Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Влияние АТФ, аденозина и гидрокортизона на сократительные ответы скелетных мышц



КАМАЛИЕВ РАФИС РУСТЭМОВИЧ

ВЛИЯНИЕ АТФ, АДЕНОЗИНА И ГИДРОКОРТИЗОНА НА СОКРАТИТЕЛЬНЫЕ ОТВЕТЫ СКЕЛЕТНЫХ МЬППЦ

14.03.06. — фармакология, клиническая фармакология 03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 0 ЯН3 2011

Москва-2010

004619209

Работа выполнена в ГОУ ВПО "Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию"

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Зиганшин Айрат Усманович

Кандидат биологических наук, доцент Гришин Сергей Николаевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Доктор биологических наук, профессор

Ковалев Георгий Иванович Гайнутдинов Халил Латыпович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет имени Н.И.Пирогова Росздрава

Защита диссертации состоится «*2 У» сДК^рЛ- 2011 г. в Ш'ОО Ч. на заседании диссертационного совета Д.001.024.01 при НИИ фармакологии имени ВБ.Закусова РАМН по адресу: 125315 Москва, Балтийская ул. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части НИИ фармакологии имени ВБ.Закусова РАМН по адресу: 125315 Москва, Балтийская ул. 8.

Автореферат разослан " ±1Г_" деМ(ХдР<Х 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Е.А. Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Внеклеточные нуклеогиды, в том числе и АТФ, оказывают разнообразные эффекты, влияя на мембранные рецепторы, названные Р2-рецепторами (Alexander et al., 2008). При этом, сложная каскадная система экзоферментов быстро метаболизирует внеклеточные нуклеотиды, в результате чего либо прекращается их действие, либо образуется метаболит с иной селективностью к Р2-рецепторам (Zimmermann, 2000). Кроме того, если АТФ и АДФ являются агонистами Р2-рецепторов, то конечный продукт их дефосфорилирования -аденозин обладает влиянием на иной, собственный класс рецепторов, названных аденозиновыми (PI) рецепторами (Fredholm et al., 2001). Так как аденозиновые и Р2-рецепторы часто являются функциональными антагонистами, разложение АТФ не только лимитирует ее действие, но и приводит к появлению новых агонистов с различными, часто с противоположными, свойствами.

Большое разнообразие и широкая распространенность Р2-рецепторов в организме человека и животных делает эти рецепторы очень привлекательными в качестве потенциальных мишеней действия новых лекарственных препаратов (Зиганшин, Зиганшина, 2009). Практическим достижением фармакологии в области Р2-рецепторов в последние годы стало внедрение в широкую клиническую практику новой группы антиагрегантов, механизм действия которых связан с блокадой тромбоцитарных P2Yi2-peueiiTopoB (Зиганшин, 2010). В самое ближайшее время ожидается появление на рынке нового лекарственного препарата для лечения муковисцидоза, являющегося селективным агонистом Р2У2-рецепторов (Keilerman, 2008). Реальны перспективы появления антигипертензивных, противоопухолевых, противовоспалительных, противодиабетических, обезболивающих препаратов, механизм действия которых связан либо со стимуляцией, либо с блокадой определенных подтипов Р2-рецепторов (Burnstock, 2006). Однако исследований по оценке функциональной активности Р2-рецепторов в скелетной мускулатуре, и соответственно, о возможностях фармакологической регуляции сократительной способности скелетных мышц посредством Р2-рецепторов, чрезвычайно мало.

Известно, что АТФ выделяется из нервных окончаний при сокращении мышц лягушки (Cunha and Sebastiao, 1993) и диафрагмы крысы (Vizi et al., 2000). В электрофизиологических экспериментах установлено, что агонисты Р2-рецепторов стимулируют выброс медиатора в нервно-мышечных окончаниях крысы (Salgado et al., 2000), тогда как в нервно-мышечных окончаниях лягушки они угнетают этот процесс (Sokolova et al., 2003). При этом, действие пуринов собственно на сократительный ответ скелетных мышц ранее не оценивался.

В настоящее время стало признано, что стероидные гормоны оказывают свои эффекты, не только в результате взаимодействия с цитоплазматическими рецепторами и запуска геномного механизма синтеза белков, но и посредством некоторых так называемых негеномных механизмов (Song and Buttgereit, 2006). Негеномные эффекты стероидов проявляются быстрее и могут быть следствием взаимодействия с липидами, белками и рецепторами, находящимися на мембране клетки (Watson et al., 1999). Электрофизиологическими методами было показано, что гидрокортизон угнетает влияние АТФ на выброс медиатора (Гиниатуллин А.Р. и др., 2000). Однако, как это действие гидрокортизона отражается на сократимости мышцы изучено не было.

В исследованиях, проведенных ранее в нашей лаборатории, было установлено, что гипотермия существенно повышает эффективность Р2-рецептор-опосредованных ответов в гладких мышцах и мышцах миокарда (Ziganshin et al., 2004; Рычков, 2007). В отношении скелетных мышц до начала нашего исследования подобных сведений не было известно.

Целью настоящего исследования было изучить взаимоотношение стероидного гормона - гидрокортизона и агонистов аденозиновых и Р2-рецепторов - аденозина и АТФ по влиянию на сократительные ответы скелетных мышц.

Задачи исследования

1. Оценить влияние АТФ, аденозина и гидрокортизона, а также совместного их применения, на сократительную активность и токи концевой пластинки изолированной портняжной мышцы лягушек.

2. Сравнить влияние однократного и 14-дневного введения гидрокортизона лягушкам на эффекты АТФ и аденозина на сократительную активность и токи концевой пластинки изолированной портняжной мышцы.

3. Изучить влияние АТФ и аденозина на сократительную активность и токи концевой пластиноки изолированной портняжной мышцы лягушек, подвергнутых прямой электрической стимуляции.

4. Установить влияние АТФ и аденозина на сократительную активность и токи концевой пластинки изолированной портняжной мышцы лягушки при различных температурных режимах.

5. Оценить влияние АТФ, аденозина и гидрокортизона, а также их совместного применения, на сократительную активность изолированной камбаловидной мышцы крысы.

