Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Трансплантация мезенхимальных стромальных клеток костного мозга для лечения термических ожогов кожи (экспериментально-клиническое исследование)

На правах рукописи

Расулов Масрур Фазлетдинович _ ^

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ТЕРМИЧЕСКИХ ОЖОГОВ КОЖИ

(Экспериментально - клиническое исследование)

14.00.41 - трансплантология и искусственные органы 14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2007 г.

003068173

Работа выполнена в ФГУ Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов Росздрава

Научные консультанты:

Академик РАН и РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Шумаков Валерий Иванович доктор медицинских наук, профессор Опищенко Нина Андреевна

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Ярыгин Владимир Никитич

доктор медицинских наук,

профессор Смирнов Сергей Владимирович

доктор медицинских наук,

профессор Ильинский Игорь Михайлович

Ведущее учреждение:

ФГУ «Научно-исследовательский институт

физико-химической медицины» Росздрава

Защита диссертации состоится «_»_2007 года

в 14 часов на заседании диссертационного совета Д-208.055.01 при ФГУ «НИИ трансплантологии и искусственных органов» Росздрава по адресу: Москва, 123182, ул. Щукинская, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росздрава. Автореферат разослан «___»__2007 года.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д-208.055.01

доктор медицинских наук, профессор Шевченко Ольга Павловна

1 л

ВВЕДЕНИЕ

Ожоговые поражения кожи стали в современном мире одним из наиболее социально значимых и распространенных типов травматических повреждений человека [Азолов В.В. и др., 1997, 1999].

Наряду с возросшей частотой термического поражения кожи в последние десятилетия резко повысилась их тяжесть, (увеличилось число ожоговых больных с сочетанной механической и термоингаляционной травмой), а также летальность (Багдатьев В.Е. и др., 1996; Азолов В.В. и др., 1999], которая в России достигла 3,3% и продолжает увеличиваться [Герасимова Л.И., 1999], особенно среди детей раннего возраста [Будкевич Л.И., 1998; Воздвиженский С.И. и др., 1999]. Высокая летальность, а также инвалццизация больных после глубоких или обширных ожоговых поражений кожи, послужило поводом к совершенствованию интенсивной и детоксикационной терапии, применению антибиотиков и иммунокорректоров [Распутин П.Г. и др., 1992; Багдатьев В.Е. и др., 1996; Адамян А.А. и др., 1998; Герасимова Л.И. и др., 1996; 1999; Ведерникова О.Л. и др., 1999; Алексеев А.А. и др., 1999; Reimann P.M. et al., 1990; Dorling A. et al., 1994], a также методов раннего «закрытия» ожоговых поверхностей аутодермотрансплантатами для предотвращения потерь организмом жидкости и плазменных белков и защиты ран от инфекции [Смирнов C.B. и др., 1998; Germann G. et al., 1995, Гришкевич B.M. и др. 1996; Воздвиженский С.И. и др., 1996, 1999; ТюрниковЮ.И. и др., 1997].

Между тем, при обширных глубоких ожогах кожи (более 20-30% поверхности тела) закрытие ожоговых ран при помощи перфорированных аутодермотрансплантантов оказалось весьма травматичным и даже невозможным для пострадавшего из-за дефицита его донорских ресурсов [МатчинЕ.Н, и др., 1998,2000].

В последние двадцать лет для улучшения результатов лечения ожоговых ран и снижения травматичности хирургического лечения, сочетающегося с аутодермопластикой, а также для снижения остроты дефицита донорского материала стали осуществлять трансплантацию клеток кожи и биоинженерных конструкций с иммобилизованными клетками для ускоренной реабилитации ожоговых больных.

Первоначально для трансплантации использовали культивированные ауто и аллогенные кератиноциты [Туманов В.П. и др., 1989;

Васильев А.В.идр, 1997; O'Connor N.E. et al., 1981;Alitalo K.etal, 1982; De Lapp et a]., 1990;Duins]aegerL.A.Yetal., 1994;WoodF.M, 1996],затем стали применять культивированные аллофибробласты кожи [Саркисов Д.С. и др., 1991; 1996; 1998] и аллогенные фетальные фибробласты [Саидгалин Г.З., 2000; Фаязов А.Д., 2003].

Однако применение фетальных фибробластов оказалось затруднительным в связи с нерешенностью этических, правовых и юридических проблем забора и использования этого материала; использование культивированных кератиноцитов и фибробластов из кожи взрослого человека не получило широкого распространения из-за высокой себестоимости процедуры наращивания клеточной массы в культуре.

В последние 5-8 лет в связи с развитием учения о стволовых клетках и, прежде всего, учения о мезенхимальных стромальных клетках (МСК) - костного мозга (КМ), появилась возможность их легитимного применения в практической комбустиологии для ускоренного закрытия ожоговых поверхностей и спасения больных с обширными и глубокими (критическими) ожогами.

Однако, в 2000 году приступая к исследованию результативности применения клеточных технологий в комбустиологии, мы не обнаружили работ; касающихся применения пред ифференцированых - фибробласто-подобных МСК аллогенного и аутогенного КМ для лечения ожоговых ран, а также для реанимации и реабилитации больных с ожогами.

Цели и задачи исследования

Цель исследования - изучить целесообразность трансплантации фибробластоподобных МСК, т.е. продифференцированных мезенхимальных стромальных (прогениторных) клеток аллогенного и аутогенного костного мозга, для повышения эффективности лечения ожоговых ран и ускоренной реабилитации ожоговых больных.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Воспроизвести модель поверхностного и глубокого термического ожога кожи со стандартно одинаковым размером зоны повреждения для изучения терапевтических эффектов клеточной трансплантации.

2. Отработать технологию выделения мезенхимальных стромальных клеток из костного мозга, идентифицировать в культуре получение фибробластоподобных МСК и определить показания к применению аутогенных и аллогенных МСК для трансплантации на поверхность ран.

3. Отработать технологию иммобилизации фибробластоподобных МСК КМ на биодеградируемых мембранах и определить условия использования таких биоконструкций для заживления обширных ожоговых ран.

4. Сравнить в модельных опытах на крысах эффективность восстановительного лечения поверхностных и глубоких ожоговых ран при трансплантации фетальных фибробластов, а также алло и аутогенных фибробластоподобных МСК КМ.

5. Изучить особенности морфологии раневого процесса при использовании методов клеточной терапии.

6. Показать на моделях термического ожога взаимосвязь активизации регенераторных процессов в ожоговой ране с присутствием в ней трансплантированных клеток (фетальных фибробластов, а также аллогенных и аутогенных фибробластоподобных МСК КМ).

7. Изучить влияние функциональной активности трансплантированных клеток аллогенных фибробластоподобных МСК на коррекцию клинических проявлений (детоксикация, иммунокоррекция) ожоговой болезни у больных с поверхностными и глубокими ожоговыми ранами.

8. Установить роль трансплантированных клеток для осуществления ранней аутодермопластики ожоговых ран и ускорения сроков приживления аутодермотрансплантата.

9. Показать целесообразность интраоперационного использования аутологичных фибробластоподобных МСК КМ для качественного приживления полнослойного лоскута аутокожи во время пластических операций при лечении поздних послеожоговых рубцовых деформаций и при коррекции врожденных дефектов кожи.

Научная новизна

В настоящей работе, выполнявшейся в рамках программы «Клеточные технологии - медицине» по заданию Росздрава (регистрационный номер - 01.2.00 305442) представлены результаты изучения эффективности применения предифференцированных фибробластоподобных МСК из алло и аутогенного КМ для местного лечения ожоговых ран и реабилитации ожоговых больных.

Впервые в мировой практике для ускоренного заживления ожоговых ран применены культуры фибробластоподобных мезенхимальных стромальных клеток из костного мозга, идентифицированных морфо-

логически, а также иммуногистохимически по маркерам МСК - белку цитоскелета - вименгину, по поверхностному антигену - CD 133 и по коллагену III типа.

Показано, что для получения стабильно высокого процента живых и активных фибробластоподобных МСК в культуре не следует использовать клетки аутологичного костного мозга от ожоговых больных в остром периоде; следует использовать ФМСК от аллогенных доноров с 75-80% монослоем этих клеток в культуре и с пассированием их не более 4 -5 раз.

Впервые на моделях термического повреждения кожи у крыс проведена сравнительная оценка темпов заживления ожоговых ран после трансплантации фетальных фибробластов, а также аллогенных и аутогенных фибробластоподобных МСК КМ здоровых доноров. Установлено, что алло и аутогенные фибробластоподобные МСК, так же как и фетальные фибробласты, достоверно повышают скорость регенерации поверхностных и глубоких ожоговых ран по сравнению со спонтанным их заживлением.

Показано, что при выборе клеточного материала предпочтение следует отдавать фибробластоподобным МСК, а не фетальным фибробластам, так как применение фибробластоподобных клеток характеризуется более высоким темпом регенерации ожоговой раны, а на этапе культивирования более высоким темпом накопления клеточной массы по сравнению с фетальными фибробластами.

С помощью рекомбинантного аденовирусного вектора (содержащего Lac-Z-ген E.coli), внедренного в донорские клетки (фетальные фибробласты, алло и аутогенные фибробластоподобные МСК) на этапе культивирования, доказано, что ускорение темпа регенерации ожоговых ран после трансплантации этих клеток связано с присутствием и функционированием (продукция цитокинов) их в зонах термического поражения (в сроках не менее 4 недель).

Показано, что ускорение процесса заживления ран под влиянием трансштангированных клеток сопровождается существенным ускорением темпов разрастания сосудистой сети и формирования грануляционной ткани в области ожоговой раны. Высказано предположение, что разрастание сосудистой сети предотвращает развитие грубых рубцовых изменений в зонах заживления ожоговой раны и сохраняет текстуру трансплантированной кожи.

Установлено, что аллогенные фибробластоподобные МСК, трансплантированные больным на шубокие ожоговые раны не только сокращают фазу деструктивных изменений в ране и способствуют осуществлению ранней аутодермопласгики, но и приводят к более быстрому устранению клинических проявлений ожоговой болезни (восстановление функций органов детоксикации, снижение проявлений системной воспалительной реакции и иммунной дизрегуляции). Высказано предположение, что последнее связано с устранением цитокинового дисбаланса и продукцией противовоспалительных цитокинов.

Ускоренное заживление поверхностных и глубоких ожоговых ран в клинике связано со стимуляцией процесса образования микрососудов и созревания грануляционной ткани, оптимизирующих условия эпителизации ожоговой раны.

Практическая значимость работы

Отработаны технологические режимы выделения и накопления в культуре фибробластоподобных МСК. Предложено д ля лечения ожоговых ран и ускорения их регенерации использовать аллогенные, а для пластических операций аутологичные фибробластоподобные МСК КМ.

Установлена целесообразность использования биодеградируемых пленок с иммобилизованными фибробластоподобными МСК на ранних этапах лечения ожоговых ран, при этом клеточный монослой не должен превышать 80%.

Трансплантация аллогенных фибробластоподобных МСК на поверхность глубоких ожоговых ран не только ускоряет темп их заживления, но и ослабляет или даже предотвращает возникающие проявления ожоговой болезни: эндотоксикозы и полиорганную недостаточность.

Показано, что трансплантация фибробластоподобных МСК способствует ускоренному осуществлению аутодермопластики ожоговой поверхности и повышает качество приживления кожного трансплантата.

Положения, выдвигаемые на защиту

Культивированные in vitro алло и аутогенные фибробластоподобные мезенхимальные стромальные клетки из костного мозга, так же как и фе-тальные фибробласты ускоряют темп регенерации ожоговых ран за счет длительного сохранения их жизнедеятельности в зонах трансплантации и продукции в рану биологически активных ростстимулирующих факторов.

Ускорение процесса заживления ран под влиянием трансплантированных фибробластоподобных мезенхимальных стромальных клеток

сопровождается существенным ускорением темпов разрастания сосудистой сети и формирования грануляционной ткани в ожоговой ране, что в свою очередь снижает вероятность образования грубых рубцов в отдаленном послеоперационном периоде.

При выборе клеточного материала для трансплантации на ожоговую рану предпочтение следует отдавать аллогенным фибробласто-подобным МСК из КМ, а не фетальным фибробластам, так как их использование способствует более высокому темп}' регенерации ран, а на этапе подготовки клеточного материала к трансплантации отмечается более высокий темп нарастания клеточной массы.

Иммобилизованные фибробластоподобные МСК способствуют ускоренному заживлению ожоговой раны на раннем этапе раневого процесса, что связано с формированием в таком монослое адекватных межклеточных взаимодействий, которые определяют более высокую функциональную активность иммобилизованных клеток.

Так как фибробластоподобные МСК КМ не являются продуцентами кератиноцитов, то для окончательного закрытия глубоких ожоговых ран трансплантация этих клеток должна завершаться аутодермопластикой.

Внедрение результатов работы

Отработанные методики культивирования фибробластоподобных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга использовались для получения клеточного материала и трансплантации пациентам травматологического отделения. МУ ЦРБ г. Оха Сахалинской обл, в Ожоговом центре больницы имени Н.В. Соловьева г. Ярославль, в ГО Российской детской клинической больнице Росздрава г. Москва.

Апробация диссертации

Апробация работы состоялась 15 марта 2006 года на межлабораторной конференции в ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию России.

