих процессов до сих пор не ясны: обусловлены ли эти структурно- функциональные перестройки опосредованным влиянием гравитационного фактора через изменения физико- химических параметров внешней среда (Парфенов. 1988) или se в ряде случаев мы имеем дело с последствиями прямого влияния измененной силы тяжести на клетку как биомеханическую конструкция {Hace, 1983, t'csland, 1987, Таирбеков, 1990). Удобной и наиболее информативной моделью при изучении гравитационных эффектов на клеточном уровне является культура (в природе популяция) свободно-кипущих одноклеточных организмов- Protozoa, которые представляют собой гивые системы, находящиеся одновременно на клеточном, организмешюм и популяциониом уровне организации (Grell, 1S68). Именно на этих системах было получено подавляющее больпинство данных, свидетельствующих об изменениях морфо-функцискалыюго статуса и поведенческих характеристик клеток в условиях гипер-, rano- и мнк-рограватации (Planel et al.,1983, Tlxador et al..1984, Richoil-ley et al., 1986.1988, Габова, 1990, Тшфбехсоз, 1995). Более того, простейшие, в частности. ¡гнфузорпм отряда Karyorelictlda, ю:с:э-C¡e специализированный гравирецептор. - один из основных объектов для изучения гюлзхулярных пеханизгаз иосирнятая н реализации

- г -

гравитационного стимула на клеточном уровне. Недавние исследования (Hemersbach- Krause et al.. 1990,19Э2, Machemer et al.,1992) показали, что ориентация простейших в поле силы тяжести происходит в результате активной переработки информации в клетке с помощью системы внутриклеточной сигнализации.

В лаборатории гравитационной биологии ИМБП, где выполнена данная работа, накоплен большой экспериментальный материал, свидетельствующий о существенных изменениях физиологического состояния культур различных свободноживущих одноклеточных организмов в поле измененной силы тяхести (Таирбеков с со-авт..1991.1992, Таирбеков. Габова, 1992). На различных типах простейших, отличающихся по размерам, массе, форме, темпам деления, уровню обмена веществ и поведенческим характеристикам, выявлены общие закономерности происходящих в них изменений в условиях гипер-. гипо- и микрогравитации. На основании имеющихся экспериментальных данных и теоретических положений авторами была выдвинута гипотеза о приоритете эколото- физиологических характеристик клеток над морфологическими при реализации клеточных механизмов гравичувствительности.

Целью настоящей работы было получение новых экспериментальных данных о структурно- функциональных особенностях до сих пор не изученных в условиях измененной силы тяжести одноклеточных организмов, занимающих промежуточную экологическую нишу в широком диапазоне распределения свободноживущих простейших.

На основании полученных результатов предполагалось расширить видовой состав представителей одноклеточных организмов, подчиняющихся выявленным закономерностям их функционирования в условиях измененной силы тяжести и окончательно сформулировать гипотезу о ведущей роли эколого- физиологических характеристик клеток в процессах восприятия и реализации гравитационного стимула.

Поставленная цель достигалась решением следующих основных задач: 1. Изучением основных морфо- функциональных характеристик (формы, размеров, темпов клеточного деления, динамики роста популяций и других физиологических процессов ) у двух одноклеточных организмов -инфузорий Bursaria truncatella и Dlleptus anser в лабораторных экспериментах в условиях гипергравитации и при

моделировании некоторых эффектов невесомости с использованием, соответственно, центрифуга и клиностата. 2.Сравнительным анализом результатов конкретной работы с экспериментальными дашпза. полученными в нашей лаборатории, и имеющимися в литературе для обоснования обЕЦ1х закономерностей Оункционирования одноклеточных организмов в полз измененной силы тяжести.

Научная новизна работы. Впервые изучены основные структурно-функциональные характеристики одноклеточных организмоз В. ЪпшсаЪеПа н О.апзег в условиях гтшер- и гапогравитацин. усовершенствованы методы культивирования этих организмов для целей проведения лабораторных (наземных) и полетных (в космосе) экспе-риментсз. Доказана необходимость их использования как перспективного модельного объекта гравитационной биологии. На основании полученных экспергменталышх дшпгих выявлено существование обпр« закономерностей поведения культур одноклеточных организмоз в поле силы тяяести и окончательно сформулирована рабочая гипотеза о пряной зависимости степени гравичувствителыгости клеток от уровня их функциональной активности и экологических особенностей обитания.

Научно- практическая значшэдсть работы. Результаты экс-пер:шентальных исследований, выполненных в рамках диссертационной работа, и проведений теоретический анализ позволяет заметно расширить наги знания о механизмах влияния сипы тязестн на клеточном уровне. Вместе с тем, полученные данные кмеат практическую ценность, т.к. могут быть использованы для оптимизации параметров культивирования одноклеточных организмов и совершенствования бкотехкологаческих процессов пак на земле, так и в космосе. Очевидно, что выявленное нагз закономерности додлш быть учтешь при разработке и создании систем биологического ¡шзиеобес-печгшш в перспективных космических летательннх аппаратах.

