Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Ассоциация полиморфизма гена IL-4Ra с развитием аллергических реакций по типу гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков

На правах рукописи

Грознова Ирина Евгеньевна

АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА 11-4Ка С РАЗВИТИЕМ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ПО ТИПУ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ НЕМЕДЛЕННОГО ТИПА ПРИ ПРИМЕНЕНИИ БЕТА-ЛАКТАМНЫХ АНТИБИОТИКОВ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

00556768/

Москва - 2014

005567682

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Сычев Дмитрий Алексеевич Официальные оппоненты:

Мошковский Сергей Александрович - доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича», заведующий отделом персонализированной медицины, заведующий лабораторией медицинской протеомики

Ушкалова Елена Андреевна - доктор медицинских наук, доцент, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов», профессор кафедры общей и клинической фармакологии медицинского факультета

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «,С1> С ^ 2015 года в часов на заседании диссертационного совета Д 001.024.01, созданного на базе Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова» (ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»), по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ученой части ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» и на сайте www.acadernpharm.ru

Автореферат разослан « & _С 2_2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Вальдман Елена Артуровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

С учетом высокой клинической эффективности и низкой токсичности бета-лактамные антибиотики составляют основу антимикробной химиотерапии, занимая ведущее или важное место при лечении большинства инфекций [Хабриев Р.У. и др., 2004; Laurence L. Brunton (Ed.), 2011].

Несмотря на высокую эффективность в лечении многих инфекционных заболеваний, применение бета-лактамных антибиотиков ограничено нежелательными реакциями, наиболее частыми из которых являются аллергические реакции (крапивница, сыпь и др.) [Страчунский J1.C. и др., 2007; García Núñez I. et al., 2012; Lagacé-Wiens P. et al., 2012]. Аллергические реакции встречаются в 0,7 — 10% случаев применения пенициллинов, частота жизнеугрожающих анафилактических реакций - 0,004-0,04% [Laurence L. Brunton (Ed.), 2011]. По результатам недавно проведенных клинических исследований цефалоспоринов III фазы, частота развития аллергических реакций, в том числе реакций гиперчувствительности немедленного типа, составила более 3% [Miller В. et al., 2012; Poon H. et al., 2012]. Одним из методов определения частоты и структуры нежелательных реакций является метод спонтанных сообщений, который позволяет изучить проблему в условиях реальной клинической практики.

Частота встречаемости аллергических реакций, в том числе серьезных, таких как анафилактический шок, при применении бета-лактамных антибиотиков, обусловливает необходимость изучения влияния различных факторов на механизмы их развития. Ряд исследований показал, что генетические факторы являются одними из определяющих при развитии данных реакций [Guéant J.L. et al., 2008; Apter A.J. et al., 2008; Guglielmi L. et al., 2006].

В настоящее время доступны данные исследований, направленных на изучение ассоциации между реакциями гиперчувствительности немедленного типа, вызванными применением бета-лактамных антибиотиков, и

генетическими факторами, такими как, например, однонуклеотидные полиморфизмы (Single nucleotide polymorphisms (SNPs)) [Qiao H.L. et al., 2005; Huang C.Z. et al., 2009; Чикало A.O., 2013]. Однако результаты, полученные разными авторами, не однозначны, что требует проведения исследований в различных популяциях. Результаты подобных исследований позволяют предположить, что полиморфизмы гена, кодирующего а-цепь рецептора к интерлейкину-4 (IL-4Ra), могут быть связаны с развитием реакций гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков у представителей европеоидной расы. Европеоидная раса включает в себя несколько этнических групп. Изучение распространенности полиморфизма в различных этнических группах целесообразно для оценки возможности проведения генотипирования для прогнозирования возникновения аллергических реакций на бета-лактамные антибиотики.

Ген IL-4Ra кодирует альфа-цепь рецептора к интерлейкину-4 (имеет решающее значение для связывания и сигнализации интерлейкина-4, который вызывает пролиферацию В-клеток и способствует синтезу IgE) и одновременно является геном-кандидатом, ответственным за развитие аллергических заболеваний [Bottini N. et al., 2002].

