Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние гепарина, димефосфона и аплегина на гемостаз при ишемии кишечника

На правах рукописи

РГб од

1 1 ОПТ Ьй

МЕРКУШКИНА

Ирина Владиславовна

Влияние гепарина, димефосфона и аплегина на гемостаз при ишемии кишечника

14.00.25: фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саранск, 1999

Работа выполнена в Мордовском ордена Дружбы народов государственном университете им.Н.П.Огарева

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор А.П.Власов Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Я.В.Костин Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В. Б. Кузин кандидат медицинских наук Л. А. Белова

Ведущая организация:

Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ

Защита состоится « » ¿СьОЛлЯу_1999 года на заседании

диссертационного совета К 063.72. И при Мордовском ордена Дружбы народов государственном университете им. Н. П. Огарева (430000 г.Саранск, ул. Ульянова, 21 «А»).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Мордовского ордена Дружбы народов государственного университета им. Н.П.Огарева (ул. Большевистская, 68)

Автореферат разослан «

в/ » с//6?Л*_ 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат мединских наук, доцент Л. А. Балыкова

/ ^/3, 3 -£1.0

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. До настоящего времени вопросы патогенеза и лечения острых расстройств кровообращения вызывают особый интерес. Ишемические процессы лежат в основе развития множества заболеваний: атеросклероза, ишемической болезни сердца, ишемиче-ского инсульта и др. Такого рода патологические явления встречаются в хирургии при вмешательствах на органах желудочно-кишечного тракта. Поэтому является актуальным вопрос фармакопрофилактики и :кции этих расстройств.

шемия является одним из пусковых механизмов нарушения процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Жданов Г.Г. и др., 1989; Бышевский А.Ш. и др., 1993; Марченко В.В. и др., 1996), приводящих к изменению структуры клеток, нарушению функционирования "калий-натриевого насоса" и проникновению в клетки кальция. Это вызывает повышение коагуляционного потенциала клетки, активацию фосфолипаз и повышение проницаемости клеточных мембран, при повреждении которых обнажаются фосфолипиды, что служит толчком к запуску ферментативных реакций процесса свертывания (Мамот А.П. и др., 1991; Kawai J., Handa М. et al., 1989). В итоге нарушается трофика тканей и может возникнуть гибель клетки. Нарушения в системе гемостаза могут быть скорригированы лекарственными средствами, прямо действующими на различные ее звенья. Этим обоснован выбор гепарина. Поскольку одним из факторов, влияющим на состояние системы гемостаза, является радикальный процесс липопереокисления (Ланкин В. 3., 1997; Соловьев В.Г., 1997; Валоченко И.В. 1998), то можно предположить наличие у лекарственных средств, обладающих антиокси-дантным эффектом, способности влиять на свертываемость крови. Поэтому сохраняется актуальность изучения влияния антиоксидантов на систему гемостаза при ишемии, что и явилось целью настоящего исследования.

Цель работы. Изучение влияния гепарина, димефосфона и аплеги-на на различные звенья системы гемостаза, активность фосфолипазы А2, перекисное окисление липидов кишечника при острой ишемии.

Основные задачи работы

1. Исследовать состояние системы гемостаза, активность фосфолипазы А2, перекисное окисление липидов, антиоксидантный потенциал, транскапиллярный обмен и морфологические изменения кишечника при острой ишемии.

2. Изучить влияние гепарина на гуморальный и тканевый компоненты системы гемостаза, активность фосфолипазы А2, ПОЛ, антиоксидантный потенциал, транскапиллярный обмен, выраженность морфологических изменений в кишечнике при острой ишемии.

3. Исследовать действие димефосфона на гуморальный и тканевый компоненты системы гемостаза, активность фосфолипазы А2, ПОЛ, антиоксидантный потенциал, транскапиллярный обмен, выраженность морфологических изменений в кишечнике при острой ишемии.

4. Изучить влияние аплегина на гуморальный и тканевый компоненты системы гемостаза, активность фосфолипазы А2, ПОЛ, антиоксидантный потенциал, транскапиллярный обмен, выраженность морфологических изменений в кишечнике при острой ишемии.

5. Исследовать механизмы влияния апробированных лекарственных веществ на систему гемостаза в опытах in vitro.

Научная новизна

1. Экспериментальным путем установлено, что при острой ишемии кишечника у животных развивается тромбогеморрагическии синдром с

угнетением фибринолиза, активируется фосфолипаза Аг и перекисное окисление липидов, резко нарушается микроциркуляция, что коррелирует со степенью выраженности патоморфологических изменений в кишечной стенке.

2. Показано, что исследованные лекарственные средства корригируют свободно-радикальные процессы, липолитическую активность, изменяют состояние системы гемостаза, транскапиллярный обмен, тем самым уменьшают выраженность ишемического процесса.

3. Выявлено, что гепарин при острой ишемии кишечника, наряду с антикоагуляционным действием, обладает антиоксидантным эффектом, корригирует фосфолипазную активность и улучшает транскапиллярный обмен.

4. Установлено, что димефосфон и аплегин при острой ишемии кишечника снижают интенсивность радикальных реакции ПОЛ и активность фосфолипазы Аг, оказывают влияние на гуморальный и тканевый компоненты системы гемостаза, уменьшают морфологические изменения в органе. Этот эффект более выражен у аплегина.

5. В опытах in vitro выявлено, что аплегин и особенно димефосфон не обладают выраженным прямым гипокоагуляционным действием. Это позволяет считать, что исследованные лекарственные средства влияют на состояние системы гемостаза через коррекцию ПОЛ.