Научная новизна работы. Впервые установлено, что гидрокортизон, АТФ и аденозин оказывают угнетающее действие на сокращения изолированной портняжной мышцы лягушки. Показано, что совместное применение гидрокортизона и АТФ приводит к исчезновению их угнетающего действия, тогда как совместное применение гидрокортизона и аденозина не изменяет их эффекты. При однократном подкожном введении гидрокортизона выражено его ингибиторное влияние на сократимость скелетных мышц, при длительном применении этот эффект гидрокортизона становится несущественным. Обнаружено, что двухнедельный курс подкожного введения гидрокортизона лягушкам не отменяет угнетающий эффект АТФ на сокращения скелетных мышц. Угнетающее действие АТФ на сокращение и амплитуду токов концевой пластинки портняжной мышцы исчезает у лягушек, подвергнутых прямой электрической стимуляции и однократному подкожному введению гидрокортизона, при этом ингибиторный эффект аденозина у этих животных существенно не изменяется. Показано, что снижение температуры среды увеличивает, а повышение - уменьшает угнетающее действие АТФ, но не аденозина на сократительные ответы и токи концевой пластинки скелетной мышцы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенные комплексные исследования in vitro и in vivo свидетельствуют о неоднозначном взаимодействии стероидного гормона гидрокортизона с агонистами аденозиновых и Р2-рецепторов, аденозином и АТФ, по их влиянию на сократительную активность скелетных мышц. Преимущественно угнетающее действие гидрокортизона на сокращения скелетных мышц исчезает при двухнедельном подкожном его применении, что свидетельствует о необходимости более тщательного анализа эффективности краткосрочных курсов лечения глюкокортикоидами. Установленные влияния АТФ и аденозина на сократительные ответы скелетной мускулатуры свидетельствуют о вовлечении пуринорецепторов в регуляцию мышечной активности в физиологических и, вероятно, в патофизиологических условиях. Данные о температурной зависимости угнетающего эффекта АТФ на сокращения скелетных мышц могут быть важны для прогнозирования действия будущих лекарств - агонистов и антагонистов Р2-рецепторов, в условиях искусственной гипотермии и при воспалительных процессах.

Положения, выносимые на защиту.

1. Гидрокортизон, АТФ и аденозин in vitro оказывают угнетающее действие на сократительные ответы скелетных мышц лягушек и крыс; совместное применение гидрокортизона и АТФ приводит к исчезновению их угнетающего действия, тогда как совместное применение гидрокортизона и аденозина не изменяет их эффекты.

2. Однократное подкожное введение гидрокортизона лягушкам предупреждает угнетающий эффект АТФ, но не аденозина на сокращения скелетных мышц; двухнедельное введение гидрокортизона не изменяет действия АТФ и аденозина на скелетные мышцы.

3. Снижение температуры усиливает, а повышение - уменьшает угнетающее действие АТФ, но не аденозина, на сократительные ответы скелетной мышцы лягушки.

Апробация результатов исследования. Результаты работы и основные положения диссертации были доложены и обсуждены на международном

б

симпозиуме "Биологическая мобильность" (Пущино, 2004), Пироговских студенческих научных конференциях РГМУ (Москва, 2004,2005), на Всероссийских студенческих научных конференциях КГМУ (Казань, 2004, 2005, 2006), на II научно-практической конференции студентов и молодых ученых "Медицина третьего тысячелетия глазами молодых" (Йошкар-Ола, 2005), на 4-ой Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Москва, 2006), на III съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007), на международном симпозиуме "Современные проблемы нейробиологии: молекулярные механизмы синаптической пластичности" (Казань, 2007), Российской конференции, посвященной 75-летию проф. И.А. Студенцовой (Казань, 2008), на Европейском конгрессе фармакологов EUPHAR-2008 (Манчестер, 2008).

Публикации. По материалам исследования опубликовано 22 печатные работы, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и обьем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 126 источников, из которых 9 отечественных. Работа изложена на 91 странице машинописного текста, иллюстрирована 24 рисунками, 4 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 170 лягушках Rana radibunda и 19 белых беспородных крысах обоего пола.

Для фармакологических экспериментов, изолированные портняжные мышцы лягушек были подвешены вертикально в ванночки с раствором Рингера. Мышцы были продеты через два платиновых кольца, диаметром 2,5 мм и расстоянием между ними 15 мм, через которые осуществлялась стимуляция электрическим полем (СЭП) с помощью стимулятора Digitimer MultiStim D330 (Великобритания). Сокращения мышц вызывались стимуляцией прямоугольными

импульсами частотой 1 Гц, длиной 0,5 мс, амплитудой 10 В в течение 30 с. Сила сокращений регистрировалась изометрическим датчиком механической активности Linton FSG-01 (Великобритания), аналоговый сигнал оцифровывался и обрабатывался системой сбора данных Biopack MP100WSW (США). Средняя величина всех сокращений, полученных в течение 30 с (30 ответов), обрабатывалась, как один результат. Сократительные ответы были нормализованы относительно максимального сокращения, вызываемого раствором КС1 (240 шМ) в конце эксперимента. Мышечный препарат инкубировали с определенной концентрацией АТФ или аденозина и регистрировались ответы на СЭП. После промывания ткани свежим раствором проводили инкубацию с PPADS, (антагонистом Р2-рецепторов, 10 цМ) в случае АТФ, или 8-SPT (антагонистом аденозиновых рецепторов, 100 цМ) в случае аденозина и дополнительно 10 мин - с соответствующим агонистом с последующей регистрацией сократительных ответов.

В экспериментах по оценке действия гидрокортизона, после регистрации контрольных ответов на СЭП и оценки влияния агонистов (АТФ или аденозина), ткань инкубировалась с гидрокортизоном (10 цМ) и с одним из агонистов, после чего проводилась стимуляция электрическим полем. Далее проводились промывание ткани и повторная инкубация с гидрокортизоном и PPADS в случае с АТФ и 8-SPT в случае с аденозином.

Влияние температуры на сократительную активность портняжной мышцы оценивали на 37 лягушках. Температура раствора регулировалась водяным насосом ТЕ-8А (Techne, Великобритания). В этих экспериментах все процедуры препарирования производились при температуре 22±0,5 °С. После записи контрольных ответов, добавлялся один из агонистов (АТФ или аденозин), и ответы на стимуляцию электрическим полем были записаны снова. Далее все процедуры повторялись последовательно при температурах 17±0,5 °С и 27±0,5 °С.

Прямая электрическая стимуляция лягушек осуществлялась в специальной камере постоянным электрическим током (3 раза в течение 3 с 15-минутными перерывами между стимуляциями, 0.7 мА). После последнего раздражения животные оставлялись в камере на 30 минут и далее возвращались в 8

стандартные условия. Через 2 часа они использовались для приготовления нервно-мышечного препарата.

Подкожное введение гидрокортизона (100 мг/кг/день) осуществляли в спинной лимфатический мешок лягушек. В группе сравнения лягушкам вводили идентичный объем вспомогательного вещества (0,5% раствора лидокаина). В остром эксперименте, животных забивали через 12 часов после однократной инъекции гидрокортизона. В подостром эксперименте, инъекции проводили один раз в день в утренние часы в течение 14 дней; животные забивались через 12 часов после последней инъекции. Сократительные ответы изолированных портняжных мышц лягушек оценивали in vitro.