Поиск генетических маркеров реакций гиперчувствительности немедленного типа на бета-лактамные антибиотики, проводимый с целью возможности прогнозирования развития данных реакций, позволит персонализировано подойти к выбору антибактериальных лекарственных средств и повысить безопасность фармакотерапии у представителей различных этнических групп.

Таким образом, изучение ассоциации полиморфизма гена IL-4Ra (rs 1801275) с развитием аллергических реакций по типу гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков является актуальным.

Цель исследования

Целью исследования являлась оценка ассоциации полиморфизма гена IL-4Ra (rsl801275) с развитием аллергических реакций по типу гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков.

Задачи исследования

1. Провести анализ частоты и структуры аллергических реакций по типу гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков в России, зарегистрированных государственной системой фармаконадзора методом спонтанных сообщений.

2. Определить частоты аллелей и генотипов по полиморфизму гена IL-4Ra (rsl 801275) в группе пациентов с аллергическими реакциями по типу гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков (основная группа) и не имеющих данных нежелательных реакций на бета-лактамные антибиотики в анамнезе (контрольная группа).

3. Изучить ассоциацию между наличием генотипов по полиморфизму гена IL-4Ra (rsl 801275) и развитием реакций гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков в популяции европеоидов Московского региона.

4. Оценить чувствительность, специфичность, прогностическую ценность положительного и отрицательного результатов (positive predictive value - PPV; negative predictive value - NPV) выявления определенных генотипов по полиморфизму гена lL-4Ra (rsl801275).

5. Определить частоты аллелей и генотипов по полиморфизму гена IL-4Ra (rsl801275) в популяциях европеоидов Московского региона и Республики Дагестан.

Научная новизна

Впервые определены частоты аллелей и генотипов по полиморфизму гена IL-4Ra (rsl 801275) в различных этнических группах (популяции европеоидов Московского региона и Республики Дагестан).

Впервые изучена ассоциация между полиморфизмом гена И-4Яа (те 1801275) и развитием аллергических реакций по типу гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков в популяции европеоидов Московского региона. Впервые установлено, что полиморфизм гб 1801275 гена /¿-4Яа ассоциирован с развитием указанных реакций на бета-лактамные антибиотики в популяции европеоидов Московского региона. Впервые определена высокая прогностическая ценность положительного результата выявления генотипа А/А по полиморфизму гена ¡¿-4Яа (гэ 1801275).

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты обосновывают целесообразность использования полиморфного локуса ге 1801275 гена 1Ь-4Яа в качестве генетического предиктора для диагностики аллергических реакций по типу гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков в регионах, в которых выявлена высокая частота генотипа А/А по полиморфизму гена И-4Иа (г$1801275).

Результаты исследования подтверждают перспективность внедрения генотипирования по полиморфному локусу ге 1801275 гена 1Ь-4Яа при разработке алгоритма выбора бета-лактамных антибиотиков с целью выявления генетической предрасположенности к развитию реакций гиперчувствительности немедленного типа на данную группу лекарственных средств.

Полученные данные могут быть использованы при проведении исследований, направленных на обоснование целесообразности включения сведений о генетических маркерах в инструкции по применению бета-лактамных антибиотиков.

Положения, выносимые на защиту

1. Определена частота аллергических реакций по типу гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков в России, зарегистрированных методом спонтанных сообщений.

Данные реакции являются в основном серьезными, в том числе приводят к смерти.

2. Обнаружена ассоциация полиморфизма гена И-4Яа (ге 1801275) с развитием реакций гиперчувствительности немедленного типа на бега-лактамные антибиотики в популяции европеоидов Московского региона.