Основные положения работы доложены и обсуждены: на конференции "Новые оперативные технологии" (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты) (Москва, июнь 2002г.), на II Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам (Москва, октябрь 2002г.), на конференции Новые технологии- медицине. 1-я Всероссийская конференция "Стволовые клетки" и перспективы исполь-

зования их в здравоохранении. (Москва, май 2003г.), на XXX Конгрессе Европейского общества искусственных органов (ESAO) (Германия. Аахен, сентябрь 2003г.); на II ежегодном совещании Европейского общества по тканевой инженерии (Италия. Генуя, сентябрь 2003г.), на Ученом совете института пластической хирургии (Москва, январь 2003г.), на Научном обществе травматологов и ортопедов Ярославской-Костромской-Вологодской областей (г. Ярославль, март 2004), на 2-ой Международной конференции "Патофизиология и современная медицина", (Москва, апрель 2004г.), на конференции "Человек и лекарство" (Москва, май 2004г.), в Государственном комитете по науке и новым технологиям. (Москва, май. 2004г.), на XIII и XV сессиях РАМН (Москва, февраль, ноябрь 2004г.), на XIII Международной конференции по проблеме "Перфторуглеродные соединения в медицине и биологии", (Пущино, июнь 2003г), на III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, ноябрь 2004г.), на Международной научно практической конференции "Управление качеством медицинской помощи на основе стандартизации и доказательной медицины" (г. Красногорск, декабрь. 2004г), на XV Европейской студенческой конференции будущих врачей и молодых ученых (Берлин, октябрь 2004г.), на IV и V Междунардном конгрессе Kocmetik international (Москва, февраль-сентябрь 2005г.), на I Национальном конгрессе по биоэтике (Ташкент, сентябрь 2005г.), на III Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам (Москва, октябрь 2005г.), на XI Конгрессе Европейской ожоговой ассоциации (Португалия - Эшторил, сентябрь 2005г.), на Международной конференции "Новые технологии в трансплантации фетальных клеток и их медиаторов" (Казахстан, г. Астана, ноябрь 2005с).

Публикации

По теме диссертации опубликована 41 работа, из них 18 - в центральной печати, 7 - опубликованы за рубежом.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 261 странице машинописного текста. Состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка цитированной литературы (522 источник, из них 160 -отечественных и 362 -зарубежных). Работа иллюстрирована 69 рисунками и 18 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Общая характеристика экспериментального и клинического материала

Экспериментальный раздел работы выполнен на 294 животных: крысах- самцах породы Вистар массой 300-350г и беременных самках породы Вистар (на 14-17 день гестации) массой 250-300г, трансгенных мышах В.10. GFP и мышах линии C57BL/6, которых содержали в виварии ФГУ НИИ Т и ИО Росздрава при свободном доступе к пище и воде на рационе питания, соответствующем нормативам ГОСТа.

Экспериментальный раздел состоит из 3-х основных частей. В I части работы были отработаны методики получения первичных культур фетальных фибробластов (ФФ) и фибробластоподобных мезенхимальных стромальных клеток (ФМСК) из мезенхимальных стромальных (прогениторных) клеток (МСК) костного мозга (КМ) для сравнительного изучения характеристик этих клеток и введения в них метки in vitro. Во II части изучали мезенхимальные свойства ФФ, МСК из КМ в первичной культуре, а также свойства ФМСК. В III части на крысах отрабатывали модель ожогового повреждения кожи разной степени тяжести (поверхностные и глубокие), и трансплантировали на ожоговые раны культуры клеток ФФ, а также алло- и аутологичных ФМСК для изучения влияния клеточной терапии на восстановительные процессы в поверхностных (п=45) и глубоких (n=60) ОР, а также идентифицировали в них трансплантированные клетки.

Ожоговые повреждения кожи моделировали у крыс и мышей в хирургическую стадию эфирного наркоза (50 мг/кг) методом термодеструкции (ТД). Для этого к коже спины прикладывали металлический полый цилиндр, через который циркулировала вода, нагретая в до 97,7°С. Площадь пластины составляла 18-20% общей поверхности кожи животных. Срок экспозиции для поверхностных ОР составлял 5-6 сек, для глубоких ОР 8 сек.

Экспериментальные животные по выполненным разделам работы были распределены следующим образом (табл. 1).

Распределение животных по сериям в 3"ей части экспериментального раздела работы представлено в табл. 2.

Таблица № 1

Распределение животных (крысы породы Вистар и мыши), по разделам экспериментальной работы.

Разделы работ Выполпеппые исследования Вид животных Всего

I Отработка методов культуралыгых исследований и моделирования ОР Получение и ведение первичных культур аллогенных ФФ Беременные крысы 20*

Получение и ведение первичных культур МСК КМ; предифференцировка МСК в ФМСК КМ Крысы-самцы, мыши В1(Ш]*Ри С57В176 20* 2 20

Отработка техники мочения ФФ и ФМСК КМ в культуре и способов идентификация клеток Крысы-самцы, мыши ВКМЗРР 30* 2

Моделирование поверхностных и глубоких ОР методом термодеструкции (ТД) Крысы-самцы, мыши С57В176 30 10

П Изучение характеристик клеточных культур Характеристика мезенхимальных свойств культур ФФ Беременные крысы 20*

Характеристика мезенхимальных свойств культур ФМСК Крысы-самцы 20*

Идентификация в культуре ФФ и ФМСК, маркированных Ьас-Х- геном и ФМСК от трапегениых мышей, содержащих СРР Крысы-самцы, мышиВНЮРР 30* 2*

Ш Изучение раневого процесса в ОР на фоне местного применения клеточной терапии Трансплантация суспензий ФФ и ФМСК на поверхностные ОР Крысы-самцы 45

Трансплантация суспензий ФФ и ФМСК на глубокие ОР Крысы-самцы, мыши С57ВЬ/6 60 10

Трансплантация иммобилизованных ФМСК на глубокие ОР Крысы-самцы 45

Итого 294

* - Крысы и мыши в I разделе работы были использованы для решения задач и во II разделе работы. Эти же животные служили донорами

клеток для выполнения 1П раздела работы.

Таблица №2

Распределение крыс породы Вистар при исследовании эффектов клеточной терапии ОР.

Группы исследований Серии выполненных эксперимептов Расход животных Включено в стат. обработку

Ш.1 Трансплантация суспензии клеток на поверхностные ОР ТД кожи без применения клеточной терапии (спонтанная регенерация) (серия Ш.1.1) 15 15

ТД кожи с трансплантацией суспензии ФФ (серия Ш. 1.2) 15 15

ТД кожи с трансплантацией суспензии аллогенных ФМСК (серия Ш. 1.3.) 15 15

Ш.2 Трансплантация суспензии клеток на глубокие ОР ТД кожи без применения клеточной терапии (спонтанная регенерация) (серия Ш.2.1) 15 13

ТД кожи с трансплантацией суспензии ФФ (серия Ш.2.2) 15 15

ТД кожи с трансплантацией суспензии аллогенных ФМСК (серия Щ.2.3) 15 15

ТД кожи с трансплантацией суспензии аутогенных ФМСК (серия Ш.2.4) 15 15

1П.З Применение ФМСК, иммобилизованных на БМ для лечения глубоких ОР ТД кожи без применения клеточной терапии (спонтанная регенерация) с использованием БМ на ОР (серия Щ.3.1) 15 12

ТД кожи с трансплантацией суспензии аллогенных ФМСК (серия Ш.3.2) 15 15

ТД кожи с трансплантацией аллогенных ФМСК, иммобилизованных на БМ (серия Ш.3.3) 15 15

Всего 150 145

и

Общая площадь термического повреждения кожи в III. 1, III.2 и III.3 группах опытов на крысах была близка к 50 см2, что составляло около 20% от общей площади поверхности кожи крысы. Суспензии культивированных ФФ и предифференцированных МСК до ФМСК во всех сериях опытов получали в стандартных условиях (при 3 ТС в С02-инкубаторе, в атмосфере с 5% С02 и 95% влажности) и наносили на поверхность ОР с помощью пипетки в количестве 20x103 кл/см2 на вторые сутки после моделирования ожога и иссечения образовавшегося некротического струпа.

При использовании ФМСК, иммобилизованных на биомембранах, посев клеток на них производили из расчета 20x103 кл/см2.

Выживших животных каждой группы выводили из эксперимента спустя 4 недели после ТД для изучения динамики заживления (регенерации) ОР по результатам визуального, планиметрического и гистологического исследований на 1, 3, 7, 15 и 30 сутки после трансплантации клеток на ожоговую поверхность.

Клинический раздел работы включал исследование 43 больных, госпитализированных: в ожоговое отделение городской клинической больницы им. Н.В. Соловьева г. Ярославль (39 больных), в МУ ЦРБ г. Оха Сахалинской области (2 больных), а также в отделение микрососудистой хирургии в ГО Российской детской клинической больницы Росздрава г. Москва. (2 больных) в период с 01.12.2003 по 01.10.2005 гг. Характеристика больных по степени тяжести термических ожогов и используемым вариантам клеточной терапии представлена в табл. 3. Все ожоговые больные, поступившие на лечение в острой фазе ожоговой болезни (п=41) были разделены на две группы: I группа включала больных с поверхностным ожогом (с повреждением кожи до базальной мембраны) II, IIIA степени (п=1б) и II группа включала больных с обширным глубоким термическим ожогом (с повреждением всех слоев дермы) ШБ степени (п=25). Каждая группа включала две подгруппы клинических наблюдений - контрольную, в которой лечение проводилось по стандартной схеме без применения методов клеточной терапии, и основную (исследуемую) подгруппу, в которой больным наряду с общепринятой терапией дополнительно проводилась трансплантация аллогенных ФМСК.

Таблица 3.

Характеристика больных по степени тяжести полученных термических ожогов,

и используемым вариантам клеточной терапии

Группы больных Серии выполненных клинических наблюдений Степень ожога Взрослые Дети Кол-во

I. Изучение влияния клеточной терапии на заживление поверхностных ожоговых ран Лечепие ОР без применения клеточной терапии (стандартная терапия) (серия 1.1.) П-ША 9 1 10

Лечение ОР с предварительной трансплантацией суспензии аллогенных ФМСК (серия 1.2.) П-1ПА 5 1 6

II. Изучение влияния клеточной терапии на заживление глубоких ожоговых ран Лечение ОР без применения клеточной терапии (стандартная терапия) (серия 11.1.) ШБ 9 1 10

Лечение ОР с предварительной трансплантацией суспензии аллогенных ФМСК (серия П.2.) ШБ 13 2 15

Ш. Изучение влияния аутогенных ФМСК на приживление полнослойных кожных трансплантатов при пластике кожных дефектов Аутодермопластика с предварительной трансплантацией суспензии аутогенных ФМСК 1 1 2

Итого 34 9 43

Контрольную группу больных с поверхностными ожогами (серия 1.1.) составили 10 больных, из которых 7 мужчин в возрасте от 19 до 45 лет, 2 женщин в возрасте 20 и 45 лет и 1 ребенок в возрасте 5 лет. В основной подгруппе больных с поверхностными ожогами (серия 1.2) наблюдалось 6 больных, из них 4 мужчин в возрасте от 19 до 45 лет; 1 женщина в возрасте 45 лет и 1 ребенок в возрасте 10 лет.

Контрольную группу больных с глубокими термическими поражениями кожи (серия II.1.) составили 10 больных, из которых 7 мужчин в возрасте от 19 до 45 лет; 2-х женщин в возрасте 32 и 45 лет и 1 ребенок в возрасте 4 лет. В основной подгруппе больных с тяжелыми ОР, получивших дополнительно трансплантацию ФМСК (серия II.2.) наблюдалось 15 больных, из них 10 мужчин в возрасте от 19 до 55 лет, 3 женщины в возрасте 25,44 и 65 лет и 2 детей в возрасте 2 и 4 года.

В отдельную (III группу) наблюдений было включено 2-е больных в возрасте 22 и 15 лет, которым была произведена пластика дефекта кожи полнослойным трансплантатом аутологичной кожи после предварительной трансплантации на область операционной раны культивированных аутологичных клеток КМ. У одной больной дефект кожи был связан с послеожоговым деформирующим рубцом в лучезапястной области; у другой больной - с врожденной артерио-венозной макрофистулёзной дисплазией кожи лица.

После удаления струпа или некротически измененных тканей кожи 20 больным проводили санацию ОР по традиционной схеме, а 21 больному с поверхностными (п=6) и глубокими ожогами на очищенную поверхность раны наносили суспензию культивированных ФМСК из КМ доноров в количестве 20x103 кл/см2.

Всем больным с обширными глубокими ожогами кожи в острой фазе проводилась противошоковая терапия, которая включала обезболивание, гемодилюцию, детоксикацию организма и борьбу с инфекцией, переливание крови и препаратов крови, местное применение различных антисептиков и мазей, а также при необходимости проводилось подсушивание ОР на кровати «Клинитрон» и другие манипуляции, направленные на скорейшее выведение больного из состояния шока.

Клеточный материал (ФМСК) получали от доноров КМ, поступивших в ФГУ НИИТ и ИО Росздрава. Доноры предварительно обследовались на отсутствие зараженности опасными инфекциями (туберкулез, сифилис, гепатиты А, В, С, цитомегаловирусы и СПИД). От каждого донора в операционной получали около 150-200 мл костного аспирата путем пункции переднего гребня подвздошной кости.

Технология получения культур ФФ и ФМСК в эксперименте и клинике

Культуры ФФ- получали в эксперименте из легкого плодов крыс на 17-21 сутки гестации по методике Д.С. Саркисова и соавт. (1991).

Культуру МСК для предифференцировки в ФМСК получали из аспирата КМ животных и человека. Аспират КМ обрабатывали лизирующим раствором (114 mM NH4C1; 7,5 тМ КНС03; 100 мкМ EDTA) при t0=(220 "240C) в течение 3 мин с последующим отмыванием и центрифугированием. Образующийся осадок мононуклеарных клеток, ресуспендировали в ростовой среде IMDM (Gibco, USA)c добавками и высевали на культуральный пластик. Культивируя в течение 7 суток удаляли клетки гемопоэтического ряда (основная фракция клеток КМ). Оставшаяся малочисленная фракция клеток, прикрепившихся к пластику, представляла собой - мезенхимальные стромальные клетки (2-5 МСК на 10б мононуклеаров) и использовалась для дальнейшего культивирования с целью предифференцировки в ФМСК. Культивацию клеток осуществляли в среде IMDM (Gibco, USA) содержащую 10% бы чьей эмбриональной сыворотки ("HyClone", USA), инсулин 0,4 мкМ/л, дексаметазон 10 нМ/л, а также основной фактор роста фибробластов (bFGF) 20 нг/мл ("Sigma", USA); замену культуральной среды осуществляли через каждые 3 суток.