В экспериментах на крысах, камбаловидная мышца (m. soleus) выделялась у животных, находящихся под наркозом (этаминал натрия, внутрибрюшинно, 40 мг/кг), и помещалась в ванночку с раствором Кребса. Сократительные ответы вызывали электрическими прямоугольными импульсами частотой 0,1 Гц, длительностью 0,5 мс и напряжением 10 В в течение 30 с. Ответы регистрировали изометрически с помощью датчика механической активности Linton FSG-01 (Великобритания), захватывались аналогово-цифровым преобразователем Biopack (Великобритания) MP100WSW и сохранялись на персональном компьютере. Средняя величина амплитуд сокращений, записанных в течение 30 с (4 сокращения) обрабатывалась как одно измерение. Сократительные ответы рассчитывались в процентах относительно контрольной стимуляции в начале эксперимента. Оценка влияния агонистов пуринорецепторов и гидрокортизона проводилась аналогично тому, как было описано выше для лягушек.

Электрофизиологическне эксперименты проводили на изолированном нервно-мышечном препарате седалищный нерв-портняжная мышца лягушек.

Внутриклеточное отведение токов концевой пластинки производили с помощью микроэлектродов, заполненных 2,5 моль/л раствором КС1 и имеющих входное сопротивление 3-5 МОм (Костюк, 1960). Индифферентный электрод представлял собой аналогичную неполяризующуюся систему в специальном гнезде ванночки, сообщающемся с основной камерой. Микроэлектроды фиксировались в

области концевой пластинки мышечного волокна под визуальным контролем. При этом расстояние между местами вкола потенциального и токового микроэлектродов не превышало 10-50 ¡.ш. Активный потенциальный и индифферентный электроды соединяли с усилителем биопотенциалов. Активный токовый электрод соединялся с системой фиксации мембранного, потенциала, представляющей собой усилитель обратной отрицательной связи. Система фиксации потенциала позволяла фиксировать мембранный потенциал в диапазоне -200±50 мВ в полосе 0-2,5 кГц. Последующее измерение параметров токов концевой пластинки осуществляли с помощью программного обеспечения. Для непрямого раздражения нервно-мышечного препарата нерв располагали на серебряных электродах, в отдельной герметической увлажненной камере, изолированной от ванночки, в которой помещалась мышца. Для регистрации токов концевой пластинки нерв раздражали прямоугольными импульсами сверхпороговой амплитуды длительностью 0,2-0,4 мс с частотой 0,03 Гц.

Анализ результатов. Электрофизиологические эксперименты анализировались с помощью парного и непарного ^критерий Стьюдента. Фармакологические эксперименты на портняжной мышце лягушки анализировались с использованием парного и непарного ^критерия Стьюдента. Фармакологические эксперименты на крысе и эксперименты с подкожным введения гидрокортизона на лягушке анализировались с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Уровень значимости менее 0,05 принимался за достоверный. Данные представлены в виде арифметического среднего ± стандартная ошибка среднего (п - число мышечных препаратов для фармакологических или синапсов для электрофизиологических экспериментов).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние АТФ и аденозина на сократительные ответы и токи концевой пластинки портняжной мышцы лягушки

АТФ (10-100 цМ) концентрационно-зависимо угнетала сокращения портняжной мышцы лягушки, вызванные СЭП. Максимальное угнетение наблюдалось при концентрации 100 цМ и достигало 77,8±2,4% (п=14) по отношению к контролю, принятому за 100% (Р < 0.05, Нгест Стьюдента для связанных величин). АТФ не оказывала угнетающего действия после инкубации с антагонистом Р2 рецепторов РРАОБ (10 цМ, п=10, Рис. 1, 2). Антагонист Р1-рецепторов 8-8РТ (100 цМ) не оказывал достоверного влияния на угнетающее действие АТФ, что свидетельствует об отсутствии влияния АТФ на Р1 -рецепторы (Рис.2).

20 с

2 г

А I

J I

Рис. 1. Механограммы сократительных ответов портняжной мышцы лягушки, вызванных стимуляцией электрическим полем (СЭП). А - исходные ответы мышцы, вызванные СЭП; Б - влияние АТФ (100 цМ); В - влияние АТФ (100 цМ) после предварительной инкубации с РРАБв (10 цМ); Г - влияние АТФ (100 цМ) после предварительной инкубации с 8-8РТ (100 цМ). Стрелки указывают на начало и конец СЭП.

91944

АТФ(ЮрМ) АТФ (30 |>М) АТФ(ЮОмМ) PPADS+ДТФ (100 цМ)

8-SPT+ATO (100 (jM)

50 SO 70 80 90 100

Рис. 2. Влияние АТФ, PPADS (10 цМ) и 8-SPT (100 цМ) на сократительные ответы изолированной портняжной мышцы лягушки, вызванные СЭП. п=10-14. Результаты представлены в процентах относительно исходных ответов, принятых за 100%. Горизонтальные линии обозначают стандартную ошибку среднего, * - Р<0,05 относительно исходных значений.

Схожее действие на сокращения портняжной мышцы оказывал аденозин, который в концентрации 100 |iM угнетал сокращения до 81.1±2.4% (n=22, Р < 0.05, t-тест Стьюдента для связанных величин). Антагонист Р1 -рецепторов 8-SPT (100 рМ) полностью предупреждал действие аденозина на сократительные ответы мышцы.

Средняя амплитуда токов концевой пластинки (ТКП) портняжной мышцы составила 138±25 пА (п=25). АТФ (100 цМ) обратимо угнетал ТКП до 66.0±2.5% от исходных значений (п=25, Р < 0.05, t-тест Стьюдента для связанных величии, Рис. 3). Сурамин (100 цМ) отменял действие АТФ, тогда как PPADS (10 дМ) и 8-SPT (100 цМ) не влияли на угнетающее влияние АТФ на ТКП.

Аденозин (100 цМ) обратимо угнетал ТКП до 70.0±3.3% от исходных значений (п=26, Р < 0.05, t-тест Стьюдента для связанных величин). PPADS (10 цМ) и сурамин (100 цМ) не оказывали действие на эффект аденозина, тогда как инкубация с 8-SPT (100 цМ) привела к отмене угнетающего эффекта аденозина на ТКП.

_] *

Ч'

А Б В

Рис. 3. Токи концевой пластинки (ТКП) изолированного нервно-мышечного препарата портняжная мышца - седалищный нерв лягушки до (А) и после (Б) добавления АТФ (100 цМ) и отмывки агониста (В).