Практическая ценность работы. Применение лекарственных средств, обладающих антиоксидантным эффектом, корригирует состояние системы гемостаза, уменьшает активность ПОЛ и фосфолипазы А2, восстанавливает транскапиллярный обмен, то есть находит эффективное отражение на важнейших звеньях ишемического процесса, что позволяет рекомендовать их для более широкого использования при такого рода патологии. При этом предпочтение следует отдать ап-легину.

О выраженности патологического процесса при острой ишемии можно судить по характеру изменений в системе гемостаза, активности ПОЛ и фосфолипазы А2.

Внедрения в практику. Разработанные диссертационные положения внедрены в практическую деятельность городской клинической больницы скорой медицинской помощи г.Саранска, включены в программу обучения студентов на кафедрах фармакологии и факультетской хирургии медицинского факультета Мордовского государственного университета им.Н.П.Огарева.

Положения, выносимые на защиту

1. Гепарин, как антикоагулянт прямого типа действия, при острой ишемии кишечника корригирует расстройства в системе гемостаза. В то же время он тормозит ПОЛ, снижает рост фосфолипазной активности, а также улучшает микроциркуляцию в органе.

2. Димефосфон также, как и другие исследованные препараты, при острой ишемии обладает способностью восстанавливать транскапиллярный обмен, снижать интенсивность ПОЛ и липолитическую активность. Однако он в сравнительно меньшей степени влияет на систему гемостаза и обладает незначительной способностью уменьшать выраженность острых морфологических изменений в кишечнике при ишемии.

3. Аплегин обладает достаточно выраженной способностью снижать коагуляционный потенциал и стимулировать фибринолитическую активность кишечника при ишемии. Наряду с этим он угнетает ПОЛ, уменьшает фосфолипазную активность и нормализует транскапиллярный обмен, уменьшает выраженность морфологических изменений в кишечнике при ишемии.

4. В опытах in vitro выявлено, что аплегин и особенно димефосфон не обладают выраженным прямым гипокоагуляционным действием.

Это позволяет считать, что исследованные лекарственные средства влияют на состояние системы гемостаза через коррекцию ПОЛ.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на международной конференции "Гипоксия: деструктивное и конструктивное действие" (Киев, 1998); на Всероссийской научно-практической конференции (Санкт-Петербург, 1998), на конференциях молодых ученых Мордовского государственного университета им. Н.П.Огарева (Саранск, 1998,1999).

Публикации* По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Ооъем н структура диссертации. Работа изложена на стра-

ницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы (1 глава), материалов и методов исследования ( 2 глава), результатов собственных исследований (3,4,5,6 главы), обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 209 отечественных и 123 иностранных источника. Работа содержит 24 рисунка и 23 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В основу работы положены экспериментальные исследования. Всего выполнено 57 острых опытов на взрослых беспородных собаках обоего пола массой от 5,5 до 14,8 кг.

С целью разрешения поставленных задач произведены следующие эксперименты:

В первой (контрольной) группе (12 животных ) изучали состояние гуморального и тканевого компонентов системы гемостаза, ПОЛ, активность фосфолипазы А2, антиоксидантный потенциал, транскапиллярный обмен толстой кишки при острой ишемии.

Во второй группе (15 животных) исследовали влияние гепарина на систему гемостаза, ПОЛ, активность фосфолипазы А,, антиоксидантный потенциал, транскапиллярный обмен толстой кишки при острой ишемии.

В третьей группе (15 животных) изучали влияние димефосфона на систему гемостаза, ПОЛ, активность фосфолипазы А,, антиоксидантный потенциал, транс капиллярный обмен толстой кишки при острой ишемии.

В четвертой группе (15 животных) определяли влияние аплегина на систему гемостаза, ПОЛ, активность фосфолипазы А,, антиоксидантный потенциал, транскапиллярный обмен толстой кишки при острой ишемии.

Животным моделировали ишемию толстой кишки путем перевязки кровеносных сосудов. Для этого под внутривенным тиопентал-натриевым наркозом (0,04 г/кг массы) животным делали срединный разрез вентральной стенки брюшной полости. В рану выводили толстую кишку, перевязывали каудальную брыжеечную и левую ободочную артерии. На уровне 12-14 см от ануса на орган накладывали зажим, что нарушало внутриорганное кровоснабжение. Таким образом дис-тальныи отдел толстой кишки получал питание только через средние и нижние (каудальные) прямокишечные сосуды, что вызывало явления острой ишемии органа. В контрольные сроки - перед перевязкой сосудов, через 10 и 60 минут после их лигирования - осуществлялся забор крови из верхней прямокишечной вены и биопсия серозно-мышечного слоя толстой кишки.

Во второй группе животным за 2 часа до операции выполнялись внутривенные введения раствора гепарина из расчета 100 ед/кг массы тела.

з

В третье» группе животным за 2 часа до операции выполнялись внутривенные введения 15% раствора димефосфона из расчета 100 мг/кг массы тела.

В четвертой группе животным за 2 часа до операции выполнялись внутривенные введения 10% раствора аплегииа из расчета 5мг/кт массы тела.

Модельная группа состояла из 10 животных, у которых осуществлялся забор крови из верхней прямокишечной вены для исследования действия препаратов in vitro. Применялись вышеуказанные дозы препаратов в перерасчете на 1 мл стабилизированной плазмы.

В работе применены следующие методы:

1. Время спонтанного свертывания крови по Lee R.J. и White P.D. (1913).

2. Время рекальцификации обычной плазмы по Beraerhof и Roka (1954).

3. Толерантность плазмы к гепарину по Poller в модификации В.П.Балуды (1954).

4. Каолиновое время свертывания плазмы богатой тромбоцитами по Hattersley P.G.J. (1966).

5. Протромбиновое время плазмы по Quick A.J. (1966).

6. Концентрация фибриногена по Рутберг P.A. (1961).