Выращенные культуры ФМСК (состоявшуюся предифференци-ровку подтверждали иммуногистохимически) хранились в низкотемпературном банке (в сосудах Дьюара) или использовались для трансплантации на ОР; кроме того культуры ФМСК использовались для дальнейшего наращивания клеточной массы, а также для морфологического подтверждения состоявшейся в культуре предифференцировки (сроки культивирования ФМСК достигали 3-4 недель). Допустимые сроки культивирования выделенных МСК составляли 4-5 пассажей с интервалами рассева культуры в 2-3 недели.

В отдельной части опытов ФМСК трансплантировали на биодеградируемые мембраны ЭластоПОБ, которые способны образовывать активные биоконструкции вместе с иммобилизованными на них клетками. Мембраны ЭластоПОБ были изготовлены в Центре по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТ и ИО Росздрава (рук. Центра проф. Севастьянов В.И).

Методы идентификации МСК и ФМСК в культуре и в тканях ОР

Идентификацию МСК и фибробластоподобных МСК в

культуре осуществляли методом непрямой иммунофлуоресценции, используя моноклональные антитела к маркерам - виментину, поверхностному антигену CD133, а также по коллагену III типа (А. Лейси, 1992).

Для идентификации трансплантированных клеток в тканях ОР использовали метод Wakitani S. et ol. (1995), основанный на прижизненном введении кодирующей метки в клеточную культуру. Введение метки в культивируемые клетки осуществляли с помощью рекомбинантного делецированного аденовируса, содержащего ген LacZ из E.coli, кодирующего бактериальную ß- галактозидазу. Активность ß- галактозидазы выявляли гистохимически по сине-зеленому окрашиванию при добавлении субстрата X-Gal. Для идентификации трансплантированных клеток использовали также МСК из КМ трансгенных мышей В. 10 GFP, содержащих в ядрах клеток ген зеленного белка, выявляемых в криопрепаратах с помощью люминесцентной микроскопии.

Фазово-контрастную и флуоресцентную микроскопию клеточных культур проводили на микроскопах "Axiovert-25" (Karl Zeiss, Германия), Laborux ("Leika", Германия). Для фотографирования использовали цифровую фотокамеру "Axiocam color" (Karl Zeiss, Германия).

Методы исследования функциональной активности трансплантируемых клеток

Цитокины в культуральной среде. IL-10, G-CSF, TGF-в определяли методом твердофазного имму но ферментного анализа (ИФА) с помощью отечественных наборов (ООО «Цитокин», Санкт-Петербург).

Скорость заживления ОР - оценивали планиметрическим методом по скорости сокращения раневой поверхности компьютерной программой анализа изображения Видео ТесТ-Мастер 4.0 (ООО "ВидеоТесТ", С-Пб.), рассчитывали площадь ожога с погрешностью до 0,01 см2.

Пролиферативная активность теток в культуре использовалась для оценки потенциальной способности наращивания клеточной массы.

Жизнеспособность клеток в культуре оценивали по прокрашиванию клеток трипановым синим (должна быть не менее 95%).

Методы исследования клинического состояния больных с ожоговой травмой включали методы оценки функционального состояния различных органов и систем, позволяющие судить о степени тяжести ожоговой болезни. Производили оценку детоксикационной функции печени и понек путем клинического исследования билирубина, АЛТ, ACT, креатинина и мочевины в плазме крови; определяли лейкоцитарную формулу крови и производили расчет ЛИИ (ЛИИ характеризует не только степень интоксикации, но и дизрегуляции иммунной системы) как при поступлении больных, так и в процессе их лечения.

Морфологические методы исследования применяли для исследования активности процессов регенерации поврежденной кожи. Получали биоптаты из зон повреждения и готовили либо крио статные, либо парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Для оценки фазы раневого процесса готовили цитологические мазки и окрашивали их также гематоксилином и эозином, использовали методы световой микроскопии для подсчета количества сосудов в срезах.

Методы статистической обработки использовали для обработки результатов экспериментальных и клинических наблюдений. Применяли методы вариационной статистики в программе Excel с использованием пакетов MS Office и Biostat 4.03. Для сравнения количественных показаний использовали t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони для множественных сравнений с контрольной группой. Межгрупповые отличия считали достоверными при Р<0,05.

Считаю необходимым отметить, что в освоении методик, использованных в данной работе, автору помогали сотрудники лаборатории биотехнологии стволовых клеток (зав. лаб. д.м.н. профессор Н.А.Онищенко), сотрудники лаборатории иммунодиагностики и имунокоррекции (зав. лаб. д.м.н. профессор B.C. Сускова), руководитель Центра по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТ и ИО Росздрава (зав. лаб. д.б.н. профессор В.И. Севастьянов); культуральные исследования были проведены под руководством научного сотрудника М.Е. Крашенинникова; гистохимические исследования были осуществлены под руководством к.м.н. В.А. Зайденова, в отборе больных на клеточную терапию принимали участие сотрудники Ожогового центра больницы им. Н.В. Соловьева г. Ярославля (зав. отд. В.Н. Березин). Содействие в обеспечении адекватного содержания животных в длительных экспериментах оказывал зав. виварием П.В. Аврамов. Всем им выражаю свою сердечную благодарность за помощь в работе.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Фенотипическая и функциональная характеристика культур МСК

При выборе клеток для оптимизации индукции заживления ОР использовали алло и аутогенные мезенхимальные клетки, биологические свойства которых позволяли в культуре охарактеризовать однородность их фенотипического состава, их зрелость, а также жизнеспособность и функциональную активность.

Применив иммунофлуоресцентный и иммуногистохимический методы идентификации мезенхимальных клеток по соответствующим маркерным белкам, мы установили, что практически у 100% всех прикрепившихся клеток выявляются белок цитоскелета - виментин и коллаген I типа; маркерные белки CD133 и коллаген III типа не выявляются в культуре ФФ; однако, в культурах МСК и предифференциро-ванных ФМСК коллаген III типа вьивляется у 100% адгезированных клеток; маркер CD 133 - выявлялся в культуре МСК у 20% адгезированных клеток, а в культуре ФМСК меньше, чем у 10% клеток.

Таким образом, изучение экспрессии стромальных маркерных белков в ФФ, МСК и ФМСК подтвердило общность мезенхимального происхождения этих клеток и показало, что культуры адгезированных клеток, получаемые нами, достаточно однородны.

Использование маркера CD133 позволило, однако, выявить различную степень зрелости (дифференцировки) клеток в различных культурах МСК.

Для характеристики увеличения выраженности дифференцировки клеток в разных культурах по экспрессии стромальных маркерных белков их следует расположить в следующем порядке: МСК <ФМСК < ФФ.

Сравнительные исследования жизнеспособности и функциональной активности клеток костного мозга (ККМ) обожженных и интактных доноров, выполненные на мышах C57BL/6, позволили придти к выводу об ингибирующих свойствах аутологичного КМ обожженных и его неспособности индуцировать репаративные процессы в ранах.

Мы установили, что первоначально количество выживающих ККМ в культуре от ожоговых доноров, остается относительно высоким, по сравнению с штатными донорами. Однако, если в культурах КМ интактных доноров уже с 7-8 дня культивирования на фоне элиминации мононуклеарных клеток начинал проявляться рост МСК, то в культурах КМ ожоговых животных усиливалась элиминация клеток

и роста МСК не наблюдалось. Результаты исследования таким образом показали, что ККМ ожоговых доноров в острую фазу стрессорного повреждения оказывают ингибнрующее воздействие на пролиферацию МСК и потому не должны использоваться для получения клеток, индуцирующих процессы регенерации. Донорами МСК для ожоговых больных в острой фазе повреждения должны быть только здоровые аллогенные доноры, имеющие высокий уровень функциональной (пролиферативной) активности клеток КМ.

2. Заживление ожоговых ран при трансплантации ФФ и ФМСК КМ (Экспериментальное исследование).

2.1. Заживление обширных поверхностных ожогов с помощью суспензии мезенхимальных клеток было исследовано в 3"х сериях опытов (табл. 4).

Таблица 4

Динамика уменьшения площади поверхностных ОР у крыс, в

зависимости от типа трансплантируемых клеток

Серии исследований Площадь поверхности ожоговой раны (в см2)

1 сутки 3 сутки 7 сутки 15 сутки 30 сутки

Контроль (Ш.1.1) п=15 50,2+ 1,03 49,2 ± 1,05 37,5± 1,75 31,4+ 1,40 6,2 ± 1,32

Фет.фибробласт (Ш.1.2) п=15 50,3 ± 1,07 48,0± 0,94 6,87+ 1,02" 2,77± 1,06® 0,00

Алло ФМСК (П1.1.3) п=15 50,2± 1,05 48,0+ 1,03 2,53± 1,35я 1,21± 0,84я 0,00

0 - Р<0,01 по отношению к контролю.

Из таблицы 4 видно, что применение суспензии ФФ и алло ФМСК способствовало более быстрому уменьшению площади ожоговых ран по сравнению с контролем и эта разница становилась достоверной уже на 7 сутки. У животных контрольной серии к 7 суткам, лишь местами появлялась грануляционная ткань и намечалась тенденция к сокращению площади ожоговой поверхности за счет появления островков эпителизации. Гистологически в ОР сохранялись признаки клеточной инфильтрации, местами появлялись островки регенерирующего эпидермиса, а в дерме отмечались редко разбросанные новообразованные сосуды; происходило формиро-

вание грубых коллагеновых волокон. При использовании ФФ и ФМСК площадь ран достоверно сокращалась, к 7 суткам за счет разрастания новообразованного эпидермиса. Гистологически рана была пронизана новообразованной сосудистой сетью и нежными коллагеновыми волокнами. Высокий темп заживления ожоговых ран под влиянием ФФ и ФМСК по сравнению с контролем сохранялся и на 15 сутки моделирования ОР, что было обусловлено продолжающейся жизнедеятельностью ФФ и ФМСК на поверхности ран, которые идентифицировались по окраске клеток на р - галактозидазу). Достоверные различия в сроках заживления поверхностных ОР под влиянием ФФ и ФМСК отсутствовали.

2.2 Заживление обширных глубоких ожогов с помощью суспензии клеток было изучено в 4 сериях опытов (табл. 5). Из табл. 5 видно, что ФФ алло и аутогенные ФМСК достоверно уменьшают площадь глубоких ОР на 7 сутки их моделирования по сравнению с контролем. Более высокий темп регенерации ОР под влиянием трансплантированных клеток сохраняется также на 15 и 30 сутки наблюдения. Мы отметили, что уже через 20-30 мин после посадки клеток на ОР (время необходимое для прикрепления клеток) снижалась плазмаррея и рана покрывалась тонкой пленкой, защищающей её от инфицирования.

Таблица 5

Динамика уменьшения площади глубоких ОР в зависимости

от типа трансплантируемых клеток у крыс

Группы, серии исследовании Площадь поверхности ожоговой раны (в см2)

1 сутки 3 сутки 7 сутки 15 сутки 30 сутки

Контроль (Ш.2.1) 11=12 50,6 ± 1,88 48,4± 1,22 46,3+ 2,00 33,6± 2,45 26,3 ± 2,96

Фет.фибробласт (Ш.2.2) п=15 50,6± 1,19 45,1 ± 1,79 36,9± 2,04 0 27,2± 2,03 0 18,0+ 2,54«

Алло ФМСК (П1.2.3) п=15 50,6± 1,45 44,1 ± 1,55 36,1 + 1,810 18,5± 2,38*0 9,18± 1 99*0

Ауго ФМСК (Ш.2.4) 11=15 50,6± 2,16 43,1 ± 2,22 33,8± 2,56 0 14,7+ 1,28*0 4,42± 1,70*я

* - Р<0,05 по отношению к фетальным фибробластам на тех же сроках исследования; 0 - Р<0,01 по отношению к контролю.

Через сутки после трансплантации клеток повязки оставались сухими и легко снимались с раневой поверхности; под пленками возникали островки новообразованных сосудов.

В контрольной серии даже на 3 сутки в рапе продолжалась плазмаррея. отмечалось присоединение инфекиии, рана выглядела бледной с островками фибринного налета. Гистологически на криостатных срезах отмечалось усиление воспалительной инфильтрации тканей, отсутствие новообразования сосудов. Сходная гистологическая картина сохранялась до 7 суток.

После трансплантации клеток уже на 3 сутки отчетливо выявлялись признаки уменьшения воспалительной клеточной инфильтрации; рана становилась розовой из-за множества новообразованных мелких капилляров; к 7 суткам количество новообразованных сосудов достоверно увеличивалось (рщ 1), а грануляционная ткань разрасталась до уровня Э1 [идермиса.

Примечательно, что у животных контрольной серии в течение первых ¡5 суток имелись клинические признаки интоксикации; особенно выраженные в течение 10 суток: снижение аппетита, веса и двигательной активности. При использовании клеточной терапии даже в течение первых суток клинические признаки интоксикации были умеренными и исчезали полностью к 7-8 суткам наблюдения. На 15 сутки наблюдения возникали достоверные различия в заживлении ран не только в сериях с применением клеток по сравнению с контрольной серией, но и при использовании различных вариантов клеточной

? 25 -1-

Контроль Фстальные Алло ФМСК Ауто ФМСК

фнбробласты

Рис. 1. Средняя плотность новообразованных сосудов в глубоких ОР на 7 сутки применения клеточной терапии. ** - Р<0,01 по сравнению с контролем.