3. Полученные статистически значимые различия по частотам генотипов полиморфного локуса ге 1801275 гена И-4Яа в популяциях европеоидов Московского региона и Республики Дагестан показывают, что такой фактор как этническая принадлежность, может влиять на распределение генотипов.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов проведенного исследования подтверждается использованием адекватных методов статистической обработки.

Основные положения и результаты исследования доложены и обсуждены

на:

1. Первой всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012).

2. Второй научно-практической конференции молодых ученых ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России «Научные подходы к повышению качества экспертизы лекарственных средств: реалии и перспективы» (Москва, 2013).

3. Заседании Ученого совета ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России (Москва, 2014).

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования и разработке плана исследования. Автором проведен сбор и анализ литературных и экспериментальных данных. Автором проводились статистическая обработка, анализ и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: в ходе постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации и публикации результатов.

Связь темы диссертационной работы с планом научных работ учреждения

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России по теме «Научное обоснование методических подходов к доклиническому и клинико-фармакологическому изучению и экспертной оценке эффективности и безопасности лекарственных средств» (№ Государственной регистрации 01201172531).

Сведения о публикациях по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в т.ч. 3 статьи в журналах из перечня рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, определенных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и обсуждения, заключения, рекомендаций по использованию научных выводов, списка сокращений и условных обозначений и списка литературы, включающего 156 источников, в том числе 110 иностранных авторов. Работа изложена на 106 страницах машинописного текста, содержит 26 таблиц, 18 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В соответствии с поставленными задачами проведенное исследование состояло из трех этапов.

На первом этапе исследования был проведен анализ частоты и структуры аллергических реакций по типу гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков в России, зарегистрированных методом спонтанных сообщений. Для анализа были использованы данные (спонтанные сообщения) из базы Федеральной службы по надзору в сфере

здравоохранения (Автоматизированные информационные системы и системы внесения сведений Росздравнадзора - Фармаконадзор («АИС Росздравнадзор -Фармаконадзор»)), за период с 1 января 2009 г. по 31 декабря 2013 г. Доступ к указанной базе данных осуществлялся через закрытый \уеЬ-интерфейс и глобальную сеть Интернет, с персонального компьютера. Сбор данных осуществлялся при участии директора Центра экспертизы безопасности лекарственных средств ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, доктора медицинских наук Романова Б.К.

На втором этапе исследования были определены частоты аллелей и генотипов по полиморфному локусу гэ1801275 гена \L-4Ra с последующим определением ассоциации между наличием генотипов по данному полиморфному локусу и развитием реакций гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков у европеоидов Московского региона.

Для проведения второго этапа исследования было сформировано две группы. В основную группу включили 59 пациентов (32 женщины, 27 мужчин) с аллергическими реакциями по типу гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков.

В контрольную группу было включено 137 человек (78 женщин, 59 мужчин) из общей популяции европеоидов Московского региона, у которых в анамнезе отсутствовали реакции гиперчувствительности на бета-лактамные антибиотики.

На третьем этапе исследования были определены частоты аллелей и генотипов по полиморфному локусу гб1 801275 гена 1Ь-4Яа в популяциях европеоидов Московского региона (137 здоровых добровольцев) и Республики Дагестан (40 здоровых добровольцев). На данном этапе исследование проводилось в различных этнических группах. Этнический аспект необходим, чтобы выявить, влияет ли этническая принадлежность на распределение генотипов.

Проведение исследования одобрено на заседании Локального этического комитета при Городской клинической больнице №23 им. «Медсантруд» г. Москвы, в которой проводился забор биологического материала у пациентов. Утвержденный протокол исследования не содержал замечаний, изменений и дополнений. Все участники подписали Информированное согласие на участие в исследовании.

Забор биологического материала осуществлялся при участии врача-пульмонолога, доцента кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России, кандидата медицинских наук Бердниковой Н.Г., а также при участии интерна кафедры клинической фармакологии и терапии ГБОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Минздрава России Мирзаева К.Б.

