Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Влияние глюконата кальция на токсичность и лечебное действие адриамицина

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК * ;' ОЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

1:: /; ::.:

На правах рукописи УДК 616-006-073: 615". 33

СМИРНОВА Галина Борисовна

ВЛИЯНИЕ ГЛШШАТА КАЛЬЦИЯ НА ТОКСИЧНОСТЬ И ЛЕЧЕБНОЕ ДЕЙСТВИЕ АДРИАМЙЦШ1А

(14.00.14 - Онкология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: Доктор биологических наук Т.А.Богуш

Кандидат физико-математических наук Е.П.Баранов

'Москва - 1994

Работа выполнена в Онкс~огическом научном центре

Российской академии медицинских наук Научные руководители: Доктор биологич» снлх наук Т.А.Богуш Кандидат физико-математических наук Е.П.Баранов

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук И.С.Буренин Доктор медицинских наук, профессор А.Ф.Бухны

Бедущье учреждение:

Научно-исследовательский институт онкологии им. П.А.Герцена

Задета диссертации состоится "г

в "_" часов на заседании Специализированного совета

К.001.17.01 пп защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Онкологическом научном центре РАМН (Москва, 11547&, Каширское шоссе, 24)

Автореферат разослан -Ш' «¿¿Ял 1994 Г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Онкологического научного центра РАМН

Ученый секретарь Специализированного совета доктор медилссяих каук

профзссср ' Е.С.Турусоз

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Актуальной проблемой современной химиотерапии злокачественные новообразований является повышение эффективности широко применяемых в клинической практике противоопухолевых препаратов.

Большинство известных лекарственных средств, а к их числу относятся и большая группа противоопухолевых препаратов антрацик-линового ряда, которые нашли широкое применение при лечении самых разных онкологических заболеваний, обладают выраженными побочными эффектами. Последнее для антрациклинов особенно существенно, так как для этой- группы цитостатиков существует ограничение применения по суммарной дозе: продолжительность лечения антрациклинами лимитируется не только потерей чувствительности опухоли к цитос-татику, но и достижением максимума суммарной дозы (550 мг/м2 ), после которого лечение прекращается, так как резко возрастает опасность развития кардиотоксичности. Клиническое использование этой группы препаратов часто ограничивается также из-за их острой и хронической токсичности, характеризующейся прежде всего супрессией миелоидного росгка кроветворения, стоматитом, тошнотой, рвотой, аллопецией.

Известно, что проявление биологической активности антрациклинов зависит от количества антибиотика, поступившего в клетку. На клеточном уровне этот процэсс регулируется трансмембранным транспортом. Вхождение препаратов в ?<летку осуществляется за счет диффузии, тогда как выброс антибиотика из клетки - активный процесс, осуществляемый энергетическюависимыми насосачи, часть из которых Са-зависимы. В разных клетках активность этой Са-зависимой составляющей может быть различной.

В резистентных опухолевых клетках внутриклеточная концентра-

ция антрациклинов, по-видимому, поддерживается главным образом за счет работы Са-зависимых насосов, тогда как в чувствительных -определяется работой только энергетически-зависимых насосов.

Это вытекает, в частности, из результатов исследований с блокатором Са-каналов верапамилом, который ингибиоует работу Са-зависимых насссов. В чувствительных опухолевых клетках это не сопровождается изменением внутриклеточной концентрации и цитоток-сичности антибиои. .ов. Воздействие верапамила . на резистентные опухолевые клетки приводит к повышение внутриклеточного содержания антрациклинов и к увеличению их цитотоксичности. В опытах на животных этот эффект верапамила реатазуется в виде появления у резистентных опухолей чувствительности к антибиотикам. При этом также отмечается и увеличение кардиотоксичности антибиотиков, то есть одного из проявлений их токсического действия на нормальные клетки. Сказанное, с одной стороны, показывает, что воздействуя на процесс внутриклеточного транспорта антрациклинов можно регу-."чровать их биологическую активность. Но с другой стороны, свидетельствует о том, что несмотря на "привлекательность" подобного рода модификации верапамилом, применение его в клинике может быть существенно ограничено за счет повышения токсических осложнений антрациклиновых антибиотиков.