терапии: при трансплантации алло и аутогенных ФМСК имел место более высокий темп уменьшения площади ожоговой поверхности по сравнению с трансплантацией ФФ.

На 30 сутки сохранялась та же закономерность - алло и ауто ФМСК под держивали более высокий темп регенерации по сравнению с контролем и ФФ. Ускоренный темп регенерации ОР при использовании алло и ауто ФМСК сопровождался более интенсивным развитием сети новообразованных сосудов по сравнению с использованием ФФ. Вероятно, это связано с более высокой функциональной активностью ФМСК, которые являются менее дифференцированными клетками, чем ФФ.

Более высокий темп заживления ОР при использовании различных вариантов клеточной терапии по сравнению с контролем (спонтанная регенерация) следует связать с сохраняющейся жизнеспособностью трансплантированных клеток, которую подтверждали гистохимически на 7, 15 и 30 сутки по наличию р- галактозидазной активности в трансплантированных клетках.

2.3 Заживление обширных глубоких ожогов с помощью иммобилизованных клеток изучено в 3 сериях опытов (табл. 6).

Иммобилизация ФМСК предпринималась для повышения функциональной активности клеток на этапе их трансплантации и для сокращения деструктивной фазы раневого процесса, а также ускоренного перехода его к фазе регенерации.

Было установлено, что ФМСК, иммобилизованные на биомембранах (БМ), через сутки после пребывания на раневой поверхности полностью покидали двухмерную поверхность биодеградируемой подложки и адгезировались на тканях обожженной поверхности.

Было установлено также, что на 3 сутки после трансплантации на рану иммобилизованных ФМСК, образовавшаяся за первые сутки на ране тонкая пленка утолщалась и становилась мутной так как была пропитана белковым раневым отделяемым.

Учитывая, что через 1 сутки в ОР создаются условия для конденсации белок-содержащей жидкости под БМ и возникает опасность присоединения экзогенной инфекции из-за снижения дренажной активности раны, БМ на 3-е сутки удаляли с поверхности раны. В последующем лечение ОР в этой серии опытов проводилось подобно тем сериям, где применялась клеточная суспензия.

Таблица 6

Динамика заживления глубоких ожоговых ран после трансплантации взвеси алло ФМСК и алло ФМСК, иммобилизованных на БМ

Группы, серии исследований Площадь поверхности ожоговой раны (в см2)

1 сутки 3 сутки 7 сутки 15 сутки 30 сутки

Контроль +БМ (Ш.3.1) п-13 50,3± 3,0 48,3± 2,8 45,6+ 2,9 29,0+ 4,4 20,2± 4,1

Суспензия алло ФМСК (Ш.3.2) п«15 50, б+ 1,4 44,1± 1,5* 36,1+ 1,8» 18,5+ 2,3я 9,1± 1,9"

Алло ФМСК +БМ (Ш.3.3) п=15 50,3± зд 42,9 ± 1,7* 32,8+ 3,8» 12,7± 1,3*я 5,3± 2,8»

*- Р<0,05 по отношению к суспензии ФМСК; # - Р<0,01 по отношению к контролю.

Из таблицы 6 ввдно, что алло ФМСК, иммобилизованные на БМ, обеспечивают более быстрое сокращение площади ОР по сравнению с контролем. По сравнению с применением суспензии алло ФМСК регенерация ОР при воздействии исходно иммобилизованных ФМСК была достоверно выше только на 15 сутки. На остальных сроках была отмечена лишь тенденция ускорения темпа регенерации. Выявить гистологически достоверные различия с суспензией ФМСК по плотности новообразованных сосудов также не удавалось. Также как в опытах с суспензией ФМСК исходно иммобилизованные ФМСК также оставались в ране на протяжении всего срока наблюдения (выявление р- галактозвдазной активности в трансплантированных клетках) и с этим фактом мы связываем более высокий темп регенерации по сравнению с контролем.

Проведенные эксперименты с трансплантацией клеточного материала на глубокие ОР показали, что хотя ФФ, и ФМСК ускоряют заживление ран регенерация их не происходит из центра, так как разрушены все слои кожи, а трансплантируемые клетки недифференци-рованы в направлении образования кератиноцитов.

Именно поэтому, трансплантация ФФ и ФМСК на глубокие ОР, является подготовительным этапом перед окончательной операцией аутодермопластики и служит ускорению и улучшению результатов приживления полнослойного кожного трансплантата.

3. Трансплантация ФМСК костного мозга для лечения ожоговых ран и подготовки больных к аутодермопластике (клинические наблюдения) Аллогенные ФМСК перед трансплантацией больным с ОР подвергали предварительному культивированию в течение 7 суток, как для наращивания достаточной массы клеток, так и для восстановления их биорегуляторной активности после криогенного хранения. О восстановлении биорегуляторной активности ФМСК свидетельствовало накопление в культуральной среде цитокинов-ТОБ-р, О-СББ и1Ь-10. Аллогенные ФМСК использовали для лечения больных с обширными поверхностными и глубокими ожогами.

3.1. Аллогенные ФМСК в комплексном лечении поверхностных ожогов. Воздействие ФМСК было изучено нами в 2-х группах больных с ожогами ША степени (п=16). ВI группе (п=10) (у 4 больных-10% и у 6 больных около 12% поверхностности тела) лечение ОР проводилось традиционными методами без применения клеточной терапии (контроль), во II группе (п=6) (у 6 больных ожоговая поверхность составляла около 15% ) - лечение традиционными методами дополнялось трансплантацией клеток (аллогенных ФМСК) на поверхность ОР.

У больных контрольной группы местная терапия состояла из ежедневных перевязок с наложением влажно-высыхающих повязок в течение 7-8 суток из - за обильной плазмарреи. В первые сутки гистологически в ОР выявлялся полный некроз эпидермиса и его десквама-ция. В микро со суд истом русле дермы изменения проявлялись расширением и полнокровием сосудов, эритро и лейкодиапедезом. Волокнистые структуры соединительной ткани поверхностных слоев дермы находились в состоянии дезорганизации и деструкции. Некротизированный эпидермальный и принекротический слои дермы были инфильтрированы клетками моноцитарно-макрофагального ряда; на поверхности ОР и в составе экссудата выявлялась обильная микрофлора. На 3 сутки изменения в ОР мало отличались от первых суток наблюдения. Гистологически, по краям раны углублялся некроз эпидермиса и его десквамация, изменения в сосочковом слое прогрессировали. Межклеточные пространства в принекротическом

слое дермы были инфильтрированы клетками моноцитарно-маркофа-гального ряда; цитологически наблюдалось большое скопление микрофлоры, фагоцитоз оставался слабо выраженным. Планиметрия на 3 сутки не выявила уменьшения площади ОР по сравнению с предыдущим сроком наблюдения.

К 7 суткам в контрольной группе в ОР лишь местами появлялась грануляционная ткань и намечалась тенденция к сокращению площади ожоговой поверхности за счет её эпителизации по островковому типу (рис. 2). Плазмаррея из ОР значительно уменьшалась и в большей части ОР имело место образование коричневатого струпа, который плотно прилегал к подлежащим тканям и трудно отделялся при механическом удалении.

При гистологическом исследовании биоптатов из зон повреждения на этом сроке, по-прежнему сохранялись признаки клеточной инфильтрации преимущественно в центральных зонах ОР, местами появлялись островки слабо регенерирующего эпидермиса, а в дерме отмечались изредка разбросанные новообразованные сосуды; происходило формирование грубых коллагеновых волокон. В биоптатах из зон с ожогами ША степени, взятых на 7 сутки, на поверхности ОР вьивлялись редкие участки многослойного плоского эпителия, базальная мембрана под клетками базального слоя эпидермиса местами

18,00

£ 16,00

I 14,00 Л .

Л 12,00

рЗ ю.оо 8,00

4,00 2,00

- ■

Г"«—■

1 ------ --о------АЛЛО ML.1V

• 1 " 1

ч \

\

т г*-.-

ч% -

1 сутки

Зсутаи

7сутки

15 сутки Время после ожога

Рис. 2. Динамика уменьшения площади поверхностных ОР у больных после трансплантации суспензии ФМСК. ** - Р<0,01 по сравнению с контролем (стандартная терапия).

отсутствовала, отмечались мелкие, единичные новообразованные сосуды (рис. 3) и клетки фибробластического ряда.

Таким образом, у больных контрольной группы деструктивные процессы в ОР стабилизировались к 7 суткам наблюдения и с этого периода деструктивная фаза раневого процесса начинала, отчетливо сменятся репаративной фазой. В результате к 15 суткам в условиях активизации процессов эпителизации площадь обширных ОР начинала сокращаться и достигала 4% исходной площади ОР.

В отличие от контрольной группы у больных II группы, где дополнительно трансплантировались на поверхность ОР аллогенные ФМСК, уже через 20 мин после иммобилизации клеток плазмаррея прекращалась. Больные отмечали значительное уменьшение болей и, по-видимому, эти факторы предотвращали развитие шоковой реакции, обычно возникающей у больных в острой фазе. Гистологические изменения в первые сутки практически не отличались от контрольной группы, но были менее выражены. На 3 сутки ОР с трансплантированными ФМСК была практически сухой, поверхность раны становилась более уплотненной и под пленкой визуально определялась сеть новообразованных сосудов (рис. 3). Гистологически в биопта-тах, взятых из ОР на 3 сутки, местами появлялись островки регенерирующего эпидермиса, а в дерме отмечалась сеть сосудистых разветвлений; происходило формирование и структурирование колла-геновых волокон. Лимфо-лейкоцитарная инфильтрация была не столь выраженной и увеличивалось количество фибробластов вокруг мелких капилляров. Планиметрически к этому сроку выявлялась тенденция к сокращению площади ОР за счет стимуляции краевой эпителизации и появления островковой эпителизации на поверхности ОР.

К 7 суткам при использовании ФМСК образованная пленка легко удалялась с поверхности ОР, новообразованный эпидермис равномерно покрывал ожоговую поверхность. В результате активной эпителизации площадь поверхности ОР резко сокращалась и к 7 суткам становилась достоверно меньше (Р<0,01), чем в контрольной группе (рис. 2).

У этих больных на 7 сутки гистологически на фоне высокой плотности новообразованных сосудов (рис. 3) и появления коллагено-вых волокон лучше сохранялись жизнеспособные эпителиальные элементы кожи; эпидермис был более сформирован за счет регенерирующих клеток базального слоя, отмечалось увеличение количества

Л30

ь 1

£ а 25 I Я

120 §

О

»15 10

**

-1 -фмск

■ Контроль

**

3 сутки 7 сутки

Рис. 3. Средняя плотность новообразованных сосудов в поверхностных ОР на 3 и 7 сутки после применения клеточной терапии.

** - Р<0,01 по сравнению с контролем.

клеток шиповатого слоя. В участках отсутствия базальной мембраны также отмечался рост эпидермальнош слой различной степени выраженности. В мазках отпечатках с поверхности ОР на 7 сутки обнаруживали уменьшение количества лейкоцитов, но относительное увеличение лимфоцитов, фибробласгов и полибластов. Относительное содержание макрофагов в ране и их фагоштар] ш активность у больных с клеточной терапией были достоверно выше, чем в контрольной группе (рис. 4).

В этот период уже до 10-15% клеток от общего количества фагоцитов содержали в цитоплазме микрофлору или продукты распада клеток. К 15 суткам наблюдения даже обширные ожоговые поверхности полностью регенерировали. Таким образом, использование аллогенных ФМСК у больных с поверхностными ожогами способствовало повышению темпа их регенерации: процесс смены фаз регенераторного процесса наступал раньше уже на 3 сутки, тогда как в контроле этот период наступал к 7 суткам.

Учитывая, что ускоренное заживление поверхностных ран при применении клеточной терапии уже на 8 сутки способствовало почти полном)' покрытию их эпидермисом, дальнейшие исследования ран в этой серии нами не проводились.

а „ 1(10.00

1 I

I ? 140,00

И 4 ; =

£ | Ш,«>

I I

г I 100,00 §0,00 мэ

40,00 20,00 0,00

12 3456705 10 II

Рис. 4. Клеточный состав мазков-отпечатков из раны на 7 сутки при поверхностных ожогах. 1 - эндотелиоцнггы; 2 - нейтрофилы; 3 - эозинофилы; 4 - большие лимфоциты; 5 - лимфоциты; 6 - макрофаги и по л иб ласты; 7 - фибробласты; 8 - плазмоциты; 9 - моноциты; 10 - ФМСК;

II - фибробласты с очень крупными ядрами и цитоплазматическими выростами. * - Р<0,05 по сравнению с контролем.

Исследования показателей эвдотоксикоза у больных с поверхностными термическими ожогами по (общепринятому протоколу обследования больных (определение креагинина. мочевины, билирубина, АсАТ, АлАТ, лейкоцитарная формула крови и расчет ЛИИ) показало, что в обеих группах больных функции печени и почек не нарушались, однако, трансплантация ФМСК способствовала повышению лимфоцитов в крови до 30,2±5,0 %, вместо 20,8=3,7% в контроле, а также снижению ЛИИ до 1,1±0Д у.е. вместо 2,5±0,7 у.е. в контроле к 7-8 суткам наблюдения.

Таким образом, проведенное сравнительное исследование заживления ОР без применения клеточной терапии и с использованием аллогенных ФМСК выявило более высокий темп регенерации поверхностных ОР при использовании ФМСК. Мы полагаем, что более высокий теми заживления поверхностных ран при использовании клеточной терапии связан с жизнедеятельностью трансплантированных клеток, которые стимулируют неоангиогенсз и созревание грануляцион-

- ФМСК Ц ■ Коятрв.ть

■

и

1 1

т г

|| К 11 Г т

^—Д|_ ■ —1 1, г*Л , 0 ^ __ п I

ной ткани, а также способствуют бурном}' развитию эпидермиса и это происходит на фоне устранения иммунной дизрегуляции в организме.

