Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние хронического потребления никотина в разные периоды онтогенеза на поведение и аддиктивный потенциал никотина у мышей

На правах рукописи

ЧИСТЯКОВ Владимир Сергеевич

ВЛИЯНИЕ ХРОНИЧЕСКОГО ПОТРЕБЛЕНИЯ НИКОТИНА В РАЗНЫЕ ПЕРИОДЫ ОНТОГЕНЕЗА НА ПОВЕДЕНИЕ И АДДИКТИВНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ НИКОТИНА У МЫШЕЙ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2009

003467521

Работа выполнена в Институте фармакологии им. А.В. Вальдмана Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени акад. И.П. Павлова и в Университете Хельсинки (Финляндия)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Звартау Эдвин Эдуардович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Андреев Борис Владимирович доктор медицинских наук, профессор Лосев Николай Андреевич

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургский научно-исследовательский психоневрологический институт им.В.М.Бехтерева

Защита диссертации состоится 15 мая 2009 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д.208.090.03 при Санкт-Петербургском государственном медицинском университете имени акад. И.П. Павлова (197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6/8) в зале заседания Ученого совета

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета имени акад. И.П. Павлова. Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор: _

Митрейкин Владимир Филлипович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Табакокурение и табачная зависимость являются ведущей предотвратимой причиной смертности, которая составляет в мире около 5,4 миллионов человек ежегодно (Mathers C.D., Loncar D., 2006). Неблагоприятные последствия курения табака, как важного фактора риска сердечно-сосудистых, пульмонологических, онкологических и других заболеваний, в первую очередь, определяются длительным воздействием на организм различных компонентов табачного дыма. В свою очередь, длительность табачной интоксикации определяется формированием табачной зависимости, являющейся следствием адциктивных свойств основного психоактивного вещества табака — никотина.

Табачная зависимость, как правило, формируется в подростковом и юношеском возрасте. Существует множество факторов, влияющих на переход от экспериментирования к регулярному потреблению табака (стресс, курение членов семьи, сверстников, реклама сигарет и др.) (Schepis T.S., Rao U., 2005). Вместе с тем остается малоизученным вклад таких биологических факторов, как «недобровольный» опыт хронической никотиновой интоксикации, связанной с курением матери в период беременности и лактации, а также влияние «пассивного» курения в семейной и иной обстановке.

Актуальность исследования эффектов перинатального введения никотина связана с широкой распространенностью материнского табакокурения. Так, курение во время беременности зарегистрировано у 12.2% женщин, родивших в США в 2000 году (Ventura S.J. et al., 2003). Вследствие этого в США рождается около полумиллиона детей в год, подвергнутых внутриутробному воздействию никотина.

Исследования перинатального введения никотина на животных дают противоречивые результаты (Winzer-Serhan U.H., 2008). Отчасти это связано с тем, что в большинстве работ, показавших негативный эффект, использованы дозы никотина, которые существенно превосходят те, которые потребляются беременными женщинами во время табакокурения (Selby Р. et al., 2001; Hussein J. et al., 2007).

Цель работы: Исследование отдаленных эффектов хронического потребления никотина в перинатальном периоде и периоде полового созревания на поведение и аддиктивный потенциал никотина.

Задачи исследования:

1. Разработать модель хронической интоксикации никотином в перинатальный период у лабораторных мышей.

2. Оценить отсроченный эффект введения никотина в перинаталь-

ном периоде на его первично-подкрепляющие свойства в препубертатном периоде и другие поведенческие реакции.

3. Оценить эффект хронического потребления никотина мышами в период полового созревания на его первично-подкрепляющие свойства и поведенческие реакции половозрелых мышей.

4. Оценить эффект введения никотина в перинатальном периоде на плотность никотиновых рецепторов на клеточных мембранах коры и гип-покампа мышей.

5. Сравнить аддиктивный потенциал никотина и кокаина на модели внутривенного самовведения психоактивных средств у мышей

Научная новизна исследования. Впервые установлено, что введение никотина в перинатальном периоде повышает чувствительность к первично-подкрепляющему действию никотина у мышей. Впервые показано, что введение никотина в перинатальном периоде приводит к возникновению поведенческой гиперреактивности. Впервые доказано в эксперименте, что хроническое потребление никотина мышами в период полового созревания (в возрасте от 4 до 11 недель) повышает чувствительность к первично-подкрепляющему действию никотина. Ранее неизвестным является экспериментальное наблюдение того, что компульсивное поведение поиска кокаина у мышей может быть восстановлено условнорефлекторно через 4,5 месяца после отмены кокаина.

Научно-практическое значение работы. Теоретическая ценность работы состоит в экспериментальном доказательстве отдаленных поведенческих последствий перинатального воздействия никотина, в частности, повышения его первично-подкрепляющих свойств и поведенческой гиперреактивности, а также в демонстрации облегчения выработки потребления никотина после хронической н-холинергической стимуляции в периоде полового созревания. Эти факты важны для понимания механизма формирования табачной зависимости и некоторых поведенческих расстройств, в частности синдрома дефицита внимания и гиперактивности.

Практическая ценность работы состоит в экспериментальном обосновании практических рекомендаций по снижению риска инициации табакокурения у детей и подростков. Практически важным является доказательство устойчивости паттерна поведения поиска психоактивных веществ на примере кокаина и возможности его позднего рецидива по ус-ловнорефлекторному механизму.

Положения, выносимые на защиту: 1. Хроническое воздействие никотина в перинатальный период жизни повышает чувствительность к первично-подкрепляющему действию нико-

тина в препубертатный период, а также приводит к поведенческой гиперреактивности у половозрелых животных.