2. Влияние гидрокортизона in vitro на эффекты АТФ и аденозина на сократительные ответы портняжной мышцы лягушки

Инкубация мышцы с гидрокортизоном (10 цМ) в течение 10 минут приводила к снижению амплитуды сокращений до 83,1±6,4% (n=14, Р < 0.05, t-тест Стьюдента для связанных величин, Рис. 4). Тем не менее, когда гидрокортизон использовался совместно с АТФ, сократительные ответы не отличались от контрольных значений. Предварительная инкубация с PPADS не повлияла на совместное действие гидрокортизона и АТФ.

ntnpoKopnooH+PPADS+АТФ гидрокортиэон+АТФ П*ДроКорТМЭОН

AT«

50 60 70 80 90 100

Рис. 4. Влияние гидрокортизона (10 цМ) и PPADS (10 цМ) на АТФ-опосредованное угнетение (100 цМ) сократительных ответов изолированной портняжной мышцы лягушки, вызванных стимуляцией электрическим полем, п=8-12.

Гидрокортизон не оказывал влияния на угнетающее действие аденозина: сократительные ответы на СЭП при добавлении одного аденозина или в

__Ш-i

_ZH

—1-н. ;

ZZZH*

комбинации с гидрокортизоном были статистически идентичны. При инкубации ткани с 8-SPT (100 цМ) угнетающий эффект аденозина блокировался (Рис. 5).

гадрокортизои+8-5РТ+аденозин гкдрокортизон+адвноэин гидрокортизон аденозин

во ао loo

Рис. 5. Влияние гидрокортизона (10 цМ) и 8-SPT (100 рМ) на аденозин-опосредованное угнетение (100 цМ) сократительных ответов изолированной портняжной мышцы лягушек, вызванных стимуляцией электрическим полем, п=6-11.

3. Влияние АТФ и аденозина на сокращения и ТКП портняжной мышцы лягушек, подвергнуть« прямой электрической стимуляции

В этих экспериментах оценивалось влияние АТФ и аденозина на сокращения портняжной мышцы, выделенной из лягушек, предварительно подвернутых прямой электрической стимуляции. АТФ в концентрации 100 иМ угнетала сокращения мышцы до 86,7±6,0% от исходных величин (п=7), чго достоверно отличается от действия АТФ на мышцы лягушек, не подвергнутых прямой электрической стимуляции (63,3±4,2%; n=12, Р < 0.05, критерий знаковых рангов Вилкоксона).

Аденозин (100 цМ) вызывал угнетение до 67,5+9,2% от исходных значений (n=4, Р < 0.05, t-тест Стьюдента для связанных величин), что сравнимо с его действием на мышцы лягушек, не подвергнутых прямой электрической стимуляции.

Средняя амплитуда ТКП нервно-мышечного препарата, выделенного из животных, подвергнутых прямой электрической стимуляции, составила 199±12 пА (п=11). В этих экспериментах не наблюдалось угнетающего действия АТФ на ТКП. В противоположность, аденозин по-прежнему оказывал угнетающее действие на ТКП, составивших 72,3±5% от исходных значений (n=6, Р < 0.05, t-тест Стьюдента для связанных величин).

Z3

ШИН' н-

4. Влияпне однократного подкожного введения гидрокортизона на эффекты АТФ и аденознна на сократительш>1е ответы портняжной мышцы лягушки

После однократного подкожного введения гидрокортизона лягушкам в дозе 100 мг/кг, АТФ не оказывала достоверного влияния на сократительные ответы портняжной мышцы, амплитуда которых составила 89,7±7,1% от исходных значений (п=4). При этом в контрольной группе АТФ (100 цМ) вызывала значительное угнетение сокращений по сравнению с исходными (70,1±6,2%; п=4, Р<0.05, парный t-критерий Стьюдента). Степень угнетения в этой группе была сравнима с таковой у интактных лягушек. Критерий Краскела-Уоллиса выявил достоверные отличия между эффектом АТФ в контрольной группе и группе, которой вводился гидрокортизон (Р < 0.05). Добавление PPADS (10 цМ) отменяло угнетающий эффект АТФ в контрольной группе, существенно не влияя на эффект в группе гидрокортизона.

В противоположность АТФ, аденозин угнетал сократительные ответы мышц в обеих группах с одинаковой силой, и амплитуда сокращений составила 69,6±2,4% (п=4) и 62,4±6,8% (п=4) в группе гидрокортизона и контроля соответственно, и эти данные не отличались от эффекта аденозина у интактных лягушек (Р > 0.05, критерий Краскела-Уоллиса). В обеих группах предварительная инкубация ткани с 8-SPT (100 рМ) блокировала влияние аденозина.

5. Влияние 14-дневного подкожного введения гидрокортизона на эффекты АТФ и аденознна на сократительные ответы портняжной мышцы лягушки

После 14-дневного подкожного введения гидрокортизона в дозе 100 мг/кг/сутки мы обнаружили, что АТФ (100 цМ) вызывает значительное угнетение сокращений, вызванных СЭП, с амплитудой 70,8±3,3% (п=6) и 69,5±5,4% (п=6) в контрольной и опытной группах соответственно по отношению к исходным ответам. Данные не отличались от полученных на мышцах интактных лягушек. В обеих группах PPADS (10 цМ) угнетал влияние АТФ.

Аденозин оказывал схожее действие на сокращения контрольных лягушек и лягушек, получавших гидрокортизон (68,9±4,2%; п=5, и 64,8±5,8%; п=6 соответственно, Р > 0.05, критерий Краскела-Уоллиса), и эффекты не отличались от действия аденозина у интактных лягушек. Инкубация с 8-8РТ приводила к угнетению эффекта аденозина в обеих группах.

6. Влияние АТФ и аденозина на сокращения камбаловидной мышцы крысы

АТФ (100 цМ) угнетала вызванные электрической стимуляцией сокращения камбаповидной мышцы до 66,8±7,6% от исходных значений (п=11, Р < 0.05, критерий Краскела-Уоллиса). Предварительная инкубация с антагонистом Р2-рецепторов РРАББ (10 цМ) не повлияла на эффект АТФ и амплитуда сокращений составила 64,6±7,4% (п=7).

Аденозин, как и АТФ, снижал амплитуду вызванных стимуляцией электрическим полем сокращений камбаповидной мышцы до 64,9±7,5% (п=4, Р < 0.05, критерий Краскела-Уоллиса). Антагонист Р1-рецепторов, 8-БРТ полностью угнетал эффект аденозина на сокращения камбаповидной мышцы (83,3±7,4%; п=3). Стабильный аналог АТФ, а,р-меАТФ в концентрации 10 цМ не оказывал влияния на вызванные СЭП сокращения камбаповидной мышцы и амплитуда ответов составила 80,2±12,5% (п=3) соответственно.

