Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Морфофункциональная характеристика кардиомиоцитов крыс в норме и после воздействия этилового эфира диметилтрихлоргексеновой кислоты в различные периоды онтогенеза

ВОЕННО-МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

РГб ол

1 7 ОКТ ЬЪа

На правах рукописи

БАЛУЕВА ОЛЬГА БОРИСОВНА

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАРДИОМИОЦИТОВ КРЫС В НОРМЕ И ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ЭТИЛОВОГО ЭФИРА ДИМЕТИЛТРИХЛОРГЕКСЕНОВОЙ КИСЛОТЫ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ОНТОГЕНЕЗА

14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология

Автореферат

диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 1996

Работа выполнена в Самарском НИИ гигиены и в Военно-медицинской академии.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Р.К.Данилов

Научный консультант: кандидат медицинских наук, доцент Н.П.Карханин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В.Ф.Пучков доктор медицинских наук, профессор Н.В.Ямщиков

Ведущая организация - Институт клинической кардиологии им. АЛ.Мясникова КНЦ РАМН

Защита состоится" " г. в" "час

на заседании специализированном совета Д. 106.03.07. при Военно-медицинской академии (194175, Санкт-Петербург, ул.Лебедева, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии.

Автореферат разослан " 2 " о 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук, доцент

В.С.Сидорин

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Неуклошшй рост сердечно-:удистых заболеваний в связи со все возрастающей химической -рузкой на организм диктует необходимость дальнейшего губленного изучения нормального и патологически измененного окарда. Химические соединения, попадая в организм, могут зывать поражение миокарда не только у взрослых, но и оказывать >ицателыюе влияние на потомство. Частота пороков развития и юлевашш сердца в детском и юношеском возрасте достаточно шка. Однако в экспериментах, посвященных изучению эдиотоксических свойств новых соединений, недостаточно полно этывается роль возрастного фактора в формировании патологии шей сердца.

Гистогенез сердечной мышечной ткани и ее реактивные свойства условиях развития патологического процесса являются предметом да фундаментальных исследований ( Д.С.Саркисов и соавт., 70,1977,1987; П.П.Румянцев, 1982; В.Н. Швалев и соавт., 1992; ^.Семенова и соавт., 1985;Л.М. Непомнящих и соавт., 1986,1991). С мощью современных гистологических методов установлены известные ранее закономерности кардиального миогенеза, жтканевых взаимодействий, показана роль клеточной и утриклеточной регенерации в развитии компенсаторно -испособителышх процессов в сердечной мышечной ткани. Однако ц вопросов кардиомиогенеза требует дальнейшей разработки с учетом зрастных особенностей развития ткани в физиологических условиях, э необходимо для последующего изучения компенсаторно-испособителышх реакций в сердечной мышечной ткани при йствии факторов внешней среды, а также для понимания механизмов армирования врожденных пороков сердца.

В основу антенатальной охраны плода легла разработанная Г.Светловым (1978) теория критических периодов. Предполагается, э кроме двух общих для зародыша в целом критических периодов, [цесгвуют частные критические периоды наибольшей вствительности органов и тканей к повреждающим факторам среды. )этому актуальна дальнейшая разработка вопросов нормального стогенеза, физиологической и репаративной регенерации сердечной ■пиечной ткани в возрастном аспекте (А.Г.Кнорре, 1977; А.А.Клишов, 84). Здесь дискуссионными остаются вопросы о динамике и сроках липлоидизации кардиомиоцитов (КМЦ) и их ядер (В.Я.Бродский и авт., 1989, 1992; Г.В.Селиванова и соавт., 1990; Е.Л.Ерохина и соавт., 91)., а также программированной клеточной

гибсли (Н.В.Ямщиков, 1985, 1991). Отсутствует анализ динамики процессов пролиферации и дифференциации популяций одно- и многоядерных сердечных мышечных клеток в онтогенезе. Мало работ, посвященных изучению динамики программированной клеточной гибели кардиомиоцитов в различные периоды жизни крыс.

Решение этих вопросов необходимо не только для понимания хода нормальною гистогенеза, но и для последующего изучения на их основе реактивности и регенерации сердечной мышечной ткани при действи и различных факторов, в частности химических антропогенных загрязшггелей. Среди последних особое место занимают пестициды и полупродукты их синтеза в силу своего широкого распространения. Единичные исследования реакций кардиомиоцитов крыс после интоксикации пестицидами и солями металлов в различные периоды гистогенеза носят описательный характер, а отсутствие комплексных исследований в ближайшие и отдаленные сроки после воздействия не дает возможность количественно оценить динамику реактивных изменений в сердечной мышечной ткани.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - выявить морфофункциональные изменения, процессы пролиферации, дифференциации и клеточной гибели в сердечной мышечной ткани в норме и после воздействия этилового эфира диметилгрихлоргексеновой кислоты (ЭДТГ) в различные периоды онтогенеза крыс.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Провести сравнительный морфологический анализ дифференцировки изолированных кардиомиоцитов в нормальном и экспериментально измененном гистогенезе сердечной мышечной ткани.

2. Охарактеризовать соотношение процессов пролиферации, дифренциации и клеточной гибели кардиомиоцитов в норме и после действия ЭДТГ в эмбриогенезе у крыс.