Поскольку известно, что ионы Са активируют Са-зависимые насосы, мы предположили, что в отличие от вераламила,Са-содержащие соединения должны уменьшать токсичег ие проявления 'антрациклинов, а их лечебное действие в отношении чувствительных опухоле;" ^джно оставаться без изменения. Иными словами, можно ожидг.77 что Па- содержаще соединейия, не позволяя преодолеть резистентность опухоли к антибиотикам, могут быть тем не менее эффективными мо-

- Б -

дификаторами биолог№ескг' активности актрациклиновых антибиотиков.

ЦЕЛИ И 2,,,АЧЛ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования является увеличение эффективности действия антрациклинового антибиотика адриамицина (АД) путем уменьшения его токсических проявлений при применении комбинации антибиотика с глюконатом кальция (ГК).

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить влияние ГК на острую, хроническую токсичность АД в опытах на мышах и кардиотоксичность в опытах на крысах.

2. Оценлть влияние ГК на лечебное действие АД на моделях трансплантируемых опухолей у мышей:

а) чувствительных к действию антрациклина; б) резистентных к антрациклину.

3. Изучить влияние ГК на внутриклеточный уровень адриамици-на в нормальных чувствительных к токсичности антибиотика.

4. Оценить возможность взаимодействия АД с ДНК в модельных экспериментах (в растворе ДНК).

5. Изучить возможность прямого химического взаимодействия ГК с АД.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Впервые проведено изучение влия..пя глюконата кальция (ГК) на острою и хроническую токсичность, в том числе кардиотоксичность, а также лечебное действие антрациклинового антибиотика АД на мо-

долях чувствительных и резистентных трансплантируемых опухолей.

С использованием нового метода прижизненной количественной оценки внутриклеточного накопления АД, разработанного в нзшей лаборатории совместно с сотрудниками Филиала Института Атомной Энергии им.Курчатова, проведено изучение влияния ГК на внутриклеточный уровень АД в нормальных клетках, чувствительных к токсичности АД и в модельных экспериментах (в растворе ДНК).

На основании полученных результатов сформулированы практические рекомендации для клинического применения ГК с целью уменьшения токсичности АД, повышения его разовой и курсовой дозы, для увеличения лечебного действия антибиотика в отношении чувствительных опухолей.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация апробирована на совместной научной конференции лаборатории медицинской химии, лаборатории токсикологии лекарств, лаборатории фармакокинетики и биодоступности, лаборатории экспериментальной эндокринной терапии опухолей и группы изучения противоопухолевых веществ ОНЦ РАМН 9 марта 1994 года.

Материалы диссертации представлены: на Московском отделении I Всесоюзного биохимического общества АН СССР, 1989; на I конференции-конкурсе НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ОНЦ РАМН, Москва, 1990 (3-я премия); на- I Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, ^992.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация изложена на страницах ' машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и ме-

тодов исследования, результатов собственных исследований ( ) обсуждения и выводов, иллюстрирована рисунками и таблицами. Список литературы включает работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Препарат и реактивы.

Препараты: адриамицин (Farmitalia, Италия), глюконат кальция (официнальный препарат, СССР). Реактивы: уксусная кислота марки "ч", натриевая соль полимерной дезоксирибонуклеиновой кислоты из эритроцитов цыплят (Reanal, Венгрия). Препараты вводили з физиологическом растворе внутрибрюшинно в дозах и режимах, указанных при описании результатов.

Животяие.

В работе использованы мыпи инбредных линий, а также их гибриды, полученные из питомника "Столбовая" РАМН и из разведения ОНЦ РАМН.

Опухоли.

Гемобластоз La, плазмацитома МОПС-406, рак шейки матки РШМ-5 и лейкоз Р388 были получены из банка опухолевых штаммов 01Щ РАМН; Р388 с индуцированной устойчивостью к ДКС получены нами в результате ле'прстченной селекции in vivo клеток исходного штамма лейкоза Р388. Опухоли поддерживались регулярными пассатами на ы:,::пзх соответствующие линий.