2. Сенситизация к первично-подкрепляющему действию никотина, возникающая после его введения в перинатальный период, не связана с изменением количества а4р2* никотиновых рецепторов в структурах мозга.

3. Хроническое потребление никотина в период полового созревания приводит как к сенситизации (первично-подкрепляющий эффект), так и к толерантности (действие на локомоторную активность) к никотину.

4. Использованные модели и протоколы внутривенного самовведения у мышей позволяют разделить психоактивные вещества, в частности психостимуляторы кокаин и никотин, по их аддиктивному потенциалу.

Реализация результатов исследования. Результаты исследования внедрены в практику учебной и исследовательской работы кафедры фармакологии и НИЦ СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на совместном заседании проблемной комиссии по фармакологии и отдела психофармакологии Института фармакологии им. A.B. Вальдмана СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. Основные материалы работы были доложены на III съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), LXIX научно-практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины -2008» (С.-Петербург, 2008), NIDA International Forum 2006, заседании Санкт-Петербургского общества фармакологов (С.-Петербург, 2009).

По результатам исследования опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах и состоит из введения, обзора литературных источников, описания материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована 11 таблицами и 15 рисунками. Литературный указатель содержит ссылки на 191 научную публикацию.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена на 268 самцах мышей линии Swiss (питомник РАН «Рапполово», Ленинградская область), 38 самках мышей линии Swiss и 230 самцах мышей линии NMRI (питомник Университета Хельсинки). На мышах линии Swiss выполнена большая часть работы, включающая исследование влияния введения никотина в перинатальном периоде на поведение мышей и плотность никотиновых рецепторов в структурах мозга

мышей. На мышах линии NMRI совместно с кафедрой фармакологии Университета Хельсинки выполнен раздел работы по оценке влияния хронического потребления никотина в период полового созревания на поведение мышей.

В работе использовали следующие вещества: (-)-никотина битартрат (Sigma-Aldrich Co., США), кокаина гидрохлорид (Центральная городская аптечная база, С-Петербург, Россия), [ЗН]-эпибатидин (Dupont-NEN Ltd., США). Никотин растворяли в фосфатном буфере (рН = 7,4). Кокаина гидрохлорид растворяли в изотоническом растворе хлорида натрия. [ЗН]-Эпибатидин растворяли в дистиллированной воде. Дозы для никотина рассчитаны по свободному основанию.

Результаты экспериментов обрабатывали с помощью пакета статистических программ SPSS (версия 13.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Статистическую достоверность оценивали с помощью одно- и двухфакторного дисперсионного анализа, адаптированного для ситуаций с повторными измерениями и с разным размером групп. При проведении дисперсионного анализа с повторными измерениями сначала применяли тест Мочли для проверки условия сферичности, в случае несоблюдения которого вводили поправку Хьюн-Фельдта для степеней свободы. Результаты сравнительного исследования внутривенного самовведения никотина и кокаина оценивали с помощью теста Фридмана.

Межгрупповые сравнения (тесты Бонферрони и Вилкоксона) проводили только при условии, что достоверный результат был выявлен процедурой дисперсионного анализа или теста Фридмана.

1. Влияние введения никотина в перинатальном периоде на поведение

Перинатальное введение никотина проводили с использованием модификации метода, предложенного ранее (Pauly J.R. et al., 2004). Никотин вводили с питьевой водой в концентрации 200 мкг/мл. Введение никотина было начато за две недели до спаривания и продолжено во время периода беременности и лактации (Рис.1).

Введение никотина Самовведение никотина у детенышей

с питьевой водой 200 мкг/мл в препубертатном периоде

- ^

I I IЖЖШШШШ 1111 1 неделя Беременность Лактация

Рис. 1. Временная схема перинатального введения никотина и проведения теста реакции внутривенного самовведения никотина.

Оценку первично-подкрепляющего эффекта никотина у детенышей в препубертатном периоде (возраст мышей 6 недель) проводили методом реакции внутривенного самовведения (РВС) никотина.

Основной показатель, характеризующий подкрепляющий эффект никотина (Я-критерий) был достоверно выше в группе мышей с историей перинатального введения никотина по сравнению с мышами, которые получали перинатально растворитель (Рис.2, Р(1>72)=4,362, р < 0,05).

—О— Контрольная группа

Перинатальное введение никотина

Рис. 2. Влияние перинатального введения никотина на РВС никотина. Данные представлены в виде средних значений величины Я-критерия (± ошибка среднего). **р < 0,01 по сравнению с соответствующей группой, самовводившей растворитель (сравнение Бонфер-рони). п = 9-10 для каждой точки.

0.000 0.028 0.056 0.084 0.112 Разовая доза никотина (рг/инфузию)

У мышей, которые получали перинатально никотин, Я-критерий был достоверно выше у тех мышей, которые самовводили никотин в разовых дозах 0,028, 0,056 и 0,084 мкг/инфузию по сравнению с подгруппой, самовводившей растворитель (Рис. 2, р < 0,01, сравнение Бонферрони). В контрольной группе мышей Я-критерий был достоверно выше у тех мышей, которые самовводили никотин в разовой дозе 0,084 мкг/инфузию по сравнению с подгруппой, вводившей растворитель (р < 0,01, сравнение Бонферрони).

Таким образом, перинатальное воздействие никотина привело к сдвигу кривой «доза-эффект» влево, т.е. повышалась чувствительность к подкрепляющему эффекту никотина.

Эффект перинатального введения никотина на спонтанную локомоторную активность оценивали тестированием мышей в актометре в разном возрасте. Перинатальное введение никотина достоверно не повлияло на локомоторную активность мышей в тесте.