3. Установить особенности процессов пролиферации, дифференциации и гибели кардиомиоцитов после действия ЭДТГ в раннем постнатальном онтогенезе крыс.

4. Выявить морфофункциональные изменения и процессы внутриклеточной регенерации кардиомиоцитов в условиях хронического воздействия ЭДТГ на организм половозрелых животных.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые на основании комплексного применения методов щелочной диссоциации клеток, морфометрии,

щтофотометрии и авторадиографии проведен сравнительный анализ .горфофункциональных свойств КМЦ двух популяций (одно- и свуядерных), выявлено соотношение процессов пролиферации, [ифференцировки и клеточной гибели в сердечной мышечной ткани в »мбриогенезе и постнатальном онтогенезе крыс.

Впервые установлены особенности проявления основных троцессов гистогенеза сердечной мышечной ткани при действии симического фактора (ЭДТГ - полупродукта синтеза пестицида терметрина) в эмбриональном и раннем постнатальном развитии крыс. Лроведен сравнительный морфологический анализ этапов гистогенеза сердечной мышечной ткани, соотношения процессов пролиферации, шфференцировки и клеточной гибели в норме и после воздействия ЭДТГ на крыс.

Впервые изучены структурные основы кардиотоксических :войств ЭДТГ, охарактеризованы процессы внутриклеточной эегенерации в условиях хронического воздействия на организм тодопытных животных ЭДТГ и сопоставлены реактивные изменения КМЦ в восстановительных периодах.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. В нормальном гистогенезе сердечной мышечной ткани крыс выделяются гистогенетические фазы, каждая из которых <аракгеризуется определенным соотношением базисных процессов -пролиферации, дифференциации и клеточной гибели. Это необходимо /читывать при оценке возрастных свойств сердечной мышечной ткани в условиях действия на организм факторов среды.

2. Воздействие химического соединения ЭДТГ в эмбриональном и раннем постнатальном онтогенезе ведет к нарушению оптимального соотношения основных процессов гистогенеза. Это отражается на морфофункциональных свойствах и диапазоне компенсаторно-приспособительных реакций миоцитов сердечной мышечной ткани. В этой связи ранний постнатальный кардиомиогенез выделяется как гистогенетическая фаза повышенной чувствительности сердечной мышечной ткани к действию факторов внешней среды.

3. Хроническое воздействие ЭДТГ на взрослых крыс приводит к развитию изменений, в основе которых лежит нарушение процессов внутриклеточной регенерации. При этом не наблюдается восстановления утраченных контрактильных элементов в полном объеме, что ведет к нарушению основной функции кардиомиоцитов -сократительной.

4. Особенности соотношения клеточной и внутриклеточной форм регенерации в сердечной мышечной ткани зависят от того, в каком возрастном периоде осуществлялось воздействие ЭДТГ на организм животного. При действии в эмбриогенезе и раннем постнатальном онтогенезе регенерация протекает как на основе изменений соотношения базисных процессов гистогенеза сердечной мышечной ткани, так и морфофункциональных свойств КМЦ. После воздействия ЭДТГ на взрослых животных имеют место только процессы внутриклеточной регенерации органелл КМЦ.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Установлены особенности соотношения процессов пролиферации, дифференциации и клеточной гибели популяций одно- и двуядерных КМЦ в онтогенезе и на этой основе выделены гистогенетические фазы кардиомиогенеза крыс. Нарушение соотношения базисных процессов гистогенеза в эмбриональном и раннем постнатальном онтогенезе лежит в основе формирования повышенной чувствительности сердечной мышечной ткани к факторам среды. Показаны возрастные особенности соотношения внутриклеточной и клеточной форм регенерации в экспериментально измененных условиях развития сердечной мышечной ткани. Установлены структурные основы кардиотоксического действия ЭДТГ и изучены особенности внутриклеточной регенерации в условиях хронического эксперимента. Сопоставлены реактивные изменения КМЦ в восстановительном периоде после действия ЭДТГ в эмбриональном и постнатальном онтогенезе крыс.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.На основании результатов работы был утвержден норматив ПДК ЭДТГ в воздухе рабочей зоны с учетом кардиовазотоксического действия. Результаты работы являются основанием для проведения ускоренного нормирования новых химических соединений, обладающих кардиотоксическими свойствами на эмбрионах и крысах раннего постнатального возраста. Полученные данные целесообразно учитывать в процессе преподавания разделов гистологии мышечных тканей, эмбриологии и профпатологии в соответствующих курсах учебных заведений. Использование результатов изучения ближайших и отдаленных последствий воздействия ЭДТГ в различные периоды онтогенеза позволило разработать мероприятия по профилактике профессиональных заболеваний и антенатальной охране плода.

АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ. Материалы диссертации изложены и обсуждены на областных научных

конференциях молодых ученых и специалистов (Куйбышев, 1988, 1990), на областном межотраслевом научно-техническом семинаре 'Экология-90" (Куйбышев, 1990), на Всесоюзной научно-практической конференции по морфометрии и математическому моделированию (Харьков, 1990), на Всесоюзной научной конференции по охране экружающей среды (Москва, 1991), на научной конференции НИЦ Самарского медицинского института (Самара, 1993), на научной конференции "Гистогенез и регенерация тканей " (С-Петербург, 1995). В целом материлы диссертации апробированы на совместном заседании кафедр гистологии, нормальной анатомия, патологической анатомии и НИЛ электронной микроскопии и гистохимии ВМА (С-Петербург, 1995) и на заседании Ученого Совета Самарского НИИ гигиены (Самара, 1995).