Основное положения, выносимые на загату. 1. Условия пшергравятацж! (в диапазоне от 2 до 5д) пргшодят к характер:^! нЕкэнекнЕм джкаяхя роста популяций одноклеточных организмов В. 1;гш!са1е11а и О.апзег. После непродолгятелыюго периода стггмулящгд происходит устойчивое синение скорости роста культур. Условия клиностатироважш не оказывают заметного воздействия иа характер дяжжнкп роста этих органиггюз.

2. Гравитационная чувствительность изученных организмов зависит от физиологического состояния культур: а. "молодая" (генетически обновленная) популяция В.truncatella проявляет большую чувствительность к изменению величины и направления вектора силы тягости. б. культуры с высокими темпами деления клеток проявляет большую зависимость динакики роста от величины силы тягестн.

3. Рост н развитие культур В. truncatella и D.anser подчиняется общим закономерностям функционирования свободнсшивуцих одноклеточных организмов в условиях гипер- и гапогравитацни.

Апробация работы и публикации. Результаты работы обсуждены на X Конференции по космической биолопш и авиахсосипеской медицине, Москва, 1994; на 30-й сессии C0SPAR, Гамбург, 1994 н на заседании Всероссийского протозоологического общества, С.-Петербург, 1995. Апробация работы состоялась 15 августа 1995г. на ыеготдельском научном семинаре подразделения 2 ГНЦ РФ- Института кеджо- биологических проблем.

По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста, содергит 16 гра^пкоз, 12 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 168 названий работ отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектами наших исследований были культуры одноклеточных организмов- инфузорий Bursaria truncatella и Dileptus anser. Эксперименты проводили в лабораторных условиях с использованием центрифуги модели "БЩ" и клиностата модели "БМК" в згаше-весен-ние периоды 1S93- 1995гг. Для обработки и анализа полученных данных применял» методы световой микроскопии, для статистической обработки данных морфометрии использовали анализатор изображения (Nlcon) и программу VIDS IV (Cambridge. 1Ж).Для оценки состояния ядерного аппарата клеток и содергшшя ДНК в них использовали метод спектрофотометрин - прибор "Morphoquant" (Robothron.Jena). Для оценки физиологического состояния культур - ряд специальных

цитологических методов, статистический анализ данных выполнен с применением критерия Стьюдента.

Музейные культуры инфузорий Bursaria truncatella и D1-leptus anser (клон ДЗ-1) были получены из Института цитологии РАИ, г.Санкт-Петербург.Клетки В.truncatella и D. anser поддерживали на стандартной среде Прескотта для Protozoa (Prescott, Carrier, 1964). дополнительно разбавленной бидистнллированной водой в 4 и 2 раза, соответственно.Кормом служили дважды отмытые от культуральной среда инфузории Paramecium caudatum (для В. truncatella) и Tetrahynena pyrlformls (для D.anser). Кормили инфузорий три раза в неделя. В условиях музейной культуры клетки В.truncatella при температуре 8-10 "С делились один раз в двое суток, D.anser при температуре 18-20 °С- один раз в сутки.

Исследования проводил!! в условиях центрифугирования при ускорениях 2 и 5 g и в условиях клиностатировашя, имитирующих некоторые эффекты невесомости. Силу тяжести величиной 2 и 5g создавали при вращении центрифуги 100 и 220 об/win, соответственно, при радиусе вращения 19S км. Скорость вращения клнноста-та составила 8 об/мин.

В каждом эксперименте использовали по 30 опытных и 30 контрольных бвксов (это количество определялось техническими параметрами клиностата и центрифуги). Для длительных экспериментов по изучению влияния измененной силы тяжести использовались сестринские клона В.truncatella и сестринские субклоны D.anser на стадии З-го-4-го деления материнской клетки: одна дочерняя особь давала начало опытному, другая- контрольному клону (субклону).

В экспериментах по изучению действия повьшенной силы тяжести мы помещали по 4 клетки В.truncatella в 10 мл свежей среды с кормом. 4 клетки Э.апзсг- в 5 мл. Такая начальная плотность обеспечивала вызтаекость клокоз (субклоноз) до конца эксперимента. Длительность экспериментов составила 30-40 суток. Этот период охватывал логари*:«ическую и стационарную фазы роста, а также начало фазы спада численности клеток опытных культур. Режим кормления на протягешш всего эксперимента поддергивался такоа se, как в музейной культуре. В экспериментах по изучению действия клиностатирсзания это не количество клетох (по 4 клетки) помещал! в бкксы объеном 12 и 6 мл для В. truncatella и D. anser,

соответственно. Бюксы заполняли свежей средой с кормом до образования сверху выпуклого мениска и плотно закрывали полупроницаемой мембраной так, чтобы избежать появления пузырьков воздуха между поверхностью среды и полупроницаемой мембраной.

Особенности процесса образования лицевых вакуолей у ВЛгипсаЪсНа изучали в условиях клиностатировошя и центрифугирования (2в и 5g) в экспериментах различной длительности: 1 сутки , 3 суток . 7 суток, а также в экспериментах, охватывающих все фазы развития культуры (24-36 суток). Подсчет вакуолей в клетках проводили под микроскопом МБС-9 каждые 48ч послс кормления (в экспериментах длительностью 1 сутки- до и после окончания эксперимента).