Культуры клеток.

1. Монослойную культуру тран( Нормированных вирусам ЗУ-40 фкбробластов джунгарского хомячка (линия ДМ-15 - чувствительная к действию здрнампцина) культивировали в стеклянных Флаконах (<:.:> щадъ дна 20 см2) в среде Игла с добавлением 101 сивсратки кру..

го рогатого скота. Опыты проводили на сформировавшемся монослое, примерно 2х106 клеток/флакон.

2. Мопослойные культуры эпителия печени крыс .. эпителия кишечника человека культивировали в пластиковых флаконах (площадь дна 25 см2) в среде ^99 с.добавлением 102 сыворотки крупного рогатого скота. Опыты проводили на сформировавшемся монослое, примерно 2х10б клеток на флакон.

Токсикологииеасю него да.

а) Острая токсичность Оценивали по продолжительности жизни и количеству павших животных в течении 30 дней наблюдения (после введения летальных доз цитостатика).

б) Хроническая токсичность Разовая доза и схема введения АД выбраны, исходя из данных литературы по индукции хронической кар-диотоксичности (РаздиаИ-1?опс|->е^1 еЬ а1., 1980). Токсическое действие оценивали по продолжительности жизни и количеству павших жиеотных в течение всего периода после введения цитостатика и до гибели всех животных.

в) Желудо -ио-кишечная токсичность

Оценивали по изменению массы тела' мышей. Контроль за массой тела животных.во всех токсикологических экспериментах производился в течение всего периода с момента введения АД и до гибели всех животных.

г) Гематотоксичность

Оценивали по количеству лейкоцитов в периферической крови, которую брали из хвостовой вены. Подст">т лейкоцитов проводили 1 камере Горяева после гемолиза эритроцитов в 3£ уксусной кислоте. *

д) Кардиотоксичность

Эксперименты проводились на крысах. Выраженность кардиоток-

сичности АД на разные сроки эксперимента оценивали по электрокардиографическим параметрам.

Хляиотерапевтичесюю методы.

Опухолевые клетки трансплантировали сингенным животным подкожно или внутрибрюшинно в дозе 10б клеток. Терапию начинали на разные сроки после прививки. Противоопухолевое действие АД оценивали по следующим критериям: по увеличению продолжительности жизни павших животных и количеству излеченых мышей в течение 60 дней наблюдения при асцигной форме опухоли и 90 дней при солидной форме опухоли.

Спектральные методы.

Уровни внутриклеточного накопления АД в клетках и в растворе ДНК определяли спектрофлуориметрически по методу, разработанному в нашей лаборатории (Богуш Т.А., Баранов Е.П. "Антибиотики и химиотерапия", 1990 т.35, N11, с.16-18), на флуоресцентном спектрофотометре MPF-4, модель 850 (Hitachi, Япония), в стандартной кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см при длине еолны "возбуждения"- 470 нм и "флуоресценции" - 590 i:m, спектральная ширина щелей составляла 10 нм. Для отсечения рассеянного клетками возбуждающего света при работе с суспензией клеток использовали светофи.7". тр FC-18.

Возможность прямого химического взаимодействия АД с ГК оценивали по влиянию модификатора на спектр АД. Для регистрации спектров поглощения использовали спектрофотометр "Hitachi U-2C00" (Япония) со спектральным разрепение-1 Ihm. Все измерения проводили в кюветах с длиной оптического пути 1 см в интервале длин воли 400 - 600 нм. Точность регистрации оптической плотности (O.D.) была не менее 2 Z.

Статистическая обработка результатов.

Расчет сшибки показателя средней, достоверности различий между значениями проводили с помощью методов параметрической и непараметрической статистики (критерии Фишера-Стьюдента).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. ВЛИЯНИЕ ГК НА ТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ АД.