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. Основные результаты диссертации опубликованы в 9 печатных работах.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (3 подглавы) , главы "Материалы и методы" (2 подглавы), результатов собственных исследований (3 главы по 3 подглавы в каждой), обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 173 источника, из которых 106 отечественных. Работа иллюстрирована 22 габлицами, 35 рисунками, которые включают 16 электронограмм, 14 микрофотографий, 10 гистограмм, 8 графиков.

ВНЕДРЕНИЕ. На основании результатов работы установлен норматив ПДК ЭДТГ в воздухе рабочей зоны на уровне 2 мг/м3 . Материалы работы использованы в 2-х НИР Самарского НИИ гигиены (номера государственной регистрации: N 018700400, N 01780027908),а гак же в 2-х разделах к проекту информационного письма " Методы диагностики повреждения и регенерации органов сердечно-сосудистой и других систем для гигиенических регламентов химических веществ ". Материалы работы используются при чтении лекций по курсу гистологии и эмбриологии Военно-медшданской академии в разделе "Гистология мышечных тканей".

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

В работе исследовали миокард левого желудочка чистых линий белых беспородных крыс различного возраста и эмбрионов крыс на разных этапах эмбриогенеза, материал от 156 животных анализировался несколькими методами (табл. 1).

Перед проведением эксперимента решались задачи изучения нормального гистогенеза миокарда. Для этого получали датированную беременность у крыс. Миокард левого желудочка от 3-х эмбрионов каждой возрастной стадии развития фиксировали в 10% растворе забуференного формалина (рН = 7,4). Перед фиксацией определяли вес животного, массу миокарда, производили разделение камер сердца по методу А.М.Лифшица (1979). Аналогично обрабатывали материал, полученный от крысят и крыс разного возраста (табл.1). Сроки взятия материала рассчитывали по методу естественной периодизации процессов (Г.С.Катинас, В.Л. Быков, 1976 ).

Для приготовления препаратов использовали метод щелочной диссоциации 37% раствором КОН (Л.Н.Белов, Т.Е.Коган, ТА.Леонтьева, 1975). Мазки изолированных КМЦ окрашивали гематоксилин-эозином и подсчитывали индексы митозов (МИ) и гибнущих КМЦ (ИГК), количество одно-, двух- и много ядерных КМЦ, определяли их процентное отношение; измеряли размеры ядра и КМЦ методом наложения квадратов. Площадь ядер и площадь одоядерных миоцитов рассчитывали по формуле элипсоида вращения, площадь двуядерных миоцитов - по формуле прямоугольника. Затем вычисляли ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО).

Для авгорадиографического исследования синтеза ДНК беременным крысам и крысятам вводили 3Н-тимидин в дозе 1 мкКи/г массы. Материал брали через один час после инъекции изотопа. Высушенные мазки изолированных КМЦ, предварительно окрашенные гематоксилин-эозином, покрывали фотоэмульсией типа ПР-2. Автографы экспонировали в течение 4-х недель при температуре 4°С, затем проявляли в амидоловом проявителе. Индекс меченых ядер (ИМЯ) подсчитывали для одноядерной популяции КМЦ, а также общий для всех видов КМЦ.

Определение ДНК в ядрах и суммарного белка в цитоплазме проводили вдггофотометрически в одном и том же кардиомиоците точечным методом (Л.С.Агроскин,Г.В.Папаян,1977). Препараты изолированных КМЦ окрашивали по методу Фельгена в модификации де Томази (Э.Пирс,1962), после чего докрашивали амидочерным 10 В. Фотометрировали не менее 50-100 клеток при длине волны 546 нм для ДНК и 620 нм для белка, диаметр зонда составлял 1,5 мкм. Контролем плоидности служили модальные классы ДНК двуядерных КМЦ на тех же мазках.

В серии 1а модельного эксперимента беременных самок подвергали внутрижелудочной затравке ЭДТГ в течение 21 сут в дозе

Таблица 1

Характеристика материала и методов исследования нормального и экспериментально измененною кардиомиогенеза у крыс

№ п/п Объекты Методы исследования Возраст Число особей

1 2 3 4 5

1 Крысы различного возраста, эмбрионы крыс Метод щелочной диссоциации Норма (13, 16, 19, 21 сут эмбр.; 1,3,5,7,10,15,20,30 сут п/эмбр.; 6,12 мес) Серия 1а (3,10 сут п/эмбр.) Серия 16 (10,15,20 сут п/эмбр.) 102

2 Крысы различного возраста, эмбрионы крыс Радиоавтогра фия ДНК с 3Н-тимиди-ном Норма (13,16,19,21 сут эмбр.; 1,3,5,7,10,15,20,30 сут п/эмбр.) Серия 1а (3,10 сут п/эмбр.) Серия 16 (10,15,20 сут п/эмбр.) 66

3 Крысы различного возраста, эмбриоиы крыс Цитофото-метрия суммарного белка и ДНК-фуксина в одном КМЦ Норма (16,19,21 сут эмбр.; 3,10,15,20,30 сут п/эмбр.; 6,12 мес) Серия 1а (3,10 сут п/эмбр.) Серия 16 (10,15,20 сут п/эмбр.) 66

