Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Ультраструктурные и цитохимические модификации клеточных органелл различных биологических объектов при адекватных и экстремальных воздействиях

its » . , i v

' РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ

На правах рукописи

ФЕДОРЕНКО Григорий Мефодьевич

Ультраструктурные и цитохимические модификации клеточных оргаиелл различных биологических объектов при адекватных и экстремальных воздействиях.

Специальность 14.00.23. - гистология, цитология, эмбриология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Москва 1996г.

Работа выполнена в Научно-исследовательском лисил Нейрокибернетики им. А.Б. Когана при Ростов« государственном университете.

Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, проф. Н.С. Косидин.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Мошков Д.А. доктор биологических наук, профессор Бродский В.Я. доктор биологических наук, профессор Пылаев A.C.

Ведущая организация:

Институт цитологии РАН (С.Петербург).

Защита состоится "П" декабря 1996г. в "п часов на заседании Специализированного совета Д 003.10.02. по защите диссертаци на соискание учёной степени доктора наук при Институте высш нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (117 865, Моек ул.Бутлерова, д.5а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Инстит/1 высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН-

Автореферат разослан

Учёный секретарь диссертационного совета

д.б.н. Лебедева H.H.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Как известно, патологические изменения при действии раэиичных экстремальных и патогенных факторов начинаются на субклеточном уровне. В настоящее время, в связи с научно-техническим прогрессом, появляется всё больше экстремальных воздействий (радиация, электромагнитные и лазерные излучения, невесомость, гипербарооксигенация и др.), к которым живые организмы не могли приспособиться в процессе эволюции (Холодов, 1975, 1992; Агаджанян, 1982, 1987; Ефуни, 1986; Сисабеков, Г1389; Наточин и др., 1995; Серова. 1996). Во многих случаях неизвестны механизмы и клеточные мишени этих воздействий. Чтобы судить о патогенном воздействии факторов внешней среды на организм человека надо знать, как они действуют на клеточные органеллы. Необходимо также уметь отдифференцировать действие "новых" (непривычных) факторов от действия факторов внешней среды к которым организм в процессе эволюции приспособился (гипоксия, температура и др.). На примере реакции органелл клетки к действию возрастающего адекватного фактора можно выяснить предел устойчивости этих структур.

В' начальный период действия различных факторов нарушается внутриклеточное ионное осмотическое равновесие (Сотников, 1976; 1985). Поддержание гомеостаза при этом неизбежно вызывает потребление энергии, которое могло бы найти своё отражение в ультраструктурных .перестройках таких органелл, как митохондрии и пластиды. В этом плане изучение ультраструктурных изменений клеток при различных функциональных состояниях, вызванных действием факторов внешней среды, обретает особую актуаль-

ность. Действительно, выявляя последовательно корреляции ыежд; структурой и функцией отдельных органелл, возможно, в конечно] счёте сложить истину» картину скрытых механизмов деструктивны процессов, а также их купирования.

Однако, использование изменений ультраструктуры в качеств показателей функционального состояния затруднено в силу ряд обстоятельств. Так, многие авторы показывают разные изменени клеточных органелл в сходных тканях при сходных условиях (За московский и др., 1972; Коган и др., 1974, 1981; Казанский др., 1979; Меркулова и др., 1982; Авдеева и др., 1987). Автор ке всегда учитывали фазу ответной реакции клетки, в которс они фиксировались', а также природу и силу воздействующего ста мула.

Большинство работ представленных, как исследования I клеточном уровне организации выполнены при действии экстр« мадьных факторов на организм. Неясно, что является в тага случаях повреждающим фактором - действие самого агента или ш рушение контролирующих механизмов более высоких уровней орп низации. Поэтому, актуальна проблема, связанная с выбором об' екта, позволяющего локально воздействовать на клетку, прич очень важно иметь возможность оценки её функционального сост яния.

Особенностью изучение структурных реакций клеток высок организованных животных, включая человека, является то, V в связи со сложной дифференциацией различных тканевых сист воздействующий агент способен влиять на клетку не только и посредственно, но и опосредовано, через систему нейро-гуь ральной регуляции. Поэтому, выявление связи между действ}

«тора меняющего функциональное состояние клетки и первичной апенью его действия в некоторых случаях удобно проводить на >лее простых объектах, так как реакция простейших и клеток »имитивных многоклето-них организмов (растений) возникает в •вет на непосредственное действие факторов внешней среды.

Выявление корреляций между структурой и функцией в такой юокодифференцированной клетке, как нейрон, затруднено в силу ишфункциональности его отдельных органелл. В этом плане пер-юктивно сопоставление данных о тонком строении нейрональных зганелл с данными полученными на объектах с более высокой гепеныо их специализации. Такими являются, например, знерго-5разующие органеллы митохондрии и пластиды растений, которые злее автономны, чем митохондрии клеток животных организмов, в *лу своей особой генетической природы (А^агсй еЬ. а1. , 1982; 1ауЬоп, 1982). Разработка вышеперечисленных вопросов является {туальной задачей не только для изучения клеточных механизмов зйствия экстремальных факторов внешней среды, но и для прог-эза процессов деструкции, а также для коррекции патологий, эзникающих при действии этих факторов.

Далью настоящей работы было исследование методами элект-онной микроскопии, цитохимии и морфом'етрии модификации орга-елл клеток животных и растительных организмов при адекватных экстремальных вбздействиях. Это определило постановку слэду-щих задач:

1. В плане изучения ;:эйствия адекватного фактора выяснить льтраструктурные изменения пирамидных нейронов и окружающей лии 5-го слоя коры мозга кошки в разные ф; зы естественного дкла бодрствования - сон с помощью специально разработанного

малотравматичного способа забора ткани мозга для электрс но-микроскопического исследования и обеспечивающего надёжи электрофизиологический контроль, исследуемых фаз.

2. Для изучения действия экстремального" фактора, исслег • вать изменение ультраструктуры и цитохимических показател

(изменение активности "маркерного" митохондриального фермел МАО) крупных пирамидных нейронов коры больших полушарий крь при гипероарооксии и холодовом воздействии.

3. Провести анализ ультраструктурной организации изолир ванного механорецепторного нейрона речного рака (ЫНРР) л адекватном раздражении:

а) вызванного действием механического стимула;

б) апликацией тормозным медиатором ГАЫК;

с регистрацией импульсов электрической активности, как маркё его функционального состояния.

4. Изучить изменения ультраструктуры различных вон со МИРР при микрооблучении гелий-кадмиевым лазером с регистраци импульсной активности, как показателя его функционального со тояния.

5. Дровести исследование ультраструктурной организаи неточных органелл растительных объектов (листьев горчицы подсолнечника) при экстремальных воздействиях - водном дефип те и хлоридном засолении с целью сравнения с выявленными изы нениями ультраструктуры клеток животных при различных функци нальных состоиниях.

6. Разработать аппаратную базу и пакет оригинальных про .рамм для автоматизированного анализа ультраструктурных изобр жений.

- 7 -

Основные положения алюсммыа на защиту.

1. Действие адекватных и экстремальных факторов на клетку юывает структурную модификацию клеточных органелл энергети-•ского и белкового метаболизма, а также цитоскелета

2. Действие непрерывного лазерного микрооблучения характе-гауется фазной реакцией клетки, которая отражается в опре-глённой модификации энергообразуюших органелл, а также в им-гльсном электрическом ответе.

3. Отсутствие специализированных регулирующих систем в ютениях, а также относительная автономия энергообразуюших ¡ганелл (пластид) позволяет использовать их для выявления мишей прямого действий экстремального фактора на клетку.

Научная повязка и научно-практическое значение результатов.

Выдвинута гипотеза об избирательном включении отдельных >ганелл, которое носит вероятностный характер, в процессы |утриклеточного метаболизма и этим, очевидно, обеспечивает

г •

щйжность и пластичность работы нейрона. Показано электронно-(кроскопическим и цитохимическим изучением клеток с различной ■епеньв специализации их структуры, что в основе вероятностно характера деятельности органелл лежит га способность к яификашш своей ультраструктуры при переходе на новый уро-!нь функциональной активности. Выявлено, что при действии асгоров внешней среды основу такой модификации составляют постройки двух типов: иэменения внутреннего строения органелл первый тип, и их пространственное перераспределение в клетке второй тип. .

Впервые с применением ультраструктурных, цитохимических, а 1юяе компьютерно-морфометрических методик, исследованы нейро-

яы мозга кошки в цикле бодрствование - сон с использование] специально разработанного устройства малотравматического забора ткани мозга. Получены данные об изменении внутреннего стро ения и пространственного распределения органелл крупных пира мидных нейронов коры в разные фазы сна. Эти результаты внося вклад в изучение роли ультраструктурных перестроек органел центрального нейрона при изменении функционального состояния вызванного естественным торможением в процессе сна Кроме то го, они способствуют пониманию механизмов субклеточного мета болизма сна, что углубляет представление о его биологическс смысле, а также вносят вклад в решение проблем нейро-глиальнь отношений.