В работе изучено влияние ГК на острую, хроническую токсичность адриачицина, а также желудочно-кишечную, кардиотоксичность и гематотоксичность. ГК всегда вводили внутрибрюшинно в дозе 200 мг/кг за 10 мин до АД, а также 15 и 40 мин после антибиотика. Таким образом мы пытались поддержать высокую концентрацию ГК во время сохранения в организме максимальной концентрации АД.

Данные, представленные в таблице 1, показывают, что при введении токсичных доз АД 10 к 15 мг/кг, вызывающих гибель от 25 до 752 мышей, ГК полностью защитил животных от летального действия антибиотика. Прл введении АД в дозе ЛДюо 20 мг/кг, снижение острой токсичности антибиотика проявилось в уменьшении количества павших животных и увеличении продолжительности их жизни. Защитный эффект ГК проявился и "при введении дозы АД 25 мг/кг, превышающей ДЦюо: средняя продолжительность жизни животных, получивших АД+ГК, была приблизительно в 2 раза выше, чем'при введении одного антибиотика.

Поскольку в клинической практике А1! применяется не однокра,-но, а многократно особое внимание было обращено на изучение влияния ГК на хроническую токсичность АД.' Результаты этих опытов представлены на рис.1, ^за и режим введения модификатора в этих

1 NN опытов АД («г/кг) Са 1) Продолжительность жизни павших мышей (дни) i Количество пгиши | шэей/обнее коли- | честго иштей в | группе |

1 10 + 8,0 i 0,5 - 2/8 0/8 (25Х; |

г 10 + 8.0 ± 1,9 2/8 0/8 (251) |

3 15 + 10,2 ± 1,5 4/3 0/8 (50« 1

4 15 + 9,6 i 0,9 "é/8 0/8 (752) |

1 20 + 8,5 + 0,8 22,3 ± 2,8 " со со ы> ctí (100« | (38« |

2 20 + 11,0 ± 1,0 14,0 t 4,7 " e/e щ (10CZ) | (зах) I

4 25 4.6 ± 0,4 10.6 ± 2,3 " 8/0 7/8 CIOOS) | (88« |

5 25 + 5,0 ± 0,3 12,1 ± 2.5 " 8/8 ' 8/8 (100« i (100*) ! 1

taüDCia i. Шляние гдэконата кальция (Са) на остров токсическое действие адриамицша (АД).

1) 200 иг/кг Са во всех экспериментах вводили трехкратно: ва 5 мин до и 15, 30 шщ' после АД. Различия между контрольной И опытной группами статистически достоверны (р<0,05).

экеперимрчтах были выбраны на основании положительных результатов оценки антитоксического действия ГК в опытах по острой токсичности АД. Разовая доза АД 4 мг/кг и релчш длительного введения антибиотика были выбраны, исходя из данных литературы.

Видно, что при введении толисо АД 1007. животных пали со средней продолжительностью жизни около 55 дней. Максимальная доза АД, которую удалось ввести животным в этой группе , сотавила 40 мг/кг. Гибель первой мыши отмечена через 33 дней, при этсм мини-

Рис.!. Влияние глюконата кальция (Са) на хроническую токсичность адриамицина (АД)

Максимальная Латентный Мин хальная

Во: .ействие курсовая период ги- летальная

доза АД бели иише&ъ доза (АД)

(мг/кг) (дни) (иг/ кг)

АД 40 38 16

Са + АД ее ее 52

Однократная доза АД - 4 ыг/кг

Количество выживших животных

малъная доза, при которой отмечается гибель периого животного, сотавляет 16 мг/кг.

При аналогичном хроническом введении АД с ГК средняя, продолжительность жизни павших животных составила 104 дня, т.е: была приблизительно в 2 раза больше, чем при введении одного АД. Мак-симальня доза АД, которую удалось ввести животнь'" вместе с ГК, сотавила 68 мг/кг. Гибель первой мыши отменена только через 86 дней, и минимальная доза АД, введенная с ГК, при которой отмечена гибел*> первого животного, составила 52 мг/кг.