4 Крысы различного возраста, эмбрионы крыс Гематокси-лин-зозин Норма (13,16,19,21 сут эмбр.; 1,3,5,7,10,15,20,30 сут п/эмбр.) Серия 1а (3,10 сут п/эмбр.) Серия 16 (10,15,20 сут п/эмбр.) 66

5 Крысы Гематокси-лин-пикро-фуксин Серия II (15 мес) 12

6 Крысы различного возраста Цитофото-метрия РНК Серия II (8,9,15 мес) 36

Продолжение таблицы 1

1 2 3 4 5

7 Крысы различного возраста Люминис- центная микроскопия суммарного белка Серия II (8,9,15 мес) 36

8 Крысы различного возраста Люминис-центная микроскопия гликогена Серия II (8,9,15 мес) 36

9 Крысы различного возраста Электронная микроскопия Серия 16 (15.30 сут 12 мес) 18

10 Крысы различного возраста Электронная микроскопия со стереометрией Серия II (2 нед, 8,9,15 мес) 48

11 Крысы Метод Норма 102

различного наложения Серия 1а

возраста, эмбрионы квадратов Серия 16

крыс

12 Крысы Метод точечной волюметрии Серия II (15 мес) 12

13 Крысы различного возраста Метод многолучевой интерференции Серия II (8,9,15 мес) 108

3,3 мт/кг (максимально недействующая доза - МНД). Миокард крысят через 3 и 10 сут после рождения подвергали такой же обработке и изучали те же показатели, что и при исследовании нормального гистогенеза.

В серии 16 осуществляли пероральную затравку интактных крысят с 3-х по 10-е сутки постнатального развития в той же дозе. Схема обработки ткани и изученные показатели аналогичны серии 1а Взятие материала производилось на 10, 15 и 20 сут после рождения. Дополнительно исследовали КМЦ на ультраструктурном уровне в

отдельные сроки через 5,20 сут и 12 мес после прекращения воздействия. Для этого миокард левого желудочка фиксировали в 4% глютаровом альдегиде и постфиксировали в 1% 0s04, обрабатывали по общепринятой схеме и заливали в эпон. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Reynolds (Б.Уикли, 1975). Просмотр и фотосъемка срезов выполнены на электрошшх микроскопах ЭВМ 100 АК при увеличении 10000 - 19000 и Хигачи-300 при увеличении 7000 - 10000.

В серии II проводили изучение миокарда взрослых животных через 2 нед и 4 мес хронического эксперимента, и через 1 и 7 мес после его окончания. Половозрелых крыс-самцов начальной массой 200г подвергали ежедневной ингаляционной затравке ЭДТГ в концентрации 74 мг/м3 в течение 4-х месяцев по 4 ч 5 сут в неделю. Контрольные группы животных соответствующего возраста подвергали всем перечисленным манипуляциям, но пары ЭДТГ в подаваемом в камеру воздухе отсутствовали. Миокард левого желудочка подвергали обработке для электронно-микроскопических исследований по схеме, описаной выше. С помощью открытой тестовой системы Вайбеля на элекгронограммах кардиомиоцитов определяли основные сгереологические параметры клетки.

Гистохимическое определение суммарного белка, гликогена и РНК в цитоплазме КМЦ выполнено на парафиновых срезах после фиксации в фиксаторах Бродского и Карнуа с использованием люминесцентного микроскопа "Люмам" и цитоспектрофотометра -флюориметра. Толщину препаратов определяли методом многолучевой интерференции (Р.К.Данилов,1980).

Для определения содержания суммарного белка в цитоплазме кардиомиоцита использовали вариант флюоресцентной окраски белков 0,01 мМ раствором примулина на фосфатно-цитратном буфере (рН = 5,3).

Гликоген выявляли флюоресцентным методом с помощью 0,45% раствора аурамина с добавлением хлористого тионила (контрольные препараты обрабатывались амилазой слюны).

РНК исследовали после обработки препаратов по Эйнарсону. Цитофотометрию вели сканирующим методом при длине волн 546 нм (контрольные препараты для извлечения РНК обрабатывали 5% хлористой кислотой при 60°С в течение 30 мин).

На срезах, окрашенных гематоксилин-пикрофуксином, окулярной линейкой измеряли диаметры мышечных волокон, методом точечной волюметрии определяли относительное содержание

коллагеновых волокон и основного вещества соединительной ткани в стенке левого желудочка.

Статистическую обработку осуществляли с помощью ЭВМ Ргауйг и программы 81а1^арЬ. Достоверность различий в сериях I и II устанавливали по критериям Стьюдента , Колмогорова-Смирнова, Вилкоксона-Манна-Уитни, по методу углового преобразования Фишера, (Л.Закс, 1976; Е.В.Гублер,1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В нормальном кардиомиогенезе происходит последовательная смена базисных процессов в течение короткого промежутка времени. По соотношению процессов пролиферации, дифференциации и клеточной гибели с учетом морфологических видов КМЦ в гистогенезе сердечной мышечной ткани крыс можно выделить три фазы.