7. Влияние гидрокортизона на эффекты АТФ и аденозина на сокращения камбаловидной мышцы крысы

Гидрокортизон (10 цМ) угнетал сокращения камбаловидной мышцы до 65,6±4,6% (п=5; Р < 0.05, критерий Краскела-Уоллиса). При совместном влиянии на камбаловидную мышцу АТФ и гидрокортизона (71,3±5,3%; п=5) происходило такое же угнетение, как и при действии каждого из них по отдельности.

Совместное действие на камбаловидную мышцу гидрокортизона и аденозина приводило к еще большему угнетению сокращений (31,7±18,2%; п=4), что

достоверно отличалось как от действия только самого аденозина, так и от самостоятельного влияния гидрокортизона (Р <0.05, критерий Краскела-Уоллиса).

8. Температурная зависимость влияния АТФ и аденозина на сокращения портняжной мышцы лягушки

АТФ концентрационно-зависимо угнетала сокращения портняжной мышцы лягушки при всех трех оцененных значениях температуры 17, 22 и 27 °С (Рис. 6). При самой высокой из использованных концентраций АТФ (100 цМ) сократительные ответы ткани составили 66.8±2.6% (п=12), 77.8±2.4% (п=14) и 84.2±0.8% (п=14) при температурах 17, 22 и 27 °С соответственно и все эти данные достоверно отличаются от соответствующих исходных значений, принятых за 100% (Р<0.05, 1-тест Стьюдента для связанных величин). Более того, при всех трех концентрациях АТФ наблюдалась температурная зависимость ее угнетающего эффекта: чем ниже была температура, тем сильнее влияла АТФ. Двуфакторный АИОУА выявил достоверное отличие между концентрационными кривыми для АТФ при всех трех значениях температуры.

■ I I

5.0 4.5 40

-1д[АТФ, М]

Рис. 6. Влияние АТФ при температурах 17, 22 и 27 °С на сократительные ответы изолированной портняжной мышцы лягушки, вызванные СЭП. Результаты представлены в процентах относительно исходных ответов, принятых за 100%. Вертикальные линии обозначают стандартную ошибку среднего, п=12-14.

PPADS (10 цМ) при 22 °С отменял угнетающее влияние АТФ и сократительные ответы составили 97.7±4.3% (п=10). Схожие результаты были получены при двух других значениях температуры: угнетающий эффект АТФ полностью отменялся и амплитуды сокращений составили 92.5±2.9% (п=10) и 93.1±5.1% (п=10) при 17 °С и 27 °С соответственно. При всех трех значениях температур было выявлено достоверное различие между влиянием АТФ в присутствии и отсутствии PPADS (Р<0.05).

Аденозин (100 цМ) при температуре 22 °С снизил амплитуду сокращений до 81.1±2.4% (п=22) по отношению к контролю, принятому за 100% (Р<0.05). Увеличение температуры до 27 °С или снижение до 17 °С, не привело к значительному изменению угнетающего влияния аденозина: амплитуда сокращений составила 82.9±5.7% (п=22) и 78.0±2.8% (п=22) соответственно. Не было достоверного различия во влиянии аденозина при всех трех значениях температур (Р>0.05). Угнетающее влияние аденозина отменялось 8-SPT. Выявлено достоверное различие между влиянием аденозина в присутствии и отсутствии 8-SPT при всех трех значениях температур (Р<0.05).

9. Температурная зависимость влияния АТФ и аденозина на токи концевой пластинки

При температуре 22 °С стимуляция мотонейрона портняжной мышцы лягушки вызвало ТКП амплитудой 138±25 нА (п=25) с экспоненциальным спадом. Возрастание температуры до 27 °С увеличило амплитуду ТКП до 162±26 нА (п=10), тогда как снижение температуры омывающего раствора до 17 °С снизило амплитуду ТКП до 96±28 нА (п=12).

При температуре 22 °С АТФ (100 цМ) обратимо угнетала амплитуду ТКП до

66.0±2.5% от исходных значений (п=25). Схожее угнетение (70.0±3.3%, п=2б)

наблюдалось при добавлении аденозина (100 цМ). При температуре 27 °С

угнетающий эффект АТФ был значительно ниже, нежели при температуре 22 °С и

составил 74.0±3.5% (п=8; Р<0.05). Самые низкие значения амплитуды ТКП были

получены в присутствии АТФ при температуре 17 °С составившие 58.6±2.6% 1S

(п=11). Схоже, ТКП, полученные после добавления аденозина, были статистически различны при температурах 17 и 27 °С и составили 64.9±2.8% (п=7) и 79.3±3.8%. (п=6), соответственно (Р<0.05).

Сурамин (100 цМ), неселективный антагонист Р2-рецепторов, отменял угнетающее влияние АТФ на ТКП, но не влиял на эффекты аденозина. В противоположность, PPADS (10 цМ) не угнетал влияние АТФ или аденозина на ТКП. Антагонист аденозиновых рецепторов 8-SPT (100 цМ) при температуре 22 °С не изменял угнетающий эффект АТФ на ТКП, но, в то же время, полностью отменял угнетающее влияние аденозина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что АТФ и аденозин угнетают сокращения скелетной мышцы лягушки и камбаловидной мышцы крысы, вызванные стимуляцией электрическим полем. Эти эффекты опосредуются Р2-рецепторами (в случае АТФ) и PI-рецепторами (в случае аденозина), поскольку антагонисты этих рецепторов предупреждают эффекты соответствующих агонистов. Угнетающий эффект АТФ усиливается при снижении температуры окружающей среды, тогда как эффект аденозина не имеет температурной зависимости. Гидрокортизон в экспериментах in vitro и в острых экспериментах in vivo противодействует эффекту АТФ, но не аденозина. В подострых экспериментах in vivo взаимодействие гидрокортизона с пуринами не регистрируется.

ВЫВОДЫ:

1. АТФ (10-100 цМ) и аденозин (100 цМ) угнетают сокращения портняжной мышцы лягушки, вызванные стимуляцией электрическим полем. Этот эффект АТФ предупреждается антагонистом Р2-рецепторов PPADS (10 цМ), тогда как эффект аденозина блокируется антагонистом аденозиновых рецепторов 8-SPT (100 цМ).

2. Гидрокортизон (10 цМ) угнетает сокращения портняжной мышцы

лягушки, вызванные стимуляцией электрическим полем. Совместное

19

применение гидрокортизона (10 цМ) и аденозина (100 цМ) существенно не изменяет их угнетающего действия на сокращения мышцы. При совместном применении гидрокортизона (10 цМ) и АТФ (100 цМ), их угнетающее действие на сокращения портняжной мышцы, вызванные стимуляцией электрическим полем, пропадает.

3. АТФ (100 цМ) оказывает угнетающее действие на токи концевой пластинки изолированного нервно-мышечного препарата лягушки, которое предупреждается антагонистом Р2-рецепторов сурамином (100 цМ), но не PPADS (10 цМ). Сходное ингибирующее действие аденозина (100 цМ) на токи концевой пластинки блокируется 8-SPT (100 цМ).