Кривые роста культур строили на основании статистической обработки данных, полученных подсчетом числа клеток в опытных и контрольных баксах под микроскопом МБС-9.

Часть материала при подсчете численности клеток в экспериментах по изучению действия измененной силы тяжести фиксировали по методу Ниссенбаума (Ы1згепЬаии. 1953). ядра клеток окрашивали по ©ельгену и заключали клетки в канадский бальзам.

Методом морфомстрии определяли размеры клеток инфузорий на постоянных препаратах, а также состояние макронуклеарного аппарата в них (количество макронуклеусов в клетках О.алэег и степень конденсироваиности хроматина в макронуклсусе клеток В.Ъгап-сагеНа). 11а основании этих параметров определяли, в какой фазе клеточного цикла находиюсь основное число клеток в культуре в момент фиксации и каково было их физиологическое состояние.

Дополнительным параметром оценки физиологического состояния ВЛгипсаЪеПа являлось относительное содержание ДНК в микронуклеусах и площадь микронуклеусоз в опытных и контрольных клетках сестринских кленов этой инфузории (метод спсктрофотомет-рии -сканирование). В этом случае использовались данные, полученные для 20 контрольных и 20 опытных клеток, находившихся в момент фиксации в поздней Б-фазе.

Для оценки физиологического состояния культуры учитывали также -количество цист и предцистных особей в популяции; -момент начала процесса виутриклонапьной конъюгации в культуре, если таковой имел место, и количество конъвгантов в ней. Количество

цист, предцистиых особей и конъюгантов в культуре определяли подсчетом их под микроскопом КБС-9.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

В зимне-весенние периоды с 1993 по 1995г. в ходе выполнения диссертационной работы были проведены лабораторные эксперименты с одноклеточными организмами- инфузориями Bursaria tnm-catella и Dileptus anser в условиях измененной силы тяжести (гипер- и гипогравитации). Были изучены следующие мор5о- Функциональные характеристики: те;шы деления клеток в культуре и динамика роста популяции, форма и размеры клеток, их метаболическая активность (скорость образования пищевых вакуолей у B.tnmcatel-1а). адаптационные процессы в популяции (конъюгация и шщистиро-вание). изменение содержания нуклеиновых кислот (ДИК) в ядерном аппарате. Получегашз результаты дали возможность выявить характер и особенности аганедеятельности одноклеточных организмов при изменении величины и направления вектора силы тяаести. Е::эсте с тем, накопленный в диссертацонной работе материал позволил отработать методы подготовки и проведет«! полетных экспериментов, планируемых в 1996-1997ГГ.

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ H3!ŒHEHH0ît СИЛЫ ТЯЕЕСТИ НА ДПНА?.П2£У РОСТА И СИНОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ КУЛЬТУРЫ BURSARIA TRUNCA-TELLA.

На р::с. 1(А,Б) приведены кривые динамики роста культур в условиях гипергравитацин: при ускорении силы тязеста в 2g (рис. 1А) и 5з (рис. 1Б) в диапазоне температур 4.0- 7.0 °С. Контролем в обеих случаях служила стационарная культура (lg). В этих условиях клоны ни в опыте, ки в контроле не достигали своей кахсн-галькой плотности -15-20 кл/мл. ¡tax спя so из рисунка, действие nosissînma сипы тяаести оеличхкоЯ 2g в диапазоне температур 5.0-7.0 °С вызвало с::ачалг стимуляции,а затем- снигегше численности клеток в опытной культуре. Точка псрехреста кривых опыта и контроля приходятся на 10 сутки. МорЗоиетрлчесяиЯ анализ посто-ягп-iKX препаратсз показал, что срся-кя плсцадь клетох о опытных клонах бшз достсзерно ккшгз сраваеЭ пжгзет клзтсх в контроль-

Б.

*- опыт, *—— контроль сутки

Рис. 1. Динамика роста культуры ВЛгипса1е11а в диапазоне температур 4.0-7.0'С в условиях гипергравитации.

А. Ю, декабрь 1993г.

Б. 50, январь 1994г.

пых на 18-е сутки эксперимента. Однако, достоверных различия размеров клеток на 2-е.10-е и 33-е сутки эксперимента не было выявлено.