7. Антитромбин III по Hensen A., Loeliger Е.А. (модификация K.M. Бишевского (1963).

8. Продукты деградации фибриногена и фибрина (ПДФ) в плазме по Nanniea Guest (1967).

9.Естественный лизис кровяного сгустка по Котовщиковой М.А. и Кузнику Б.И.(1962).

10. Фибринолитическая активность эуглобулиновым методом по Kowarzvk H., Buluck L. (1954).

11. Метод получения тканевого экстракта тканей кишки (Скипетров В.П., 1969).

Активность фосфолипазы Аг оценивали в среде, содержащей 10 ммоль трис-НСЬ-буфер (pH 8,0), 150 ммоль тритон Х-100, 10 ммоль СаСЬ и субстрат (1,2 ммоль). В качестве субстрата использовали фос-фатидилхолины яичного желтка. Регистрацию каталитической деятельности фермента проводили по образованию свободных жирных кислот, определяемых потенциометрическим методом.

Содержание малонового диальдегида выявляли в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (Евгина и др., 1982; Егоров, Козлов, 1988). Антиоксидантный потенциал определили по содержанию ТБК-реагирующих продуктов при действии прооксиданта (Fe~+).

Активность каталазы исследовали спектрофотометрическим методом, основанным на способности перекисей образовывать с молибда-том аммония стойкий окрашенный комплекс.

Содержание белка определяли по методу Бредфорд (Гаспаров, Дег-тярь, 1994).

Определение вено-венозного градиента проводили по методу Лен-диса. Изменение гистогематической проницаемости регистрировалось по капиллярной фильтрации и потере белка.

Применена световая микроскопия при окраске препаратов гематоксилин-эозином.

Полученные цифровые данные обрабатывали методом вариационной статистики, с использованием критерия t Стьюдента. Вычисления производили на CRU 199 MHz «Pentium-MMX» с помощью программы МЕДСТАТ (автор В. Л. Акимов, Copyright 93). Использован текстовый процессор Microsoft Word 97. Динамика показателей отражена на графиках, построенных с использованием программы электронных таблиц Microsoft Excel 97.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследованиями в контрольной серии опытов нами установлено, что после лигирования сосудов в толстой кишке развивались характерные клинико-морфологические изменения в виде гиперемии, отека, очагов цианоза, мелкоточечных кровоизлияний. При микроскопическом исследовании отмечены дисциркуляторные явления в виде стаза форменных элементов крови, дилатации сосудов, интерстициального отека, лейкоцитарной инфильтрации, очагов кровоизлияний. Наиболее резким изменениям при ишемии подвергалась слизистая оболочка органа.

Изучение показателей системы гемостаза позволили установить, что гуморальная система свертывания крови изменялась в сторону гиперкоагуляции и угнетения фибринолитической активности. Так, время свертывания крови через 10 минут после лигирования сосудов укорачивалось на 22,3 % (р<0,001), а через 60 минут - на 30,2 % (р<0,001) по сравнению с исходом.

Показатели, характеризующие первую фазу гемокоагуляции - время рекальцификации, каолиновое время - укорачивались по сравнению с исходными данными соответственно на 32,6 % (р<0,001), 20.7 % (р<0,01) при 10-минутной ишемии и на 55,9 %, 42,5 % (р<0,001) при 60-минутнои ишемии.

Исследованиями антикоагулянтной активности плазмы установлено следующее. Толерантность плазмы к гепарину через 10 минут ишемии увеличивалась на 31,2 % (р<0,001), а через 60 минут на 35 % (р<0,001) по сравнению с исходом, а содержание антитромбина III уменьшилось соответственно на 31,6% и 24,5 % (р<0,001), что, вероятно, обусловлено его расходом на инактивацию факторов свертывания крови при геперкоагуляции.

Фибринолитическая активность крови в исследуемой группе животных в целом снижалась: через час после лигирования сосудов спонтанный фибринолиз угнетался на 42,5 % (р<0,01), а эуглобулиновый -на 7,85 % (р<0,05) по сравнению с исходом.

В тканевой системе гемостаза происходили активация гемокоагули-рующих и стимуляция фибринолитических свойств. Так, добавление в реагирующую смесь экстракта серозно-мышечного слоя ишемизиро-ваннои кишки вызывало ускорение времени рекальцификации, каолинового и протромбинового времени соответственно на 80, 9 % (р<0,001), 49,2 % (р<0,001) и 28,6 % (р<0,01) на начальном этапе, на 86 % (р<0,001), 66,8 % (р<0,60П и 33,2 % (р<0,01) через 10 минут после лигирования сосудов и на 85 % (р<0,001), 52,7 % (р<0,001) и 31,2 % (р<0,05) через 60 минут после наложения лигатур.

Толерантность плазмы к гепарину при добавлении тканевого экстракта возрастала на 65 2 % ip<0,00n на исходе, на 64,2 % (р<0,001) при 10-минутной, и на 60, 6 % (р<0,001) при 60-минутной ишемии, а время лизиса эуглобулиновых сгустков укорачивались соответственно на 49 % (р<0,001), 29, 3 % (р<0,01) и 31,3 % (р<0,01).

При анализе результатов реакций на продукты паракоагуляции не исключалось наличие у животных пред- и тромботического состояния крови при острой ишемии кишечника. Этаноловый и нафтоловый тесты в этот период времени были положительными. При десятиминутной ишемии степень нафтолового теста повышалась на 125 % с 0,67±0,23 до 1,5±0,24 ЕД (р<0,05), а при 60-минутной ишемии уже на 175 % (р<0,01) по сравнению с исходом. Количественное определение ПДФ показало достоверное увеличение их на 49,0 % (р<0,01)с 6,0±0,78 до 8,98±0,22 мкг/л при десятиминутной ишемии и на 87,3 % (р<0,01) при

60-минутной ишемии. Динамика этих показателей под влиянием экстракта кишки не отличалась от таковых без него.