Эффект перинатального введения никотина на зоосоциальное поведение половозрелых мышей был оценен в тесте парного взаимодействия. Тест был проведен трижды. В первом тесте животные были протестирова-

ны в обычных условиях, а во втором и третьем тестах — после инъекции никотина (0,4 мг/кг, подкожно, за 10 минут до теста) либо растворителя в чередующемся порядке.

Перинатальное введение никотина достоверно не повлияло на поведение мышей в течение первого теста. Однако, введение никотина в перинатальном периоде привело к достоверному уменьшению количества времени, проведенного в подчиненном состоянии после инъекции растворителя (Рис. 3 А, взаимодействие перинатального введения никотина и эффекта инъекции: Б^о) = 7.663, р < 0,01; р < 0,05, сравнение Бонферрони).

Инъекция никотина достоверно снизила длительность агрессивного поведения (Рис. 3 Б; эффект инъекции: ^1,35) = 21.062, р < 0.001) у всех животных, независимо от перинатального введения никотина, а также снизила длительность зоосоциального взаимодействия (Рис. 3 В; эффект инъекции: Р(1>35) = 10.433, р < 0.005) и увеличила длительность времени проведенного в подчиненном состоянии (Рис. 3 А, эффект острой инъекции: Р(135) = 31,885, 2 < 0,001). Последние два эффекта были достоверными только в группе животных, которым вводили перинатально никотин (р < 0,05 и р < 0,001 соответственно; сравнения Бонферрони).

Эффект перинатального введения никотина на поведение мышей после инъекции растворителя в тесте парного взаимодействия позволил предпо-

□ Сахарин

г///] Перинатальное введение никотина

л

& 120 8

1бо -| А

140 -

подчиненное

л

Й о

X л с; О) ё

100 -80 60 40 20 -0

а

I

70 60 50 • 40 -30 -20 ■ 10 О

£ агрессивное

А

70 60 50 -40 -30 • 2010 О

В заосоциапьное

I

1

Рис. 3. Влияние введения никотина в перинатальном периоде и острой инъекции никотина на поведение половозрелых мышей в тесте парного взаимодействия. Животные протестированы в обычных условиях (1), после инъекции растворителя (2) и после инъекции никотина (3). Данные представлены в виде среднего значения длительности элементов поведения (± ошибка среднего). *р < 0,05, **р < 0,01, ***р < 0,001 по сравнению с растворителем, #р < 0,05 по сравнению с группой, получавшей перинатально никотин (сравнения Бонферрони). п= 18-19.

ложить, что воздействие никотина в перинатальном периоде приводит к гиперреактивности половозрелых мышей в ответ на раздражающие стимулы (инъекция), что потребовало дополнительного экспериментального доказательства.

Исследование эффекта перинатального введения никотина на поведение мышей в условиях стрессового воздействия оценивали в тесте принудительного плавания. В данном тесте погружение в воду может рассматриваться как стрессовое воздействие.

Тест принудительного плавания показал, что перинатальное введение никотина приводит к достоверному снижению длительности пассивного поведения в тесте (рис. 4, Е(135)=21,244, р < 0,001) и достоверному увеличению стереотипного поведения в тесте (рис. 4, «педалирование»; Р(|>35) = 5,709, р < 0,05).

| I Сахарин

г//л Перинатальное введение никотина

Рис. 4. Влияние перинатального введения никотина на поведение половозрелых мышей в тесте принудительного плавания. Данные представлены в виде суммарной длительности отдельных элементов поведения («пассивность», «карабканье», «педалирование», «плавание», М ± т) в течение теста, *р < 0,05, ***р < 0,001 (сравнения Бонферрони).

2. Влияние введения никотина в перинатальном периоде на количество а4р2 никотиновых рецепторов в головном мозге мышей

Поскольку воздействие никотина в перинатальном периоде приводило к повышению чувствительности мышей к его первично-подкрепляющему действию, представляло интерес изучить возможные молекулярные основы этого эффекта. С этой целью был проведен отдельный эксперимент. Введение никотина в перинатальном периоде проводили по тому же мето-

ду что и ранее. Концентрацию никотина и котинина определяли в плазме крови самок мышей в момент отлучения детенышей от матери (рис.5).

Реакции связывания [3Н]-эпибатидина с гомогенатами коры и гиппо-кампа мышей-детенышей проводили в два временных периода: в период, соответствующий проведению РВС никотина (шестинедельный возраст) и в более ранний период (трехнедельный возраст, рис.5).

Введение никотина Реакции связывания с

с питьевой водой 200 мкг/мл рЬЦ-эпибатидином

-ч1/ *

I I I1 I I 1-1

1 неделя Беременность Лактация ^

Изменение концентраций никотина и котинина в плазме крови самок, пивших раствор никотина Рис.5. Временная схема измерения концентраций никотина и котинина в плазме крови самок мышей и проведения реакций связывания [3Н]-эпибатидина с гомогенатами структур мозга мышей-детенышей.

Количество [3Н]-эпибатидина, связавшегося с мембранами коры и гип-покампа мышей, представлено в таблице 1. Перинатальное введение никотина не оказало статистически значимого эффекта на связывание. Концентрация никотина и котинина была определена у 14 самок мышей, потреблявших раствор никотина либо растворителя. Среднее значение уровня никотина и котинина в плазме крови самок, потреблявших раствор никотина, составило 51±8 нг/мл и 547±90 нг/мл, соответственно. У самок, пивших воду без никотина, никотин и котинин в плазме крови обнаружены не были.