У всех участников исследования была проведена идентификация генотипов по полиморфному локусу rsl801275 гена IL-4Ra методом аллель-специфической ПЦР (полимеразная цепная реакция) после предварительного выделения ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) из лейкоцитов крови. Метод аллель-специфической ПЦР основан на неспособности Taq-полимеразы инициировать синтез ДНК на праймерах, 3'- концевой нуклеотид которых некомплементарен матричной ДНК [Патрушев Л.И., 2004].

ДНК выделяли из лейкоцитов цельной крови с помощью коммерческого набора реактивов Genomic DNA purification Kit № K0512, производства фирмы «Fermentas», Литва. Выделение ДНК из лейкоцитов цельной крови осуществлялось при участии начальника отдела персонализированной медицины и клинической фармакогенетики Центра клинической фармакологии ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, кандидата биологических наук Казакова P.E.

В исследовании для проведения ПЦР применялся амплификатор модели «Mastercycler» («Eppendorf AG», Германия).

ПЦР программа состояла из 30 циклов. Каждый цикл состоял из трех стадий: денатурация, отжиг и элонгация (синтез). Предварительно была стадия инактивирования антитела, удерживающего полимеразу (при 95°С, в течение 2 минут). Денатурация ДНК проводилась в течение 20 сек при 95°С; отжиг праймеров - 20 сек при 67°С; элонгация ДНК - 20 сек при 72°С.

Праймеры для амплификации исследованного локуса были подобраны с помощью программы Vector NTI advance 10 («Invitrogen», США) в соответствии с требованиями метода. Их специфичность была проверена с помощью программы primer BLAST. Подбор праймеров осуществлялся при участии эксперта 2 категории ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, кандидата биологических наук Чикало А.О.

Последовательность используемых праймеров отражена в таблице!.

Таблица 1 - Праймеры для проведения аллель-специфической ПЦР

Последовательность праймеров Размер амплифицируемого фрагмента

lL-4Ra-F-A - 5' - CCCCACCAGTGGCTATCA - 3' IL-4Ra-F-G - 5' - CCCCACCAGTGGCTATCG - 3' lL-4Ra-R -5'- TGTCCAGTCCAAAGGTGA - 3' 266 пар нуклеотпдов

Детекцию продуктов амплификации проводили методом горизонтального электрофореза в агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Фрагменты ДНК после амплификации наносили в лунки агарозного геля. Для детекции продуктов амплификации использовали 1,5% агарозный гель. Визуализировали продукты амплификации на трансиллюминаторе ТСХ-15 M производства «Vilber Lourmat», Франция в ультрафиолетовом свете при длине волны 312 нм. Размеры амплифицированных фрагментов определяли с помощью маркера ЮОЬр + 50bp DNA Ladder («Сибэнзим», Россия).

Для построения таблиц, диаграмм и статистической обработки данных были использованы приложения для персонального компьютера: Microsoft Excel 2010; Microsoft Word 2010. Статистическая обработка результатов проводилась также с использованием программы Graph Pad In Stat 3 и с

использованием программы «Ген-эк-сперт» с открытого интернет ресурса [http://gen-exp.ru].

Для сравнения частот генотипов по исследуемому полиморфному локусу на втором этапе работы в основной и контрольной группах мы использовали критерий уг. За нулевую гипотезу (Н0) было принято отсутствие различий в распределении генотипов между исследуемыми группами. Альтернативная гипотеза (Hi) - существуют различия в распределении генотипов между исследуемыми группами.

Для сравнения частот генотипов по исследуемому полиморфному локусу на третьем этапе работы в популяциях европеоидов Московского региона и Республики Дагестан мы также использовали критерий х~. Н0 - частоты генотипов распределены равновероятно между исследуемыми группами. Н] -существуют различия в распределении генотипов между исследуемыми группами. При Р>0,05 различия считали статистически незначимыми.

Были рассчитаны значения чувствительности и специфичности. Также были рассчитаны такие показатели как отношение шансов (Odds ratio - OR); прогностическая ценность положительного результата (positive predictive value - PPV); прогностическая ценность отрицательного результата (negative predictive value - NPV).