Впервые в результате сопоставления данных по изменеш "маркерного" митохондриального фермента ЫАО и ультраструктп нейрона показан характер модификации клеточных органелл щ воздействии стрессовых факторов: гипероксии и гипотермии.

Впервые изучена динамика изменения ультраструктуры ыехан< рецепторного нейрона речного рака (ЫНРР) при адекватном раз ражении, действии тормозного медиатора ГАЫК с чётким Фикс рованием уровня функционального состояния по показаниям элек рической импульсной активности.

Показано, что непрерывное лазерное микрооблучение характ ризуется фазной реакцией клетки, которая отражается в импуг сном электрическом ответе, а также в определённой модификаи знергообразугсдос органелл. -

Впервые для выявления мишеней прямого действия экстрема.' ного фактора иа клетку проведено сравнительное структурно-1 тохимическое исследование выеокоднфференцировакиых клеток !

этных .и клеток растительных организмов, так как для последних арактерно отсутствие специализированных регуляторных клеточ-ях систем и органеллы обладают относительной автономностью.

В целом, полученные в работе данные, вносят вклад в знания пределах выносливости и характере модификаций клеточных ор-анелл при действии как адекватных, так и экстремальных фак-эров и позволяют выявить мишени их действия. Помимо теорети-зского, полученные данные имеют самостоятельное практическое качение. Они могут быть использованы в качестве ультраструк-урных показателей функционального состояния при раннем диаг-эстировании некоторых патологий и коррекции их лечения в ме-ицине, а также для выявления признаков устойчивости к дейст-кю вредных факторов среды у исходных растительных форм при эздании .высокоэффективного .целенаправленного селекционного роцесса в сельском хозяйстве.

Научные результаты диссертации используются при чтении спец-урсов на биолого-почвенном факультете и ФПК "Биология" РГУ.

Апробация д^ссертацнотэтто ютерюла. Результаты нсследо-еший были представленны на: Всесоюзном сьезде "Применение редств и методов лазерной техники в биологии и медицине", 381 (Киев); 1 Всесоюзном семинаре "Ультраструктура нейронов и эрмакологические воздействия", 1981 (Пукино на Оке); 1 Между-ародном симпозиуме "Иейробиология цикла бодрствование-сон". 086 (Тбилиси); 5 сьезде ВОГИС, 1987 (Москва) 1987; Междуна-одНой конференции "Персг-ктивные иформационные технологии в нализе изображений", 1992 (Ташкент); Международной конферен-ии "Щюблемы нейрокибернетики," 1992 (Ростов-на-Дону); 1 сь-зде ВОГИС, 1994 (Волгоград); Йеждународной конференции "Проб-

леш нейрокибернетики",, 1995 (Ростов-на-Дону); 4 Word contres on addaption medicine, India, 1995.

Структура N объём диссертации. Диссертация изложена на 16 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзор , литературы, описания материалов и методов исследований, че тырёх глав с изложением результатов собственных исследований заключения, выводов и библиографического указателя. Работа ид люстрирова.а 56 рисунками и 12 таблицами.

Материалы и методы исследования Экспериментальные исследования проведены на животных: кои ках, лабораторных крысах, речных раках и на некоторых высши растениях (масличных): подсолнечнике (линия 3629) и горчии сарептской (Донская - 5).

1.1. Эксперименты по у ль траструктурноцу и авторадиографичш ' кому исследованию нейронов коры мозга кокки. Использовано S животных обоего пола весом 1,5-2 кг. в одно и то же время cj ток (19 час.). Разработан способ, защишённый авторским свид« тельством (йедоренко и др.; 1982), который позволяет в разш фазы цикла бодрствование - сон: медленноволновой фазы с} ( МВК), парадоксальной фазы сна .( ГНС), состояния бодрствоваш ( ЕС), контролируемые показаниями элелектрокортикограммы, ок; лологрммы и миограммы, проводить малотравматическую биопа подэлектродного участка коры мозга животного..

- Подготовку ткани для последующих ультраструктурных и a¡ торадиографических исследований проводили по специально разр. боташюй методике (Фельдман, ФеДоренко и др. ; 1979). Биопсир ванные кусочки мозга делились на 2 Части: для электронно-ми; роскопических исследований и для авторадиографии.

При авторадиографическом исследовании ткань инкубировали 'Н-лейцином (фирма Amers ham, уд. акт. 1мКи/мл), затем многок-iTHO промывали охлажденной инкубационной средой для удаления связанного лейцина и фиксировали смесью Бродского. Изго->вляли парафиновые срезы толщиной 5 мкм. которые затем депа-1финировали и покрывали фотоэмульсией типа М. Через 45 суток >епараты подвергали стандартной фотообработке, докрашивали шатоксилином Караччи и подсч:ггывали число автографов в пяти >нах крупных пирамидных нейронов: у основания апикального и 5оих базальных дендритов, над ядром и областью отхождения ак-)на.

Дальнейшая подготовка обьектов для электронномикроскопичес-зго исследования, включающая б себя этапы обезвоживания тка-1, пропитку её заливочными смолами типа эпон 812 и аралдит, энтрастирования в спиртовом растворе солями тяжелых металлов

фанилацетатом), полимеризации эпоново-аралдитовых блоков, в *

эторых была заключена исследуемая ткань, проводилась общепри-]тыми методическими приёмами (Гайэр, 1981). Крупные пирамид-je нейроны 5-го слоя идентифицировали на полутонких срезах, {ратенных метиленовой синью, под светооптическич контролем, пьтратонкие срезы этих клеток готовили на ультрамикротоме BS 30 A (Tesla), дополнительно контрастировали в солях тьжёлых зталлов и фотографировали в электронных микроскопах ГШ-100 ХСР), Phillips (Голландия).

, 2 Исследашэдпге ультраструктуры и активности ыоиогшююксидазм ало) коры мозга крш пря гкпероксяи и хояодовоа воздейст-!«. Объектом исследования служили около 150 взрослых белых рыс обоего пола массой 150-280Г. Первую серию животных поме-

пали в холодную камеру при 2°С на 1. 3 и 45 суток. На 3-й сут ки наиболее выражена стрессовая реакция. К 45-м суткам наст> пала адаптация к холоду (Горопшнская и др., 1981). Контроле служили крысы, взятые из этой же группы и .содержащиеся такс же время в условиях вивария при температуре 20-22° С. ОС группы крыс получали одинаковый рацион. Опыты проводили в зш ний период (январь - март).

Другую серию животных подвергали действию гипербарооксшч нации: использовали три режима гипероксии: 0,2Ша 0В в течен: 1 часа, 0,3 МПа 0а в течении 2 ч. и 0,7 МПа до наступления с: дорог (в среднем 30 мин.). Заданные условия гипероксии созд вали в специальной барокамере, снабженной щелочным поглотит лем углекислоты при постоянное режиме компрессии и декомпре сии 0,2 Ша в 1 мин. В обеих эксле ре ментальных серигтх и в ко трольной группе животных декапитировали в одно и то жв вре суток (9-10 часов утра), и всю дальнейшую обработку ткани мс га проводили на холоду.

Митохондрии выделяли методом дифференциального центров гирования (Шсквитина, 1977). Активность маркёрного ¡¿итохо! риального фермента (МАО) определяли в митохондриальной фраш и супернатанте, содержащем микросомы, лизосомы и растворю компоненты. О дезаминировании серотонина и глюкоэамина суд] по образованию аммиака после инкубации суспензий митохонд] или супернатанта с одним из субстратов. Серотонинкреатинсу. фат использовали в конечной концентрации 2,5 мМ, гдхт мин-гидрохлорид -10 мМ. Инкубацию проводили в воздушной ср при 37,5.° С и рН 7,45 в течение 30 мин. (Горкин и др., 196 Содержание аммиака определяли спекгрофлуориметрическим ыето

la флуориметре "Hitachi 650-60" (Sugawara К. , Oyama F.J. ,1981) юсле изотермической отгонки (Seligson D. a. al. ,1951). При подготовке материала к ультраструктурному_исследованию использовали методические прг-змы, описанные в п. 1.1.

1.3. Элвкхроино-шкроскопкческое и элега-рофмзиодогичеадае ^следование мехалгорепзпторного нейрона речного рака. Исследование проведено на 50 половозрелых раках преимущественно в летне-осенний период. Для эксперимента использовали изолированные сенсорные нейроны медленноадаптирующегося рецептора растяжения речного рака (МНРР), способные при неизменном адекватном растяжении рецепторной мышцы длительное время генерировать потенциалы действия (ПД) с постоянной частотой. Выделение рецепторного органа, дозированное растяжение мышцы осуществлялось с использованием приёмов и устройств, специально разработанных для этой цели в нашей лаборатории (Загускин, 1965, Коган и др., 1974).