Первая фаза (до 3-х суток после рождения) характеризуется преобладанием процессов пролиферации: репродукция клеток и нарастание клеточной массы происходит за счет митозов одноядерных миоцитов, составляющих основной дифферон незрелой мышечной ткани срдца. Здесь регистрируются высокие индексы меченных изотопом ядер и митозов КМЦ наряду с высоким показателем гибели миоцитов (рис.1). Содержание белка в цитоплазме миоцитов низкое. Сердечная мышечная ткань крыс до 19-х суток эмбриогенеза представлена исключительно одноядерными КМЦ. С 19-х суток возникают ацито кинетические митозы, в результате которых образуются первые двуядерные миоцигы (табл.2). Этот срок определяется как начало формирования популяции двуядерных миоцитов и полиплоидизации клеток сердечной мышечной ткани.

Вторая гистогенетическая фаза рагистрируется с 3-х по 10-е сутки постнатального развития крыс и характеризуется кратковременными остроконкурентными отношениями между процессами пролиферации и дифференциации в мышечной ткани сердца. С одной стороны, наблюдается повторная активация пролиферации одноядерных КМЦ, проявляющаяся в увеличении индекса пролиферации и числа митотически делящихся одноядерных КМЦ (рис.1), с другой стороны, нарастающая дифференцировка одноядерных миоцитов приводит к накоплению суммарного белка цитоплазмы (рис.2). Результатом повторного усиления пролиферации одноядерных КМЦ на фоне продолжающейся дифференцировки является увеличение численности популяции двуядерных клеток.

Рис.1 Изменение индекса первично меченных 3Н-тимидином ядер (ИМЯ), миготического индекса (МИ) и индекса гибели изолированных одноядерных КМЦ (ИГК) в нормальном гистогенезе сердечной мышечной ткани крыс. По оси абсцисс: сроки эмбрионального (13, 16, 19, 21 сут) и постэмбрионального (1, 3, 5, 7, 10, 15, 20 сут) развития. По оси ординат: ИГК в % х 10"2 , МИ в % х 10~2 х 2, ИМЯ в %х10"' .

Клеточная гибель волнообразно изменяется параллельно с колебаниями индекса пролиферации (рис.1). Гетероморфия КМЦ возрастает. Фаза осгоконкурентнах отношений между пролиферацией и дифференциацией, морфологически сопровождающаяся повышением уровня гетероморфии и клеточной гибели, определяется как гистогенетическая фаза повышенной чувствительности, или частный критический период гистогенеза сердечной мышечной ткани в соответствии с теорией критических периодов (П.Г.Светлов, 1977).

С 10-х суток постнатального развития крыс ведущим поцессом в кардиомиогенезе становится дифференциация, что проявляется в увеличении размеров КМЦ, оптической плотности белка и суммарного белка цитоплазмы, уменьшении ЯЦО (рис.2). Пролиферация основной популяции КМЦ завершается к концу 3-ей недели , что сопровождается уменьшением миготического индекса,ИМЯ

Таблица 2

Динамика соотношения популяции сердечных мышечных клеток в нормальном и экспериментально измененном кардиомиогенезе крыс X ± Бх . Числитель - доля одноядерных КМЦ (%), знаменатель - доля двуядерных КМЦ в %.

Воз - Эмбриогенез, сут Постнатальный онтогенез, сут

раст 19 21 1 3 5 7 10 15 20 30

99,9±3.6 99,4±2,6 93,3±3,4 91.3±2,0 68,912.3 37,913,1 11,711,9 3,5Ю,5 2.6Ю.1 2,510,1

порма 0,1010,001 0,6010,01 6,710,6 8,710,4 31,111,0 62,110,6 88,311,1 96,512,0 97,411,4 97,511,2

С с Р К 92.013.6 9,010,4 11.511.2 88,513,2

и я 1а О 78.012.4*' 22,011,0" 5.0±0,5* 95,013,4

С е Р к 13,011,2 87,0±2,0 3,010,1 97,0±2,2 2,710,1 97,313,5

и я 16 О 28.012,0* 72,0±1,6* 19,011,2" 81,0+2,0' 7,010,2* 93,012,8

ПРИМЕЧАНИЕ: К - контроль, О - опыт ; достоверные изменения по критерию Фишера (*-Р<0,05; **-Р<0,01).

19 21

3 10 15

зо 6 12

Рис 2. Изменение морфофункциональных показателей изолированных одно- и двуядерных КМЦ в нормальном гистогенезе сердечной мышечной ткани. I - по оси абсцисс : сроки эмбриональною (16, 19, 21 сут) и лостэбрионального (3, 10, 15 сут) развития; По оси эрдинат : 8 - площадь одноядерных КМЦ, мкм2 х10; О - оптическая плотность белка,1 отн.ед.х10"3 ; А - содержание суммарного белка в КМЦ, отн.ед.х10" . II - по оси абсцисс : сроки эмбрионального ( 19 сут ) и постэбрионального (3, 10, 15, 20, 30 сут; 6, 12 мес ) развития. По оси эрдинат : А - содержание суммарного белка в двуядерных КМЦ, этн.ед.х10

и ИГК (рис.1). У 30-суточных крыс фигуры митоза и апоптоза не регистрируются.