Регенераторный процесс в ОР без применения клеточной терапии так же имел место, но темп его был более замедлен.

Вышеизложенное позволяет считать трансплантацию аллоген-ных ФМСК альтернативным методом по отношению к традиционному методу лечения. Этот метод способствует сокращению сроков восстановительной регенерации поверхностных ОР и способствует более быстрой реабилитации больных.

3.2. Аллогенные ФМСК в комплексном лечении глубоких ожогов

Эффективность воздействия ФМСК была изучена нами в 2 х группах больных с ожогами ШБ степени (п=25). В I группе (п=10) лечение ОР проводилось традиционными методами с включением противошоковой терапии, но без применения клеточной терапии (контроль), во II группе (п=15) - лечение традиционными методами дополнялось трансплантацией аллогенных ФМСК на поверхность ОР.

В обеих группах площадь термического повреждения варьировала от 10 до 20% поверхности тела большего числа больных. Только у 2 больных I группы площадь ожога составляла около 30%; во II группе у 2 больных площадь поражения составляла 30-40% и у 2 больных около 50% поверхности тела; все больные при поступлении в клинику находились в тяжелом состоянии. У них сразу проводилась инфузионная противошоковая и детоксикационная терапия. Для выявления демаркационных границ ОР в течение 2-3 дней на область ран накладывались дезинфицирующие влажно-высыхающие повязки. Для предотвращения всасывания токсинов го поврежденной собственной кожи и дальнейшего развития ожоговой болезни, зоны некроза на 2-3 сутки иссекали дерматомом (некрэктомия) т.е. ОР превращали по возможности в относительно чистую хирургическую рану. Проводили тщательную санацию ОР раствором детергентов и ополаскивали рану физиологическим раствором, готовя её таким образом к аутодермо-пластике так как из-за особенностей строения кожи человека (отсутствия контрактильности) и гибели при обширных ожогах ШБ степени росткового слоя эпидермиса нельзя рассчитывать на самостоятельное закрытие ОР.

В контрольной группе для выявления грашщ раны первые 2-3 дня продолжалось лечение мазевыми повязками. Через 1-2 дня после выявления границ проводилась некрэкшмия (4-5 сутки раневого процесса); через 3 суток после некрэктомии (6-7 сутки развития раневого процесса) у большей части больных ОР были покрыты фибринным 11алетом и имели бледно-розоватый опенок, края раны были набухшими, эпидермис отслаивался и тем самым увеличивалась площадь поражения кожи,

Г"исто.логически на 6-7 сущи раневого процесса (3 сутки после некр-жтомии) на дне раны определялись расширенные и полнокровные капилляры, сладж и диапедез эритроцитов, нарастание клеточной инфильтрации тканей пораженных зон. Волокнистые структуры соединительной ткани дермы находились в состоянии дезорганизации, коллагеновые волокна деструкгурированны. Межклеточные пространства в сохранившихся зонах дермы кожи были И1 фмьтрированы клетками моноиитарно-

- х 1К0

К я о 2

г. ? 160

Л 4* О ""

2 с ' * 111)

Г 5

- £

| I Ш т яо 60 40

0

Рис. 5, Клеточный состав мазков-отпечатков из раны на 6-7 сутки раневого процесса при глубоких ожогах (3 сутки после некрэктомии) 1 - эндотелиоциты; 2 - нейтрофнлы; 3 - эозинофилы; 4 - большие лимфоциты; 5 - лимфоциты; 6 - макрофаги и полибласты; 7 -- фиброб-ласты; 8-плазмошегы, 9 - моноциты; 10-ФМСК; 11 - фибробласты с оче(Еь крупными ядрами и цитоплазматическими выростами. * -Р <0,05 по сравнению с контролем

■ ФМСК Щ - Контроль

*

г 1

И А. .Л .г^

123<1567Я9 1(111

макрофагального ряда. Нацитограммах мазков (рис. 5) раневого отделяемого определялось преобладание нейтрофилов, лимфоцитов; полибласты и макрофаги были малочисленны; фагоцитоз был ингибирован (единичные клетки с микрофлорой в цитоплазме). Стафилококковая микрофлора большими скоплениями лежала свободно вне клеточных структур.

У больных II группы, на 1 сутки после иссечения некротизирован-ных тканей производилась санация ОР и затем трансплантация алло-генных ФМСК. У этих больных на поверхности ОР через 20-30 мин после имплантации клеток происходило образование тонкой пленки, которая способствовала отчетливому уменьшению плазмарреи. Через сутки после применения клеточной терапии повязки были сухими и легко снимались с раневой поверхности. При механическом удалении образовавшейся пленки с ОР были видны островки новообразованных сосудов.

Гистологически через 3 суток после имплантации ФМСК (6-7 сутки раневого процесса) имело место уплотнение поверхностных слоев поврежденной ткани, образование тонкостенных мелких капилляров и снижение лейкоцитарной инфильтрации по сравнению с контролем. Цитологически выявлено снижение количества зрелых полибластов и макрофагов, особенно нейтрофилов, увеличение эндотелиоцитов и лимфоцитов, а также фибробластов разных типов (рис. 5).

Состояние больных ко1прольной группы на 3 сутки после иссечения некротизированной кожи по сравнению с предыдущими днями ухудшалось: они становились адинамичными, теряли в весе. Несмотря на комплексную терапию, картина ожоговой болезни нарастала. Больные II группы, которым на ОР трансплантировали суспензию аллогенных ФМСК, на 3 сутки после очищения ОР и трансплантации ФМСК выглядели значительно лучше, чем больные в I - контрольной группе. Движения в обожженных конечностях у них осуществлялись в значительном объеме. По клиническому состоянию больных было видно, что ожоговая болезнь и эндогенная интоксикация не прогрессировали, больные легче вступали в контакт и отмечали ослабление болей в области раны. Субъективно больные отмечали значительное улучшение общего состояния по сравнению с предыдущими днями.

11оскольку трансплантированные ФМСК не могут служить источником образования кератиноштов, но стимулируют, по нашим данным, развитие грануляционной ткани и сосудов в ОН использование их создает благоприятные условия для закрытия раны и проведения операции аутодермопластики (АДП), Именно поэтому на 3 сутки после трансплантации ФМСК (6-7 сутки после возникновения ожога ) на фоне очищения раны и возросшей васкуляризации, мы могли осуществлять пересадку расщепленной и перфорированной аутокожи на раневую поверхность с коэффициентом перфорации 1:4. К 8-9 суткам раневого процесса (через 2-3 суток после АДП) ОР становились сухими; визуально в ячейках отмечался рост эпителиальных клеток с краев трансплантированной аутодермы. Подаутотрансллантатом определялась розовая грануляционная ткань с густо развитой сетью сосудов. У 14 из 15 больных 11 группы Эпителизация раны практически полностью завершалась через 7 -10 суток после проведения АДП (на 14-17 сутки раневого процесса). В одном наблюдении из-за увлажнения повязки

§ 45

&

8 40

I з

а I 35 ¡1

13 зо &

125

с 1

20 15 1«

5

0

3 сутки 7 сутки

(2-3 суток после АДП) Рис. 6. Средняя плотность новообразованных сосудов в глубоких ОР

на 3 и 7 сутки раневого процесса без и на фоне применения ФМСК.

** - Р < 0,01 по сравнению с контролем

■р - ФМСК Щ - КацтфОлк

**

1 1 1**

мочой пересаженная аутодерма частично отторглась, что увеличило срок заживления ОР до 21 суток.

Гистологически на срезах, взятых из раны на 3 и 7 сутки раневого процесса, при использовании ФМСК отмечалось уменьшение клеточной инфильтрации, увеличение количества фибробластов, а также происходил рост сосудов преимущественно в вертикальном направлении к поверхности ОР (рис. 6). На 14-17 сутки раневого процесса гистологически после завершения эпителизации в области раны отмечалось уменьшение количества сосудов и лимфо-лейкоцитарной инфильтрации. Происходило дальнейшее формирование коллагеновых волокон и образование базальной мембраны.

У 6 из 10 больных контрольной группы, которым на 7 сутки также была трансплантирована перфорированная аутокожа, внутри ячеек плазмаррея прекратилась, однако подлежащие ткани оставались бледной окраски визуально даже через 2-3 суток после АДП. Развитие эпидермиса внутри ячеек происходило медленным темпом.

Гистологически у этих больных на 2 сутки после АДП мы также отмечали развитие сосудов в вертикальном направлении, однако их количество было значительно меньшим по сравнению с больными II группы (рис. 6). При неосложненном течении раневого процесса полная эпителизация ячеек у больных контрольной группы происходила на 14-18 сутки после АДП или на 21-25 сутки раневого процесса, тогда как в группе больных с трансплантацией ФМСК на 14-17 сутки раневого процесса. Однако у 4 больных контрольной группы на 3 сутки после АДП местами на ожоговой поверхности возникала плазмаррея, аутокожа начинала набухать, повязка пропитывалась раневым отделяемым и развивался ее частичный лизис. У 2"х из этих болных на фоне активизированной эпителизации произошло самостоятельное заживление ОР. У 2_х оставшихся больных после санации зон лизиса на 13-14 сутки раневого процесса производили повторную операцию АДП. Эпителизация ячеек у этих больных после повторной трансплантации аутодермы наступала на 27-32 сутки после возникновения ОР. Важно подчеркнуть, что выявленное ускорение приживления аутологичной кожи в основной группе (с трансплантацией ФМСК) происходило несмотря на более тяжелый контингент больных в этой группе по сравнению с контролем.

Для контроля и коррекции проявлений ожоговой болезни осуществляли забор венозной крови для биохимических исследований. Было установлено, что в первые сутки (2-4 сутки) при глубоком ожоговом поражении кожи у всех больных возникали тяжелые нарушения функции почек и печени. Содержание креатинина и мочевины в сыворотке крови значительно превышали нормальные показатели, что, очевидно, было связано с поступлением в организм через ожоговую поверхность продуктов белкового распада тканей и микробных токсинов, способствующих развитию синдрома системной воспалительной реакции. На фоне проведения комплексной терапии без трансплантации культивированных ФМСК(группа1 - контрольная) на 15-16 сутки наступало лишь недостоверное снижение уровня креатинина и мочевины (с 163,3±32,8 до 148,60±33,46 мкмоль/л и с 17,8±2,9 до 15,63±5,48 мкмоль/л соответственно), общего билирубина (с 25.2±3,9 до 22,0=4,7 мкмоль/л), АсАТ (с 28,0±3,2 ДО 30,Ш,9 усл. ед/л) и АлАТ (с 28,7±3,2 до 23,7±2,5 усл. ед/л).

После трансплантации на ОР аллогенных ФМСК на 15-16 сутки в отличие от контрольных наблюдений происходило достоверное снижение уровней креатинина и мочевины (с 166,0±32,0 до 86,6±24,4 мкмоль/л и с 17,8±3,3 до 9,3±2,8 мкмоль/л соответственно), АсАТ и АлАТ (с 27,8±2,7 до 19,8±2,0 усл. ед/л и с 28,5±2,7 до 17,9±2,8 усл. ед/л соответственно) в плазме крови по отношению к исходному уровню (2-4 сутки) и по отношению к контролю, причем нормализация этих показателей шла параллельно с ослаблением клинических проявлений эндотоксикоза.

Лейкоцитарная формула крови у больных с глубокими ОР в исходе в обеих группах наблюдений имела значительные отклонения от нормальных величин. Отмечено существенное снижение уровня лимфоцитов как в контрольной так и в группе с иммобилизацией ФМСК на ОР (15,0±4,2% и 16,2±3,8% соответственно), а также повышение значений отношения сегментоядерных нейтрофилов к лимфоцитам (4,6 и 4,2 соответственно). Традиционная терапия без применения клеточной терапии на 15-16 сутки наблюдений не приводила к повышению уровня лимфоцитов однако наметилась тенденция снижения отношения сегментоядерных нейтрофилов к лимфоцитам с 4,6 до 3,3. У больных, где применялась местно клеточная терапия в сочетании с комплексной

общей традиционной терапией происходило достоверное повышение в крови лимфоцитов до 29,1 ±4,0% (Р<0,05) и снижение отношения сегментоядерные нейтрофилы/ лимфоциты с 4,2 до 2,1.

Анализ показателей лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ) у больных с глубокими ожогами кожи показал, что исходные значения ЛИИ и в контрольной, и в основной группе с применением ФМСК были в пределах нижних границ декомпенсированного состояния иммунной системы - 8,13±1,52 и 8,0±1,4 у.е.; к 15 суткам после традиционной терапии значения ЛИИ почти не изменились (7,74±3,07 у.е.), однако в группе с трансплантацией аллогенных ФМСК наступало достоверное снижение ЛИИ до 2,33± 1,77 у.е. (Р<0,01), т.е. значения ЛИИ стали близки к верхней границе нормы.

Таким образом, у больных с глубокими ожогами трансплантация ФМСК в составе комплексной терапии ОР предотвращает развитие клиники тяжелого ожогового шока, уменьшает риск развития проявлений ожоговой болезни, обеспечивает стабильность шмеостаза, предотвращает избыточную деструкцию тканей в паранекротической зоне и стимулирует репаративный процесс. Это выражается последовательным ослаблением в ране клеточной инфильтрации, развитием сосудистой сети, увеличением количества фибробластов, ускоренным созреванием грануляционной ткани, которая стимулирует процесс краевой эпителизации.