Концентрация никотина в плазме крови самок, потреблявших раствор никотина, была приблизительно в 2,5 раза выше таковой у курящих бере-

Таблица 1. Влияние введения никотина в перинатальном периоде на связывание [3Н]-эпибатидина с гомогенатами структур мозга мышей._

Структура Перинатальное вве- Возраст 3 Возраст 6 п

дение недели* недель*

Кора Растворитель 108 ±8 85 ±3 14

Никотин 100 ±6 86 ±3 13

Гиппокамп Растворитель 58 ±6 65 ±2 7,11

Никотин 61 ± 7 62 ±6 6,11

* Данные представлены как количество специфически связавшегося [3Щ-эпибатидина, фмоль/мг белка, п-количество гомогенатов, количество животных составляло 11-14.

менных женщин (Selby P. et al., 2001). В ранних работах, исследовавших эффекты пре/перинатального ведения никотина на животных, никотин вводили в дозе б мг/кг/день через осмотические мини-насосы. При таком режиме дозирования концентрация никотина в плазме крови беременных крыс в 10 раз превышает таковую в крови беременных женщин (Hussein J. et al., 2007).

3. Влияние хронического потребления никотина в период полового созревания на поведение

Хроническое потребление никотина мышами осуществляли путем добавления его в питьевую воду (Pekonen К. et al., 1993). Введение проводили в течение 7 недель, начиная с четырехнедельного возраста. Концентрацию никотина в воде повышали постепенно, начиная с 50 цг/мл и заканчивая 500 цг/мл.

Тестирование мышей в опыте РВС никотина проводили на седьмой день после отмены никотина. В опыте был выявлен эффект хронического потребления никотина, что проявилось в достоверном взаимодействии факторов разовой дозы никотина и хронического потребления никотина (рис. 6, F(2,«9)=7.452, р < 0,01). У мышей, которые потребляли никотин, R-критерий был достоверно выше у подгрупп, самовводивших никотин в разовых дозах 0,014 и 0,028 цг/инфузию по сравнению с подгруппой, самовводившей растворитель (р < 0,001 и р < 0,05 соответственно, тест Бон-феррони). В контрольной группе мышей R-критерий был достоверно выше только у подгруппы, самовводившей никотин в разовой дозе 0,028 цг/инфузшо по сравнению с подгруппой, самовводившей растворитель (рис. 6, р < 0,01, тест Бонферрони).

ме никотина Рис. 6. Влияние хронического потреб-

ления никотина в период полового созревания на инициацию РВС никотина. Данные представлены в виде средних значений величины Я-критерия (± ошибка среднего). *р < 0,05, **р < 0,01, ***р < 0,001 по сравнению с соответствующей подгруппой, самовводившей растворитель (сравнения Бонферрони). п = 11-14 для каждой точки.

-0.1

0.000 0.014 0.028

Разовая доза никотина, иг/инфузию

Таким образом, потребление никотина в период полового созревания привело к сдвигу кривой «доза-эффект» влево, т.е. повышалась чувствительность к подкрепляющему действию никотина.

Тестирование мышей в опытах с «приподнятым крестообразным лабиринтом» и «тестом принудительного плавания» проводили через две и три недели после отмены никотина, соответственно. Тесты были выполнены на разных мышах. Статистически значимого эффекта хронического потребления никотина в период полового созревания на поведение мышей не было обнаружено ни в одном тесте.

Исследование влияния потребления никотина в период полового созревания на локомоторную активность проводили через 3-5 недель после отмены никотина. Исследование было проведено в два этапа. Сначала была оценена спонтанная локомоторная активность мышей. Затем локомоторную активность измеряли поле инъекции никотина в дозе 0,4 мг/кг (подкожно).

Хроническое потребление никотина в период полового созревания не повлияло на спонтанную локомоторную активность половозрелых мышей (рис 7). Никотин в дозе 0,4 мг/кг вызывал снижение локомоторной активности только в группе, которая пила воду и не повлиял на показатели локомоторной активности мышей, которые до этого пили воду, содержащую никотин. Статистически это отразилось в достоверном взаимодействием

Вода

1///1 Хроническое потребление никотина

500

400 -

о

X

т

Ё га 3

5

ш

зоо

200 -

100

Общая активность 11

22

11

Л,

X

250 п

200

150

_ 100 -

50

Ч Ш

Передвижение

22

11

д.

I

11

Рис. 7. Влияние потребления никотина в период полового созревания и острой инъекции никотина на локомоторную активность мышей. Животные протестированы в обычных условиях (1), после инъекции растворителя (2) и после инъекции никотина (3). Данные представлены в виде среднего значения единиц активности (± ошибка среднего). Цифрами над столбцами обозначено количество животных для каждого столбца. ** р < 0,005, *** р < 0,001 по сравнению с локомоторной активностью после инъекции растворителя (сравнения Бонферрони).

факторов хронического введения никотина и острого введения («общая активность»: р < 0,005, F1>4O=9,108; «передвижение»: р < 0,005, FM0=11,151). Последующее межгрупповое сравнение Бонферрони выявило достоверный эффект острой инъекции никотина только в группе мышей, которая пила воду (р < 0,001 и р < 0,005 для «общей активности» и «передвижения» соответственно).

Таким образом, хроническое потребление никотина в период полового созревания привело к возникновению толерантности к подавляющему действию инъекции никотина на локомоторную активность.

4. Сравнительное исследование внутривенного самовведения никотина и кокаина у мышей на модели внутривенного самовведения с использованием внутривенных катетеров.

Исследование проведено на 30 самцах мышей линии Swiss. Всем мышам был имплантирован внутривенный катетер в правую яремную вену. Затем половина мышей получала возможность самовводить кокаин в разовой дозе 250 мкг/кг, а другая - никотин в разовой дозе 10 мкг/кг по методу внутривенного самовведения.