Таким образом, полученные результаты исследований этой серии опытов позволяют утверждать, что при острой ишемии толстой кишки, у животных без лечения гуморальная система свертывания крови изменялась в сторону гиперкоагуляции и угнетения фибринолитической активности. Происходила также активация гемокоагулируюших и торможение фибринолнтических свойств тканевой системы гемостаза. Следовательно, при ишемии у животных возникает тромбогеморрагиче-ский синдром. Изменения регистрируемых параметров гемостаза позволяют утверждать о развитии I стадии ТГС-синдрома - гиперкоагуляции.

Таким образом, при моделировании острой ишемии кишечника у животных развивается тромбогеморрагический синдром с угнетением фибринолиза, что может быть одним из ведущих зевеньев в нарушении микроциркуляции при данной патологии.

В работе нами изучена активность фосфолипазы Ai. В плазме крови в норме она составила 0,04±0,01 мкмоль/г.с белка.

Через 10 минут после развития ишемии наблюдалось увеличение ее активности почти в 14 раз (р<0,001). Такое значительное повышение активности фермента в плазме крови свидетельствует о включении биохимического ответа организма при исследованной патологии.

При 60-минутной ишемии данная тенденция сохранялась и активность энзима превышала исходный ее уровень более чем в 19 раз (р<0,001).

Таким образом, при острой ишемии кишечника активность данного липолитического фермента может служить одной из констант, позволяющих судить о степени выраженности патологического процесса.

В работе нами изучено ПОЛ. Как известно, перекисное окисление липидов, являясь одним из важных биохимических процессов в организме человека (Барабой В.А. и др., 1992; Бобырев В.Н. и др., 1994; Barclay L.R.C. et al., 1990; Korytowski W. et al., 1992), позволяет выявить возможный переход обратимых изменений в необратимые или адаптационных - в патологические (Меерсон Ф.З., 1984; Александровский Ю.А. ссоавт., 1991).

При изучении содержания ТБК-реагирующих продуктов в плазме крови при острой ишемии нами установлено, что их уровень через 60 минут после лигирования сосудов возрастал на 34,6 % (р<0,05) по сравнению с исходным значением.

Интересным представляется факт понижения антиоксидантного потенциала ткани П£и ишемии, что показано в опытах с ирооксидантом. Концентрация Fe"' - индуцированного МДА возрастала к 60-й минуте ишемии на 18,3 %(р<0,05).

В плазме крови при острой ишемии нами изучена активность ката-лазы. При 10-минутной ишемии ее активность возросла на 40 % (р<0,05) и оставалась на этом уровне в течение всего периода наблюдения.

Нами исследован тоанскапиллярный обмен толстой кишки при острой ишемии (рис. 1, 2). Опыты показали, что через 10 минут после лигирования сосудов проницаемость микроциркуляторного русла резко возрастала. Капиллярного фильтрата образовывалось больше исходного уровня в 4,5 pasa (р<0,01), потеря белка возрастала более чем в 10 раз (р<0,01). Через час вено-венозный градиент изменялся еще больше: уровень капиллярного фильтрата был почти в шесть раз (р<0,01) выше исходного значения, потеря белка превышала исходную величину в 12 раз(р<0,01).

Таким образом исследования этой серии опытов показали, что при моделировании острой ишемии толстой кишки в органе развивались

выраженные морфофункциональные нарушения, причем изменения го-меостаза коррелировали со степенью выраженности патоморфологиче-ских изменений в кишечной стенке.

Следовательно, выбранная модель вполне адекватна для исследования действия лекарственных веществ на основные звенья патогенеза ишемических поражений органа.

Рис.1. Образование капиллярного фильтрата (мл) толстой кишки при ишемии под влиянием исследованных лекарственных средств

1 9 7 5 3 1 1

Исход

10 минут

60 минут

- контроль -гепарин -димефосфон -аплегин

Рис.2. Потеря белка (%) толстой кишки при ишемии под влиянием исследованных лекарственных средств

Во второй группе опытов нами изучено действие гепарина на мор-фофункциональное состояние толстой кишки.

Исследования показали, что под действием данного препарата морфологические изменения в органе были менее выражены. Это определялось как макро-, так и микроскопически.

Гепарин, являясь прямым антикоагулянтом, удлинял время свертывания крови уже в исходный период до 394,4±8,81 с, что на 33,8 % (р<0,05) больше контрольных данных. К 60-й минуте ишемии этот показатель увеличился на 47,4 % (р<0,001) по отношению к аналогичному

значению в серии опытов, где данный фармакологический препарат не применялся, причем значение времени свертывания при 60-минутной ишемии под действием гепарина практически соответствовало исходному времени свертывания в контрольной группе, а значит приближалось к норме (табл. 1).

Время рекальцификации обычной плазмы и каолиновое время также удлинялись в течение всего периода наблюдения (рис.3).

■ Время рекальцификации (контроль)

■ Время рекальцификации (опыт)

О Время рекальцификации с экстрактом (контроль)

□ Время рекальцификации с экстрактом (опыт)

Исход

60 минут

Рис.3. Время рекальцификации плазмы крови при острой ишемии кишечника под действием гепарина

Активность факторов протромбинового комплекса снижалась. Так, начальное значение протромбинового времени составило 25,8±1,19 с, что на 33,5 % (р<0,05) больше контрольного показателя. В последующие сроки эта динамика сохранялась: через 60 минут протромбиновое время было уже на 100,5 % (р<0,05) больше контрольного.