В данном исследовании была проведена проверка выполнения закона Харди-Вайнберга в изучаемых выборках. Мы определили, насколько изучаемые выборки близки к тому, чтобы адекватно отражать частоты генотипов в реальных популяциях. Если изучаемые выборки реально отражают свойства целых популяций, тогда наблюдаемые в них частоты генотипов не должны статистически значимо отличаться от ожидаемых частот, рассчитанных по уравнению Харди-Вайнберга [Hardy G.H., Weinberg W., 1908; Игнатьев И.В., 2007].

Результаты исследования Анализ частоты и структуры аллергических реакций по типу гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков в России, зарегистрированных методом

спонтанных сообщений При анализе спонтанных сообщений о нежелательных реакциях при применении бета-лактамных антибиотиков, содержащихся в базе данных «АИС Росздравнадзор - Фармаконадзор» за период с 1 января 2009 г. по 31 декабря 2013 г., было выявлено 5069 сообщений о нежелательных реакциях при применении данных лекарственных средств. При этом всего в базу данных Росздравнадзора «АИС Росздравнадзор - Фармаконадзор» за указанный период поступило 53119 сообщений.

Таким образом, доля нежелательных реакций на бета-лактамные антибиотики в общем количестве спонтанных сообщений о нежелательных реакциях составляет 9,54%.

Исходя из общего количества спонтанных сообщений о нежелательных реакциях на бета-лактамные антибиотики мы определили частоту встречаемости реакций гиперчувствительности немедленного типа - 35,7 % (1812 случаев из 5069).

Анализ частоты встречаемости реакций гиперчувствительности немедленного типа на бета-лактамные антибиотики показал, что данные нежелательные реакции в 1130 случаях из 1812 (62,4%) развивались при применении цефалоспоринов (рисунок 1).

1200 1000 800 600 400 200 О

i

■ Количество спонтанных сообщений, случаи

ж

¿г

Рисунок 1 - Количество спонтанных сообщений о развитии реакций гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных

антибиотиков

В 1119 из 1812 случаев (61,8%) реакции гиперчувствительности немедленного типа были серьезными, в том числе приводили к смерти.

Далее проводился анализ причинно-следственной связи «реакция гиперчувствительности немедленного типа - лекарственное средство». В результате в 165 случаях (9,1%) связь расценивалась как определенная, в 779 случаях (43%) связь была интерпретирована как вероятная, в 550 случаях (30,4%) - как возможная, в 26 случаях (1,4%) - как сомнительная, в 7 случаях (0,4%) - как условная, в 285 случаях (15,7%) - как неклассифицируемая.

Таким образом, полученные значения частоты встречаемости реакций гиперчувствительности немедленного типа, в том числе серьезных, при применении бета-лактамных антибиотиков, обусловливают необходимость изучения влияния различных факторов на механизмы их развитая.

Определение частот аллелей и генотипов по полиморфизму гена 1L-4Ra (rsl801275) в основной и контрольной группах

Основная и контрольная группы были прогенотипированы по полиморфному локусу rsl 801275 гена IL-4Ra. В результате были получены распределения генотипов участников исследуемых групп, представленные в таблице 2.

Таблица 2 - Распределение генотипов по полиморфизму гена И-411а (ге 1801275) в основной и контрольной группах

Генотип Количество исследуемых (чел.)

основная группа (п = 59) контрольная группа (п = 137)

а/а 41 54

a/g 16 75

g/g 2 8

Данные, представленные в таблице 2, показывают следующее распределение генотипов: в основной группе: А/А - 41 человек (частота 0,695), А/С - 16 человек (частота 0,271), G/G - 2 человека (частота 0,034); в контрольной группе: А/А - 54 человека (частота 0,394), A/G - 75 человек (частота 0,548), G/G- 8 человек (частота 0,058).