—•— Выглядывания в "активное" отверстие —О— Выглядывания в "неактивное" отверстие

зоо -| Кокаин (250 мкг/кг/инфузию) 300 1 Никотин (10мкг/кг/инфузию)

S

<5 S

250- _

250

200

150 -

100

50 •

123456 123456

ДНИ N = 5 ДНИ N = 9

Рис. 8. Выработка внутривенного самовведения кокаина и никотина у мышей. Данные представлены в виде среднего количества выглядываний мышей (± ошибка среднего) в «активное» и «неактивное» отверстия аппарата для внутривенного самовведения в течение шести последовательных сессий. Столбцами обозначено количество инфузий. * р < 0,05 по сравнению с первой сессией (критерий Вилкок-сона).

Выработка самовведения отображена на рис. 8. Критерием стабильного самовведения было отношение выглядываний в «активное» и «неактивное» отверстие равное двум и более при количестве инъекций за сессию не менее 20. При этом отклонение в количестве «активных» выглядываний в течение трех последовательных дней не должно было превышать 20%. Данного критерия достигли 5 мышей самовводивших кокаин и ни одна из мышей, самовводивших никотин (рис. 8).

Мыши, достигшие критерия стабильного самовведении, были подвергнуты процедурам угашения и условнорефлекторного восстановления поведения поиска кокаина.

Тест восстановления поведения поиска кокаина путем предъявления световых стимулов, ассоциированных с инъекцией кокаина, был проведен через 1,5 и через 4,5 месяца после окончания фазы внутривенного самовведения. Предъявление стимулов, ассоциированных с инъекцией кокаина, привело к достоверному увеличению количества выглядываний в «активное» отверстие (р < 0,01, тест Фридмана), и не повлияло на количество выглядываний в «неактивное» отверстие. При этом достоверное увеличение количества выглядываний в «активное» отверстие под воздействием условнорефлекторных стимулов было обнаружено как через 1,5, так и через 4,5 месяца после отмены кокаина (рис. 9, р < 0,05 критерий Вилкоксо-

на).

о 250 -, т

выглядывания в "активное" отверстие

выглядывания в 'неактивное"отверстие

Рис. 9. Восстановление поведения поиска кокаина. Световые стимулы, ассоциированные с инъекцией кокаина, были предъявлены мышам через 1,5 (УС 1,5 месяца) и 4,5 (УС 4,5 месяца) месяца после отмены кокаина. Белые столбцы - сессия без условных стимулов. Заштрихованные столбцы — сессия с условными стимулами. *р < 0,05 по сравнению с предшествующей сессией без условных стимулов (критерий Вил-коксона), п=5.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Никотин потребляется человеком в процессе табакокурения («активное» и «пассивное» курение), при терапии табачной зависимости, а также потенциально может быть применен при терапии некоторых заболеваний

центральной нервной системы (Jamner L.D. et al., 1998; Checkoway H., Nelson L.M., 1999; Potter A.S., Newhouse P.A., 2004; Allam M.F. et al., 2004). Социальная и медицинская значимость влияния хронического потребления никотина на поведение людей подчеркивается широкой распространенностью табакокурения (доклад ВОЗ о глобальной табачной эпидемии за 2008).

Основной целью настоящего исследования было оценить влияние хронического потребления никотина в два различных периода онтогенеза на поведение и аддиктивный потенциал никотина. Моделирование было проведено на лабораторных мышах с использованием модификаций методов, опубликованных ранее (Pekonen К. et al., 1993; Pauly J.R. et al., 2004). С целью возможности экстраполяции полученных данных на людей в плазме крови мышей были определены концентрации никотина и его основного метаболита котинина. Модель перинатальной никотиновой интоксикации рассматривалась как аналог курения женщинами в периоды беременности и лактации, а хроническое потребление никотина мышами в периоде полового созревания, как модель курения в подростковом возрасте у человека.

Обнаруженные эффекты хронического введения никотина суммированы в таблице 2. Хроническое потребление никотина в перинатальный период и период полового созревания привело к сенситизации мышей к первично подкрепляющему эффекту никотина. Потребление никотина в перинатальный период привело к достоверным отклонениям в поведении мышей в тестах парного взаимодействия и принудительного плавания, которые можно трактовать как гшерреактивность к действию стрессовых стимулов. Эти данные позволяют предположить, что введение никотина в этот ранний период онтогенеза является причиной отклонений поведения, наблюдаемых у потомства женщин, которые курят во время беременности (Wakschlag L.S. et al., 2002; Linnet K.M. et al., 2005; Nigg J.T., Breslau N., 2007; Cornelius M.D. et al., 2007).

Известно, что введение никотина в определенных дозах длительностью от одного дня и более приводит к увеличению плотности («ир»-регуляции) никотиновых рецепторов в структурах мозга, что может объяснить сенси-тизацию к действию никотина (Marks М J. et al., 1985; Pietila К. et al., 1998; Lai A. et al., 2005). С целью исследования правомерности данного механизма сенситизации к действию никотина был выполнен эксперимент, исследующий влияние введения никотина в перинатальном периоде на плотность a4ß2* никотиновых рецепторов. Данный подтип был выбран вследствие известной критичной роли а4 и ß2 субъединиц никотинового рецептора в вентральной тегментальной области в реализации первично-

подкрепляющего действия никотина (Picciotto M.R. et al., 1998; Pons S. et al., 2008). Результаты эксперимента показали отсутствие эффекта перинатального введения никотина на связывание радиоактивного лиганда, [3Н]-эпибатидина, с а4(32* никотиновыми рецепторами коры и гиппокампа мышей. Следовательно, сенситизация к первично-подкрепляющему действию никотина после потребления никотина в перинатальном периоде не связана с увеличением плотности данного подтипа никотиновых рецепторов.