После воздействия ЭДТГ в эмбриогенезе наблюдается увеличение пролиферативной активности ( ИМЯ и числа митозов, рис.3), числа одноядерных КМЦ с большой величиной оптической плотности белка и содержанием белка в цитоплазме, что является первой реакцией на внутриклеточном и клеточном структурном уровнях в ответ на действие экстремальных факторов среды ( Д. С. Саркисов, 1987; И.Ф.Ибрагимо-ва,1994 ). Возростает гетероморфия КМЦ по площади, оптической плотности белка цитоплазмы и содержанию белка В результате активации клеточной и внутриклеточной форм регенерации в популяции одноядерных КМЦ изменяется соотношение одно- и двуядерных клеток в пользу последних : у подопытных животных раньше, чем у контрольных, формируется популяция двуядерных КМЦ. Численность двуядерных клеток, их площадь и содержание белка к 3-м суткам превышают аналогичные показатели параллельного контроля (табл.2). Имеет место смещение гистогенетических фаз, характерных для нормального кардиомиогенеза, на более ранний срок, что можно расценивать, как проявление регенераторной реакции на тканевом уровне в ответ на действие ЭДТГ в эмбриогенезе (Р.К.Данилов и соавт., 1993). Однако более раннее формирование популяции двуядерных КМЦ ведет в последующем к нарушению их вдггодифференировки, проявляющейся к 10-м суткам в снижении таких показателей как оптическая плотность белка цитоплазмы и суммарное содержание белка (рис.4).

При действии ЭДТГ с 3-х по 10-е сутки после рождения соотношение базисных процессов (пролиферации, дифференциации и клеточной гибели) сохраняется, смещаясь во времени; темп формирования популяции двуядерных КМЦ замедлен (А.А.Клишов,1984; Д.Е.Семенов и совт. 1994 ). Так, к 10-м суткам наблюдается незначительное увеличение количества суммарного белка цитоплазмы одноядерных КМЦ. Индексы митозов и меченных 3Н-тимидином ядер невысокие, что говорит о более низкой пролиферативной активности в сердечной мышечной ткани у подопытных животных (рис.3). Результатом изменения соотношения клеточной и внутриклеточной форм регенерации в сердечной мышечной ткани явилось уменьшение доли двуядерных клеток (табл.2) и нарушение их цитодифференцировки (уменьшение площади, оптической плотности белка и содержания суммарного белка цитоплазмы) (рис.4).

Рис.З Изменение индекса первично меченных 3Н-тимидином дер (ИМЯ), митотического индекса (МИ) и индекса гибели (ИГК) колированных одноядерных КМЦ : I - после воздействия ЭДТГ в эмбриогенезе крыс. II - после воздействия ЭДТГ с 3 по 10 сут юстэмбрионального гистогенеза крыс. По оси абсцисс: возраст крыс в ;ут. По оси ординат: I - ИГК в % хЮ"2, МИ в % хЮ"1 , ИМЯ в %. I - ИГК в % хЮ"2 , МИ в % хЮ"1, ИМЯ в % : 3.

—

■ II

1 □ вк

1

1 □ Ак

1 ШАо

10 15

Рис.4 Изменение площади (5) и содержания суммарного белка (А) двуядерных КМЦ: 1-после воздействия ЭДТГ в эмбриогенезе. II-после воздействия ЭДТГ с 3 по 10 сут постэмбрионального гистогенеза. По оси абсцисс: возраст крыс, сут. По оси ординат: 8к-площадь КМЦ контрольной группы, мкм2;8о-шющадь КМЦ подопытной группы, мкм2;Ак-содержание суммарного белка в КМЦ контрольной группы,отн.ед.х10~1;Ао-содержание суммарного белка в КМЦ подопытной группы , отн.ед.х10"1. Столбики гистограмм: 1 - Бк, 2 - 8о; 3-Ак,4-Ао.

Через 5 дней восстановительного периода процессы гугрикл сточной регенерации одноядерных КМЦ начинают нарастать, го проявляется увеличением содержания суммарного белка и площади иоцитов. В популяции возрастает доля клеток большой площади и с элыпим содержанием белка. Регистрируется значительное повышение :МЯ и МИ как проявление клеточной формы регенерации, в гзультаге чего количество двуядерных клеток увеличивается по эавнению с 10-ми сутками, но оно все еще не достигает уровня щовозрастного контроля. В последних вторая волна пролиферации жанчивается и численность двуядерпых миоцитов достигает уровня (гфшпггивной сердечной мышечной ткани (табл.2).

Одноядерные КМЦ являются исходной морфологической ормой для двуядерпых миоцитов. И те, и другие подвергаются гйствию ЭДТГ с 3-х по 10-е сутки после рождения. Однако процессы гутриклсточной регенерации в развивающихся двуядерпых КМЦ иражены слабо: популяция отстает по количественным и ачественным показателям от контрольного уровня. Содержание дшарного белка, оптическая плотность и площадь двуядерпых КМЦ еньше (рис.4). Индекс гибели миоцитов попрежнему выше энтрольного. Следовательно, двуядерные миоциты, возникшие в гзультате нарушения темпа цитодифференцировки одноядерных ардиомиоцитов, характеризуются снижением внутриклеточных ^генераторных потенций.