Действие повышенной силы тяжести величиной 5g в диапазоне температур 4.0-6.0 °С оказывало сходное воздействие (рис.1Б). Точка перекреста кривых приходится на 28-е сутки. Морфонетричес-кий анализ показал, что средняя площадь клеток, развивающихся при действии силы тяжести 5g меньше по сравнению с площадью клеток в контроле как в момент превышения численности клеток опытной культуры над контрольной (19-е сутки эксперимента),так и тогда, когда плотность контрольной культуры была выае опытной (28-е,40-е сутки) (таблица1). Мы предполагаем, что причины уменьшения среднего размера опытных клеток, культивируемых при действии силы тяжести 5g на 19-е и 28-40-е сутки эксперимента различны. Так. на 19-е сутки площадь клеток в опытной культуре оказалась меньше по сравнению с контролем за счет большего количества в опытных пробах клеток в (51-фазе (сразу после деления материнской клетки) и в первой половине Б-фазы (начало периода синтеза клеткой ДНК). Это свидетельствует об интенсивных тешах деления их.Уменьшение не средней площади опытных клеток по сравнению с контрольными на 28-е и 40-е сутки эксперимента было выявлено за счет большего количества предцистных особей в опытной культуре. Снижение темпов роста опытной и контрольной культур и сдвиг точки перекреста кривых опыта и контроля на 28-е сутки в эксперименте по изучению действия силы тягеста величиной 5g по сравнению с темпами роста культур в эксперименте по изучению действия силы тяжести 2g мы объясняем низкой температурой . при которой культивировались опытные и контрольные клетки (4.0-6.0 °С) во время этого эксперимента.

Таблица 1.

Площади клеток инфузории Bursaria truncatella в эксперименте с центрифугированием (5g. январь 1994г.)

контроль опыт оценка достоверн. % отнош.

по Стьюденту опыт/контр

2-е сутки »0.054+0.005 ¡0.049+0.003 ¡недостоверно !

10-е сутки ¡0.080+0.003 ¡0.093+0.002 ¡достоверно.Р<0.01!116.3%

19-е сутки ¡0.106+0.004 ¡ 0.067+0.004 !достоверно.Р<0.01!63.2%

28-е сутки ¡0.099+0.004 ¡0.072+0.004 ¡достоверно,Р<0.01!72.1%

40-е сутки ¡0.089+0.009 ¡ 0.043+0.005 ¡достоверно,Р<0.01¡48.3%

Таким образом, основной причиной изменения динамики роста опытных культур клеток В. truncatella по сравнению с контрольными является повышенная сила тягеста. В начале экспериментов темпы деления клеток в опытных культурах превышают темпы деления их в контрольных. Это сопровождается усилением анаболических процессов в опытных клетках, что подтверждает увеличение количества ДНК в микронуклеусах опытных клеток, находившихся в момент фиксации в поздней S-фазе(таблица 2). В последующем темпы роста опытных культур по сравнению с контролем снижаются. Это сопровождается снижением синтетических процессов в опытных клетках. о чем свидетельствует уменьшение площади микронуклеусов и

Таблица 2.

Цитофотометрические параметры микронуклеарного аппарата у инфузорий Вигзаг1а 1гипса1е11а в условиях гипергравитации (5в, январь 1991).

контроль 1 опыт оценка достоверн. % отнош. по Стьюденту опыт/контр

2-е сутки

содержание ДНК¡4272+136 в Ми (отн.ед) ¡3956+68 ¡недостоверно !

площадь Ми (отн.ед.) ¡2859+77 ¡2676+37 ¡недостоверно !

число Ми в клетке ¡33.13+3.22¡41.39+2.26 ¡недостоверно !

10-е сутки

содержите ДНК¡4678+106 в 1!и (отн.ед) ¡5209+95 ¡достоверно, Р<0.01!111%

площадь Ки (отн.ед.) ¡2998+43 ! 3130+39 ¡недостоверно !

число !!и в клетке ¡34.11+2.77!39.10+2.68 ¡недостоверно !

28-е сутки

содерзсакне ДНК!4453+101 в Ми (отн.ед) ¡3192+66 ¡достоверно,Р<0.01¡72%

площадь Гл (отн.ед.) !2393+52 »2544+40 ¡достоверно, Р<0.01 ¡8555

число !'Л! ¡35.72+2.71!33.50+1.68 ¡недостоверно ! з клетке

количества ДМ в них. Момент начала спада численности клеток в опытных культурах, вероятно, зависит не только и не столько от длительности культивирования при повышенной силе тяжести, но от количества проведших клеточных делений в опытной культуре с начала эксперимента. Спад численности клеток в опытных культурах происходит после достижения популяцией плотности порядка 50- 65 кл на 10 мл, что соответствует четвертому делению клеток в ней. Сизиологическое состояние опытных клеток в период спада их численности в культуре также ухудшается-замедляются темпы деления их по сравнению с контрольным!, в опытных культурах раньше отмечается появление предцистных особей и цист.

На рисунке 2(А.Б)приведены кривые роста культур в условиях гипергравитации при температурах 10.9-12.4 °С.Динамика роста опытных и контрольных культур имеет тот се характер, что и в предыдущих экспериментах: повышенная сила тяжести вызывает увеличение скорости деления клеток в первые недели эксперимента, затем при достижении плотности 40-50 кл в 10 мл в опытных культурах начинается спад численности клеток, в то время как в контрольных клонах увеличение численности клеток продолжается вплоть до максимально возможной плотности порядка 100 кл на 10 мл. Хотя диапазон температур 10-12 °С считается оптимальным для культивирования В.ШшсаЪеПа. тем не менее, в наших экспериментах в этих условиях наблюдалась внутриклональная конъюгация. Этот процесс наступал в опытных культурах по времени раньше, чем в контрольных. и при меньшей плотности клеток в них. В опыте наблюдался также больший процент конъюгантов. Очевидно, с помощью внут-риклональной конъюгации популяция В. 1гипса1е11а стремится приспособиться к условиям повышенной силы тяжести.