Таблица 2. Эффекты хронического введения никотина мышам в перинатальном периоде и в возрасте от 4 до 11 недель_

Перинатально Возраст от 4 до 11 недель

Сенситизация к первично-подкрепрляющему действию никотина + +

Гиперреактивность на стрессовые раздражители в тесте парного взаимодействия и принудительного плавания + -

Усиление ориентировочно-исследовательской реакции + -

Толерантность к подавляющему действию инъекции никотина на локомоторную активность Нет данных +

Сенситизация к эффектам никотина в тесте парного взаимодействия + Нет данных

Изменение спонтанной двигательной активности - -

Изменение поведения в тесте «крестообразный лабиринт» -

** наблюдалась тенденция к увеличению времени пребывания в открытом луче крестообразного лабиринта (р = 0,064)

Помимо исследования эффектов хронического потребления никотина была проделана работа по развитию и внедрению в исследовательскую практику лаборатории метода внутривенного самовведения у мышей, который используется для оценки поведения компульс явного поиска наркотических веществ (Highfield D.A. et al., 2002; Fuchs R.A. et al., 2003; Soria G. et al., 2008).

В настоящей работе было проведено исследование аддиктивных свойств кокаина и никотина с использованием указанной модели. Однако никотин в отличие от эталонного препарата кокаина не проявил первично-подкрепляющего действия в данной модели, что не позволило сравнить поведение поиска указанных веществ.

Тем не менее, результаты данного исследования впервые показали, что у мышей поведение поиска кокаина провоцируется стимулами, ассоциированными с инъекцией кокаина, через 4,5 месяца после отмены кокаина. Эти результаты позволяют рекомендовать к использованию данную модель для оценки генетической предрасположенности к формированию устойчивого компульсивного поведения поиска кокаина.

ВЫВОДЫ

1. Потребление никотина самками мышей в период беременности и лактации повышает чувствительность к первично-подкрепляющему действию никотина у потомства в возрасте 6 недель, что проявляется сдвигом кривой «доза-эффект» влево на модели инициации внутривенного самовведения никотина.

2. Одним из отсроченных эффектов перинатального воздействия никотина является изменение поведения животных в тесте парного взаимодействия. В частности происходит увеличение продолжительности подчиненного состояния и снижение длительности зоосоциального взаимодействия у животных, подвергнутых никотиновой интоксикации в перинатальном периоде, при введении тест-дозы никотина (0,4 мг/кг).

3. Введение никотина в перинатальном периоде приводит к появлению у мышей поведенческой гиперреактивности в ответ на стрессирую-щее воздействие, что проявляется усиленной ориентировочно-исследовательской реакцией в отборочных претестах в экспериментальных камерах для инициации внутривенного самовведения, снижением длительности подчиненного состояния в ответ на инъекцию растворителя в тесте парного взаимодействия, а также увеличением длительности активных форм поведения в тесте «принудительного плавания».

4. Введение никотина в перинатальном периоде в дозе, сенсити-рующей мышей к первично-подкрепляющему действию никотина, не оказывает влияния на плотность а4р2* никотиновых рецепторов в структурах мозга, что доказывается отсутствием эффекта введения никотина на связывание [ЗН]-эпибатидина с гомогенатами коры и гиппокампа.

5. Семинедельное потребление никотина мышами с питьевой водой в период с 4 по 11 недели жизни приводит к сенситизации к первично-

подкрепляющему действию никотина и повышает его аддиктивный потенциал, что проявляется сдвигом влево кривой «доза-эффект» на модели инициации внутривенного самовведения.

6. Семинедельное потребление никотина мышами не влияет на спонтанную локомоторную активность и поведение в условиях стресса через 2 недели после отмены никотина, о чем свидетельствуют идентичные показатели поведенческих реакций в тесте «принудительного плавания», в «приподнятом крестообразном лабиринте» и в актометре у животных после хронического введения никотина и контрольной группы животных. При оценке влияния тест-дозы никотина на локомоторную активность через 3-5 недель после прекращения хронической интоксикации выявляется толерантность к ингибирующему эффекту холиномиметика.

7. На модели внутривенного самовведения с имплантированным катетером и выбором «активного» и «неактивного» отверстий для выполнения оперантных реакций никотин, в отличие от кокаина, не проявляет достаточной первично-подкрепляющей активности для выработки оперант-ной реакции.

8. После внутривенного самовведения кокаина у мышей вырабатывается устойчивое поведение поиска кокаина, которое провоцируется стимулами, ассоциированными условнорефлекторно с потреблением кокаина, через 1,5 и 4,5 месяца после отмены кокаина.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В период беременности и лактации необходим полный отказ женщин от курения табака. Нецелесообразно лечение табакокурения у беременных и кормящих женщин с применением холинергических агони-стов (пластыри, аэрозоли, жевательные лекарственные формы). Необходимо принимать меры по недопущению «пассивного» курения детей и подростков.

2. Рекомендуется продолжить исследование первично-подкрепляющих свойств никотина на модели внутривенного самовведения после предварительного обучения экспериментальных животных опе-рантным реакциям.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Chistyakov V.S., Tsibulsky V.L. How to achieve chronic intravenous drug self-administration in mice // J.Pharmacol.Toxicol.Methods.-2006.-Vol.53, №2.~P.l 17-127.

2. Zvartau E.E., Chistyakov V., Patkina N.A. Perinatal nicotine exposure has long-term influence on sensitivity to nicotine-induced locomotor activity changes and reinforcement in mice // In "International Trends and needs in Drug Abuse Research", NIDA International Forum. - 2006. - P.44.

3. Чистяков B.C. Перинатальное введение никотина повышает чувствительность к его поведенческим эффектам у мышей // Ученые записки СПбГМУ. - 2006. -Т. 13, №4.-С.76-79.