4. После однократного подкожного введения лягушкам гидрокортизона в дозе 100 мг/кг аденозин угнетает, а АТФ достоверно не влияет на сокращения изолированной портняжной мышцы. АТФ и аденозин угнетают сокращения изолированной портняжной мышцы лягушек, которым в течение 14 дней вводился подкожно гидрокортизон в дозе 100 мг/кг/сутки.

5. АТФ не влияет, а аденозин угнетает сокращения портняжной мышцы лягушки и токи концевой пластинки нервно-мышечного препарата лягушек, подвергнутых прямой электрической стимуляции.

6. При температуре 17°С АТФ проявляет более выраженный угнетающий эффект на сокращения портняжной мышцы лягушки, чем при температуре 22°С и 27°С. Ингибиторное действие аденозина на сокращения портняжной мышцы лягушки существенно не изменяется при разных температурных режимах.

7. АТФ, аденозин и гидрокортизон in vitro угнетают сокращения изолированной камбаловидной мышцы крыс. Совместное применение гидрокортизона с аденозином или АТФ существенно не изменяет их угнетающего действия на сокращения мышцы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Камалиев P.P. Понижение температуры усиливает пуринергическую регуляцию нервно-мышечной передачи [Текст] / P.P. Камалиев, Б.А. Зиганшин // 78-я Всероссийская студенческая научная конференция, посвященная 190-летию Казанского ГМУ: Тезисы. Казань, 13-15 апреля 2004 г. - Казань, 2.004. - Т. 1. - С. 36-37.

2. Камалиев P.P. Температурная зависимость ингибиторного эффекта пуринов и ее влияние на параметры сокращения скелетной мускулатуры [Текст] / P.P. Камалиев, С.Н. Гришин // Вестник РГМУ: Материалы Пироговской студенческой научной конференции, Москва, 18 марта 2004 г. - Москва, 2004. - С. 163.

3. Камалиев P.P. Гипотермия увеличивает влияние Р2-рецепторов на параметры сокращения скелетной мускулатуры [Текст] / P.P. Камалиев, А.У. Зиганшин, Б.А. Зиганшин // Биология -наука XXI века: Сборник тезисов 8-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых, Пущино, 17-2.1 мая 2004 г. - Пущино, 2004. - С. 83-84.

4. Камалиев P.P. Возрастание роли АТФ в регуляции сокращения скелетной мышцы при гипотермии [Текст] / P.P. Камалиев, А.У. Зиганшин, А.Л. Зефиров // Российский физиологический журнал. - 2004. - Т. 90. - № 8. - С.255.

5. Kamaliev R.R. Temperature regulates ATP inhibitory effect on responses of the frog skeletal muscle [Текст] / R.R. Kamaliev, S.N. Grishin, A.U. Ziganshin, A.L. Zefirov // Biological Motility: International symposium, Pushchino, May 23 - June 1. - Pushchino, 2004. - P. 33-35.

6. Зиганшин Б.А. Вероятная стресс-модулирующая роль Р2-рецспторов [Текст] / Б.А. Зиганшин, P.P. Камалиев, С.Н. Гришин, A.JI. Зефиров // Вестник РГМУ: Материалы Пироговской студенческой научной конференции - Москва, 17 марта 2005 г. - Москва: РГМУ. - 2005, № 3 (42).-С. 167.

7. Камалиев Р.Р. Влияние гидрокортизона на Р2-рецептор-опосредованную модуляцию нервно-мышечной передачи [Текст] / P.P. Камалиев, Б.А. Зиганшин // 79-я Всероссийская студенческая научная конференция, посвященная 1000-летию Казани: Тезисы. Казань, 12-14 апреля 2005 г. - Казань, 2005. - С. 75.

8. Зиганшин Б.А Гидрокортизон предупреждает Р2 рецептор-опосредованное угнетение сокращений скелетной мышцы [Текст] / Б.А. Зиганшин, Р.Р. Камалиев, С.Н. Гришин, А.Л. Зефиров, А.У. Зиганшин // Физиология мышц и мышечной деятельности: Материалы III Всеросс. конф., посвященной 250-летию МГУ им. М.В.Ломоносова, Москва, 1-4 февраля 2005 г.-Москва, 2005.-С.16.

9. Камалиев Р.Р. Влияние АТФ на сокращения медленной скелетной мышцы [Текст] / P.P. Камалиев, Б.А. Зиганшин, С.Н. Гришин, А.Л. Зефиров, А.У. Зиганшин // Физиология мышц и мышечной деятельности: Материалы III Всеросс. конф., посвященной 250-летию МГУ им. М.В.Ломоносова, Москва, 1-4 февраля 2005 г. - Москва, 2005. - С.19.

10.Камалиев P.P. Влияние гидрокортизона на Р2-рецегггор-посредованную модуляцию активности скелетной мышцы [Текст] / Р.Р. Камалиев БА. Зиганшин, С.Н. Гришин, А.У. Зиганшин // Клиническая фармакология и терапия. - 2005. - № 4 (приложение). - С. 207208.

11 .Камалиев P.P. Модулирующее влияние гидрокортизона на эффекты, опосредуемые Р2-рецепгорами [Текст] / Р.Р. Камалиев, Б.А. Зиганшин // Медицина третьего тысячелетия глазами молодых: Тезисы II научно-практической конференции студентов и молодых ученых. Вып.2. / Map. Гос. Ун-т. - Йошкар-Ола, 2005. - С. 9.

12.3иганшин А.У. Гидрокортизон и эпинефрин отменяют модулирующее действие АТФ на сократимость скелетной мышцы озерной лягушки [Текст] / А.У. Зиганшин, P.P. Камалиев, Б.А. Зиганшин, С.Н. Гришин, А.Л. Зефиров // Научные труды I Съезда физиологов СНГ "Физиология и здоровье человека", Сочи, 19-23 сентября 2005 г. - М.: Медицина - Здоровье, 2005.-С. 120.

13.Ziganshin A.U. The influence of hypothermia on P2 receptor-mediated responses of frog skeletal muscle [Текст] / A.U. Ziganshin, R.R. Kamaliev, S.N. Grishin, L.E. Ziganshina, A.L. Zefirov, G. Burnstock//European Journal of Pharmacology. -2005.-Vol. 509.-P. 187-193.

14.Зиганшин А.У. Оценка Р2-рецепторов как мишеней воздействия потенциальных лекарственных препаратов [Текст] / А.У. Зиганшин, Ю.Т. Зефирова, Б.А. Зиганшин, P.P. Камалиев // Тезисы докладов 4-ой Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (13-16 марта 2006 г., "Подмосковье"). - Москва, 2006. - С. 31.