Была выполнена также серия экспериментов по изучению действия гипергравитацш: (2 и 5£) на две различные музейные культуры клеток В. 1птсаЪе11а "молодую" (генетически обновленную) популяцию, после кассовой конъюгации в которой до начала экспериментов прошло около 2-3-х недель и "старую" популяцию, размножавшуюся агамно около года. Обе популяции одновременно подвергались действию измененной силы тяжести при температуре 10.9-12.4 °С. Анализ полученных данных подтверди!, что характер

Б. 120

5 10 15 - опыт, м

Рис. 2. Динамика роста культуры ВЛгипсагеНа в диапазоне температур 10.9-12.4 С в условиях гипергравитации.

А. 20, март 1994г.

Б. 50, апрель 1994г.

динамики роста опытных и контрольных культур В.ЪгипсаЪеПа в условиях гипергравнтации сходен для различных популяций этой инфузории. Вместе с тем. в нашх экспериментах "молодая" популяция оказалась более чувствительна к действию повышенной силы тяжести величиной 5ё. чем к действию гипергравитации при ускорении 2g -точка перекреста кривых роста опытной и контрольной культур в эксперименте по изучению действия ускорения величиной 5е приходится на 6-е сутки при численности около 20 кл на 10 мл, а в аналогичном эксперименте по изучению действия гипергравитации величиной 2е- на 11-12-е сутки при плотности опытных и контрольных клонов около 70 кл на мл. Точки перекреста кривых роста опытных и контрольных культур "старой" популяции наблюдались при плотности приблизительно 50 и 60 кп на 10 мл на 11-е и 9-е сутки в экспериментах по изучению действия повышенной силы тяжести 5 и 2g. соответственно. Таким образом, можно заключить, что степень влияния гипергравитации на динамику роста "молодой" (генетически обновленной) популяции инфузории В. ЪгипсаЪеПа находится в линейной зависимости от величины силы тяжести, т.е. с увеличением силы тяжести снижение численности клеток в опытных культурах происходит по времени раньше и при меньшей их плотности по сравнению с контрольными. Для генетически "старых" популяций В.Шт-саге11а подобной зависимости в нашх опытах не наблюдалось.

В экспериментах по изучению действия скомпенсированной силы тяжести (клиностатирование) в диапазонах температур 6.7-8.2 и 10.9-12.4 °С отмечали кратковременные периоды (3-7 суток ). когда численности клеток в опытных клонах достоверно превышает численность клеток в контрольных, пркчем это прев&зение наблюдается в период интенсивного роста как в опыте, так и в контроле. Морфометрнческш анализ показал, что достоверные различия в размерах клеток опытной и контрольной культур наблюдались в конце периода превышения численности клеток опытных клонов над контролем . Уменьшение размеров клеток в этот период в оюткых клонах козно объяснить более интенсивными, чем в контроле, темпами деления клеток (основное число клеток- в И- и в начале Б-фазы).

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ИЗМЕНЕННОЙ СИЛЫ ТЯЖЕСТИ НА ПРОЦЕСС ОБРАЗОВАНИЯ ПЕЦЕВЫХ ВАКУОЛЕЙ В КЛЕШАХ ВШШША ТЯЦКСАТЕНА.

Образование, передвижение пзяцевых вакуолей в одноклеточном организме, выделение неперевариваемых остатков пищи - строго упорядоченный биомеханический процесс, в основе которого легат структурное перестройки акто-миозинового комплекса, требувщие затраты энергии (Албертс с соавт.. 1394). Наги была предпринята попытка выяснить эффекты измененной силы тяжести на механизмы образования туевых вахуолей у В. 1гипса1е11а.

Экспозиция "сотых" бурсарий в лишенкой корма среде и "голодных" клеток в среде с кормом в течзннн 1 суток в условиях измененной силы тяжести не выявила разницы в количестве вакуолей меяду оттока и контролыпла культурам. Такт образом, крат-ковргмеиное (в течение суток) воздействие пшо- и пшергравита-15:11 ие повлияло ни на поглощение клетками корма, ни на образование или перемещение пищевых вакуолей, ни на выделение непергва-ркваекых остатков пг.^'1. 3 экспериментах длительность» 3 суток (в диапазоне температур 10.9-12.4°С) использозали "молодую" популяция клеток (через 2 педели посла конъюгации) и "старую" популяция клеток, разкиозавпувся аггмио около года. Для обеих популяций условия кяшюстатирования не повлияли на количество пищевых вакуолей в клетках. Центрифугировать клеток при 2% в течение того же сроха вызывало снижение количества пищеварительных вакуолей в "молодой" популяции клеток (количество вакуолей в контроле 5.87+0.39. в опыте 2.48+0.29).но количество вакуолей в клетках "старой" популяции не изменилось. Воздействие ускорения силы тязести в течение 3 суток привело к некоторому снижению количества вакуолей в обеих популяциях ("молодая" популяция: контроль - 7.54+0.25, опыт - 6.80+0.31. "старая" популяция: контроль 8.70+0.28. спит - 7.00+0.28). В экспериментах длительностью 7 суток (при температурах 10.9 - 12.4 °С), под влиянием ускорений Zg и 5ц на вторые сутки также происходит уменьшение количества вакуолей в клетках (23: контроль 5.20+0.28, опыт 4.66+0.26, 5g: контроль 7.17+0.47. опыт 5.50+0.35), на четвертые сутки различий не обнаружено. Клзшостатнрование в течение 7 суток не выявило разницы между опнтньгм и контрольным вариантами.