Кроме того в хронических экспериментах проводилось постоян-

ное взвешивание животных. На рис.2 представлено изменение массы тела по отношению к исходной, принятой за 100%, в течение всего эксперимента. Видно, что на все сроки наблюдения масса тела мышей, получавших АД с ГК, была выше, чем у животных, которым вводили только антибиотик. Поскольку по общепринятым представлениям уменьшение массы тела после введения цитостаткка является отражением желудочно-кишечной токсичности, можно говорить о том, что ГК уменьшает хроническую желудочно-кишечную токсичность АД.

При оценке влияния на хроническую кардиотоксичность АД по некоторым электрокардиографическим и физиологическим параметрам работы сердца наблюдалась тенденция к ое улучшению. Например, ГК уменьшал, индуцированные АД, изменения начальной стадии деполяризации желудочков, менее выраженными были ишемические изменения миокарда, снизились проявления тахикардии. Тем не менее, на основании имеющихся данных, мы не можем говорить об уменьшении карди-отоксичности АД при введении ГК. На этом этапе, исследования с уверенностью можно утверждать лишь, что ГК не усилил проявления хронической кардиотоксичности АД.

Влияние ГК на гематотоксичность АД оценивали по количеству лейкоцитов в периферической крови (рис.3). Видно, что антибиотик в дозе 10 мг/кг вызвал умеренную лейкопению на 2-4 сутки после введения препарата, а к 6-ым суткам количество лейкоцитов восстанавливалось полностью. При предварительном введении ГК уменьшение количества лейкоцитов в крови после введения АД на Есе сроки наблюдения было менее выраженным.

Итак, по результатам исследования влияния ГК на токсические проявления АД можно сделать заключение, что ГК снижает сстр/и и хроническую токсичность антибиотика, в том числе желудочно-киш-.ч-

Изменение массы тела в% по сравнению с ис- одной

Дни после первого введения АД

Рис .¿Влияние глюконата кальция (Са) на изменение массы тела мышей при курсовом введении адриамицина (АД).

1 - Контроль 2 — АД 3-АД + Са

Опыт 1 Опыт 2

Рис.5. Влияние глюконата кальция (Са-20и ыг/кг) на количество лейкоцитов в периферическс ": крови после введения . адриамицина (АД-10 иг/кг).

колебания количества лейкоцитоз у контрольных животных

ную и гематотоксичность.

2. ВЛИЯНИЕ ГК НА ЛЕЧЕБНОЕ ДЕЙСТВИЕ АД.

Результаты опытов, выполненных на мышах с гемобластозом Ьа, представлены на рис.4. Видно, что при применении одного АД, его

УПЖ

Доза адриамицина (иг/кг)

Рис. ^ . Лечебное действие адриамицина (1) и адриаыиц" ча

с глюконатом кальция (2) у мьшгей о гемобластозом Ьа.

лечебное действие увеличивается с увеличением дозы от 2,5 до 5 мг/кг, при которой лечебный эффект достигает максимальных значений - около. 707. увеличения продолжительности жизни. Затем, из-за проявления токсичности, лечебный эффект антибиотика при увеличении дозы постоянно уменьшался и при высокотоксичной дозе адриамк-цина 10 мг/кг леченые животные живут меньше контрольных.

С ГК характер кривой при применении нетокйичных доз АД 2,5 -

Б мг/кг остается таким же: лечебное действие увеличивается с увеличением дозы антибиотика. Однако, максимально лечебный эффект АД при дозе 5 мг/кг достигает 110% увеличения продолжительности жизни (по сравнению с 70%, при применении только антибиотика). Эффект сохраняется на этом высоком уровне и при дозе АД 7,5 мг/кг, когда лечение животных одним антибиотиком приводит лишь к незначительному (46%) увеличению продолжительности их жизни из-за выраженной токсичности антибиотика и, наконец, при дальнейшем увеличении дозы АД, примененного с ГК, до 10 мг/кг также отчетливо проявляется антитоксическое действие модификатора, что приводит к реализации заметного лечебного эффекта антибиотика (около 30% увеличения продолжительности жизни), в сравнении с 30% уменьшением продолжительности жизни животных, леченых одним АД, по сравнению с контролем.