4. Чистяков B.C. Модификация метода внутривенного самовведения психоактивных веществ у мышей // Вопросы наркологии. 2007. - №2. - С.40-46.

5. Чистяков B.C., Паткина Н.А., Звартау Э.Э., Отдаленные поведенческие эффекты перинатального введения никотина у мышей // Тезисы научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы биологической, клинической и профилактической наркологии». - 2007. - С. 114-115.

6. Беспалов А.Ю., Драволина О.А., Захарова Е.С., Чистяков B.C., Шекунова Е.В., Звартау Э.Э., Поведенческие механизмы никотиновой зависимости: поиск новых путей лечения // Тезисы III съезда фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» . - 2007. -Tl. -С.1612.

7. Chistyakov V, Patkina N.A., Zvartau Е.Е. Р.2.17, Perinatal nicotine exposure increases sensitivity to reinforcing effect of nicotine and has long-term effect on behavior // European Neuropsychopharmacology -2007.-Vol. 17-Suppl. 1.-S52-53.

8. Tammimaki A, Chistyakov V, Patkina N, Skippari J, Ahtee L, Zvartau E, Mannisto P. Effect of forced chronic oral nicotine exposure on intravenous self-administration and rewarding properties of acute nicotine // Eur.J.Pharmacol.-2008.-Vol.591.-P.164-17.

Лицензия от ИД № 00597 от 15.12.99 Подписано в печать 03.04.2009 Усл. печ. л. 1.25 Формат 60x84 1/16 Печать офсетная Тираж 100 экз. Заказ 734/09 197089, Санкт - Петербург, ул. Л. Толстого 6/8 Издательство СПбГМУ

Актуальность проблемы. Табакокурение и табачная зависимость являются ведущей предотвратимой причиной смертности, которая составляет в мире около 5,4 миллионов человек ежегодно (Mathers C.D., Loncar D., 2006). Табачный дым включает более 4000 химических веществ и более 60 из них являются канцерогенами (Hoffmann D. et al., 2001). Неблагоприятные последствия курения табака, как важного фактора риска сердечнососудистых, пульмонологических, онкологических и других заболеваний, в первую очередь, определяются длительным воздействием на организм различных компонентов табачного дыма. В свою очередь, длительность табачной интоксикации определяется формированием табачной зависимости, являющейся следствием аддиктивных свойств основного психоактивного вещества табака - никотина.

Табачная зависимость, как правило, формируется в подростковом и юношеском возрасте. Существует множество факторов, влияющих на переход от экспериментирования к регулярному потреблению табака (стресс, курение членов семьи, сверстников, реклама сигарет и др.) (Schepis T.S., Rao U., 2005). Вместе с тем остается малоизученным вклад таких биологических факторов, как «недобровольный» опыт хронической никотиновой интоксикации, связанной с курением матери в период беременности и лактации, а также влияние «пассивного» курения в семейной и иной обстановке.

Актуальность исследования эффектов перинатального введения никотина связана с широкой распространенностью материнского табакокурения. Так, курение во время беременности зарегистрировано у 12.2% женщин, родивших в США в 2000 году (Ventura S.J. et al., 2003). Вследствие этого в США рождается около полумиллиона детей в год, подвергнутых внутриутробному воздействию никотина.

Исследования влияния перинатального введения никотина на животных дают противоречивые результаты (Winzer-Serhan U.H., 2008). Отчасти это связано с тем, что в большинстве работ, показавших негативный эффект, использованы дозы никотина, которые существенно превосходят те, которые потребляются беременными женщинами во время табакокурения (Selby P. et al., 2001; Hussein J. et al., 2007).

Целью работы являлось:

Исследование отдаленных эффектов хронического потребления никотина в перинатальном периоде и периоде полового созревания на поведение и аддиктивный потенциал никотина.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Разработать модель хронической интоксикации никотином в перинатальный период у лабораторных мышей.

2. Оценить отсроченный эффект введения никотина в перинатальном периоде на его первично-подкрепляющие свойства в препубертатном периоде и другие поведенческие реакции.

3. Оценить эффект хронического потребления никотина мышами в период полового созревания на его первично-подкрепляющие свойства и поведенческие реакции половозрелых мышей.

4. Оценить эффект введения никотина в перинатальном периоде на плотность никотиновых рецепторов на клеточных мембранах коры и гиппокампа мышей.

5. Сравнить аддиктивный потенциал никотина и кокаина на модели внутривенного самовведения психоактивных средств у мышей.

Научная новизна исследования. Впервые установлено, что введение никотина в перинатальном периоде повышает чувствительность к первично-подкрепляющему действию никотина у мышей. Впервые показано, что введение никотина в перинатальном периоде приводит к возникновению поведенческой гиперреактивности. Впервые доказано в эксперименте, что хроническое потребление никотина мышами в период полового созревания (в возрасте от 4 до 11 недель) повышает чувствительность к первично-подкрепляющему действию никотина. Ранее неизвестным является экспериментальное наблюдение того, что компульсивный поиск кокаина у мышей может быть восстановлен условнорефлекторно через 4,5 месяца после отмены кокаина.

Научно-практическое значение работы. Теоретическая ценность работы состоит в экспериментальном доказательстве отдаленных поведенческих последствий перинатального воздействия никотина, в частности, повышения его первично-подкрепляющих свойств и поведенческой гиперреактивности, а также в демонстрации облегчения выработки потребления никотина после хронической н-холинергической стимуляции в периоде полового созревания. Эти факты важны для понимания механизма формирования табачной зависимости и некоторых поведенческих расстройств, в частности синдрома дефицита внимания с гиперактивностью.