Данные по воздействию повышенной силы тяжести на коли-

10

9

»1 76 5 4-

э-21 0

Б.

я в о о н и и 7 X с о к

I

м

м

1

1"

10

26

28

сутки

О

контроль

Рис. 3. Динамика изменения количества пищевых вакуолей в клетках В.1гипса1е11а при действии повышенной силы тяжести.

А. 2С, декабрь 1993г.

Б. 5С, январь 1994г.

чество пищевых вакуолей в ¡слетках при длительном культивировании агамно размножавшихся бурсарий в диапазоне t° 4.0-7.0°С приведе-кы на рис.3 (А,Б). Как показано на рисунке, в этом случае наблюдается тенденция укеньиения количества вакуолей в опытных клетках по сравнения с контролем. Причем преобладание количества вакуолей в контрольных клетках по сравнению с опытными клетками наблюдается как в Оазе логарифмического роста культур, так и в период спада численности клеток в культуре.

Такта! образом, из полученных нагз! результатов га можем сделать следующие выводы: -во-первых, изменения в процессе образования паевых вакуолей в условиях измененной сивы тяжести развиваются постепенно и не проявляются в первые сутки эксперимента, -во-вторых, направленность этих изменений такова, что центрифугирование приводит к уменьпення пищевых вакуолей в клетках, -в-третьих, зйгкт воздействия возрастает с увеличением силы тяжести от 2g до 5g.

КССЛЕЛ0ВЛ1ШЕ ВЛИЯНИЯ ИЗМЕНЕННОЙ СЯЛЫ ТЯЖЕСТИ НА ДГША!ПШ

РОСТА II СИЗКОЛОГИЧЕКОЕ СОСТОЯНИЕ КУЛЬТУР DILEPTUS AN5ER.

На рисунке 4 (А.Б)приведена динамика роста культур D.an-ser в диапазоне температур 18.0-20.0 °С. В условиях действия силы тяжести 2g переое деление клотох в опытных и контрольных субклонах презло между 2-!® и 4-ми сутками после начала эксперимента. Второе деление контрольных клоноз состоялось на 14-е, опытных- на 16-е сутки эксперимента. В дальнейшем темпы роста контрольно!! и опытной культур возросли и плотность контрольной культуры удваивалась приблизительно каздые 36-40 ч на протяжении эксперимента. Темпы увеличения численности клеток опытной культуры в два раза составляли около 42 часов в период между 16-roí и 21-reí сутками эксперимента, в последующие сутки наблюдался спад численности клеток в опытной культуре. Корфометрический анализ постоянных препаратов выявил достоверное уменьшение размеров опыпшх клетох по сравнении с контролем на 21-е сутки эксперимента. В условиях эксперимента по изучению действия повышенной силы тяжести величиной 5g первое деление клетох контрольной и опытней культур приходилось на 14-е. второе-на 17-е сутки опыта. Далее наблюдался рост контрольной культуры (увеличение численности клеток вдвое каждые 36-40 ч ). а в опытней культуре начал-

сутки

Б. 100

90......

ВО......

70

60......

50

40

У*

10

20

30

40

сугки

*<- опыт 4......... кантрокь

Рис.4. Динамика роста культуры О.апвег в условиях гипергравитации. А. 2С, март 1995г. Б. 50, апрель 1995г.

ся спад численности клеток.МорфометрическиЯ анализ показал, что на 17-е сутки эксперимента средняя длина опытных клетох была достоверно меньше длины контрольных, а на 28-е сутки опытные клетки достоверно уменьшились по сравнению с контрольными также по ширине.

Достоверное уменьшение размеров опытных клетох при длительном культивировании в условиях гипергравитации в диапазоне 2-5g на 21-28-е сутки эксперимента мозно объяснять преобладанием в опытной культуре клеток в G1- и ранней S-Оазе в момент взятия проб. При действии же повышенной силы тягести величиной 5g более 30-ти суток в опытных клетках наблюдали изменение стандартной величины отконешш длины "хобота" к длине "тела" клетки. Воамог-ко, длительное (более месяца) воздействие птергравнтацген величиной 5g ведет к заметному нарушению регуляции процессов линей-кого роста и деления клетох в опытной культуре (Golinska, Jer-ka-Dziadosz. 1973).

Условия шшостатирозшшя в капз1х экспериментах из оказывали заметного влияния на темпы делеш!я и мор5ологическке параметры клетох опытных культур по сравнения с контролем.