Электрофизиологический контроль функционального состояния осуществлялся путём униполярного отведения электрических потенциалов аксона нейрона с помощью серебряных электродов и последующей регистрацией на усилителе биопотенциалов (УБП-2). Один из двух симметричных нейронов приводили в состояния покоя (отсутствие импульсной активности) - контроль, другой соответственно - в состояние слабого возбуждения (5-бгц.) и после выдерживания в физиологическом растворе (Harreveld. 1936) в течение 10 и 120 минут поме али в фиксирующую смесь. Торможение импульсной активности достигалось перфузией, растворенной в физрастворе ГАМК в концентрации 2,5x10'/. Н в течение 10 и 120 минут.

- 14 -

В опытах с лазерным воздействием использовалось излучени гелий-кадмиевого лазера ЛГ-70 с длиной волны 441,6 нм. В мс мент, соответствующий изучаемой стадии импульсной реакции неЯ рона на лазерное микрооблучение, осуществлялась его фиксавд для исследования в электронном микроскопе. Последующая обрг Сотка ткани рецептора проводилась по ранее разработанной схе ме, как в п. 1.1.

1.4. 1 .¡следование уж траструктуры энергопродуцируюцих о] ганелл клеток растений. Обьектом исследования служили лист! высших растений (масличных) - подсолнечника и горчица Jb изучения влияния водного дефицита растения выращивали в экс периментальных условиях (Белецкий и др. ,1988). Почвень^ю 3acj ху создавали путём прекращения полива и доведения влажности ; 30,t от поливной влагоёмкое:'и (60%) в условную фазу развит! 5-6 пары листьев. Заданный режим влажности поддерживали дальнейшем' на постоянном уровне путем полива сосудов по веез Фиксацию материала осуществляли спустя неделю и две неде: после заданного режима влажнйети.

При изучении действия засоления, в качестве критерия сс леустойчивоети использована всхожесть семян на фоне хлоридно] засоления. Опыты проводили по методике, разработанной в наш( лаборатории Белецким КХ Д. с сотрудниками (Белецкий и др. 1S90). ' Изучали сортовую популяцию Донская-5. Всхожесть опред< ляли на вторые сутки, режим засоления - 1% (Na Cl). Для ул! траструктурного исследования клеток растений была примене] модификация метода глутаро-осмиевой фиксации (Лявдэнко, Фед< реико Г. IА , 1981). Содержание пигментов в клетках растений oi ре,пулялось методом. Гавриленко (Гавриленко и др., 1975).

- 15 -

Мэрфометрическая обработка включала в сеия подсчет на ед.

-5 2

пощади среза цитоплазмы 4x10 см. числа рибосом, митохондрий измерение площади митохондриальных профилей. На единицу пло-зди пластид подсчитывали число гран, тилакоидов стромы, плас-эглобул, число тилакоидов в гране. Для оценки параметров, ис-педуемых органелл, использовалась специально разработанная в ашей лаборатории диалоговая автоматизированная система обра-этки ультраструктурных изображений (Федоренко, 1992). Досто-гряость численных различий в контроле и опыте определяли по ритерию Стьюдента (Бейли, 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2. Ультраструктура и распределение автографов в крупных «рамидньсс нейронах ютры позга коао! в разные фазы цикла бодрствование-сон.

' Естественный сон является удобной моделью для выяснения эрфофунгадеональных корреляций в центральной нервной системе, эк как даёт возможность изучения целостной реакции всего ор-анизма и отдельно взятой клетки, при этом хорошо разработаны кзиологические, в том числе и электрофизиологические, крите-т оценки отдельных фаз цикла бодрствование-сон.

2.1. Ультраструктура нейронов в гэстоянии бодрствования ВС), ыедленноволновой (ШЗФС) и парадоксальной (ПФС) фаз сна. ¡ализ электроннограмм крупных пирамидных нейронов 5-го слоя зри в ЕС шлсазал, что в целом, характер ультраструктуры схож данными, которые были получены на нейронах интактных животах различными авторами (Питере и др., 1973; Манина. 1978; Бо-

голепов, 1979; Коган и др. , 1987 и др.). В МВФС'была отмечена незначительная фрагментация ядерного хроматина и увеличение степени извилистости ядерной оболочки Отдельные митохондрии выглядели несколько увеличенными в разменах. Существенных изменений ультраструктуры других клеточных органелл нами обнаружено не было. В ГНС состояние ультраструктуры сходно с ШЮ: Степень фрагментации ядерного хроматина немного снижена, а складчатость ядерной оболочки осталась на том же уровне, что и в ШЮ.

Количественный анализ показал (табл. 1), что среднее число рибосом на единицу площади перинуклеарной зоны нейрона в ШЮ достоверно меньше, чем в ЕС и соответственно составляло 70,7±2,8 и 83,5+3,1 на единицу плошади. В ШС, напротив, это число возрастало'и составляло 91,3±2,6 единиц.

Таблица N1

Среднее количество рибосом в крупных пирамидных нейронах в В? , МВФС . МО (на единицу площади 4,2х10'5 сь£) в околоядерной зоне. .«•

Состояние 1 Медленноволновая Парадоксальная

бодрствования (ВС) 1 фаза сна (ШХО) фаза.сна (ШС)

83,5±3,1 1 70,7+2,8* 91,3+2,6 *

*Достоверно отличается от значения при бодрствовании(р<0,05), 2. 2 Интенсивность включения 3Н-лейцииа в белки крупных пирамидных нейронов в розные фазы сна. Во время ШЮ выявлен уменьшение числа автографов по сравнению с ЕС, причём в сред

- 17 -

нем по,клетке это уменьшение достоверное (табл.2).

Таблица N2

Средние числа автографов в различных зонах нейрона, выявленные в разные фазы ц^лсла бодрствование-сон

1 Состоя-1 ние I 1 Число на клетку 1 Зоны нейрона 1

1 Апикальный! ! дендрит 1 Еазальный) дендрит 1 Ядро 1 1 _______1 Аксон 1 I

ВС 1 МВОС ! 1ИС 1 17 + 0.7 10 ± 0,7 15 ± 0,6* 1 7,0+0,6 1 1 1,9±0,4 ! ! 5,1+0.5 1 5,1±0,5 1 3,7±0,5 ! 2,9±0,3 -1 2,810,31 1, 8±0,31 1,6±0,2! 1,9±0,2! 2,4±0,2! 2,3+0,3! ________1

* Достоверно не отличается от бодрствования ( р > 0,05)

В различных зонах нейрона количество автографов снижалось неравномерно. Наиболее значительно оно падало в зоне апикальных дендритов, в зоне отхождения аксона, напротив, отмечена тенденция его повышения. Суммарное число автографов по всем зонам пирамидных'клеток во время ПФС существенно не отличаюсь от ВС. Наиболее значительное снижение числа автографов обмечено в зоне ядра '

2.3. Уль траструктура сателлипюй глии при развнтхх сна.

Результаты подсчёта соличестйа рибосом на единицу площади в крупных пирамидных нейронах и клетках-сателитах а зоне их контакта приведены в табл. 3. Из данных табл. 3 следует, что в глии в зоне контакта при переходе из ВС в ММС число рибосом

достоверно возрастало '(на 26,62), а затем в 1ИС несколько снижалось, оставаясь, всё же достоверно выше по сравнению с В (на 17%). В нейроне, в отличие от изменений в глии, число ри босом на единицу площади при переходе из ВС,в ЫВЮ достоверн! уменьшалось, а в 1НС приближалось к уровню ВС. Во время сна особенно в МЫС, снижалось соотношение числа рибосом межд нейроном и глией.

Таблица №

Количество рибосом в нейронах и в клетках-сателитах в зоне их контакта в разные фазы цикла бодрствование-сон.

Количество рибосом на ед. площади

Состояние

I-

I в нейроне I

в клетке глии

соотношен. нейрон-гл

Бодрствование (ВС) I 88,7±3,0 .

Медленноволновая I

фаза сна (МВСЕС) -I 73,6±2,2

Парадоксальная I

Фаза сна (ГНС) I 86,2±3,1*

74,8±2.0

101.8+2.2

92,9+2,1

1.18

0.69

0,93

* Достоверно не отличается от вначения при бодрствовании, Р>0,05.

Количественная оценка извилистости линии контакта наруж них мембран нейронов и клеток-сателитов показала недостоверно' увеличение извилистости в ШЯС и в.ПХС по сравнению с ВС среднее значение расстояний между ядром глиальной клетки и ли

ией контакта с нейроном значительно уменьшается в МЕЖ

-5 -5 -5"

1,6x10 см.) и в ШС (1,6x10 см ) по сравнению с БС(3.бх10см ).