Терапевтический эффект аллогенных ФМСК обусловлен ускорением смены фаз раневого процесса: сокращением сроков выраженности деструктивно-воспалительной фазы и более быстрым развитием репаративной фазы процесса, способствующей заживлению ран. Присутствие и активное функционирование ФМСК в ране (продукция цитокинов О-СБИ, ТОР-р, 1Ь-10 и др.) способствуют восстановлению тканевого иммунитета в ране (гистологически определяется элиминация нейтрофилов и макрофагов и накопление лимфоцитов и плазмоцитов), а также иммунного гомеостаза в организме (снижение ЛИИ и восстановление соотношения сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов), которые участвуя в регуляции репаративных процессов в органах, способствуют ускоренному восстановлению адекватной детоксикационной функции печени, почек, кишечника и др.

3.3 Аутогенные ФМСК при пластике дефектов кожи (собственные клинические наблюдения)

Нами наблюдалось 2 больных, которым была произведена аутодермопластика кожи после трансплантации аутологичных ФМСК, забор которых и культивирование проводилось на фоне удовлетворительного общего клинического состояния.

I наблюдение - больная Ш. - 22 года, у которой произошел термический ожог кожи в возрасте 18 лет и который завершился образованием обширного послеожошвого рубца кожи в области лучезапястного сустава. Больной требовалась пластическая операция - аутодермо пластика (АДП) дефекта кожи.

II наблюдение больная К. -15 лет, у которой был поставлен диагноз Артерио-венозная макрофистулёзная дисплазия мягких тканей лица и требовалась косметическая операция - АДП после хирургического удаления врожденного дефекта кожи и поврежденных мягких тканей лица.

ВI и II наблюдении лечение включало этап проведения АДП для более быстрого и неосложненного приживления полнослойного ауто-трансплантата колеи. АДП проводили после предварительной трансплантации на сформированную раневую поверхность аутологичных ФМСК из аутологичного КМ. Мы исходили из того, что аутологичные ФМСК обеспечивают наиболее благоприятное заживление кожных ран (хотя достоверные различия между аллогенными и аутогенными ФМСК нами не подтверждены). Возможность использования аутологичных ФМСК, а не аллогенных, применяемых у ожоговых больных, была установлена нами после обстоятельного клинического обследования больных; было установлено удовлетворительное обще-соматическое состояние больных и отсутствие каких - либо признаков иммунной дизрегуляции, что позволило за 30 суток до операции произвести забор клеток аутологичного КМ и приготовить для трансплантации культуру аутологичных ФМСК.

Аутологичные ФМСК трансплантировали в количестве 20x103 кл/см2 на сформированную раневую поверхность непосредственно перед АДП.

Наблюдение за этими больными показало, что несмотря на довольно значительную коагуляцию сосудов раны во время оперативного вмешательства и трудности приживления свободной полнослойной аутодермы, в этих условиях трансплантированные аутогенные ФМСК способствовали полному приживлению трансплантированной кожи об-

щей площадью 200 ем2 в I наблюдении и площадью 190 см2 во II наблюдении. Бездефектное приживление полнослойных трансплантатов кожи обусловлено ускорением новообразования сосудов и восстановлением микроциркуляции, а также стимуляцией продукции коллагено-вого матрикса (коллаген I и III типа), формирующего «подложку» для аутологичного полнослойного кожного лоскута.

Подробное описание этих наблюдений с выписками из истории болезни и иллюстрациями результатов выполненной АДП приводится в диссертации.

ВЫВОДЫ

1. Трансплантация фибробластоподобных клеток - предифферен-цированных мезенхимальных стромальных клеток аллогенного или аутогенного КМ взрослых практически здоровых доноров повышает эффективность лечения ожоговых больных, а также кожных ран и дефектов, требующих проведения аутодермопластики.

2. Перед трансплантацией ФМСК из костного мозга на ожоговые раны необходимо осуществлять фенотипическую идентификацию этих клеток и оценивать их пролиферативную активность. Идентификацию культур ФМСК из КМ следует проводить морфологически, а также иммуно-гистохимически по белку цитоскелета - виментину, по поверхностному антигену - CD 133 и по коллагену III типа; для получения стабильно высокого процента живых и активно пролиферирую-щих ФМСК в культуре не следует использовать клетки КМ от обожженных доноров в остром периоде; следует применять ФМСК от здоровых взрослых доноров с 75-80% монослоем этих клеток и с повторением их пассажа не более 4 -5 раз (при этой кратности не изменяется фенотипический состав клеток).

3. Разработанная модель поверхностного и глубокого термического ожога кожи у животных со стандартно одинаковым размером зоны повреждения является адекватной для оценки эффективности лечения ОР методами клеточной трансплантации.

4. Аллогенные и аутогенные ФМСК из КМ интактных доноров также, как ФФ, ускоряют темп регенерации поверхностных и глубоких ОР при моделировании термического повреждения кожи. При выборе клеточного материала предпочтение следует отдавать ФМСК, так как использование их характеризуется более высоким темпом регенерации ОР, а на этапе направленного культивирования МСК отмечается более

высокий темп накопления клеточной массы. Отсутствие достоверных различий в регенерационной активности алло и ауто ФМСК практически здоровых доноров указывает на возможность использования этих клеток для стимуляции заживления ОР.

5. ФМСК, иммобилизованные на биомембранах, за счет сохранения нативных свойств клеток в монослое ускоряют регенерацию ОР на ранних сроках после их применения по сравнению с суспензией ФМСК.

6. Ускорение темпа заживления ОР под влиянием трансплантированных ФМСК достигается за счет ослабления выраженности деструктивно- воспалительной фазы раневого процесса и активизации пролиферативно - репаративной фазы. Заживление ОР сопровождается более быстрым темпом разрастания сосудистой сети (неоангиогенез) и формирования грануляционной ткани, а также активизацией краевой эпителизации, что уменьшает необходимость дополнительного забора ауто кожи и снижает риск развития грубых рубцов в зонах глубокого повреждения кожи.

7. Усиление пролиферативно-репаративной фазы раневого процесса при трансплантации ФМСК на ожоговую поверхность обусловлено присутствием и продолжающимся функционированием (продукция цитокинов) трансплантированных клеток в зонах повреждения (сохранение ß- галактозидазной активности у клеток, предварительно меченных Lac Z геном Е. coli).

8. Пересадка аллогенных ФМСК у больных с глубокими ОР позволяет оптимизировать подготовку ОР к ранней аутодермопластике, ускорить сроки и улучшить результаты приживления расщепленного и перфорированного кожного аутотрансплантата за счет активизации в ране процессов: новообразования сосудов, формирования грануляционной ткани и краевой эпителизации, ускоряющих закрытие перфорированных ячеек трансплантата эпидермисом. Аутодермотрансплантаты без подготовки ОР ФМСК могут подвергатся частичному лизису.

9. Аллогенные ФМСК, трансплантированные больным с глубокими ОР, позволяют снизить тяжесть клинических проявлений ожоговой болезни (тяжелой эндотоксикации и полиорганной недостаточности), а также предотвратить инфицирование ран.

10. Аутологичные ФМСК целесообразно использовать для лучшего приживления полнослойных трансплантатов аутокожи у планово -оперирующихся больных при лечении поздних послеожоговых Рубцовых деформаций и врожденных дефектов кожи.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При моделировании термической деструкции кожи использование металлического полого цилиндра с полусогнутым срезом, через который постоянно циркулирует вода, нагретая до 97,7° С, создает условия для получения стабильно воспроизводимых размеров ожоговой раны. Время экспозиции через влажную двухслойную салфетку (для увеличения проникающей способности тепла), должно составлять 5-6 сек для поверхностных и 8-9 сек для глубоких ожогов.

2. Для точного определения (с погрешностью до 0,001 см2) площади ожоговой раны необходимо производить фотографирование раны та фоне линейки и производить расчеты с использованием компьютерной программы "Видео ТесТ-Масгер 4.0 (ООО "ВвдеоТесТ", С-Пб.)".

3. При использовании суспензии культивируемых клеток количество пластик адгезивных клеток следует доводить до 80% монослоя, с пассажем до 4-5 раз, что может служить гарантией получения стабильно большого процента живых и активных ФМСК. При использовании биодеградируемой пленки с иммобилизованными фибро-бластоподобными мезенхимальными стромалышми клетками -клеточный монослой также не должен превышать 80%.

4. Биодеградируемые пленки следует удалять с ожоговой раны на 2-3 сутки после их наложения, чтобы избежать осложнений, обусловленных преципитацией белков на биодеградируемой пленке, снижающей её диффузионные свойства.

5. Клеточная терапия должна применяться местно, чтобы через индукцию восстановительных процессов в ране уменьшать потери белка и жидкости из организма, а также снижать тяжесть ожогового шока и препятствовать развитию ожогового истощения организма.

6. При крупных ожоговых центрах необходимо создавать криогенные банки аллогенных ФМСК и использовать эти клетки для сокращения сроков заживления поверхностных ОР и улучшения результатов приживления кожных аутотрансплантатов при глубоких ожогах.

7. Хорошее приживление свободного полнослойного кожного лоскута при лечении рубцовых деформаций кожи и при выполнении косметических операций может быть обеспечено с помощью аутоло-гичных предифференпированных ФМСК, предварительно иммобилизованных на раневую поверхность (2-3 суток).

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Уразметова М.Д., Расулов М.Ф., Уразметов К.Г., Саидов P.C., и др. Лечение ожоговых и вялогранулирующих ран с использованием культивированных аллогенных фибробластов // Метод, рекоменд. Ташкент. 1998. - 9с.

2. Расулов М.Ф., Уразметова М.Д. Результаты трансплантации культивированных клеток при поверхностных ожогах // Мед журн Узбекистана. - 2001. №2. - С. 4-6.

3. Уразметова М.Д., Расулов М.Ф. Опыт применения искусственно выращенных кожных клеток при глубоких ожогах // Медицинский журнал Узбекистана - 2001. №4. - С. 90-92.

4. Расулов М.Ф., Хаджибаев А.М., Уразметова М.Д. Применение аллогенных фибробластов у больных при обширных поверхностных термических повреждениях кожи // Мед. журн. Узбекистана - 2001. №5-6. - С. 87-88.

5. Уразметова М.Д., Расулов М.Ф., Джуманов УЮ. Применение искусственно выращенных кожных клеток при обширных ожогах // Сборник научных трудов «Экстрен, медицинская помощь в Узбекистане» г. Андижан. Июнь. 2001. - 256с.

6. Шумаков В.И., Расулов М.Ф. Применение искусственно выращенных эмбриональных аллофибробластов для биопластических операций при обширных ожогах //Конф-я посвященнная 75 летию и 50 летию практич. деятельности проф.И.Д. Кирпатовского 2002.19 с.

7. Расулов М.Ф., Крашенинников М.Е., Онищенко H.A. Применение аллогенных эмбриональных фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для биопластических операций при обширных ожогах // Вестн. трансплантол. и искусств, органов - 2002. № 3. - С. 90-91.

8. Шумаков В.И., Расулов М.Ф., Крашенинников М.Е., Зайденов В.А., Онищенко H.A. Сравнительная оценка эффективности применения аллогенных эмбриональных фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для терапии глубоких ожоговых ран // Вестн. трансплантол. и искусств, органов - 2002. №4. - С. 7-11.

9. Шумаков В.И., Онищенко H.A., Расулов М.Ф., Крашенинников М.Е, Зайденов В.А. Использование предифференцированных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для лечения глубоких ожоговых ран // Вестн. хирургии им И.И. Грекова - 2003. Т162. № 4. - С. 38-41.

10. Расулов М.Ф., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., и др. Фибробластоподобные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга подобно эмбриональным фибробластам стимулируют заживление поверхностных ожоговых ран // Вестн. трансплантол. и искусств, органов - 2003. № 3. - С. 46-49.

11. Онищенко Н. А. Крашенинников М.Е., Расулов М.Ф. и др. Экспериментальное обоснование терапевтической эффективности применения стволовых и прогениторных клеток костного мозга для регуляции восстановительных процессов в поврежденных органах // Тез. докл. конф. Стволовые клетки и их использование в Здравоохранении Май. 2003. - 40с.

12. Расулов М.Ф., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., и др. Использование перфтордикалина для ускоренного приживления фибро-бластов и МСК при лечении ожоговых ран // XIII Межд. конф по проблеме «Перфторуглеродные соединения в медицине и биологии». 2003.-67с.

13. Onischenko N.A., Krasheninnikov М.Е., Rasulov M.F.,Zorin V.L., Bersenev A. V., Potapov I. V., Zajdenov V.A., Bashkiria L. V. Tissue engineering approaches for treatment of organ disfunction, by bone marrow-derived mesenchymal stem cells //Tissue Engineering - 2003; 9(4):788 (abstract 24).

14. Onischenko NA, Krasheninnikov ME, Rasulov M.F., Potapov IV et al. Experimental models and technological approach for the estimation of therapeutic efficiency of organ dysfunction, by bone marrow-derived mesenchymal stem cells //Int J Artif Organs - 2003; 26; 7:563 (abstract 127).

15. Шумаков В.И., Онищенко H.A., Расулов М.Ф., и др., Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга эффективнее эмбриональных фибробластов стимулируют регенерацию ожоговых ран //БЭБ и М,- 2003. 136. 8.-С. 220-223.

16. Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., Расулов М.Ф., и др. Использование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для лечения органных дисфункций//Биотехнология: состояние и перспективы развития. 2-й московский международный конгресс. Ноябрь 2003.-40с.

17. Перова Н.В., Порунова Ю.В., Урьяш В.Ф., Фаминская Л.А., Крашенинников М.Е., Расулов М.Ф., и др. Биодеградируемый коллагенсодержащий матрикс Сферогель™ для биоискусственных органов и тканей // Перспективные материалы. - 2004. №2. - С. 52-59.

18. Онищенко Н.А., Расулов М.Ф. Применение стволовых клеток и ранней кожной пластики при лечении обширного глубокого ожога // Ярославское-Костромское-Вологодское науч общество травмат- ортопедов. 2004. - 45 с.