Антикоагулянтная активность плазмы при острой ишемии под влиянием гепарина возрастала, о чем свидетельствовало повышение содержание антитромбина III на 13,6 % (р<0,05) на исходе и на 32,8 % (р<0,05) через 60 минут после лигирования сосудов (табл. 1). Отмечено уменьшение толерантности плазмы к гепарину.

Количество фибриногена увеличилось на 17,6 % (р<0,05), а количество продуктов его деградации в течение всего периода наблюдения по сравнению к контрольной группе исследований изменялось мало.

Добавление в реагирующую смесь экстракта ишемизированной кишки вызывало достоверное укорочение времени рекальцификации, каолинового и протромбинового времени соответственно на 83,3 % 62,7 %, 56,6 % (р<0,001) на начальном этапе и на 70,4 %, 63 % и 57,8 % (р<0,01) через час после лигирования сосудов. Под влиянием тканевого экстракта тест толерантности плазмы к гепарину активизировался на 41,3 % (р<0,001) на начальном этапе и на 35,3 % (р<0,001) к 60-й минуте наблюдения по отношению к группе опытов без него. Эуглобулино-вый фибринолиз ускорялся соответственно на 57,7 и 45,3 % (р<0,00 Динамика изменений показателей внутри серии опытов с добавле-

нием экстракта серозно-мышечного слоя ишемизированнои кишки соответствовала динамике показателей без него.

Таким образом, при острой ишемии кишечника, под действием гепарина нарушения как гуморального, так и тканевого компонентов системы гемостаза по сравнению с контролем были менее выраженными.

Установлено, что гепарин повышает активность фосфолипазы А2 в плазме крови в 5,5 раз (р<0,05). Через час после моделирования острой ишемии происходило увеличение фосфолипазной активности в 3,5 раза (р<0,01) по сравнению с исходом, в то время как в контрольной серии опытов этот показатель возрастал более чем в 19 раз(р<0,001).

При определении эффективности влияния гепарина на радикальные реакции процесса перекисного окисления липидов, установлено, что в данной серии опытов содержание МДА снизилось на 63,3 % (р<0,001) на начальном эуапе и на 57,9 % (р<0,00П при 60-минутной ишемии, а содержание Ге"+- индуцированного МДА, соответственно на 31,9 % (р<0,05) и 32,1 % (р<0,01) (рис.4).

■ - МДА (контроль)

■ - Ре'4- индуцированный

МДА (контроль)

■ - МДА (гепарин)

В - Рег<- индуцированный МДА (гепарин)

Рис.4. Содержание ТБК-реагирующих продуктов (нмоль/г белка) в плазме крови при острой ишемии кишечника под влиянием гепарина

При исследовании транскапиллярного обмена при ишемии под влиянием гепарина нами установлено следующее. Исходные значения капиллярного фильтрата и потери белка не отличались от контрольных. Через 10 минут после лигирования сосудов капиллярного фильтрата образовывалось почти в 2 раза (р<0,01) меньше по сравнению с контрольной серией исследований, несколько уменьшилась потеря белка.

При 60-минутной ишемии показатель капиллярного фильтрата был в 4,2 раза (р<0,01) ниже контрольного значения, потеря белка была почти в 2 раза (р<0,01) меньше по сравнению с группой опытов, где данное лекарственное средство не применялось (рис.1, 2).

Следовательно, результаты этих опытов показали, что гепарин, являясь прямым антикоагулянтом, проявлял и антиоксидантные свойства, уменьшая количество ТБК-реагирующих продуктов. Таким образом, гепарин уменьшает выраженность патоморфологических изменений кишечника через систему гемокоагуляции, изменения интенсивности ПОЛ и улучшения микроциркуляции, тем самым создавая благоприятные условия для быстрого стихания патологического процесса.

В следующей серии опытов нами исследовано влияние днмефос-фона на морфофункциональное состояние толстой кишки при острой ишемии. Исследования показали, что при применении этого лекарственного средства изменения в органе во многом соответствовали таковым изменениям контрольной группы, хотя были менее выражены.

Время свертывания крови под влиянием димефосфона на начальном этапе и при 10-минутной ишемии было сопоставимо с аналогичными показателями в серии опытов без применения препарата. К 60-минутам ишемии этот параметр превысил контрольное значение на 21.8 %(р<0,01) (табл. 1).

На другие исследованные показатели коагуляционного гемостаза димефосфон не оказывал существенного влияния.

Антикоагуляционная активность изменялась более значимо. Толерантность плазмы к гепарину к 60-й минуте ишемии по сравнению с контрольной группой уменьшалась на 16,6 % (р<0,05).

Начальная концентрация антитромбина 111 в плазме крови была в пределах нормы. При 10-минутной ишемии она увеличилась по сравнению с контрольным значением на 32,8 %(р<0,05).

Показатели фибринолитической активности крови имели ту же динамику, что и в серии опытов без применения димефосфона (таол.1).

Добавление экстракта в реагирующую смесь влияло на динамику показателей коагуляционной, антикоагулянтной и фибринолитическои активности так же, как и в контрольной серии экспериментов.

Таким образом, данное лекарственное средство при острой ишемии кишечника не оказывало значительного влияния на систему гемостаза.

Установлено, что введение животным димефосфона на начальном этапе по сравнению с контролем вызывало повышение активности фосфолипазы А> в 9 раз (р<0,001). При 10-минутной ишемии активность энзима увеличивалась по отношению к исходу недостоверно, а при 60-минутной ишемии повышалась в 2,7 раза (р<0,01), в то время как в контрольной серии опытов происходило ее повышение, по сравнению с исходом, более чем в 19 раз (р<0,001).