Через 10 суток восстановительного периода в сердечной ышечной ткани регистрируется незначительный уровень клеточной збели. Показатели цитодифференцировки одноядерных миоцитов штическая плотность белка и суммарное содержание белка итоплазмы) снижаются, что можно расценить как нарушение ¡гутрикл сточных регенераторных процессов. Пролиферативная ктивность по показателям ИМЯ и МИ хотя и уменьшается по равнению с предыдущим сроком, но остается на более высоком уровне ри сравнении с контролем. Численность двуядерных КМЦ величивается. Однако, несмотря на рост двуядерных миоцитов по равнению с предыдущим сроком, накопление белков цитоплазмы идет едленно. Показатели оптической плотности белка, суммарного белка площади КМЦ ниже одновозрасгного контроля (рис.4), а ядерно-итополазматическое отношение выше, что свидетельствует о арушении дифференцировки двуядерных КМЦ. По-видимому, это вязано со спецификой кардиотоксического действия ЭДТГ, так как в гдаленном периоде после воздействия (через 1 год) в КМЦ

обнаружены ультрасгруктурные изменения ( Н.Н.Сарбаева и соавгг., 1993).

В результате анализа данных эксперимента показано, что реакция на тканевом уровне проявляется в виде смещения во времени второй гисгогенетической фазы. При этом нарушается оптимальное соотношение процессов пролиферации, дифференциации и клеточной гибели, что лежит в основе развития ткани по патологическому типу.

Это подтверждает вывод о том, что период с 3-х по 10-е сутки посгнатального развития крыс является гисгогенетической фазой повышенной чувствительности к действию факторов внешней среды, или частным критическим периодом развития сердечной мышечной ткани (П.Г.Светлов,1978; ХА^о&т, 1987; 8.Е.Ка1г ег а1., 1988).

В эксперименте четко проявились свойства одно- и двуядерных КМЦ. Одноядерные миоциты - наименее дифференцированные в постнатальном гистогенезе, выступают как камбиальная часть развивающейся сердечной мышечной ткани, ответственная за клеточную форму регенерации, что согласуется с теорией камбиальности тканей А.А.Заварзина (А.А.Клишов,1984). Тогда как двуядерные КМЦ - это специализированная на сократительной функции часть миокарда и в данных клетках регенераторные реакции проявляются на внутриклеточном уровне. Развивающиеся двуядерные миоциты наиболее чувствительны к повреждающему фактору среды, так как преимущества полиплоидии еще не успели проявиться.

Таким образом, в экспериментально измененном гистогенезе происходит смещение во времени соотношения базисных процессов, I результате чего не реализуются адекватно условиям механизмы клеточной и внутриклеточной форм регенерации. Первой реакцией незрелой мышечной ткани при действии ЭДТГ в эмбриогенезе является увеличение пролиферативной активности и внутриклеточной регенерации одноядерных КМЦ (камбиальной части ткани).

В хроническом эксперименте по воздействию ЭДТГ на половозрелых крыс наиболее чувствительными структурами КМЦ через две недели опыта оказываются митохондрии. Лизис миофибрилл наблюдается лишь в отдельных клетках (В. С. Пауков, В.А.Фролов, 1982). Увеличивается количество липидных включений.

К концу 4-го месяца со стороны митохондриальногс компартмента клетки наблюдается тенденция к повышение функциональной активности. Это свидетельствует об активации внутриклеточной регенераторной реакции. Вместе с тем, сократительный аппарат находится в различной степени повреждения,

:о проявляется в снижении суммарного белка цитоплазмы

0.Г.Целлариус и соавт.,1985, Л.М.Непомнящих и соавт., 1989).

Через 1 мес восстановительного периода объемная плотность

иофибрилл осталется по-прежнему низкой, хотя в отдельных клетках гмечаются признаки регенераторной реакции в виде скопления *босом, полисом и новообразования филаменгов. Высокие значения деленной, поверхностной и объемной плотности митохондрий -фактерная особенность реактивных изменений органелл в сердечных ышечных клетках после эксперимента Через 7 мес продолжается »рушение митохондрий, а к лизисным повреждениям миофибрилл отсоединяются конграктурные. Выявляется атрофия части КМЦ и эмпенсаторная гипертрофия других КМЦ. Однако как в период «действия ЭДТГ, так и в отдаленные сроки после прекращения ссперимента установлено стойкое и, по-видимому, необратимое гижение объемной плотности конграктильных элементов в КМЦ эдопытных животных. Все это является результатом нарушения роцесса внутриклеточной репаративной регенерации, что лежит в люве развития сократительной недостаточности миокарда

1.A.Семенова и соавт., 1985).

ВЫВОДЫ:

1. В нормальном кардиомиогенезе формируются кяогенетические фазы, каждая из которых характеризуется тределенным соотношением процессов пролиферации, 1фференциации и клеточной гибели кардиомиоцитов. Установленное ы каждой фазы соотношение базисных процессов гистогенеза следует нтгывать при оценке возрастных реактивных изменений сердечной ышечной ткани в условиях действия на организм экстремальных акторов среды.

2. В эмбриогенезе у крыс в сердечной мышечной ткани реобладают процессы пролиферации за счет митозов одноядерных иоцигов. Первые ацито кинетические митозы кардиомиоцитов эзникают в конце эмбриогенеза С 3-х суток постнатального развития эыс в сердечной мышечной ткани возрастают индекс пролиферации цюядерных миоцитов и гетероморфия тканевых элементов. С 10-х ток развития индекс пролиферации миоцитов снижается, и сердечная ышечная ткань состоит преимущественно из двуядерных миоцитов, в эторых происходит накопление сократительных белков.