15.Камалиев Р.Р. Оценка скорости распада натрия аденозинтрифосфата при контакте с биологическими тканями [Текст] / Р.Р. Камалиев, БА. Зиганшин // 80-я Всероссийская студенческая научная конференция (18-20 апреля 2006 г.). Тезисы - Казань: КГМУ, 2006. - С. 71.

16.3иганшин А.У. Взаимоотношения гидрокортизона с АТФ и аденозином в нервно-мышечном синапсе скелетной мышцы лягушки [Текст] / А.У. Зиганшин, Р.Р. Камалиев, С.Н. Гришин // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т.7, Вып. спец., Ч. 1. - С. 17041705.

17.KamaIiev R.R. Hydrocortisone interaction wilh P2 receptors in frog skeletal muscle [Текст] / R.R. Kamaliev, B.A. Ziganshin, A.U. Ziganshin, S.N. Grishin // Contemporary problems of neurobiology: molecular mechanisms of synaptic plasticity. - Kazan, 2007. - P. 14-15.

18.Зиганшин А.У. Перспективы создания лекарственных препаратов, влияющих на Р2-рецепторы [Текст] / А.У. Зиганшин, P.P. Казакова, А.П. Зиганшина, P.P. Камалиев, Б.А. Зиганшин // Фармакология и токсикология фосфорорганических соединений и других биологически активных веществ. Выпуск 4. Материалы Российской конференции, посвященной 75-летию проф. И.А. Студенцовой. - Казань, 2008. - С. 37.

19.Камалиев P.P. Влияние АТФ и аденозина на сокращения различных типов скелетных мышц крысы [Текст] / Р.Р. Камалиев, А.У. Зиганшин // Фармакология и токсикология фосфорорганических соединений и других биологически активных веществ. Выпуск 4. Материалы Российской конференции, посвященной 75-летию проф. И.А. Студенцовой. -Казань, 2008. - С. 42.

20.Ziganshin A.U. Effect of hydrocortisone on ATP-induced inhibition of neuromuscular transmission in frog skeletal muscle [Текст] / A.U. Ziganshin, R.R. Kamaliev, R.R. Kazakova, B.A. Ziganshin // Late breaking and hot topic abstracts of EUPHAR 2008 Congress, Manchester, 13-17 July, 2008. - P. 19.

21.Камалиев P.P. Воздействие гидрокортизона, АТФ и аденозина на скелетную мышцу крысы [Текст] / Р.Р. Камалиев, С.Н. Гришин, Ж.Ю. Фалу, А.У. Зиганшин // Казанский медицинский журнал. — 2009. - Т. 90. - С. 556-559.

22.Ziganshin A.U. Interaction of hydrocortisone with ATP and adenosine on nerve-mediated contractions of frog skeletal muscle [Текст] / A.U. Ziganshin, R.R. Kamaliev, S.N. Grishin, B.A. Ziganshin, G. Burnstock II European Journal of Pharmacology. - 2009. - Vol. 607. - P. 54-59.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии «АртПечахьСервис» ИП Мартынов М.Н. Подписано в печать 06.12.10 г. Заказ № 158. Тираж 100 экз. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Объем 1,5 п.л. 420061, г. Казань, ул. Космонавтов, 41. Тел. 295-10-19

Пуриновые соединения (АТФ и аденозин), пребывая во внеклеточном пространстве, вовлечены практически во все функции организма, хоть и крайне редко как главные игроки. Обычно АТФ в физиологических условиях выполняет модулирующую роль, вовлекаясь в быстрые и долгосрочные клеточные процессы (Burnstock, 2006а; liles and Ribeiro, 2004). Ранее считалось, что основным источником внеклеточной АТФ являются поврежденные и отмирающие клетки. Однако сейчас установлено, что выделение АТФ из многих клеток является физиологическим или патофизиологическим ответом на стресс, гипоксию, воспаление и некоторые агонисты (Burnstock, 2009а). Например, из окончаний нервных клеток везикулярная АТФ выделяется как котрансмиттер в комбинации с другими веществами (Burnstock, 2009а).

Внеклеточные нуклеотиды, в том числе и АТФ, оказывают разнообразные эффекты, влияя на мембранные рецепторы, названные Р2-рецепторами (North, 2002; Ralevic and Burnstock, 1998). При этом сложная каскадная система экзоферментов быстро метаболизирует внеклеточные нуклеотиды, в результате чего либо прекращается их действие, либо образуется метаболит с иной селективностью к Р2-рецепторам (Zimmermann, 2000). Кроме того, если АТФ и АДФ стимулируют семейство Р2-рецепторов, то конечный продукт их дефосфорилирования - аденозин обладает влиянием на иной, собственный класс рецепторов, названных аденозиновыми (PI) рецепторами (Fredholm et al., 2001). Так как аденозиновые и Р2-рецепторы часто являются функциональными антагонистами, разложение АТФ не только лимитирует ее действие, но и привносит новые агонисты с различными, часто противоположными, свойствами. Эта сложная система присутствует практически во всех тканях. В дополнение, внеклеточная АТФ может играть классическую роль донатора фосфатных групп и фосфорилировать наружные части мембраны, тем самым, изменяя их функциональные свойства (Fujii et al., 2002; Wirkner et al., 2005).

Внеклеточное действие АТФ на скелетные мышцы было обнаружено более 35 лет назад (Forrester, 1972). Известно, что АТФ выделяется из нервных окончаний при сокращении мышц лягушки (Cunha and Sebastiao, 1993) и диафрагмы крысы (Vizi et al., 2000). Установлено, что в нервно-мышечных окончаниях лягушки АТФ угнетает выброс медиатора, действуя на P2Y рецепторы (Sokolova et al., 2003). В нервно-мышечных окончаниях крысы Ру-имидо-АТФ, устойчивый аналог АТФ, увеличивает выброс ацетилхолина, предположительно, действуя на пресинаптические Р2 рецепторы (Salgado et al., 2000).

В настоящее время стало признано, что стероидные гормоны оказывают свои эффекты, не только в результате взаимодействия с цитоплазматическими рецепторами и запуская геномный механизм синтеза белков, но и посредством некоторых так называемых негеномных механизмов (Song and Buttgereit, 2006). Негеномные эффекты стероидов проявляются быстрее и могут быть следствием взаимодействия с липидами, белками и рецепторами, находящимися на мембране клетки (Watson et al., 1999). Ранее было установлено, что в нервно-мышечном синапсе лягушки быстрый (негеномный) эффект гидрокортизона приводил к усилению, а длительное влияние - к угнетению токов концевой пластинки. Кроме того, было установлено, что гидрокортизон угнетает влияние АТФ на выброс медиатора (Гиниатуллин А.Р. и др., 2000). Однако, как это действие гидрокортизона отражается на сократимости мышцы изучено не было.