Результаты, полученные электронномикроскопическими метода-и исследования, свидетельствуют об уменьшении количества ри-осом в ЫВХС и увеличении их в ПФС. Эти результаты совпадают с анными другого независимого метода исследования - авторадиог-афического и позволяют утверждать, что в ходе МИС закономер-

0 снижается уровень белкового синтеза и последующее его уве-ичение в ПФС до уровня БС. Установленные в настоящей работе акты коррелируют с данными об интенсивности белкового синтеза

различные фазы сна в биохимических исследованиях других ав-оров (Бродский и др., 1974; Редгат еЬ. а1., 1973), а также с анными ультраструктурных наблюдений, показывающих связь коли-ества рибосом в клс.ке с интенсивностью воздействия СКомис-арчик и др., 1970; Боголепов. 1979 и др.)

•Электрофизиологические исследования нейронов теменной ко-ы мозга кошки показали, что во время МВ2С в выходных пирами-;ах 5-го слоя снижается уровень возбудительной активации по равнению с БС, а во время 1ЙС- повышается (Фельдман, 1974; !ЬеИас1е еЬ а1., 1975). Следовательно, динамика нейронной ак-ивности хорошо согласуется с динамикой рибосом, отражающих . ровень синтеза белка и количество автографов: падение возбу-¡имости и усиление постсинаптического торможения соответствует снижению уровня белкового синтеза в МВЮ, а рост возбудимости ■

1 ослабление торможения - повышению синтеза в 1КС.

Одновременное исследование ультраструктурных показателей Тювня белкового синтеза в нейроне и в глие выявило, что в од-!их фазах цикла бодрствование-сон уровень белкового синтеза

преобладает в нейроне, в других - в глие; сзгамарно не, для комплекса нейрон - глиоцит он удерживается относительно постоянным во всех изученных состояниях.

3. ультраструктура и активность фершнта мао коры мозга крыс при гилероксми н холодовоы воздействии.

Для изучения экстремального воздействия на состояние уль-= траструктуры центрального коркового нейрона было проведено их электронно-микроскопическое исследование в условия холодового и гипербарооксического стресса (ГБО). Существенным различием мету выбранными для исследования воздействиями является их переносимость организмом. Для выяснения возможных механизмов структурных органе'лльных модификаций определялась активность митохондриального "маркерного" фермента МАО.

3.1. Ультраструктура пирамидных нзйрогав и акхмгность мао при гкперокскм. Изменения ультраструктуры нейронов были отмечены после 2-х часового воздействия 0,3 МПа 0а. Они проявлялись в некотором повышении электронной плотности митохондриального матрикса, увеличении степени пространственной дезорганизации канальцев ЭГО, уменьшении размеров и числа лизосом, снижении электронной плотности ядра

Наиболее выраженные изменения ультраструктуры нейрона обнаружены при анализе препаратов мозга в судорожной фазе кислородной интоксикации - при действии на животных 0,7 МПа Ог.

Размеры митохондрий увеличивались, значительная их часть выглядела набухшими,число митохондриальных крист. умень шалось, в некоторых митохондриях наблюдалось полное разрушение крист и снижение электронной плотности матрикса.

Для этой фазы воздействия характерно отсутствие лизосом и

массовое появление липофусцииновых гранул размером до 2 мкм. в диаметре. Канальцы ЭПС, а также цистерны и вакуоли' АГ выглядели дезорентированными и значительно набухшими.

Результаты исследования активности МАО в митохондриях при разных режимах гипероксии представлены в табл. 4. Активность МАО достоверно не изменялась при действии на животных 0,2 МПа 02в течение 1 часа, а в условиях 2-х часового действия 0,3 МПа 0а , снижалась на 412 с норадреналином в качестве субстрата и на 47% с серотониноы. В судорожную фазу кислородной интоксикации дезаминирование норадреналина снижается в среднем на 68%, серотонина - на 74%, причем у половины исследованных животных наблюдается полное ингибирование активности фермента.

Изменение каталических свойств МАО при гипероксии может быть обусловлено нарушением связи фермента с митохондриальными мембранами и выходом его в цитоплазму. В связи с этим исследовали интенсивность дезаминирования серотонина и глюкозамина в супернатанте, полученном после осаждения митохондрий. Из табл.5 видно, что в условиях гипероксии (судорожная фаза) в супернатанте появляется спосрбность дезаминировать со значительной скоростью серотонин и глюкозамин. Интенсивность дезаминирования серотонина возрастает более чем в 4 раза, глюкоза-мина - почти в 15 раз.

3.3. Ультраструктура нейронов и активность моноаминокси-дазы при действии холода. Односуточное действие холода (2°0 ) на животных вызывало нет :орые изменения ультраструктуры нейронов коры мозга. Наиболее заметные изменения были отмечены в строении митохондрий. Они проявлялись в. увеличении их размеров. просветлении матрикса, уменьшен'.»'.! числа крист. Канальцы

Таблица '

Активность МАО типа А митохондрий мозга при гипероксии (в нмоль азота аммиака/мг белка/мин)

! Субстраты де- ' Условия опыта

I эаминирования I----------------------------------------------

! ! контроль I 0,2МПа 1ч. I О.ЗМПа 2ч. I 0,7МПа

! ( I I I. судорог]

!--------------!----------1------------.------------(---------

¡Серотонин I 8,Б0±0,331 7,3310,70 I 4,47±0,27 I 2,20±0,-

! I I р>0,05 I р<0,001 I р<0,001

I Норадреналин I 5,57*0,171 4,93±0,57 I 3,30±0,30 I 1,76±0,<

I I I р>0,05 I р<0.001 I р<0,001

Таблица 5.

Активность МАО в супернатанте мозга при гипероксии (в нмоль азота аммиака/мг белка/мин)

1 Субстраты 1 1 дезамини- 1 1 рования 1 1 контроль 1 1 0,7 МПа, 1 судороги 1

1 Серотонин 1 0,347± 0,12 1 1,49+0,01 1

1 ' 1 1 р<0.001 1

1 Глюкозамин 1 0,13 + 0,04 1 1,82+0,23 1

1 1 • : I р<0.001 1

ЭПС выглядели несколько расширенными. Почти вдвое уменьшились размеры лизосом, их диаметр составлял около 0,1 мкм. (по срав-гению с 0,2 мкм. в контроле).

В результате 3-х суточного действия холода характер набу-{ания митохондрий менялся: наряду со значительно-набухшими эстречались частично - набухшие митохондрии. Диаметр лизосом уменьшился, по сравнению с предыдущими случаями и составил Э,05мкм. Отмечено появление большого числа крупных, до 2-х жм. диаметром, липофусцииновых образований.

При кратковременном действии холода (3-е суток) установ-гено снижение активности МАО (форма А, субстраты серотонин и юрадреналин) в митохондриальной фракции мозга на 28-29% и избиение субстратной специфичности, (МАО приобретает способ-юсть дезаминировать глюкозамин,табл. 6). У интактных животных ютивность МАО в супернатанте отсутствовала или была очень шзка, в среднем в 20 раз ниже, чем в митохондриальной фрак-щи. В условиях холодового стресса (3 суток, 2°С ), наряду со жиэтэнием активности МАО в митохондриях наблюдалось усиление ишашости МАО в супернатанте. Интенсивность дезаминирования ¡еротонина в супернатанте возрастала в 3,5 раза и становилась >еличиной одного порядка с активностью фермента в митохондри- > иньной фракции. При этом в супернатанте появлялась способность ¡езаминировать глюкозамин, интенсивность которого превышала контрольный уровень в 18 раз.

В условиях холодовой адаптации (45 суток, 2° С) актив-юсть МАО в митохондриях увеличивалась по сравнению с холодо-1ым стрессом, но не достигает 1юнтрольного уровня. При этом :убстратная специфичность нормализуется. Аналогичное снижение

Таблица 6.

Дезаминирование азотистых соединений митохондриями и супер-натантом мозга крыс при действии холода

(Н моль азота аммиака/мг белка/мин) ------------------------------------------т-------------------

I

Условия I Митохондрии | Супернатант

опыта I--------------------------------^-------------------

!Серотонин ! Глюкозамин! Норадре- I Серотонин! Глюкоза! ! I налин I I мин

Контроль 18,00+0,47 ! 0,21+0,09 ¡5,46*0,44 I 0,44±0,18!0,09±0,05

3 суток I 5,7340,42 ¡3,54+0,46 1 3,85±0,05 ¡1,5610,1511,64+0,23

Р К0.01 ¡<0,001 I <0,05 ¡<0,001, !<0,001

Изменения 11111

к контр. % I -28 I +1563 I -29 I +251 I +1683

45 сут. ¡6,5610,70 10,29±0,19 13,69±9,30 10,16+0,1010,32+0,12

Р ! >0,05 I >0,05 I <0,01 I >0,05 I >0,05,

Примечание: Р-достоверность отличий от контроля.