19. Расулов М.Ф., Васильченков А.В., Крашенинников М.Е. и др. Трансплантация мезенхимальных стволовых клеток костного мозга ускоряют процесс заживления ожоговых ран и реабилитацию больных // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2004. № 4. - С. 32-33.

20. Расулов М.Ф. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга и эмбриональные фибробласты ускоряют регенерацию глубоких ожоговых ран // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2004. №1.(15) -С. 7-9.

21. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е. Расулов М.Ф. и др. Экспериментальное обоснование эффективности применения стволовых и прогениторных клеток костного мозга для регуляции восстановительных процессов в органах при их остром и хроническом повреждении //Вестн. РАМН. - 2004. №9. - С. 44-47.

22. Расулов М.Ф., Севастьянов В.И., Зайденов В.А. Использование иммобилизированных на биодеградируемой мембране предиф-ференцированных клеток костного мозга при глубоких ожогах // Тез конф. Человек и лекарство М. 2004. - 340с.

23. Онищенко Н. А. Крашенинников М.Е., Расулов М.Ф., и др. Применение стволовых и прогениторных клеток костного мозга для регуляции восстановительных процессов в поврежденных органах // II Международ конфер «Патфизиологоия и современная медицина» М. - 2004. - 298 с.

24. Расулов М.Ф., Севастянов В.И., Зайденов В.А., Перова Н.В. Ускорение регенерации при трансплантации алло и аутогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга на поверхность ожоговых ран// III Международный конгресс патофизиологов. Ноябрь. 2004. М. - 236с.

25. Rasulov MF, Bogatyrev SR., Transplantation of bone marrow-derived stem cells immobilized on bioceramical membranes in treatment of deep skin burn wounds in rat model // 15th European Students' Conference for future doctors and young scientists. 19-23 October - 2004, Berlin, Germany. - P. 302-303.

26. Расулов М.Ф. Ускорение заживления глубоких ожоговых ран при трансплантации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, иммобилизованных на биодеградируемых пленках или снятых с культуральнош пластика // Межд. научно практ. конф. «Управление качеством медицинской помощи на основе стандартизации и доказательной медицины». Красногорск. Декабрь. 2004. - 313с.

27. Расулов М.Ф., Васильченков A.B., Онищенко H.A. и др. Первый опыт применения мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для лечения больной с глубокими ожоговыми ранами кожи // Клеточн. технол. в биол. и мед. - 2005. №1. - С. 42-46.

28. Расулов М.Ф., Севастьянов В.И., Егорова В.А. и др. Сравнительное изучение динамики заживления глубоких ожоговых ран при использовании аллогенных фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, иммобилизованных на биодеградируемых мембранах или снятых с культуральнош пластика // Патологии физиология и эксперимент, медицина - 2005. №2. - С. 20-23.

29. Расулов М.Ф.. Опыт применения мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для лечения больного с поверхностными ожоговыми ранами кожи // Веста эстетической медицины - 2005. №1. - С. 22-25.

30. Расулов М.Ф. Клеточные технологии в клинике эстетической медицины Применение эмбриональных алло фибробластов и МСК КМ для биопластических операций при обширных ожогах и повреждениях кожи // Сборник тезисов. IV Международного конгресса. Kocmetik international Москва. Февраль. 2005. - 97с.

31. Расулов М.Ф. Клеточные технологии в эстетической медицине // Материалы V Международного конгресса эстетической медицины Москва, Сентябрь. 2005. - 32с.

32. Долгих М.С., Григорьева А.Ю., Жигулин А.О., Зайденов В.А. Расулов М.Ф., и др. Применение рекомбинантной аденовирусной конструкции AdSV40-ßgal для мониторинга трансплантированных клеток // Клеточн. технол. в биол. и мед. - 2005. № 3. - С. 146-150.

33. Расулов М.Ф., Онищенко H.A. Биоэтические вопросы связанные с клеточной технологией: Тез. докл. // Ташкент. Сентябрь. 2005.-203с.

34. Rasulov MF, Bogatyrev SR., Local transplantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves bum wound regeneration in rat

model //11th Europ. Burns Association Congr.. Sept. 21-24, 2005. Estoril - PORTUGAL. Abstractbook.

35. Потапов И.В., Севастьянов В.И., Егорова B.A., Зайденов В.А., Расулов М.Ф. Стромальные клетки костного мозга, иммобилизирован-ные на мембранах ЭластоПОБ®, создают условия для регуляции процессов восстановительной регенерации // Маг. III Всероссийского съезда по трансплантол. и искусств, органам. Москва. Октябрь. 2005. - 55с.

36. Расулов М.Ф. К механизму ускоренной регенерации ожоговых ран при трансплантации аллогенных стромальных стволовых клеток костного мозга // Мат. III Всероссийского съезда по трансплантол. и искусств, органам. Москва. Октябрь. 2005. - 56с.

37. Василенко В.Т., Расулов М.Ф., Зайденов В.А. Морфологическое подтверждение ускоренной регенерации глубоких ожоговых ран при трансплантации фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга // Мат. III Всероссийского съезда по трансплантол. и искусств, органам. Москва. Октябрь. Вестн трансплантол. и искусств, орган. 2006. №1. - 53 с.

38. Березин В.Н., Веденин И.А., Расулов М.Ф. Ускоренное восстановление клинико-морфологических показателей у больных после трансплантации стромальных клеток аллогенного костного мозга на поверхность глубоких ожоговых ран. //' Мат. III Всероссийского съезда по трансплантол. и искусств, органам. Москва. Октябрь. 2005. Вестн трансплантол. и искусств орган. 2006. №1. - 56с.

39. Расулов М.Ф. Регенерация ожоговых ран при трансплантации алло и аутогенных стромальных клеток костного мозга //Международная конференция «Новые технологии в трансплантации фетальных клеток и их медиаторов» Казахстан г. Астана. Ноябрь. 2005. - 130с.

40. Расулов М.Ф., Василенко В.Т., Зайденов В.А. Клеточная трансплантация ослабляет воспалительную реакцию и стимулирует репаративные процессы в ожоговой ране // Клеточн. технол. в биол. и мед. 2006. №3. С. 127-131.

41. Быстров А.В., Поляев Ю.А., Погодина М.А., Расулов М.Ф., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А.. Использование аутогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для приживления свободного полнослойного кожного лоскута в зоне с выраженной гипо-перфузией мягких тканей, обусловленной артерио-венозным шунтированием // Клеточн. технол. в биол. и мед. - 2006. №3 - С. 137-141.

Заказ №417. Объем 2 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 wvnv.postator.ru

Ожоговые поражения кож» стали а современном мире одним hi наиболее социально значимых и распространенных типов травматических повреждений человека (Аэолов В В. к др., 1997, I999J.

Наряду с возросшей частотой термического поражения кожи в последние десятилетия резко повысилась нх тяжесть, (увеличилось число ожоговых бальных с сочетали ой механической и термоингаляннонной травмой), а также летальность (Багдатьев В.Е. и Др, 1996; Аэолов ВВ. и др., I999J, которая в России достигла 3,3% и продолжает увеличиваться [Герасимова ЛИ, 1999], особенно среди детей раннего возраста [Будкевич Л.И., 1998; Воздвиженский С И. и др., 1999]. Высокая летальность, а также ннвалидикщия больных после глубоких или обширных ожоговых поражений ножи, послужило поводом к совершенствованию интенсивной и летокенкацнонной терапии, применению антибиотиков и нммунокоррекгоров [Распугни П Г. н др., 1992. Багдатьев B E. и др., 1996; Адамян А А и др., 1998; Герасимова ЛИ, и др., 1996; 1999; Ведерникова O.JL и др-, 1999; Алексеев А,А. н др„ 1999, Reiniann РМ е( а!-, 1990, Dueling A, et al., I994J, а также методов раннего "закрытия" ожоговых поверхностей аутадермотрансплантатэмн для предотвраще-ння потерь организмом жидкости и плазменных белков и защиты ран oi инфекции [Смирнов С.В и др., 1998; Germann G et al-, 1995, Гришксвнч В М. и др., 1996; Воздвиженский СИ. и др., 1996, 1999; Тюрннко» Ю.И. и др., 1997),

Между тем, при обширных глубоких ожогах кожн (более 20-30 % поверхности тела) закрытие ожоговых ран при помощи перфорированных аутодермотранешмитаитов оказалось весьма травматичным и даже невозможным для пострадавшего из-за дефицита его донорских ресурсов [Матчнн Е.Н. и др., 1998, 2000, Qaiyoule S. et al. 2001; Erhlich HP el al-, 2004].

В последние двадцать лет для улучшения результатов лечения ожоговых ран и снижения трэвматичности хирургического лечения, сочетающегося с ауто-дермопластикрй. а также для снижения остроты дефицита донорского материала стали осуществлять трансплантацию кзеток кожи и биоинженерных конструкций с иммобилизованными клетками для ускоренной реабилитации ожоговых больных.

Первоначально ant трансплантации использовали культивированные ауто и аллогенные кератиноциты [Туманов В П. н др., 19Я9; O'Connor N E. с( aL, 1981; Aliulo К. й aL, 19fi2; Dc Lapp el aL. 1990; Duinslaeger L-A.Y. ct a]., J994; Wood P.M., 1996], затем стали применять культивированные аллофнбробласты кожи [Саркнеов Д.С. н др., 1991,1996, 1998] н фетальные фибробласты [Саидгалнн ГЗ., 2000; Фдапов АД, 2003J

Однако применение фстальных фнбробпктоа оказалось затруднительным в связи с нерешенностью этических, правовых и юридических проблем забора н использования этого материала; использование культивированных кератиношгтой и фибробластов ю кожи взрослого человека не получило широкого распространения и i- a высокой себестоимости процедуры наращивания клеточной массы в культуре В последние 5-8 лет в свяэи с развитием учения о стволовых клетках н, прежде всего, учения о мезенхнмалькых строыальных клетках (МСК) - костного мо:иа (КМ), появилась возможность их легитимного применения в практической ком-бустнологин для ускоренного закрытая ожоговых поверхностей н спасения больных с обширными и глубокими (критическими) ожогами,

Однако, в 2000 году приступая к исследованию результативности применения клеточных технологий в комбустнолошн. мы не обнаружили работ, касающихся применения преднфферендироваиых фибробластоподобных МСК аллогснного и аутогенного КМ для лечения ожоговых ран, а также для реанимации и реабилитации больных с ожогамн

Цслн и задачи исследовании. Цель исследования - изучить целесообразность трздеилантзднн фмбробллетолоаобных МСК, т.е- яреднфференциро-ванных мезенхнмальных стромальных (проге и игорных} клеток аллогснного и аутогенногокостногомозга для повышения эффективности лечения ожоговых ран и ускоренной реабилитации ожоговых больных.

Дая достижения поставленной цели бьши сформулированы следующие запачн 1 Воспроизвести модель поверхностного и глубокого термического ожога кожи со стандартно одинаковым размером юны повреждения для изучения терапевтических эффектов клеточной трансплантации.

2, Отработать технологию выделения мезеихимальных строгальных клеток ш костного мозг а. идентифицировать а культуре получение фюбробяасголодобгшх МСК и определить показания к применению аутогенных и аллогенных МСК для трансплантации на поверхность ран.

3 Отработан, технологию шмобшиош фиброблзстоподобных МСК КМ на биодегралнруемых мембранах и определить условия использования таких бноконструкцнй для заживления обширных ожоговых ран.

4. Сравнить и модельных опытах на крысах эффективность восстановитель-нот лечения поверхностных н глубоких ожоговых ран при трансплантант! феталь-ных фиброблаетов, а также алло и аутогенных фнбробластоподобных МСК КМ

5. Изучить особенности морфологии раневого процесса при использовании методов клеточной терапии.

Покатать на моделях термического ожога взаимосвязь активизации регенераторных процессов в ожоговой ране с присутствием в ней трансплантированных клеток (фстзльных фнбробластов, а также оллогсшшх и аутогенны* фибро-бластол сдобных МСК КМ).

7. Изучить влияние функциональной активности трансплантированных клеток аллогенных фнбробластотюдобных МСК на коррекцию клинических проявлений (детокенкация, нммун о коррекция) ожоговой болезни у больных с поверхностными и глубокими ожоговыми ранами.

8. Установить роль трансплантирован ных клеток для осуществления ранней яутадермопластики ожоговых ран и ускорения сроков приживления аушдермо-грансплантата,

9. Показать целесообразность ннтраоперацнониого использования аутологич-ных фибробластогюдобных МСК КМ для качественного приживления полнослой-иого лоскута аутокожи во время пластических онерашгй при лечении поздних после-ожоговых Рубцовых деформаций и при коррекции врожденных дефектов кожи

Научная новизна. В настоящей работе, выполнявшейся в рамках программы "Клеточные технологии - медицине" но заданию Росддрава (регистрационный номер-01.2.00 305442) представлены результаты изучения -эффективности при weнении прслиффсреншгрованных фнбробластоподобных МСК из алло н аутогенного КМ для местного лечения ожоговых ран н реабилитации ожоговых больных

Впервые в мировой практике для ускоренного заживления ожоговых ран применены культуры фнбробластоподобных меэенхнмадьных стромалвдых клеток из цветного мозга, идентифицированных морфологически. а также нммуногнстохи-мичееки по маркерам МСК - белку цнтоскелета - виментину. по поверхностному антигену - CD133 и по коллагену III типа.

Показано, что для получения стабильно высокою процента живых и активных фнбробластоподобных МСК (ФМСК) в культуре не следует использовать клетки ауталогнчного костного мотга от ожоговых больных в остром периоде; следует использовать ФМСК от аллогеиных доноров с 75-80 % монослоем этих клеток в культуре к с пассированием их не более 4*5 раз

Впервые на моделях термического повреждения кожи у крыс проведена сравнительная оценка темпов заживления ожоговых ран после трансплантации фетальных фибробластов. а также адлогенных и аутогенных фнбробдаетоподобн ых МСК КМ здоровых доноров. Установлено, что алло и аутогенные фнбробласто-полобнме МСК. так же как и фетальньге фнбро&члеш. достоверно повышают скорость регенерации поверхностных и глубоких ожоговых ран по сравнению со спонтанным их заживлением.