При изучении влияния димефосфона на ПОЛ при острой ишемии выяснилось, что это лекарственное средство обладало способностью снижать активность перекисного окисления липидов: концентрация МДА была ниже, по отношению к серии исследований без применения димефосфона на 64,7 % (р<0,001) на начальном этапе и на 45 °/о (р<0,01) к концу времени наблюдения, но количество Fe -индуцированного МДА, было сопоставимо с контрольной группой.

Активность каталазы под влиянием димефосфона изменялась незначительно.

Капиллярного фильтрата под действием димефосфона образовывалось в 2,5 раза (р<0,01) меньше, чем в контрольном ряду экспериментов, несколько уменьшилась потеря белка (рис.1, 2).

Учитывая вышеизложенное, становятся очевидными пути влияния димефосфона на морфофункционалыюе состояние кишечника, а именно: его воздействие реализуется через влияние на ПОЛ.

В четвертой серии опытов нами исследовано влияние аплегина на морфофункциональное состояние толстой кишки при острой ишемии.

Выяснилось, что это лекарственное средство оказывало наиболее благоприятное фармакокорригирующее действие как на систему гемостаза, так и на процессы ПОЛ.

По сравнению с другими исследованными препаратами под действием аплегина морфологические изменения в толстой кишке были выражены в сравнительно меньшей степени.

Время свертывания крови под влиянием аплегина за время всего периода наблюдения по отношению к исходу изменялось незначительно, но было удлинено по отношению к контрольным данным на 11,4 % (р<0,05) на начальном этапе, на 43,7 % (р<0,01) при 10-минутной ишемии и на 58,6 % (р<0,001) при 60-минутной ишемии.

Динамика показателей первой фазы свертывания крови была сопоставима с динамикой указанного выше параметра гемостаза (рис. 5).

Добавление экстракта серозно-мышечного слоя ишемизированной кишки в реагирующую смесь вызывало укорочение времени рекальци-фикации и каолинового времени по сравнению с рядом опытов без тканевого фактора соответственно на 76,2 %, 71,6 % (р<0,001), на исходе и на 72,5 %, 70 % (р<0,001) при 60-минутной ишемии. Активность факторов протромбинового комплекса при добавлении экстракта изменялась несущественно. Внутри серии с применением экстракта кишки значительных изменений также не происходило.

Антикоагулянтная активность плазмы при острой ишемии кишечника с применением аплегина возрастала на протяжении всего эксперимента, достигая своего максимума к концу наблюдения. Так, через 60 минут после лигирования сосудов толерантность плазмы к гепарину была на 134,3 % (р<0,001) меньше контрольной, а концентрация антитромбина 111 возрастала на 129,5 % (р<б,001) по отношению к аналогичному значению серии экспериментов без использования данного

180 Са 160 140 120 100 80 60 40 ■ 20 -О

Рис.5. Время рекальцификации плазмы крови при острой ишемии кишечника

пол влиянием аплегина

Экстракт ишемизированной кишки активизировал тест толерантности плазмы к гепарину на 90,8 % (р<0,001) на исходе и на 86 % (р<0,001) после наложения лигатур.

Общая фибринолитическая активность крови под действием аплегина к 60 минутам наблюдения увеличивалась более чем в 3,7 раза (р<0,001).

Тканевой экстракт со^ащал время лизиса эуглобулиновых сгустков по сравнению с сериеи опытов без него на 17,4 % (р<0,01) на начальном этапе, на 38 % (р<0,001) при 10-минутной и на 13,7 % (р<0,001) при оО-минутной ишемии.

Исследованиями установлено, что этаноловый тест на протяжении всего времени наблюдения оставался слабоположительным, показатели нафтолового теста изменялись недостоверно, а количество продуктов деградации фибриногена оставалось на уровне 6,9 мг% на исходе и 8,5 мг% при 60-минутной ишемии, тем самым исключая наличие у животных пред- и тромботического состояния крови.

п

)армакологического препарата. ■к

р В? I

Исход

10 минут

60 минут

■ Время рекальцификации (контроль)

■ Время рекальцификации (опыт)

О Время рекальцификации с экстрактом (контроль)

□ Время рекальцификации с экстрактом (опыт)

Таблица 1.

Некоторые показатели системы гемостаза при острой ишемии под влиянием исследованных лекарственных веществ (М±ш)

Изучаемые показатели Исход 10-минутная ишемия 60-минутная ишемия

гепарин

время свертывания крови,с I 294,6718,54 I 228,8619,6* I 205,6715,39*

11 394,4±8,81 11 303,816,14* 11 303,212,16*

р<0,05 р<0,01 р<0,001

Антитромбин III, % 1 67,8±1,98 I 46,411,99* I | 51,2+1,56*

II 77,0±1,7 II 64,211,68* II 68,0+1,7*

р<0,05 р<0,05 р<0,05

Спонтанный фибринолиз, % 1 23,41 + 1,09 I 17,9411,13* I 13,45+0,92*

II 18,92±0,7 II 15,08+1,48* II 12,91 + 1,04*

р<0,05 р >0,05 р<0,05

диме< )ОС( эон

время свертывания крови,с I 294,67±8,54 I 228,8619,6* I 205,67+5,39*

II 293,33±8,56 II 242,0+7,21* II 250,5+6,44

р>0,05 р>0,05 р<0,05

Антитромбин III, % 1 67,811,98 I 46,411,99* I 51,2+1,56*

И 68,0±1,65 II 61,6111,28* 11 58,1111,56*

р>0,05 р<0,05 р<0,05

Спонтанный фибринолиз, % I 23,41±1,09 I 17,94+1,13* I 13,4510,92*

И 22,5610,88 II 18,24+1,04* 11 10,811,6*

р>0,05 р >0,05 р>0,05

аплегин

время свертывания крови, с I 294,6718,54 I 228,86+9,6* I 205,67+5,39*

II 328,414,54 II 329,016,64 11 326,2110,36

р<0,05 р<0,01 р<0,001

Антитромбин III, % I 67,811,98 I 46,411,99* I 51,2+1,56*

II 80,58+1,22 II 76,74+1,31 II 117,48+0,71*

р<0,01 р<0,001 р<0,001

Спонтанный фибринолиз, % 1 23,41 + 1,09 I 17,9411,13* I 13,45+0,92*

11 20,7+0,55 11 23,610,79* 11 50,2511,21*

р<0,05 р <0,01 р<0,001

I- контрольная группа; 11- опытная группа;