активности МАО А и изменение субстратной специфичности выявлено при гипербарооксигнации (Табл. 4).

Анализ электроннограмм нейронов коры мозга крыс при действии на животных различных режимов гипероксии и хлодовом воздействии позволил выявить закономерные изменения ультраструктуры клеточных органелл, которые особенно выралены в судорожную фазы воздействия. При этом было выявлено резкое снижение

- 2Б -

етивности МАО в митохондриях и её увеличение - в цитоплазме, оскольку МАО является "маркерным" ферментом митохондрий, дос-аточно прочно связанным с фосфолипидными компонентами мито-ондриальных мембран, появление митохондриального фермента в итозоле свидетельствует о нарушении структуры липидного бис-оя митохондриальных мембран и её проницаемости.

Сопоставление полученных данных по изменению свойств МАО изменениями ультраструктуры позволяет сделать вывод о том, то одной из возможных причин, выявленного нами набухания ми-охондрий, а так же деструкции лизосом, является изменение ли-идного состава органельных мембран в результате инициации ГОЛ юд действием активных форм кислорода, и как следствие этого, вменение их проницаемости не только для МАО, но и для других гонов, в том числе и для воды.

Л. ИЗМЕНЕНИЯ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ МЕХАНОРЕЦЕПТОРНОГО НЕЙРОНА РЕЧ-ЮГО РАКА с МИРР) ПРИ АДЕКВАТНЫХ И ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ.

Эксперименты на речных раках были поставлены с целью изу-шть особенности ультраструктурной организации одиночного 1дентифицированнного нейрона, позволяющего осуществлять гадёжный контроль его функционального состояния по импульсному электрическому ответу при действии адекватного фактора, воз-ростаюшей длительности и при экстремальном воздействии.

4.1. Ультраструктура МНРР при его возбуждении. Ультраструктура нейронов, находившихся в течение 10 минут в состоянии слабого возбуждения, тогда рецепторная мышца была еле пса растянута, а электрическая активность регистрировалась в виде импульсной последовательности с частотой 5-6 Гц., не имела су-

щественных различий с контрольными образцами. Однако, при этом, была отмечена некоторая степень складчатости наружной плазматической мембраны и незначительная локализация субповерхностных цистерн вдоль неё в центральном участке сомы клетки.

Увеличение длительности пребывания нейрона в состоянии возбуждения с 10 до 120 минут приводило к возрастанию степени агрегированности митохондриальиых профилей, появлению их асси-метричных, изогнутых и удлинённых форм. Отмечено появление митохондрии с трубчатыми кристами, ориентированными параллельно их продольной оси. Наблюдалось также формирование телец Ниссля в виде участков шероховатого ЭПР, окружённых митохондриями и расположенными между ними элементами цитоскелета. Цистерны аппарата Гольджи были значите1ьно расширенны в своих концевых участках, пузырьки ЭПР оказались также несколько расширенными, резко возросло число лизосом, особенно-вторичных.

4.2. Удьтраструктура UHPP при тормовении электрической активности. Торможение импульсной активности нейрона, вызванное апликацией ГАМК в течении 10 минут, характеризовалось такими же ультраструктурными признаками, -что и 10-минутное состояние возбуждения, однако выраженность их оказалась значительно большей. Воздействие ГАМК в течение 120 мин. приводило к образованию многочисленных групп плотноконтактирующих между собой митохондрий, локализованных на всей площади сомы, в том числе и около ядра. Часть митохондрий в агрегатах выглядела сконденсированными, с электронно-плотным матриксом, некоторые имели палочковидную и разветвлённую форму и гигантские размеры (до 8 mi см). Часть мембран в межмитохондриальных контактах ли-

зировалась, образуя везикулы диаметром около 600 А. Возможно, лизис плотноприлегагацих друг к другу межмитохондриальных мембран в зоне контакта лежит в основе механизма формирования гигантских разветвлённые митохондрий. Отмечено резко возросшее количество первичных и вторичных лизосом, некоторые из них содержали внутри себя митохондриальные фрагменты. Канальцы и цистерны ЭГО выглядели значительно набухшими, перинуклеарное пространство расширенным, а ядерный хроматин разреженным и локализованным вблизи ядерной мембраны.

4.3. .'Лорфоыстрический анализ клеточных органелл (митохон-др?й1) JÍHPP при его возбуждении н тор»«)женки.

Результаты морфометрии митохондрий и площадей нейронов представлены в таблицах N7 и N8. Их можно резюмировать следующим образом:

1) как возбуждение, так и торможение импульсной активности в течении 120 минут по сравнению с соответствующими воздействиями длительностью 10 мин. увеличивает количество митохондри-альных профилей;

2)' количество митохондриальных контактов резко возрастает уже после 10 минутного торможения по сравнению с 10 минутным возбуждением, однако в дальнейшем, к 120 минутам торможения оно несколько уменьшается сравнительно с 10 минутным торможением;

3) средняя площадь митохондриального профиля и средняя площадь нейрона возрастали после 10 минут воздействия на нейрон, а после 120 мин. воздействия происходило их уменьшение.

Таблица 7.

Морфометрические характеристики митохондрий ЫНРР в состоянии возбуждения и торможения различной длительности.

1 Функциональные 1 состояния Параметры морфологических показателей

1 нейронов. Среднее число митохо-¡Среднее количество митс

ндриальных профилей на хондриальных контактов

ед. плошади цитоплаз- на 1 митохондрию.

•5 г мы (4,5x10 см )

1 Е1(10мин) 0,48+0,025 0,042+0,00з

I Е2(120мин 0,56±0,02 0,093±0,002

¡ FI(IOmhh) 0,44±0,03 0,14±0,004

i F2(120мин) 0,75±0,035 0.12+0,003

1 Е1/Е2 . р >0,05 р <0,001

! El/Fl р >0,05 р <0,001

1 .E2/F2 р <0,001 ' р <0,05

! E1/F2 ; р <0,001 р <0,05-

Примечание. Е1-состояние слабого возбуждения (1-бгц)в течЛОм Е2-состояние слабого возбуждения в течение 120 мин F1-состояние торможения в течение 10 мин. Р?.-состояние торможения в течение 120 мин. р -достоверность различий 4. 4. Действие на МИРР микрооблучения гелий-кадмиевого лазера. В настоящей работе мы изучали ультраструктуру нейрона npi действии непрерывного микрооблучения гелий-кадмиевого лазера ]

период микрооблучения и после блокирования импульсации. В облучённых клетках изменения наиболее выражены в митохондриях: .они значительно увеличивались в размерах со снижением электронной плотности матрикса и дезорганизацией крист. Степень деструкции митохондрий изменялась в ходе лазерного облучения. В фазе учащения импульсной активности увеличение размеров митохондрий сопровождалось фрагментацией крист и просветлением матрикса в отдельных зонах, а в других участках этих митохондрий кристы сохраняли свою целостность. В фазе торможения импульсации строение митохондрий изменялось значительно сильнее. Происходило дальнейшее увеличение их размеров, усиливалась 'степень их агрегированности, в результате чего облучённая область клетки почти целиком была заполнена большими скоплениями плотноконтактирующих митохондрий с электронно-светлым матрик-сом и фрагментированными кристами.

. Выраженным следствием лазерного воздействия на клетку является появление миелиноподобных структур - многослойных, спирально-закрученных образований. Существенных изменений строения цитоскелета под влиянием лазерного облучения выявлено не было. Отмечены изменения тонкой структуры глиальной капсулы как в зоне облучения, так и над необлучённой зоной нейрона.

Пространственно-временная перестройка ультраструктуры нейрона под влиянием как 120 мин. возбуждения, так и 120 мин. торможения импульсной активности оказалась сходной. Действие стимула повышает функциональную нагрузку на органеллы, в результате чего происходит изменение их внутреннего строения (умеренное набухание, расширение крист и т.д.), что мы и наб-

- ÜÜ -

Таблица 8.

Средняя площадь нейрона и одной митохондрии в различных функкциональных состояниях

Функциональные! состояния 1 нейронов 1 1 Морфологические показатели 1

Площадь нейрона (юЛм*) ¡Средняя площадь мито - 1 -Ч Z. 1 хондрии (10 мм ) 1

El (10 мин) 1 4,86*0,013 1 0,30±0,02 I

Е2(120 мин) 1 4.49Ю.011 1 0.3710.01 1

Fl (10 мин) 1 5,20±0,01Ь I 0.44Ю. 015 1

F2(120 мин) 1 4.10+0,012 1 0,29*0,01!. 1

Е1/Е2 1 р <0,05 1 р <0,05 1

El/Fl I р <0,05 1 р <0,05 . 1

E2/F2 1 р <0,05 1 р <0,05 1

E1/F2 1 р <0,05 1 р <0,05 ' 1

. Примечание: Обозначения, как в таблице 7.