Результаты опытов по изучению влияния ГК на лечебное действие АД у мышей с плазмацитомой МОПС-406 представлены па pr^.5. Видно, что при применении одного АД, его лечебное действие увеличивается с увеличением дозы вплоть до 10 мг/кг, при которой лечебный эффект достигает максимальных значений - около 130% увеличения продолжительности жизни. Затем, из-за проявления токсичности, которая пропорциональна дозе АД, лечебный эффект антибиотика при- увеличении дозы постоянно уменьшается и при высокотоксичной дозе 20 мг/кг леченые животные живут ппиблизительно в два раза меньше контрольных.

При применении ГК, характер кривой остается таким же, но, во-первых, проявление токсичности АД начинается только с дозы 15 мг/кг, а, во-вторых, что наиболее вайю, лечебное действие достигает 180% увеличения продолжительности жизни. При этом, в группе

>ЛЖ

Рис.5 , Лечебное действие адриаиицина (1) и адриамнцина с гяюконатои кальция (2) у мышей с плазмацитомой МОПС-406.

животных, леченных АД с ГК, появляются излеченные животные: 20 и 40% при дозе антибиотика 10 и 15 мг/кг соответственно.

Исследование влияния ГК на лечебное действие АД в отношении резистентных опухолевых клеток выполнено на двух моделях трансплантируемых опухолей: с' исходной резистентностью -• рак шег и матки РИМ-5 (солидная) и с индуцированной - лейкоз Р-388.

Во всех экспериментах при введении АД с ГК показатели эффективности антибиотика были аналогичны таковым как у животных, получивших только АД. Это свидетельствунт о том, что ГК не повлиял на эффективность лечения АД резистентной опухоли при этом, однако, что наиболее важно, не увеличил резистентность резистентность опухоли к цитостатику.

Таким образом, применение ГК никак не влияет ча биологическую характеристику опухолевых клеток: чувствительность или резис-

тентность опухоли к АД не изменяется при примене. ии модификатора. В то ке время при применении ГК у мышей с опухолью, так же как и у интактных животных, отмечено снижение токсичности АД, что позволяет ■ увеличить лечебную дозу антибиотика и повысить его эффективность до уровня, не достигаемого при введении противоопухоле-. вого препарата без модификатора.

3. ВЛИЯНИЕ П£ НА ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ ТРАНСПОРТ АД.

Для изучения возможного механизма модифицирующего влияния ГК были проведены эксперименты по изучению влияния 'модификатора на внутриклеточный уровень АД.

В нашей лаборатории совместно с сотрудниками .Филиала Института Атомной Энергии им.Курчатова разработан принципиально новый метод исследования прижизненного накопления антрациклинов в клетках, позволяющий оценить этот параметр в динамике и что особенно важно для нашей задачи - в одних и тех же клетках оценить внутриклеточный транспорт АД до л после воздействия модификатора.

В основу метода легли данные литературы и собственные наблюдения о том, что взаимодействие АД с ДНК, но не с другими макромолекулами," приводит к тушению флуоресценции антибиотика. Иллюстрация этой посылки представлена на рис.6. Видно, что в диапазоне доз' АД от 1СТ8 до Ю-4 М при концентрации ДНК в "\створе 5х10~б М отмечается дозово-зависимое тушение флуоресценции антибиотика. В живых клетках этот процесс развивается в течение инкубации их с антрациклином и количественно отражает внутриклеточное содержание антибиотика. Ми использовали этот подход для оценки внутриклеточного накопления АД в клетках нормального эмбрионального эпителия печени крыс и эпителия кишечника человека.

Тушение флуоресценции АД {"/,у. исходному)

Ряс. 6. Изменение интенсивности флуоресценции вдриа— мицина (АД) в растворе ДНК в зависимости от концентрации антибиотика.