Показано, что при выборе клеточного материала предпочтение следует отдавать фибробласгоподобным МСК. а не фстальным фнбробластам. так как применение фнбробластоподобных клеток характеризуется более высоким темпом регенерации ожоговой раны, а на этапе культивирования более высоким темпом накопления клеточной массы но сравнению с фатальными фибробласгамн

С помощью рекомбинантиого аденовирусного вектора (содержащего l.ac-Z raiEcoli), внедренною в донорские клетки (фетатьные фибро&мсты, axio и аутогенные фибробластоподобные МСК) на этапе культивирования, доказано, что ускорение темпа регенерации ожоговых ран после трансплантации этих клеток связано с присутствием и функционированием (продукция ннтокинов) их в зонах термическою поражения (в сроках не менее 4 недель),

Показано, что у шэренне процесса заживления рш пол влиянием трансяланти-рованных клеток сопровождается существенным ускорением темпов разрастания сосудистой сети и формирования грануляционной ткани в области ожоговой раны Высказано предположение, что разрастание сосудистой сети предотвращает развитие грубых рубцовых изменений в зонах заживления ожоговой раны н сохраняет текстуру трансплантированной кожи

Установлено, что аллогеииые фнбробчастоподобные МСК КМ трансплантированные больным на глубокие ожоговые раны не только сокращают фазу деструктивных изменений в ране и способствуют осуществлению ранней ауп> дермопластики, но и приводят к более быстрому устранению клинических проявлений ожоговой болезни (восстановление функций органов детоксикацнн, снижение проявлений системной воспалительной реакции и иммунной яизрегуляцнн) Высказано предположение, что последнее связано с устранением цитокннового дисбаланса и продукцией противовоспалительных щпокинов.

Ускоренное заживление поверхностных н глубоких ожоговых ран в клинике связано со стимуляцией процесса образования микрососудов и созревания грануляционной ткаин, оптимизирующих условия >лнтели зашгн ожоговой раны.

Практическая значимость работы. Отработаны технологические режимы выделения и накопления в культуре фибробластоподобных МСК. Предложено для лечения ожоговых ран и ускорения их регенерации использовал, аллогенные, а для пластических операций аутологичные фнбробластоподобные МСК КМ,

Установлена целесообразность использования биодс градируемых пленок с иммобилизованными фнбробластонодобными МСК иа ранних этапах лечения ожоговых ран, при тгом клеточный монослой не должен превышать 80%,

Трансплантация агтогенных фнбробэотэлояобных МСК на поверхность глубоких ожоговых ран не только ускоряет темп нх заживления, но и ослабляет или лаже предотвращает возникающие проявления ожоговой болезни: эндотокенко-зы и поднорганную недостаточность.

Показано, «по трансплантация фибробластоподобных МСК способствует ускоренному осуществлению эутодермопластнкн ожоговой поверхности н повышает качество приживления кожного трансплантата

Положения, ввдпнгоемые «л защиту. Культивированные in vitro алло - и аутогенные фибробластоиодобные меэекхныАльные строшльные клетки из костного мозга, так же как и фетальные фнбробласты ускоряют темп регенерации ожоговых ран за счет длительного сохранения их жизнедеятельности в зонах трансплантации и продукции в раж биологически активных ростстнмулнрутшцнх факторов

Ускорение процесса заживления ран под влиянием трансплантированных фиброблаетоподобных мезеихимальиых стромальиых клеток сопровождается существенным ускорением темпов разрастания сосудистой сети и формирования грануляционной ткани в ОЖОГОВОЙ ране, что в свою очередь снижает вероятность образованна грубых рубцов в отдаленном послеоперационном периоде |ри выборе клеточного материала для трансплантации на ожоговую рану предпочтение следует отдавать аллогениым фнброблаетоподобным МСК из КМ, а не фетальнцм фнбробластам, так как их немользоваине способствует более высокому темпу регенерации ран. а на этапе подготовки клеточного материала к трансплантации отмечается более высокий темп нарастания клеточной массы

Иммобилизованные фибробластоиодобные МСК способствуют ускоренному заживлению ожоговой раны на раннем этапе раневою процесса, что связано с формированием в гаком монослое адекватных межклеточных взаимодействий, которые определяют более высокую функциональную активность иммобилизованных клеток.

Ток как фибробластополобные МСК КМ не являются продуцентами керзтино-цнгоа, то для окончательного закрытия глубоких ожоговых ран трансплантация этих клеток должна завершаться аутодерйтомдастнкой.

Внедрение результатов работы. Отработанные методики культивирования фиброблаетоподобных мезенхнмальных стромальиых клеток костного мозга использовались для получения клеточного материала и трансплантации пашен там травматологического отделения МУ ЦРБ г Оча Сахалинской обл., в Ожоговом центре большгны имени Н.В. Соловьева г. Ярославль, в ГО Российской детской клинической больнице Росздрава г, Москва

Аироби li 11 si диссертации, Л нробацпя работы состоялась ] 5 марта 2006 года на межлабораторной конференции в ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Федерального агентства по здравоохранению и социальному' развитию России,

Основные положения работы доложены и обсуждены: на конференции 'Новые оперативные технологии- (анатомические, экспериментальные н клинические аспекты) (Москва, нюнь 2002г.), на 11 Всероссийском съезде но трансплантологии н искусственным органам (Москва, октябрь 2002г.). на конференции Новые технологии - медицине. 1-я Всероссийская конференция "Стволовые клетки" и перспективы использования их в здравоохранении (Москва, май 2003г,}, на XXX Конгрессе Европейского общества искусственных органов (ESAO) (Германия Аахен, сентябрь 2003г,); на И ежегодном совещании Европейского общества по тканевой ннженерин (Италия. Генуя, сентябрь 2003г. К на Ученом сонете института пластической хирургии (Москва, январь 2603г.), на XIII Международной конференции по проблеме "Перфторуглеродные соединения в медицине и биологии" (Пущине, нюнь 2003г.), на Научном обществе травматологов и ортопедов Ярославской-Костромской'Вологодской областей (г Ярославль, март 2004г), на2-ой Международной конференции "Патофизиология и современная медицина", (Москва, апрель 2004г.), на конференции "Человек н лекарство" (Москва, май 2004г.), в Государственном комитете по науке и новым технологиям, (Москва, май 2004г.), на XIII и XV сессиях РАМН (Москва, февраль, ноябрь 2004г.). на III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, ноябрь 2004г.}, на Международной научно-практнческой конференции "Управление качеством медицинский помощи на основе стандартизации и доказательной медицины" (Красногорск, декабрь, 2004г.), на XV Европейской студенческой конференции будущих врачей и молодых ученых (Берлин, октябрь 2004г.), на I V и V Междунардном конгрессе Kocmetik international (Москва, февраль-сентябрь 2005г.), на Е Национальном конгрессе по биоэтике (Ташкент, сентябрь 2005г), на Ш Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам (Москва, октябрь 2005г.). на Конгрессе Европейской ожоговой ассоциации (Португалия - Эшторнл, сентябрь

2005с), на Международной конференции "Новые технологии в трансплантации фстальных клеток и их медиаторов" (Казахстан. г. Астана, ноябрь 2005г.).

Публикации. По теме диссертации опубликована 4] работа, in них 18 - в центральной печати. 7 - опубликованы за рубежом.

Объем и стру ктура работы. Диссертация изложена на 261 странице машинописного текста. Состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка цитированной литературы (522 источник, нз них 160 -отечественных и 362 - зарубежных). Работа иллюстрирована 69 рисунками и 18 таблицами,

212 ВЫВОДЫ

1 Трансплантация фиброблаетоподобных клеток - продифференцированных мезенхи мальных стромальиых клеток аллогенного или аутогенного КМ взрослых практически здоровых доноров повышает эффективность лечения ожоговых больных, а также кожных ран и дефектов, требующих проведения аутодермопластикн.

2 Перед трансплантацией ФМСК из костного мозга на ожоговые раны необходимо осуществлять феиотнпическую идентификацию этих клеток и оценивать их пролифератнвную активность Идентификацию культур ФМСК из КМ следует Проводить морфологически, а также нммуногнстохнмнчески по бедку цнтоскелега - виментину, по поверхностному антигену - CD 133 н по коллагену 111 типа; для получения стабильно высокого процента живых и активно проднфернрующих ФМСК в культуре не следует использовал» клетки КМ от обожженных доноров в остром периоде; следует применять ФМСК от здоровых взрослых доноров с 7580% монослоем этих клеток н с повторением их пассажа не более 4-5 раз (при этой кратности не изменяется фенотнпнческий состав клеток),

3 Разработанная модель поверхностного и глубокого термического ожога кожи у животных со стандартно одинаковым размером зоны повреждения является адекватной для оценки эффективности лечения ОР методами клеточной трансплантации.

4, Лллогенные н аутогенные ФМСК нз КМ интахтных доноров так же, как ФФ, ускоряют темп регенерации поверхностных и глубоких ОР при моделировании термического повреждения кожи. При выборе клеточного материала предпочтение следует отдавать ФМСК, так как использование их характеризуется более высоким темпом регенерации ОР, а на этапе направленного культивирования МСК отмечается более высокий темп накопления клеточной массы. Отсутствие достоверных различий в регенерацпонной активности алло и ауто ФМСК практически здоровых доноров указывает на возможность использования зтих клеток для стимуляции заживления ОР

5. ФМСК, иммобилизованные на бномембранах, за счет сохранения нагивных свойств клеток в монослое ускоряют регенерацию ОР на ранних сроках после их применения по сравнению с суспензией ФМСК.

6. Ускорение темпа заживления ОР пол влиянием трансплантированных ФМСК достигается за счет ослабления выраженности деструктивно-воспалительной фазы раневого процесса и активизации иролнфератнвно-рспаратнвной фазы Заживление ОР сопровождается более быстрым темпом разрастания сосудистой сети (неоангногенез) и формирования грануляционной тканн, а также актнвизашгсй краевой эпнтелнзацнн. что уменьшает необходимость дополнительного забора аутокожн и снижает риск развития грубых рубнов в зонах глубокого повреждения кожи

7. Усиление пролиферативно-репаративной фазы раневого процесса при трансплантации ФМСК на ожоговую поверхность обусловлено присутствием и продолжающимся функционированием (продукция цитокинов) трансплантированных клеток в зонах повреждения (сохранение р-галактозндазной активности у клеток, предварительно меченых Lac Z геном Е- coli).

8. Пересадка аллогенных ФМСК у больных с глубокими ОР позволяет оптимизировать подготовку ОР к ранней аутодермопластике, ускорить сроки н улучшить результаты приживления расщепленного и перфорированного ЮЖНОГО аутотраисплантата за счет активнзащш в ране процессов: новообразования сосудов, формирования грануляционной ткани н краевой эшгтелнзацнн, ускоряющих закрытие перфорированных ячеек трансплантата эпидермисом. Аутщермотрзнсплантаты без подготовки ОР ФМСК могут подвергатся частичному лизнет

9- Аллогснныс ФМСК, трансплантированные больным с глубокими ОР, позволяют снизить тяжесть клинических проявлений ожоговой болезни (тяжелой эндотоксикацнн н иолнорганной недостаточности), а также предотвратить инфицирование ран

10, Аутолоптчные ФМСК целесообразно использовать для лучшего прижн в-леиня полнослойных трансплантатов аутокожн у планово-оперируюшнхея больных при лечении поздних послеожоговмх рубцовых деформаций н врожденных дефектов кожи.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

I При моделировании термической деструкции кож» использование металлического полого цилиндра с полусогнутым срезом, через который постоянно циркулирует вода, нагретая до 97,7*47» создаст условия для получения стабильно воспроизводимых размеров ожоговой раны Время зкепознцнн через влажную двухслойную салфетку (для увеличения проникающей способности тепла), должно составлять 5-6 сек для поверхностных н 8-9 сек для глубоких ожогов.

2. Для точного определения (с погрешностью до 0,01 см1) плошали ожоговой раны необходимо производить фотографирование раны на фоне линейки н производить расчеты с использованием компьютерной программы "Вндсо ТссТ-Мастер 4 0 (ООО "ВндсоТесГ. С-Пб)"

3- При использовании суспензии культивируемых клеток количество пластик адгезивных клеток следует доводить до 80% монослоя, с пассажем до 4-5 раз. что может служить гарантией получения стабильно большого процента живых и активных ФМСК. При использовании биодеградируемой пленхн с иммобилизованными фибро&гастоподобными меэенхнмальныыи стромальнымн клетками - клеточный монослой также не должен превышал» 80%.

4. Биодеграпнруемые пленки следует удалял, с ожоговой раны на 2-3 сутки после их наложения, чтобы избежать осложнений, обусловленных преципитацией белюэв на биодеградируемой пленке, снижающей ей их диффузионные свойства.

5. Клеточная терапия должна применяться местно, чтобы через индукцию восстановительных процессов в ране уменьшать потерн белка и жидкости из организма а также снижать тяжесть ожогового шока и препятствовать развитию ожогового погашения организма,

6. При крупных ожоговых центрах необходимо создавал» криогенные банки атгогенных ФМСК н использовать эти клетки для сокращения сроков заживления поверхностных ОР н улучшения результатов приживления кожных ауттрансплан-тагов при глубоких ожогах.

7 Хорошее приживление свободного полнослойного кожного лоскута при лечении Рубцовых деформаций гаки и при выполнении косметических операций может быть обеспечено с помощью лугологнчных продифференцирован»lux ФМСК. предварительно иммобилизованных на раневую поверхность (2-3 суток).