ждали при 10-минутном возбуждении. Увеличение интенсивности действия стимула вызывает агрегирование митохондрий, при этом происходила нормализация их внутренней структуры, отмеченная при 120-минутном возбуждении. Усиление интенсивности воздействия приводило к дальнейшему изменению внутреннего строения митохондрий, которое не снимала даже высокая степень их агрегации, наОдюдавшэяоя при 120-минутном торможении ГАМК.

- 31 -

Очевидна важная роль цитоскелета в осуществлении, отмеченной нами, пространственной перестройки клеточных органелл. Об этом свидетельствует, в частности, факт локализации значительных по размерам пупков микротрубочек вблизи митохондриаль-ных агрегатов, при расслоении цитоплазмы на гранулярные и фиб-рилярные зоны.

Ответная реакция на длительную стимуляцию связана также с образованием гигантских митохондрий. Предполагается, что количество гигантских митохондрий может служить структурным индикатором степени адаптации нейрона к действующему раздражителю. По-видимому, чем сильнее адаптация, тем больше гигантских митохондрий образуется в тех участках цитоплазмы нейрона, где потребность в уровне энергообразования одинакова и нет различий в уровне знерготрат между соседними локусами цитоплазмы.

Характер выявленных органелльных изменений при микрооблучении . схож с таковым при возбудительной и тормозной активации МНРР. Однако, степень изменений внутреннего строения отдельных органелл, в частности, митохондрий глубже и определяется спецификой лазерного воздействия. Причём, при облучении можно выделить временные фазы, в которых клеточные органеллы отличаются по своей реакции. Это также согласуется с данными по электрической импульсной активности клетки при облучении.

. Такие изменения структуры митохондрий говорят о мобилизации энергетических ресурсов клетки именно в эту фазу действия лазерного облучения.- Регистрация электрической активности при непрерывном действии лазера дало основание говорить о том, что фаза функциональной активности и структурная организация нейрона имеют определённый временной лимит, так как дальнейшее

длительное облучение.вызывает необратимое блокирование импульсной активности и деструктивные изменения митохондрий. Поэтому, молло говорить о фазности в ответной структурно-функциональной реакции клетки при действии лазерного облучения. Учитывая, что в настоящее время лазеры начинают широко использоваться в практике, следует принимать во внимание фазный характер действия лазерного облучения. Наблюдаемые изменения в глие при лазерьом облучении свидетельствуют о реципрокных ней-ро-глиальных отношениях, часто отмечаемых в мозгу животных различными авторами и описанные нами при протекании естественного цикла: бодрствование - сон (п. 2)

& электрошсмшрооюпическое и цитохимическое исследование некоторых высших растений в норме и при водно-солевом

стрессе.

.Особеностью изменения структурных реакций клеток высокоорганизованных животных, включая человека, является то, что в связи со сложной дифференциацией различных тканевых систем, воздействующий агент способен влиять на клетки не только непосредственно, но и опосредовано, через систему нейро-гумо-ральной регуляции. У подавляющего большинства животных, исключая примитивно организованных, наблюдается комбинация обоих типов воздействия. Поэтому, выявление связи между действием Фактора и первичной мишенью его действия, в некоторых случаях удобно проводить на более простых организмах, так как реакция простейших и клеток примитивных многоклеточных организмов (растений) возникает в ответ на непосредственное действие факторов внешней среды.

В этом плане было проведено исследование ультраструктуры

>сновных энергообразующих органелл высших растений (горчицы и юдсолнечника), которые более автономные, чем митохондрии жи-ютных организмов в силу • своей особой генетической природы Attardi, 1992; Clayton, 1982). Хлоропласты, в частности, сами синтезируют большую часть липидов. необходимых для построения собственных мембран, в то время как митохондрии получают их из цитоплазмы (Raven, 1976; Stumph, 1881).

В настоящей работе исследована ультраструктура пластид -слеток мезофила настоящих листьев подсолнечника (Helianthus annus L.) линии 3629 и горчицы сарептской (Brasica juncea J.) при действии экстремальных факторов внешней среды: хлоридном засолении (IX NaCl) и дефицита влаги (засухи) - факторов, хорошо изученных физиологами растений. Кроме того, определялось содержание в них зелёных пигментов - хлорофиллов, использующих энергию света для образования сильного электронного донора (Govindjee, 1974), и связанных непосредственно с тилакоидной мембраной.

5.1. Влияние дефицита влаги на ультраструктуру и содержание зелёных пигментов в листьях подсолнечника. Внутреннее строение пластид контрольных растений подсолнечника, в целом, сходно со строением пластид других высших растений и во многом совпадает с описанием ультраструктуры другой масличной культуры - горчицы сарепстская.

Негативное влияние водного дефицита у подсолнечника начинает проявляться уже спустя неделю после начала действия стрессового фактора. Плотность стромы хлоропластов повышалась, наблюдалось расширение межтилакоидного пространства, дезорганизовывалась вся внутренняя система мембран, что являлось первой

заметной реакцией хлоропластов на засуху. Уменьшалось число ламелл в гранах. Появлялось большое количество уменьшенных в размерах осмиефильных глобул, что свидетельствует, как полагают некоторые авторы (Силаева. 1978), об изменении функции ти-лакоидной системы.

Через две недели влияние стрессового фактора усиливалось,-те структурные изменения органелл. о которых говорилось выше, ещё более углублялись. Процесс гранообразования блокировался. Изменилось пространственное распределение тилакоидно-ламеляр-ной системы в строме пластида Более мелкие граны числом до 5-6 ламелл относительно равномерно локализовались по всей строме пластиды. Значительно уменьшились в размерах крахмальные зёрна. Содержание зелёных ..игментов, по сравнению с контролем, также снизилось.

5.2. Состояние ультраструктуры и содержание пигмента в листьях горчицы при хлоридноы засолении. Анализ электронног-рамм 3-5 пары листьев растений, выросших при 1% хлоридном засолении почвы показал существенные изменения ультраструктуры пластид по сравнению с контролем, которые, в ссновном, совпадают с данными, полученные на подсолнечнике при засухе. Крахмальные зёрна отсутствовали, а размеры пластоглобул значительно уменьшились. Клеточная мембрана со стороны вакуоли образовывала значительные изгибы. Отмечено уменьшение (примерно в 2 раза) размеров гран по сравнению с контролем, соответственно уменьшилось и число ламелл в гранах.

Изменился характер пространственной организации тилакоид-ной систему: она в виде небольших гран и одиночных тилакоидов стромы отпоет ельно равномерно распределена по всей плошади

среза .пластиды. Межтилакоидное пространство выглядело набухшим. Значительно, почти вдвое, снизилось количество зелёного пигмента

Сравнительный анализ данных визуальной оценки и морфомет-рии электроннограмм растений подсолнечника и горчицы, выращенных в условиях дефицита влаги и хлоридного засоления показал, что состояние их ультраструктуры существенно отличалось от ультраструктуры растений, выращенных в условиях нормальной влажности и на пресном фоне (контроль).

Особенно чётко эти различия проявлялись в ультраструктурной организации пластид - основной энергообразующей органеллы зелёных растений. Отмеченная, при этом, пространственная перестройка внутренних мембран пластид свидетельствует, об активизации функции модифицированной тилакоидной системы. Действительно, снижение числа ламелл в гранах и равномерное распределение их по всей площади среза хлоропласты, очевидно, оптимизирует условия контактирования поверхности тилакоидов с окружающей стромой, обеспечивая усиленное "перекачивание" протонов из стромы (рН 8) в тилакоидной пространство (рН около 5). Это создаёт на тилакоидной мембране дополнительную протонодвижушую силу, в результате чего мембранная АТР-синтетаза осуществляет синтез ATP (Hinkle et. al. , 1978), в обьоме, необходимом для обеспечения клетки энергией в условиях действия экстремального фактора

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в работе экспериментальные данные, вносят вклад з изучение структурно-функциональных отношений в нейроне. Основной вклад составляют данные о некоторых обоз»х законо-

мерностях изменений его ультраструктуры. Так, выдвинута гипотеза об избирательном включении отдельных органелл, которое носит вероятностных характер, в процессы внутриклеточного метаболизма и этим, очевидно, обеспечивая надёжность и пластичность работы нейрона.