Предце всего, оценивая кинетические кривые внутриклеточного накопления разных концентраций АД в суспензии клеток, можно заключить, что использованные клетки высоко чувствительные к действию АД, что совпадает с представлением о гепатотоксичности и желудочно-кишечной токсичности актрациклинов как в опытах на живо. • ных, так и у онкологических больных. В пользу, этого свидетельствует тот факт, что при обеих концентрациях антибиотика, в обоих типах клеток за 60 мин инкубации флуоресценция АД падает более чем на 50% (рис.7, кривые 1). Иными словами можно сказать, что более 50% добавленного антибиотика входит внутрь клеток и взаимодействует с ДНК. Такой уровень внутриклеточного, транспорта АД характерен для чувствительных к нему клеток, тогда как клетки резистентных клеточных культур в аналогичных условиях обычно включают не более 30£ антибиотика.

Рис.7. Влияние глюконата кальция (Са) на инт нсивность флуоресценции адриамицина (Л) при инкубации с гепатоциТаыи (А) и с клзткаыи эпителия кишечника человека (Б).

Флуоресценция .АД исходной/; Слуоресценщи АД исходному)

1- АД (5x10 М)

2-АД (5х10_Т М)+Св (10 и)

л

Г,

»р«ых (ихх)

1- АД (6x10 "и).

г- АД (6x10 7М)+Са (10*^ М)

При добавлении ГК к суспензии гепатоцигов (рис.7А), в которых внутриклеточное накопление ДЦ достигло стационарного уровня к 35-45 мин (кривая 1) отмечено "возгорание" флуоресценции АД, которое увеличивалось во времени и выходило на плато за 5-10 мин инкубации (кривая 2). В пересчете относительно уровня флуоресценции АД, принятого за 100%, при котором ГК был добавлен к клеткам, это "возгорание" флуоресценции составляет около 20%. Иными словами; при добавлении ГК, часть АД переходит в свободное, не связанное с ДНК, состояние.

На рис.7Б показан характер изменения кинетической кривой при добавлении ГК к суспензии клеток эпителия кишечника человека. В момент, когда внутриклеточное накопление АД достигло стационарного уровня (кривая 1), отмечено аналогичное "возгорание" флуоресценции АД, которое составило около 30% (кривая 2).

Обсуждая возможные причини уменьшения внутриклеточного содержания АД при добавлен...1 ГК, можно высказать по крайней мере два возможных объяснения наблюдаемого эффекта. Во-первых, это может быть связано с нарушением комплекса АД с ДНК.Во-вторых - спектральным феноменом,отражающие химическое взаимодействие АД с ГК.

Результаты оценки возможности химического взаимодействия АД с ■ ГК приведены на рис.8. Вилно, что в диапазоне исследованных

АД - 5х1СГ°М Са - 5х10~2 М

АД - 2,5x1 Са - 5x10 ^М

-----АД + Са

—.— АД + Са

Рис. & . Влияние глюконата кальция (Са) на спектральные характеристики адриаыицина (АД).

длин волн (от 400 до 600 нм) при обеих исследованных, концентре циях антибиотика ГК не повлиял на спектр поглощения АД: ни высота, ни местоположение пиков АД на спектре не изменялись при добавлении модификатора.

Таким образом, в прямых экспериментах, при оценке спектральных характеристик АД, химического взаимодействия антибиотика с ГК выявлено не было.

Исследование возможности'нарушения ГК комплекса АД с ДНК было проведено в серии модельных экспериментов, выполненных в растворе ДНК. Результаты этих' опытов представлены в таблице 2. Видно,