*- достоверность по отношению исходных данных;

р - достоверность по отношению данных контрольной группы

Исследования показали, что под влиянием аплегина в плазме крови более чем в 5 раз (р<0,01) возрастает уровень фосфолипазы А2, но с течением времени наблюдается уменьшение активности энзима по отношению к контрольным данным.

Нами установлено, что под влиянием аплегина при острой ишемии толстой кишки интенсивность ПОЛ снижалась. При определении количественных показателей эффективности влияния аплегина на радикальные реакции процесса перекисного окисления липидов оказалось, что по сравнению с контрольными данными это лекарственное средство обладало достаточно выраженным эффектом. Так, концентрация малонового диальдегида понижалась по сравнению с контролем на 33 -48% (р<0,05). 2*

Содержание Ре - индуцированного МДА было ниже контрольного уровня на 19-26,5 % (р<0,05) (рис. 6).

И - МДА (контроль) П - Fe!*- индуцированный

МДА (контроль) □ - МДА (аплегин) 13 - Fe'*- индуцированный МДА (аплегин)

Рис.6. Содержание ТБК-реагируюших прод\ктов (нмоль/г белка) в плазме крови при острой ишемии кишечника под влиянием аплегина

Выявлено, что данное лекарственное средство благотворно влияет на транскапиллярный обмен. При его применении более чем в 5 раз (р<0,01) уменьшается проницаемость сосудистой стенки, а потеря белка-в 4,5 раза (р<0,01) (рис.1, 2).

Для выявления и подтверждения вновь обнаруженных свойств исследуемых препаратов, нами проведены модельные опыты в условиях in vitro. С этой целью в плазму крови интактных животных добавляли исследуемые лекарственные средства в вышеуказанных дозах в перерасчете на 1 мл.

Оказалось, что димефосфон и аплегин не влияли на время свертывания крови по Ли-Уайту, а гепарин удлинял этот показатель в 3 раза (р<0,001). Каолиновое время под влиянием гепарина и аплегина оставалось сопоставимым с контрольным, а димефосфон укорачивал его на 18,7% (р<0,05) (табл.2).

Протромбиновое время под влиянием гепарина удлинялось на 40 % (р<0,01). Димефосфон и аплегин не оказывали существенного влияния на данный показатель.

Время рекальцификации под действием гепарина удлинялось более чем в 4 раза (р<0,01) по сравнению с контрольным, тогда как в случае применения аплегина оно увеличилось в 2,5 раза (р<0,01).

На эуглобулиновый фибринолиз ни один из вышеуказанных препаратов влияния не оказывал (табл.2).

Анализируя результаты, полученные в опытах in vitro и сопоставляя их с экспериментальными исследованиями в опытах с острой ишемией, можно сделать следующее заключение. Гепапин, являясь антикоагулянтом прямого типа действия, при данных фармакологических дозах непосредственно оказывал влияние на систему гемостаза, увеличивая время свертывания, время рекальцификации, показатель толе-рангости плазмы к гепарину, тем самым улучшая реологические свойства крови и препятствуя развитию тромбоооразования.

Димефосфон не оказывал благотворного влияния на систему гемостаза в опытах in vitro, а в исследовании с каолином даже достоверно укорачивал время образования сгустка, тогда как данные, полученные в эксперименте с острой ишемией,"показали, что при применении данного препарата происходила стимуляция антикоагулянтной активности плазмы крови. Это дает основание утверждать, что влияние димефос-фона на систему гемостаза при острой ишемии было опосредованным -через коррекцию свободно-радикальных реакций.

Аплегин, увеличивая время рекальцификации в опытах in vitro, проявлял тем самым некоторый антикоагулянтный эффект. В опытах с острой ишемией это действие препарата было более выражено.

Таблица 2.

Влияние исследованных лекарственных средств на гемостаз в опытах in vitro (М±ш)

Без препарата димефос" фон Гепарин Аплегин

Время свертывания крови, сек. 222,5±1,67 221,2+4,9 р>0,05 715,0+28,9 р<0,001 218,7+3,6 р>0,05

Эуглобулиновый лизис, мин. 460+24,0 453,0+21,6 р>0,05 495±5,7 р>0,05 483,3+4,1 р>0,05

Каолиновое время, сек. 53,3+2,0 43,3+2.1 р<0,05 59.3±2,8 р>0,05 51,6±2,1 р>0,05

Протромбпно-вое время, сек. 37,3 + 1,8 38.3+2.0 р>0,05 52,3±1,8 р<0,01 38,7+3,9 р>0,05

Время рекальцификации. сек. 56,7+5.4 53.3+7.4 р>0.05 233.3+24,8 р<0,()1 133,3±14,7 р<0,01

Толерантность плазмы к гепарину«сск 298,318,9 305.0+3.5 р>0.05 560,0±32,4 р<0.01 303,3± 14,7 р>0,05

р - достоверность по отношению контрольных данных

Таким образом, представленный фактический материал достаточно ясно доказывает, что применение данных лекарственных средств, обладающих разнонаправленным фармакологическим действием: гепарина, димефосфона и аплегина, позволило скорригнровать ряд патологических реакций, обусловленных интенсификациеи процессов ПОЛ, активизацией фосфол'нпазы А; и нарушением различных звеньев системы гемостаза.