Показано электронномикроскопическим и цитохимическим изучением клеток с различной степенью специализации структуры, что в осноье вероятностного характера деятельности органелл лежит их способность к модификации своей ультраструктуры при переходе на новый уровень функциональной активности. Выявлено, что основу такой модификации составляют перестройки двух типов: изменения внутреннего строения органелл - первый тип, и их пространственное перераспределение в клетке - второй тип. Предполагается вероятностный характер взаимодействия между этими двумя типами органелльных перестроек, так как он зависит от ряда случайных факторов: исходного состоянием отдельно взятой органеллы, зоны локализации органеллы в клетке, . природы воздействующего .фактора и некоторых других. Эти предположения основаны на сопоставлении результатов исследований, проведённых . на различных объектах:. центральных (корковых) нейронах млекопитающих, переферических (рецепторных) нейронах ракообразных и клетках высших растений - подсолнечника и горчицы.

Такой подход обусловлен. сложностью выявления связи между структурой и функцией в такой высокодифференцированной клетке пак нейрон, вследствии многопараметрности (полифункциональности) его органелл. Конструктивным оказалось сопоставление изменений ультраотруктуры клеток с различной степенью специализа-

ции своих органелл, обусловленной местом исследуемого объекта в эволюционном ряду. Важно, при этом, было использование в качестве удобных моделей объектов, позволяющих осуществлять: а) забор материала для исследования в определенную фазу деятельности; б) дозированное воздействие на него; в) надёжный контроль функционального состояния объекта исследования. Кроме того, полезным явилось использование адекватных и экстремальных воздействий различной природы на объекты исследования для выяснения специфичности выявленных изменений.

Сравнительный анализ внутриклеточных структурных и цитохимических перестроек позволил выяснить их метаболически;! смысл, а в ряде случаев и возможные механизмы органелльных модификаций. Так, на основе сопоставления изменений числа рибосом в отдельных крупных пирамидных нейронах коры мозга кошки в разные фазы естественного сна с данными авторадиографических наблюдений южно судить о колебаниях уровня белкового метаболизма в цикле бодрствов'ание - сон. Разнонаправленность изменений числа рибосом в нейронах и в клетках-сателлитах, а также количественные данные о смешении их ядер в сторону нейрона при развитии сна, позволили выявить реципрокный характер ней-ро-глиалышх отношений в цикле бодрствование-сон.

Анализ динамики фермента МАО, локализованного преимущественно на митохондриальных мембранах, позволил связать набухание митохондрий с изменением уровня перекисного окисления ли-пидов, влияющего на проницаемость клеточных мембран при действии экстремальных факторов среды - повышенного давления кислорода и холодового воздействия. Сопоставление данных о содержании зелёных пигментов, локализованных преимущественно на тила-

коидных мембранах пластид подсолнечника и горчицы, выращенных в норме, в условиях водного деффицита и хлоридном засолении, с ультраструктурными показателями, позволило предположить высокую функциональную активность модифицированной, в результате экстремального воздействия, мембранно-тилакоидной системы энергообразующих органелл клеток исследуемых растительных форм.

Данные, полученные при действии на идентифицированный- нейрон - МНРР адекватного стимула, возрастающей длительности, позволили детально выявить последовательность изменений тонкого строения внутриклеточных органелл, в частности митохондрий, и их пространственной реорганизации, а также показать взаимозависимый характер этих типов органелльных модификаций.

С использованием данных об избирательном действии лазерного облучения на МНРР, показан цикл структурных превращений митохондрий: набухание, сморщивание, полная деструкция, и кроме того, выявлена важная роль микротрубочек в осуществлении пространственных перестроек клеточных оганелл. Сопоставление этих данных с электрофизиологическими характеристиками позволило показать фазный характер реакции клетки на исследуемое экстремальное воздействие.

Сопоставление данных ультраструктурных исследований выполненных на нейронах с данными, полученными на клетках растительных организмов с сравнительно высокой степенью автономности своих органелл,позволяет предположить наличие единого принципа оптимизации внутриклеточных метаболических процессов путём модификации своих органелл. Однако, способы осуществления органелльных модификаций клеток растительных и животных орга-

низмов . различны. Так, было показано, что в нейронах важную роль в осуществлении пространственных перестроек играет цитос-келет, в клетках растений пространственная реорганизация мемб-ранно-тилакбидной связгла, по-видимому, с экспрессией генов, обусловленной действием экстремальных факторов среды.

Заключая, можно сказать, что в целом, учитывая и литературные данные, структурные, биохимические и электрофизиологические характеристики нейрона в различных функциональных состояниях, изучены в достаточной степени, чтобы строить на этой основе представления о роли органелльных перестроек в механизмах обеспечения его надёжного и адаптивного функционирования.

выводы

1. При использовании различных фаз естественного цикла бодрствование - сон, как адекватного воздействия, показано, что в пирамидных нейронах коры мозга модификация ультраструктуры проявляется, в основном, в изменении концентрации общего числа рибосом (уменьшении на 14% в ЫВДС и увеличение на 8% в ПК! по сравнению с БС). Существенных изменений со стороны дру-

. 4

гих органелл не наблюдалось.- Показана реципрокность нейрогли-альных отношений в разные фазы цикла бодрствование - сон, выявлена статистически достоверная ассиметрия в распределении ядер глиальных сателлитов по отношению к нейрону.

2. При действии экстремальных* факторов среды - гипербарической оксигенации и холодового воздействия получены данные об их. действии на энергопродуцирующую систему клетки, что нашло своё отражение в умеренном набухании митохондрий. Выявленное

- АО -

при этом изменение уровня активности "маркерного" митрхондри-ального фермента МАО (достоверное снижение в четыре раза в митохондриях и увеличение более чем в четыре раза в цитоплазме), указывает на изменение проницаемости мембран клеточных органелл. Кроме того, отмечено резкое уменьшение числа и размеров лизосом и дезорганизация элементов ЭПС, что может свидетельствовать о признаках деструктивных процессов, более выраженных при гиперб^рооксическом воздействии.

3. В результате адекватного воздействия на мышечный меха-норецепторный нейрон речного рака ( ЫНРР), растяжением рецеп-торной мышцы и апликацией тормозным медиатором ГАМК, выявлены модификации клеточных органелл, которые выражены в изменении размеров митохондрий (достоверное увеличение их площади на 18Z при 120 минутном возбуждении и на 30Z при 10 минутном торможении электрической активности по сравнению с контролем), в частности, появлении гигантских митохондрий (длиной около 15 мкм. ), степени их агрегированности (число межмитохондриальных контактов статистически достоверно увеличивается более чем в два раза при 120 минутном возбуждении и в три раза - при 10 минутном,торможении, по сравнению с контролем), изменении числи крист, просветлении матрикса, набухании и пролиферации цистерн и [санальцев ЗПР, массовом появлении уплощённых субповерхностных мембран, а также в расслоении цитоплазмы на "фибриляр-nue" и "гранулярные" зоны. Степень этих изменений зависела от интенсивности растяжения и длительности апликации тормозным медиатором ГАМК. '

На примере структурной перестройки энергообразуюших органелл клетки при действии адекватного фактора, возрастающэй си-

- 41 -

[ы, выявлен предел устойчивости этих структур.

4. Экстремальное воздействие на МНРР - непрерывное лазер-гае микрооблучение, характеризуется фазной реакцией клетки, соторая отражается в изменении электрической импульсной актив-гости (фаза увеличения частоты импульсации, фаза торможения и раза блокирования электрической активности), а также в опре-(елённой модификации энергообразующих органелл: резком увели-гении размеров митохондрий, просветлении матрикеа, трансФорма-ши крист, существенных изменений со стороны других органелл. з частности цитоскелета, отмечено не было.

5. Для решения вопроса о системном или прямом действии экстремального фактора на клеточные оргакеллы изучена ультрас-груктура клеток растений - организмов, не имеющих специализированных регулирухзщих систем (нейрогуморальных, нейроглиалышх я т. д.), а их энергообразующие оргаяеллы - обладают относительно высокой степенью автономности. Обнаружено, что при водно-солевого стрессе модифицируется мембрано-тилакоидная система пластид, это проявилось в изменении внутреннего строения мембранных комплексов и их пространственной реорганизации в строме пластиды. Отмечена схожесть принципа пространственной реорганизации энергообразующих органелл клеток растзний. с перестройками митохондрий, выявленными в нейроне.

6. В клетках организмов высокоорганизованных животных изменения клеточных органелл могут быть следствием, как системного, так и прямого действия фактора. Выявленные в процессе исследований меточные мишени воздействия экстремальных факторов внешней среды позволяют прогнозировать течение деструктивных процессов, а тагао направленно планировать тактику тера-

певтического действия при лечении различных клеточных патологий.

Список основных публикаций по теш диссертации.

1. Коган А. Б. , Машанский В. Ф., Федоренко Г. 11, . Загускин С. Л. Ультраструктура механорецепторного нейрона рака в состоянии покоя, ритмической импульсивной активности и торможения, вызванных адекватным раздраженней.: - Цитология, 1974, т. 16, N2, с. 150-154.