Ксяно заключить, что степень гравичувствителькости культуры D.anser с невысокими темпами деления приближается к таковой культур ккЗузорий В. truncatella, размнозав^хся долгое время агакно.

Возрастите величины силы тягести от 1 до 2 и 5g суцест-венно изменяло динамику роста культур и сникало их физиологическую ахтсашость, в то вреги ках условия скомпенсированной силы тяжести не охазкзали столь зокетиого влияния на состояние культур инфузорий. При этом изменение величины вектора силы тяжести с 2 до 5з не вызывало существенных изменений дшшзпш роста этих культур, но оказывало более вырааежгое влияние на корфо-фязиоло-гнческие параметры клеток.

Таким образом, характер ддаакнки роста инфузорий В. truncatella и D.anser в условиях измененной силы тягести в общих чертах сходен с таковым для культур одасхлеточных организмов Tetrahynsna pyriforais. Paraneciun spp. (Clllata). Chlasydoconas reinhardtli. Euglena gracilis (Flagellata). Amoeba proteus (Sarcodina) (Габоза. 1990. Танрбехсз,Габсза, 1992). А т:ен;:о, дейс-

твие повышенной силы тяхести в диапазоне ускорений 2-5g вначале стимулирует рост опытных культур, а затем численность клеток в опыте по сравнению с контрольной культурой заметно снижается. Величина наибольшей плотности опытных культур при действии гипергравитации, как правило, меныае величины той максимальной плотности, которой достигает контрольная культура в условиях эксперимента. К концу экспериментов нередко наблюдается уменьшение размеров опытных клеток и снижение общей физиологической активности опытных культур. Длительность периода стимуляции темпов роста опытных культур по сравнению с контрольными, момент начала спада численности клеток в опытных культурах и динамика дальнейшего их роста в условиях гипергравитации определяется особенностями биологии каждого из изученных одноклеточных организмов.

Высокая гравитационная чувствительность культур одноклеточных организмов Ch.reinhardtii. Е.gracilis, T.pyriformis выражалась в четкой зависимости динамики роста этих культур от величины и направления вектора силы тяжести. Так. в условиях действия повышенной силы тяжести величина ускорении в диапазоне l-5g определяет время наступления спада численности клеток в этих культурах, а также их плотность в стационарной фазе роста. В экспериментах по изучению действия силы тяхести на культуры клеток A.proteus. B.tnmcatella и D.anser столь отчетливо эти зависимости не наблюдались.

На основании анализа большого количества экспериментального материала, полученного в лаборатории, и литературных данных была сформулирована рабочая гипотеза о взаимодействии клеток и клеточных популяций в гравитационном поле в норме и при изменении величины и направления вектора силы тяжести (Таирбеков с со-апт..1991. Таирбеков. Габова. 1992). Сущность этой гипотезы состоит в том. что определяющее значение для функционирования клетки в гравитационном поле имеют уровень ее метаболической активности и экологофизиологические условия ее существования. Отсюда, основными параметрами при оценке степени гравичувствительиости клетки должны быть не только и не столько ее морфологические характеристики (форма, размеры, масса), а уровень метаболической активности клетки и Факторы окружающей среды (степень участия клетки в процессах биоконвекции).

Полученные в ходе вготолпеиия диссертационной работы данные в целом согласуются с общими закономерностями динамики роста свободнозквущих одноклеточных организмов в условиях измененной силы тяжести и подтверждают вызеизложенную рабочую гипотезу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Проведенные в рамках выполнения диссертационной работы исследования позволяют сделать заключение о том, что изменение величины стих тяжести в диапазоне от 1 до 5 g вызывает заметные сдвига в струхтурко- сЗугссцпоналызсй организации! изученных одноклеточных организмов Bursaria truncatella и Dlleptus anser как на уровне издпгалдуальной клетки, так а популяции в целом. Экспериментальны:! доказательством этого могут слузггь: в первом случае -изменения форма и разг.ерсз клетсгс, изменения уровня г:згабо~:з::а клеток (умсньсгпив кол!1чества паевых вакуолей в них), во второй- ускоренна темпов "старения культуры" (раннее гшцнсткрсза-irae, увеличение доли мелких анеуплоидных мпхронуклеусоз в клет-:сах), активация адаптационных процессов в кеп (увеличение числе конъюгантоз) я изменения в ходе крявнх, отраяг;г?;!х д'шаишсу роста культура. Вместе с тем, выявленные особенности "0Г'!з-'-дологического состояния культур позволяют сделать некоторое замечать и дополнения общего характера.

Прежде всего, следует отметить, что особенности хода кривых, отражающих динамику роста культур В. truncatella и D.anser сходни в принципе с особенности:;:! динамики роста других типов одноклеточное оргшшзмсв в аналогичных условиях. Эти особенности подтверждают сОормулированную в надей лаборатории рабочую гипотезу о существовании положительной корреляции между уровнем метаболизм, двигательной активностью клетки, с одной стороны, и степенью ее гравичувствительности. с другой. Основным инструментом для восприятия и реализации гравитационного стимула в метках. лишенных специализированных (морфологически выраженных) граЕирецептсров. очевидно, служат интегральные механизмы, вхлю-чакщие регуляторкые систе-сы, функционирующие ка клеточном и по-пуляциониом уровнях (системы внутриклеточной сигнализации, межклеточные взаимодействия).