Общим в механизме действия исследованных препаратов при острой ишемии является то, что все они в различной степени и по различным механизмам, прямо или опосредованно, влияли на систему гемостаза, стабилизируя ее, ингибировали процессы ИОЛ, поддерживали общий антиоксидантный потенциал плазмы крови, что вытекает из динамики индуцированной МДА, к тому же все апробируемые препараты в той или иной мере улучшали микроциркуляцию, уменьшая проницаемость стенок сосудов и предотвращая потер'ю белка (рис. 1, 2). Изменения, происходящие под влиянием данных препаратов, были сопоставимы с патоморфологическим состоянием ишемированной кишки.

Таким образом, исследованные лекарственные препараты, несмотря на некоторые специфические особенности их действия, позволяют скорригнровать ряд процессов: улучшить реологические свойства крови, ингиоировать процессы перекйсного окисления липидов, повысить антиоксидантную активность, улучшить транскапиллярный обмен, тем самым предохранить ткани от повреждающего действия ишемии.

Следовательно, лекарственные средства, обладающие антиокси-дантным эффектом, способны в большей или меньшей степени уменьшать выраженность морфологических изменений в органе, что имеет, несомненно, большое практическое значение, а установленный нами факт, что управлением интенсивности ПОЛ при ишемии можно регулировать агрегатное состояние крови, имеет весьма важное и теоретическое значение.

ВЫВОДЫ

1. При острой ишемии кишечника развиваются нарушения в системе гемостаза в виде гиперкоагуляции и угнетения фибр'инолиза, происходит активация процессов ПОЛ и резкое возрастание активности фосфолипазы А2, снижается антиоксидантный потенциал, нарушается транскапиллярный обмен, что обуславливает морфологические изменения в ишемизированном органе.

2. Гепарин, как антикоагулянт прямого типа действия, при острой ишемии кишечника корригирует расстройства в системе гемостаза. В то же время он тормозит ПОЛ, снижает рост фосфолипазной активности, а также улучшает микроциркуляцию в органе.

3. Аплегин и димефосфон при острой ишемии кишечника снижают интенсивность радикальных реакций ПОЛ и активность фосфолипазы А2, оказывают влияние на гуморальный и тканевый компоненты системы гемостаза, уменьшают морфологические изменения в органе. Этот эффект более выражен у аплегина.

4. В модельных опытах m vitro установлено, что аплегин удлиняет время рекалышфикации более чем в два раза, а димефосфон укорачивает каолиновое время на 18 %. Следовательно, исследованные лекарственные средства обладают незначительным прямым воздействием на систему гемостаза.

5. Полученные данные позволяют утверждать, что при выборе лекарственных средств с целью коррекции коагуляционных нарушений при ишемии, следует руководствоваться тем, что важная роль в управ-

лении системой гемостаза, наряду с прямым на нее воздействием, отводится и опосредованному пути через управление радикальными реакциями процесса ПОЛ и липолитическои активностью.

Практические рекомендации

1. С целью коррекции ишемических нарушений в комплексную терапию следует включать лекарственные средства, обладающие антиок-сидантным эффектом. При этом предпочтение следует отдать аплегину.

• 2. О выраженности патологического процесса при острой ишемии можно судить по характеру изменений в системе гемостаза, активности ПОЛ и фосфолипазы А3.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Влияние гипоксии на состояние тканевого гомеостаза в различном возрасте// Материалы международной конференции "Гипоксия: деструктивное и конструктивное действие. Киев, 1998. С. 130-131. (Соавт. С.А.Маркосьян, Н.А.Лелюхина.)

2. Витамин Е и верапамил в коррекции тромбоцитарной активности и гемостаза при патологии //Научные труды III конференции молодых ученых Мордовского государственного университета им.Н.П.Огарева. Саранск,1998. 4.2. С.210-210. (Соавт.

B.А.Трофимов, О.В.Ельчева, Л.В.Брячак, С.В.Аксенова, В.В.Рункова.)

3. Изменения в кишечнике при ишемии и действии антиокси-дантов//Научные труды III конференции молодых ученых Мордовского государственного университета им.Н.П.Огарева. Саранск, 1998. 4.2. С.190-190. (Соавт. Л.В.Брячак, Г.Г.Гарькин, И.С.Опарин.)

4. Компенсаторные механизмы кишечника при ишемии// Hypoxia medical Jornal^W 2. С.50-50. (Соавт. С.А.Маркосьян, А.П.Власов,

C.В.Аксенова).

5. Фармакокоррекция липидного обмена кишки при патологии/Ал. ^ Материалы Всероссийской научно-практической конференции. СПб/-

С.80-80. (Соавт. Я.В.Костин, А.П.Власов, Р.З.Аширов, Л.В.Брячак, С.В.Аксенова, О.Ю.Рубцов.)

6. Фармакокоррекция ишемических расстройств морфофункцио-нального состояния кишечника//Сборник научных трудов ученых Мордовского государственного университета им.Н.П.Огарева. Саранск, 1998. Ч.З. С. 68-70. (Соавт. С.В.Аксенова, А.А.Тюрин, Л.А.Головко, И.Ю.Давыдов.)

7. Фармакокоррекция локальных ишемических расстройств гомеостаза// Материалы ÍY научной конференции молодых ученых Мордовского государственного университета им. Н.П.Огарева. Саранск, 1999. 103-104. (С оавт. С.В.Аксенова, О.Ю.Рубцов, И.Г.Румянцев, Е.А.Харитонов.)

Подписано в печать 26.05.99 г. Объем 1,0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ N '21. Типография Издательства Мордовского университета 430000, Саранск, ул.Советская, 24