1------1 - - — | NN |Концент- т--- ¡Концен- Уменьшение флуоресценции АЛ Уменьшение свя-1

|опы-|радоя трация в растворе ДНК (в * к не*.) зываиия с ДНК |

|тов |ЯНК (и) |Са (и) Без добавле- После добавле- АД после добав-1

1 1 1 ния Са ния Са ления Са 1

1 " 1 1 1 ! В3.7 75,5 13,2 1

1 1 1 10"5 1

1 1 |5 ЧО-3 ВО, 6 81,3 3,3 1

1 1 1 10"г 82,7 67,3 15,4 1

1 2 ¡5 10"° 1

1 1 |5 -10"3 ■80,7 70,г 10,5 1

1 1 1 10"* 83,5 67.4 16,1 1

1 3 15 Ю'й 1

1 1 15 -1СГ3 81.4 70,4 11,0 1

1 1 ! Ю'г • 26,3 17,0 9,3 |

1 4 15 10" 1

1 1 |5 -Ю-3 22,7 11,8 10,в | . , _ .... J

Таблица 2. Влияние глвконата кальция (Са) на связывание адриамицина ' (АД - 5 -10"7 М) с дак.

" - уменьшение флуоресценции адриаыицина в растворе ДНК без добавления Са расчитывалось в I по отношение! к исходной флуоресценции антибиотика в физиологической растворе, принятой за 1002

уменыеиие флуоресценции адриэыицина в растворе ДНК при добавлении С^ расчитывалась в г по отношение к стационарному уровшо флуоресценции АД в растворе ДНК

что при всех использованных концентрациях ДНК, антибиотика и модификатора тушение флуоресценции АД при добавлении ГК уменьшалось от 10 до.15%. Таким образом, в присутствиии ГК часть связанного с ДНК антрацмклина может переходить в свободное состояние.

Анализируя представленные данные, можно заключить, что ГК способен нарушить взаимодействие АД с ДНК. Это может являться причиной описанного нами "возгорания" флуоресценции антрациклина при его инкубации с чувствительными нормальными клетками после добавления ГК. А это, в свою очередь, мажет быть одной из причин антитоксического действия ГК, так как взаимодействие с ДНК объясняет многие биологические эффекты антрациклинов. в том числе и их токсические проявления.

ВЫВОДЫ

1. Глюконат кальция проявляет выраженное защитное действие в отношении острой токсичности адриамицина, существенно уменьшая летальный эффект антибиотика, проявление желудочно-кишечной токсичности и гематотоксичности.

2. Глоконат кальция проявляет выраженное защитное дейетвче в отношении хронической токсичности адриамицина, существенно уменьшая летальный эффект и проявления желудочно-кишечной токсичности.

3. Глоконат кальция не влияет на специфическую активность адриамицина в отношении опухолей, чувствительных и резистентных к действию антибиотика.

4. Применение глюконата кальция позволяет за счет снижения токсичности адриамицина увеличить лечебную дозу антибиотика и как результат - существенно повысить его лечебное действие в отношении чувствительных к антрациюшнам опухолей.-

5. Глюконат кальция уменьшает внутриклеточное накопление адриамицина в нормальных клетках, чувствительных к токсичности антибиотика.

6. Химического взаимодействия глюконата кальция с адриамигр-ном не выявлено.

7. Гдоконат калымя способен нарушать Езаимодействи' А," о

ДНК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Влияние глюконата кальция на токсичность и лечебное действие адриамицина. Доклад на Московском отделении 1 Всесоюзного биохимического общества АН СССР, 1989 (соавт.: Т.А.Богуш, Н.В.Сквабчэнкова).

2. Снижение токсичности и повышение эффективности адриамицина при применении глюконата кальция. Тез.доклада на 1 Конференции- конкурсе НИИ ЭДиТО ОНЦ РАМН "Терапия, диагностика и профилактика опухолей в эксперименте, Москва, 1990, с.76-80, (3-я премия), (соавт.: Т.А.Богуш, А.Локшин).

3. Уменьшение побочных осложнений противоопухолевых препаратов - путь к повышению эффективности лечения злокачественных опухолей. Тез.доклада на 1 Российском Национальном Конгрессе "Человек и лека^тво",' Москва, 1992, N259, (соавт.: A.B.Сыркин, Т.А.Богуш).

4. Снижение побочных осложнений противоопухолевых препаратов. Тез.доклада на I Российском На зональном Конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 1992, N 334, (соавт.: Т.А.Богуш, А.Б.Сыркин) .