В исследованиях, проведенных в нашей лаборатории, было установлено, что гипотермия существенно повышает эффективность Р2-рецептор-опосредованных ответов в гладких мышцах и мышцах миокарда (Ziganshin et al., 2002). В отношении скелетных мышц до начала нашего исследования подобных сведений не было известно.

Целью настоящего исследования было изучить взаимоотношение стероидного гормона - гидрокортизона и агонистов аденозиновых и Р2-рецепторов - аденозина и АТФ по влиянию на сократительные ответы скелетных мышц.

Задачи исследования 1. Оценить влияние АТФ, аденозина и гидрокортизона, а также совместного их применения, на сократительную активность и токи концевой пластинки изолированной портняжной мышцы лягушки.

2. Сравнить влияние однократного и 14-дневного введения гидрокортизона лягушкам на эффекты АТФ и аденозина на сократительную активность и токи концевых пластинок изолированной портняжной мышцы.

3. Изучить влияние АТФ и аденозина на сократительную активность и токи концевых пластинок изолированной портняжной мышцы лягушек, подвергнутых прямой электрической стимуляции.

4. Установить влияние АТФ и аденозина на сократительную активность и токи концевых пластинок изолированной портняжной мышцы лягушки при различных температурных режима.

5. Оценить влияние АТФ, аденозина и гидрокортизона in vitro, а также их совместного применения, на сократительную активность изолированной камбаловидной мышцы крысы.

Научная новизна.

Впервые установлено, что гидрокортизон, АТФ и аденозин оказывают угнетающее действие на сокращения изолированной портняжной мышцы лягушки. Показано, что совместное применение гидрокортизона и АТФ приводит к исчезновению их угнетающего действия, тогда как совместное применение гидрокортизона и аденозина не изменяет их эффекты. При однократном подкожном введении гидрокортизона выражено его ингибиторное влияние на сократимость скелетных мышц, при длительном применении этот эффект гидрокортизона становится не существенным. Обнаружено, что двухнедельный курс подкожного введения гидрокортизона лягушкам не отменяет угнетающий эффект АТФ на сокращения скелетных мышц. Угнетающее действие АТФ на сокращение и амплитуду токов концевой пластинки портняжной мышцы исчезает у лягушек, подвергнутых прямой электрической стимуляции и однократному подкожному введению гидрокортизона, при этом ингибиторный эффект аденозина у этих животных существенно не изменяется. Показано, что снижение температуры среды увеличивает, а повышение - уменьшает угнетающее действие АТФ, но не аденозина, на сократительные ответы и токи концевой пластинки скелетной мышцы.

Научно-практическая значимость работы.

Проведенные комплексные исследования in vitro и in vivo свидетельствуют о неоднозначном взаимодействии стероидного гормона гидрокортизона с агонистами аденозиновых и Р2-рецепторов аденозином и АТФ по их влиянию на сократительную активность скелетных мышц. Преимущественно угнетающее действие гидрокортизона на сокращения скелетных мышц исчезает при двухнедельном подкожном его применении, что свидетельствует о необходимости более тщательного анализа эффективности краткосрочных курсов лечения глюкокортикоидами. Установленные влияния АТФ и аденозина на сократительные ответы скелетной мускулатуры свидетельствуют о вовлечении пуринорецепторов в регуляцию мышечной активности в физиологических и, вероятно, в патофизиологических условиях. Данные о температурной зависимости угнетающего эффекта АТФ на сокращения скелетных мышц могут быть важны для прогнозирования действия будущих лекарств - агонистов и антагонистов Р2-рецепторов, в условиях искусственной гипотермии и при воспалительных процессах.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Гидрокортизон, АТФ и аденозин in vitro оказывают угнетающее действие на сократительные ответы скелетных мышц лягушек и крыс; совместное применение гидрокортизона и АТФ приводит к исчезновению их угнетающего действия, тогда как совместное применение гидрокортизона и аденозина не изменяет их эффекты.

2. Однократное подкожное введение гидрокортизона лягушкам предупреждает угнетающий эффект АТФ, но не аденозина, на сокращения скелетных мышц; двухнедельное введение гидрокортизона не изменяет действия АТФ и аденозина на скелетные мышцы.

3. Снижение температуры усиливает, а повышение - уменьшает угнетающее действие АТФ, но не аденозина, на сократительные ответы скелетной мышцы лягушки.

2. Обзор литературы

2.1. Введение

Пуринергическая сигнальная система представлена пуриновыми и пиримидиновыми нуклеотидами, оказывающими эффекты через семейства аденозиновых, Р2Х- и Р2¥-рецепторов. Впервые гипотеза о пуринергической нервной передаче была выдвинута в начале 70-х годов прошлого века (Burnstock, 1972, 1976), а чуть позже было предположено наличие двух типов рецепторов: Р1 и Р2 (к аденозину и АТФ соответственно) (Burnstock, 1978). Вскоре после того, как были клонированы несколько типов подобных рецепторов, основываясь на молекулярной структуре и механизме активации, (Abbracchio and Burnstock, 1994) предложили, что пуринергические рецепторы следует разделить на два семейства: Р2Х-рецепторы - лиганд-оперирующие ионные каналы и Р2У-рецепторы, связанные с G белком. В настоящее время эта классификация получила всеобщее одобрение и на сегодняшний день описано семь подтипов Р2Х- и восемь подтипов Р2У-рецепторов, включая рецепторы, чувствительных как к пуринам, так и к пиримидинам (Alexander et al., 2008).

Результаты исследования рекомендуется использовать в учебном процессе при изучении нормальной физиологии в разделе "синаптическая передача возбуждения" и фармакологии в разделе "механизмы действия лекарственных средств". Проведенные комплексные исследования in vitro и in vivo свидетельствуют о неоднозначном взаимодействии стероидного гормона гидрокортизона с агонистами аденозиновых и Р2-рецепторов аденозином и ЛТФ по их влиянию на сократительную активность скелетных мышц. Преимущественно угнетающее действие гидрокортизона на сокращения скелетных мышц исчезает при двухнедельном подкожном его применении, что свидетельствует о необходимости более тщательного анализа эффективности краткосрочных курсов лечения глюкокортикоидами. Установленные влияния АТФ и аденозина на сократительные ответы скелетной мускулатуры свидетельствуют о вовлечении пуринорецепторов в регуляцию мышечной активности в физиологических и, вероятно, в патофизиологических условиях. Данные о температурной зависимости угнетающего эффекта АТФ на сокращения скелетных мышц могут быть использованы для прогнозирования действия будущих лекарств - агонистов и антагонистов Р2-рецепторов, в условиях искусственной гипотермии и при воспалительных процессах.

7. Практические рекомендации