Практическая ценность работы состоит в экспериментальном обосновании практических рекомендаций по снижению риска инициации табакокурения у детей и подростков. Практически важным является доказательство устойчивости паттерна поиска психоактивных веществ на примере кокаина и возможности его позднего рецидива по условнорефлекторному механизму.

Положения, выносимые на защиту:

1. Хроническое воздействие никотина в перинатальный период жизни повышает чувствительность к первично-подкрепляющему действию никотина в препубертатный период, а также приводит к поведенческой гиперреактивности у половозрелых животных.

2. Сенситизация к первично-подкрепляющему действию никотина, возникающая после его введения в перинатальный период, не связана с изменением количества (Х4Р2* никотиновых рецепторов в структурах мозга.

3. Хроническое потребление никотина в период полового созревания приводит как к сенситизации (первично-подкрепляющий эффект), так и к толерантности (действие на локомоторную активность) к никотину.

4. Использованные модели и протоколы внутривенного самовведения у мышей позволяют разделить психоактивные вещества, в частности психостимуляторы кокаин и никотин, по их аддиктивному потенциалу.

Реализация результатов исследования. Результаты исследования внедрены в практику учебной и исследовательской работы кафедры фармакологии и НИЦ СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на совместном заседании проблемной комиссии по фармакологии и отдела психофармакологии Института фармакологии им. А.В. Вальдмана СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. Основные материалы работы были доложены на III съезде фармакологов России «Фармакология -практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), LXIX научно-практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины -2008» (С.-Петербург, 2008), NIDA International Forum

2006, заседании Санкт-Петербургского общества фармакологов (С.-Петербург, 2009).

По результатам исследования опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 124 страницах и состоит из введения, обзора литературных источников, описания материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована 11 таблицами и 15 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Потребление никотина самками мышей в период беременности и лактации повышает чувствительность к первично-подкрепляющему действию никотина у потомства в возрасте 6 недель, что проявляется сдвигом кривой «доза-эффект» влево на модели инициации внутривенного самовведения никотина.

2. Одним из отсроченных эффектов перинатального воздействия никотина является изменение поведения животных в тесте парного взаимодействия. В частности, происходит увеличение продолжительности подчиненного состояния и снижение длительности зоосоциального взаимодействия у животных, подвергнутых никотиновой интоксикации в перинатальном периоде, при введении тест-дозы никотина (0,4 мг/кг).

3. Введение никотина в перинатальном периоде приводит к появлению у мышей поведенческой гиперреактивности в ответ на стрессирующее воздействие, что проявляется усиленной ориентировочно-исследовательской реакцией в отборочных претестах в экспериментальных камерах для инициации внутривенного самовведения, снижением длительности подчиненного состояния в ответ на инъекцию растворителя в тесте парного взаимодействия, а также увеличением длительности активных форм поведения в тесте «принудительного плавания».

4. Введение никотина в перинатальном периоде в дозе, сенситирующей мышей к первично-подкрепляющему действию никотина, не оказывает влияния на плотность а4(32* никотиновых рецепторов в структурах мозга, что доказывается отсутствием эффекта введения никотина на связывание [ЗН]-эпибатидина с гомогенатами коры и гиппокампа.

5. Семинедельное потребление никотина мышами с питьевой водой в период с 4 по 11 недели жизни приводит к сенситизации к первично-подкрепляющему действию никотина и повышает его аддиктивный потенциал, что проявляется сдвигом влево кривой «доза-эффект» на модели инициации внутривенного самовведения.

6. Семинедельное потребление никотина мышами не влияет на спонтанную локомоторную активность и поведение в условиях стресса через 2 недели после отмены никотина, о чем свидетельствуют идентичные показатели поведенческих реакций в тесте «принудительного плавания», в «приподнятом крестообразном лабиринте» и в актометре у животных после хронического введения никотина и контрольной группы животных. При оценке влияния тест-дозы никотина на локомоторную активность через 3-5 недель после прекращения хронической интоксикации выявляется толерантность к ингибирующему эффекту холиномиметика.

7. На модели внутривенного самовведения с имплантированным катетером и выбором «активного» и «неактивного» отверстий для выполнения оперантных реакций никотин, в отличие от кокаина, не проявляет достаточной первично-подкрепляющей активности для выработки оперантной реакции.

8. После внутривенного самовведения кокаина у мышей вырабатывается устойчивое поведение поиска кокаина, которое провоцируется стимулами, ассоциированными условнорефлекторно с потреблением кокаина, через 1,5 и 4,5 месяца после отмены кокаина.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В период беременности и лактации необходим полный отказ женщин от курения табака. Нецелесообразно лечение табакокурения у беременных и кормящих женщин с применением холинергических агонистов (пластыри, аэрозоли, жевательные лекарственные формы). Необходимо принимать меры по недопущению «пассивного» курения детей и подростков.

2. Рекомендуется продолжить исследование первично-подкрепляющих свойств никотина на модели внутривенного самовведения после предварительного обучения экспериментальных животных оперантным реакциям.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность к.м.н., ст.н.с. Паткиной Н.А. за помощь в выполнении экспериментов по инициации внутривенного самовведения, зав. лабораторией, к.б.н. Белозерцевой И.В. за помощь в выполнении экспериментов с применением метода парного взаимодействия, Таммимяки А. за методическое обеспечение ГХ-МС исследования плазмы крови, а также к.м.н. Малышкину А.А., Галанкину T.JL, Салминен О, Талка Р., Туоминен Р. за содействие в организации и проведении экспериментов.

Автор выражает благодарность рук. отдела фармакоэпидемиологии и бимедицинской статистики, к.б.н. Вербицкой Е.В. за помощь в статистической обработке данных.