3. В сердечной мышечной ткани дифференцировка морфологически различных видов миоцитов протекает по-разному: в одноядерных миоцитах содержание белков цитогшазмы возрастает в 2 раза; в двуядерных миоцитах содержание белков в течение года возрастает в 21 раз по сравнению с первоначальным показателем. Популяция одноядерных миоцитов является камбиальной частью дифференцирующейся сердечной мышечной ткани.

4. Программированная клеточная гибель является составной частью нормального кардиомиогенеза у крыс. Индекс клеточной гибели изменяется волнообразно, и постепенно уменьшается параллельно с уменьшением индекса пролиферации кардиомиоцитов. Кардиомиогенез с 3-х по 10-е сутки развития крыс по комплексу основных процессов характеризуется как гисгогенетическая фаза, в течение которой формируются основные механизмы физиологической регенерации ткани.

5. При использовании модели воздействия ЭДТГ на крыс различного возраста выявлено, что в основе нарушений гистогенеза сердечной мышечной ткани лежат изменения базисных процессов и морфофункциональных показателей КМЦ, характерных для физиологических шсгогенетических фаз. При действии фактора в эмбриогенезе изменяется нормальное соотношение одно- и двуядерных КМЦ в пользу последних. В них нарушается внутриклеточная регенерация. Одноядерные миоцигы составляют основу клеточной регенерации в дифференцирующейся сердечной мышечной ткани.

6. При действии фактора в раннем постнатальном развитии крыс в мышечной ткани уменьшается гетероморфия и замедляется дифференцировка одноядерных КМЦ в двуядерные. Индексы пролиферации и гибели миоцитов превышают контрольные. В двуядерных КМЦ снижаются цитохимические показатели, характеризующие их дифференцировку по сравнению с одновозрасгным контролем. Двуядерные КМЦ - наименее устойчивая к действию фактора развивающаяся популяция сердечной мышечной ткани крыс.

7. При длительном воздействии ЭДТГ на половозрелых крыс возникают нарушения ультраструктуры миофибрилл, митохондрий у увеличивается количество липидных включений в КМЦ. Размерь: миоцитов уменьшаются, содержание сократительных белког цитоплазмы снижается. В ближайшем восстановительном периоде регенерация проявляется внутриклеточно в виде гиперплазщ-

итохондрий, но сократительный аппарат КМЦ полностью не эсстанавливается. В отдаленном периоде полной регенерации пьтраструктур КМЦ также не происходит, что является проявлением ардиотоксического действия вещества

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Ультраструктурные изменения кардиомиоцитов крыс при ействии ЭДТГ // Обл. научн.-технич. конференц. " Актуальные роблемы молодых ученых и специалистов в организации научно-гхнического творчества молодежи": Тез. докл.- Кубышев, 1988. - С.61-2. (соавторы: Н.Н.Сарбаева)

2. К вопросу о механизме биологического действия ЭДТГ // Обл. [ежотраслевой научно-технич. семинар " Ноосфера и экология альванического производства. Экология - 90": Тез.докл. - Куйбышев, 990. - С.61-52. (соавторы: Н.П.Казьмина, Н.Н.Сарбаева)

3. Особености развития потомства после воздействия ЭДТГ в мбриональном периоде развития //Областная молодежная онференция " Молодые ученые и специалисты - производству": Тез. окл. - Куйбышев, 1990. - С.43. (соавторы: М.Н.Кирюшкина, Н.П. Казьмина)

4. Количественный анализ ультраструктур клетки в игиенических исследованиях // Всесоюзная научно-практическая онференция " Новые приложения морфометрии и математическое юделирование в медико-биологических исследованиях" : Тез.докл. -[арьков, 1990. - С. 191.(соавторы: Р.КДанилов, Н.Н.Сарбаева)

5. Сравнительный анализ дифференцировки кардиомиоцитов рыс в норме и экспериментально измененных условиях // 1аучн.конференция " Морфология раневого процесса" : Тез.докл. - С.-1етербург. BMA. - 1992. - С.6.

6. Оценка реакции одно- и двуядерных кардиомиоцитов крыс на оздействие ЭДТГ в различные периоды онтогенеза // 1аучн.конференция " Критерии и методы оценки жизнедеятельности каней в раневом процессе " : Тез. докл. - С.-Петербург. ВМА.-1993. -:.50.

7. Структурно-метаболические проявления кардиотоксического ффекта ЭДТГ// Кардиология. - 1993. - N 1. - С.55-57.

8. Характеристика патологии миокарда крыс в отдаленные ериоды после воздействия ЭДТГ в эмбриональном периоде развития / Республиканская конференция "Современные проблемы и

методические подходы к изучению влияния факгорог производственной среды на здоровье человека".: Тез.докл. - Ангарск. -1993. -С.155-157.

9. Пролиферация и дифференциация кардиомиоцитов i нормальном гистогенезе и при действии экстремальных факторов // Научная конференция "Гистогенез и регенерация тканей": Тез.докл. -С.-Петербург. BMA.- 1996. - С.24.