С другой стороны, решающа! фактором при реализации механического влияния повышенной силы тяжести, с напей точки зрення.

может быть пространственное перераспределение различающихся по размерам и массе внутриклеточных структур в момент восприятия клеткой гравитационного стимула, как показано на графиках, сти-мулируккций эффект гипергравнтации на темпы роста культур представляет собой лншь кратковременное явление. У одноклеточных организмов. стремящихся образовать скопления в поверхностном слое среды, это связанно со способность» силы тяжести запускать механизмы биоконвекции при более низких значениях разности концентрации клеток, накапливающихся в верхних, насыщенных кислородом слоях воды. В дальнейшем, очень скоро, действие силы ткжести вызывает массовую седиментацию клеток, что ухудшает условия функционирования культуры и, как следствие. - заметное торможение темпов деления клеток и скорости прироста биомассы. У придонных организмов, возмогно, стимулирукифий эффект гипергравнтации объясняется эффектом небольших доз отрицательных воздействий - активацией анаболических процессов в клетках в период адаптации их к повышенной силе тяаести.

Анализ кривых, отрагаж^их динамику роста культур в нагшх экспериментах показывает, что оптимальные величины ускорений для достижения эффектов стимуляции у одноклеточных организмов зависят, главным образом, от степени их двигательной активности и уровня метаболизма. Вместе с тем. ход кривых динамики роста культур в опыте и контроле имеет универсальную сигкоидную форму, характерную для всех ростовых процессов. При этом кривые роста численности клеток в опытных культурах в стационарной фазе всегда располагаются на графике ниже таковых для контрольных культур.

вывода.

1. Условия цзнтрифугирозания в диапазоне ускорений силы тяжести от 2 до 5g вызызгшт характерные сдвига в кар£о-бязиологическом статусе свободноплавающих одноклеточных организмов Вигзаг1а 1.гипса1е11а и ОПсрЬга апзег, которые выражаются в изменении следуюгцих характеристик: а. увеличении темпов деления клеток и скорости роста культуры в начальный период с последувлзш стойким торпоженлем прироста биомассы;

б.изменении метаболической активности (уменьшении количества пищевых вакуолей в клетках):

в. активации адаптационных процессов (более раннее вступление большего количества клеток в процесс конъюгации)

г.ускорении процессов "старения" культуры (раннее образование цист, увеличение в клетках инфузорий доли мелких микронуклеусов с малым количеством ДНК в них)

2.Наблюдается положительная корреляция мезду уровнем Функциональной активности клетки и степенью гравитационной чувствительности культуры, выраженной

а.в более четкой зависимости характера роста культуры от изменения величины и направления вектора силы тяжести;

б. в увеличении периода стимуляции роста культуры в условиях гипергравитации, определяемого числом клеточных делений и скоростью прироста биомассы.

3. Условия юзиостатировання (имитирующие некоторые эффекты невесомости) не вызывают существенных изменений в структуре и функции изученных оргашзмов. характерных для гапергравитацни. В некоторых случаях наблюдается лишь тенденция к ускорению темпов роста клеток и прироста биомассы.

4.Выявленные закономерности динамики роста (характерные кривые роста) являются универсальными для всех топов свободноплавающих одноклеточных оргаинзкез, функционирующих в условиях измененной силы тяжести.

5. Полученные данные подтверждают рабочую гипотезу о приоритете физиологических и экологических характеристик (функциональная и двигательная активность, условия среды) по сравнению с морфологнчесюии (форма, размер, масса) при восприятии и реализации гравитационного стимула на клеточном уровне.

6.Варьируя силой тязести в определенном диапазоне величин (от 1 до 5д) можно управлять процессами роста и развития культур одноклеточных свободноплавающих организмов, что даст

возможность оптимизировать бнотехиологические процессы как. на земле, так и в космических летательных аппаратах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Влияние измененной силы тяжести на культуру одноклеточных зукариотических организмов Bursaria truncatella (Ciliopho-га).// Авиакосмическая и экологическая медицина. 1995, т.29. H 5, с.34-37 (соавторы: Габова А.В.,Сергеева Г.Н..Таирбсков М.Г.)

2.Биомеханические аспекты процесса образования пищевых вакуолей у инфузории Bursaria truncatella в условиях измененной силы тяжести.// Авиакосмическая и экологическая медицина. 1995.т.29, H 6, с.40-46 (соавторы:Габова А.В..Сергеева Г.И..Таирбеков М.Г.)

3. Закономерности роста и функционирования одноклеточных организмов в условиях измененной силы тяжести.// Известия академии наук, 1966 (в печати) (соавторы:Габова А.В.Даирбеков М.Г.)

4. Growth and function regularities of unicellular organises under altered gravity conditions. // Theses for the 31-th COS-PAR Scientific Assembly. Birmingham. England. 199S (в печати) (соавторы:Tairbekov M.G..Gabova A.V.)