2. Машанский В. Ф., Загускин С. Л , Федоренко Г. VL Гистохимическое и электронномикроскопическое изучение нейронно-гли-альных отношений в' рецепторе растяжения речного рака. - Цитология, 1974, Т.16, N6, с. 77(^*72.

3. íeДоренко Г. М. О роли пространственных перестроек субклеточных структур нейрона при адекватном раздражении. Сб. Материалы Всесоюзной с международным участием конференци по ней-рокибернетике. Ростов-на-Дону, 1976, с. 52. • ,

4. Фельдман Г. А., Федоренко Г. Ы., Гусатинский Е R Изучение топографии и уровня синтеза белка в крупных, пирамидальных нейронах во время сна и бодрствования. - , Цитохогия. 1979, Т. 21, N4, с. 429-433.

5. Оельдман Г. А.. Федоренко Г. Ы., Гусатинский RE Синтез белков в крупных пирамидальных нейронах коры во время парадоксальной фазы сна. - Цитология, 1980,.т.22, N5, с.548-552.

6. Оедоренко Г. Ы., Увденский A. Б. Исследования ультраструктурных и цитохимических изменений в нейроне растяжения речного paiía при лазерном микрооблучении. В кн. "Применение методов и средств лазерной техники в биологии и медицине", Киев,'

- 43 -

Наукова .думка, 1981, с. 184-185.

7. Федоренко Г. Ы., Лященко и. И. Ультраструктура и некоторые биохимические показатели метаболизма летального хлорофиль-ного мутанта подсолнечника типа ALBINA. - Цитология и генетика, 1981, т. 15, N2, с. 51-57.

8. Белецкий КХ Д., Степанова JL Е , Федоренко Г. М. Влияние N-HHrpoaa-N-метил мочевины на ультраструктуры подсолнечника. -Цитология и генетика, 1981, т. 15, N6, с. 3-6.

9. Коган А. Б., Фельдман Г. JL , Федоренко Г. Ы., Гусатинский Е Е Об изменении количества рибосом в глии и нейронах коры мозга при развитии сна - ДАН СССР, 1981 т. 259, N4, с. 1009-1012.

10. Коган А. В., Федоренко Г. М., Гусатинский Е Е Об ультраструктурных показателях пластичности нейро-глиального комплекса - В сб.: Ультраструктура нейрона и фармакологические воздействия. - Дущино-на-Оке, 1981, с. 64-71.

11. Федоренко 1 Г. 14 , Фельдман Г. Л. , Бондаренко Е И. Устройство для биопсии мозговой ткани. Авторское свидетельство, 1982, N 71264. ,

12. Федоренко Г. М. Динамика ультраструктуры нейрона, как основа длр управления его функциональным состоянием. Материалы Всесоюзной конференции с международным участием по нейрокибер-нетике. Ростов-на-Дону, 1981, с. 53-54.

13. Гуськов Е. IL , Федоренко Г. М., Шкурат Т. Е Влияние ги-пероксии на ультраструктун/ корневой меристемы пшеницы. - Цитология. 1985, т. 27. N1, с. 94-97.

14. Федоренко Г. 11, Гусатинский ЕЕ, Фельдман Г. JL Количество рибосом сателитной глии 'и нейроглиальных отношений в

цикле бодрствовани&-сон. - Цитология,. 1983, т. 25, N3, с. 272-277.

15. Федоренко Г. М., Горошинская И. А. , Ходакова А. А. Исследование активности моноаминооксидазы и "ультраструктуры то-ловного мозга крыс при холодовом воздействии.- Нейрохимия, 1985, т. 4, N2, с. 134-140.

16. Кричевская А. А. , «едоренко Г. М., Горошинская И. А., Ходакова А. А. Активность моноаминооксидазы и ультраструктург головного мозга крыс при разных режимах гипероксии. - Нейрохимия, 1986, т. 5, N1, с. 737-744.

17. Федоренко Г. М., Узденский А. Б. Изменения ультраструктуры рецепторного нейрона растяжения речного рака при действш лазера - Цитология, 1986, т. 28, N5, с. 512-516.

18. Белецкий Ю. Д. , Федоренко Г. М. , Щербакова JL Б. , Разо-рителева Е. К Ядерная супрессия выражения пластидной мутации : подсолнечника. - ДАН СССР, 1976, т. 239, N36, с. 714-716.

19. Федоренко Г. Ы. , Белецкий К1 Д , Щербакова JL Б. Влияши водного дефицита на ультраструктуру пластид пластомного мутан та подсолнечника- типа chlorlna. - Цитология и генетика, 1988 Т. 22, Np, с. 53-557.

20. Федоренко Г. М. Интеграция ультраструктуры нервно клетки при ее возбуждении и торможении. Сб. Интерактивная дея тельность нервной системы. Москва, 1988, N18, с. 43-47.

21. Kogan А. В. .Feldman G. L., Gusatinski V. N. , Buriko Д. А. , Verbitsky Е. V. , Kondrateva L. A., Chigrinov О. А. Fedorenko G. М. Levels of cytochemical, neuronal and sistemati reseach in the neurobiology of sleep. - Neurobiology of sleep wakefulness cycle. Tbilisi. 1988. c. 373-390.

- 45 -

21. Щербакова Л. R . Белецкий Kl Д. , Федоренко Г. M. Уль-аструктура пластид пластомного мутанта подсолнечника, выра-нного в разных световых условиях. - Цитология и генетика. 89, Т. 23, N5, с. 59-61.

22. Федоренко Г. М., Каминский И. И., Гусатинский К Н. Уль-аструктурная организация нейрона при длительном воздействии диаторов. Количественный анализ- сб. Макро- и микроуровни ганизации мозга. Москва, 1990, вып. 19, с. 49-52.

23. lütypaT Т.П., Тимофеева И. В., Гуськов Е. П., Федоренко Ы. Реакция клеток костного мозга крыс на гипер-баро оксиги-щию - Цитология, 1991, т. 33. ,N5 с. 110.

24. Федоренко Г. М., Волжина Е Г. Структурно-функциональ-1Я перестройка нейронов головного мозга при адаптации и пере-:лаждении. Сб. Биохимические аспекты холодовой адаптации. фЬков, 1991, с. 50-57.

25. Федоренко Г. М. , Владимирский R11 Автоматизированная гстет анализа ультраструктурных характеристик функциоиально-) состояния растительных и животных клеток. Сб. Перспективные ¡формационные технологии в анализе изображений. Ташкент. )92. с. 22-23.

26. Федоренко Г. Ы., Каминский И. И., Гусатинский R II Воз-гдимость и ультраструктура нейрона при длительном действии гдиатора. Сб. Проблемы нейрокиберпетики. Рсстов-на-Лону, 392, с. 233-234.

27. Egorova Е. А., Dunin-Barkovskf V.L., Fr-dorenkc G. M patial reconctruction of the frog cerebellar network on the 3sis of elektron mJcroscop on ultra-thin slice. Symposium on suroinformatles and Neuroccrcputers. Postov-on- Den, v.l.

p. 64-70.

28. Федоренко Г. М., Щербакова JL Б. , Разорителева Е. I Исследование генетической природы и механизмов солеустойчивс ти у горчицы. - Генетика, 1994, т. 30, Пр. с. 163-164.

29. Fedorenko G. М., Gusatinsky V.N. Gigant mitohondria intracellular index of a cell adaption.- 4 World Congress adaption medicin. India, 1995, p. 18-19.

30. федоренко Г. Ы. , Щербакова JL Б. , Разорителева Е. I Карнаухова Т. Б. , Сизова JL И. Генетический и ультраструктур! анализ пестролистных форм, индуцированных N-нитрозо-N-метилк чевиной у горчицы. - Генетика, 1995, т. 31., N4, с. 504-509.

31. Федоренко Г. Ы. Ультраструктурные аспекты синаптиче кой регуляции функционального состояния механорецепторнс нейрона. Сб. Проблемы нейрокибернетики, Ростов-на-Дону, 19i с. 260-261.

32. Федоренко Г. М., Гусатинский В. Е Гигантские mhtoxoi рии- способ оптимизации энерготрат при адаптации к длительнс возбудительному или тормозному воздействию. Сб. Проблемы не рокибернетики. Ростов-на-Дону, 1995, с. 259-260.

33. Fedorenko G. М. , Gusat i nsky V. N. , Kaminskl I.I.', Kor rateva L. A., Korzak V. A. The lsolatet Neuron ultrastructi changie during a prolonged umpact mediatr. -Neuroreport, 1995, v. 6, N17, p. 2325-2332.

Подписано к печати 05.11.96. Формат 60x84/16. Печать офсетная. Бумага типографская. Объём 2,9 п. л. Тираж 100 экз. Тип 1ЩГИ. Зак.ЭЬ . . .