Исходя из полученного распределения генотипов в основной и контрольной группах мы определили частоты аллелей {А и G) полиморфного локуса rs 1801275 гена IL-4Ra. Результаты определения частот аллелей по полиморфизму гена IL-4Ra (rsl801275) в основной и контрольной группах представлены в таблице 3 и на рисунке 2.

Таблица 3 - Частоты аллелей по полиморфизму гена IL-4Ra (rsl801275) в

основной и контрольной группах

Аллели Основная группа Контрольная группа

а 0,831 0,668

g 0,169 0,332

Прежде чем сравнивать исследуемые группы по частотам аллелей и генотипов необходимо определить, насколько они близки к тому, чтобы адекватно отражать эти частоты в реальных популяциях. Для этого следует проверить выполнение закона Харди-Вайнберга в исследуемых выборках. Принимая во внимание, что рассматриваемые нами популяции достаточно многочисленны и являются более или менее панмиксными, можно ожидать выполнения в них закона Харди-Вайнберга. То есть, если изучаемые выборки

реально отражают свойства целых популяций, тогда наблюдаемые в них частоты генотипов не должны статистически значимо отличаться от ожидаемых частот, рассчитанных по уравнению Харди-Вайнберга.

основной и контрольной группах В таблицах 4 и 5 представлены сравнения наблюдаемых частот генотипов с ожидаемыми частотами. Проверка выполнена с помощью критерия при Р>0,05 различия считали статистически незначимыми. Таблица 4 - Проверка выполнения закона Харди-Вайнберга в контрольной группе для частот генотипов полиморфного локуса гз ] 801275 гена И-4Яа

Генотип Наблюдаемые частоты Ожидаемые частоты X" Р

а/а 0,394 0,446 4,00 0,05

а/о 0,548 0,444

С/С 0.058 0,110

Таблица 5 - Проверка выполнения закона Харди-Вайнберга в основной группе для частот генотипов полиморфного локуса гв 1801275 гена Л-4Яа

Генотип Наблюдаемые частоты Ожидаемые частоты у: Р

а/а 0,695 0,690 0,02 0,88

а/с 0.271 0,281

С/С 0.034 0,029

Как видно из данных, приведенных в таблицах 4 и 5, во всех случаях Р>0,05. А значит изученные выборки адекватно отражали частоты генотипов в реальных популяциях и могут служить для сравнения таковых.

Изучение ассоциации между наличием генотипов но полиморфизму гена IL-4Ra (rsl801275) и развитием реакций гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков в популяции европеоидов Московского региона

На основании данных, представленных в таблице 2, изучена ассоциация между наличием генотипов по полиморфизму гена IL-4Ra (rsl801275) и развитием реакций гиперчувствительности немедленного типа на бета-лактамные антибиотики в популяции европеоидов Московского региона.

Была исследована статистическая значимость различий между участниками основной и контрольной групп по частотам распределения генотипов полиморфного локуса rsl 801275 гена IL-4Ra.

Рассчитанное с использованием программы Graph Pad In Stat 3 фактическое значение 14,96 оказалось больше табличного для уровня значимости 0,05 (и фактическое значение Р=0,0006 меньше 0,05). Полученные данные позволили отвергнуть нулевую гипотезу о том, что различий в распределении генотипов между группами нет, и принять альтернативную гипотезу о существовании статистически значимых различий в распределении генотипов между исследуемыми группами.

Для того, чтобы установить, какой именно генотип связан с развитием реакций гиперчувствительности немедленного типа, мы использовали программу «Ген-эксперт» с открытого интернет ресурса [http://gen-exp.ru]. Для этого сравнивали значения Р для различных статистических гипотез, выбрав ту, при которой Р<0,05.

Выявлено, что лучше всего распределение генотипов (с наименьшим значением Р) описывает рецессивная модель наследования (таблица 6). Это означает, что развитие аллергических реакций по типу гиперчувствительности немедленного типа связано с наличием у человека А/А генотипа.

Таблица 6 - Рецессивная модель наследования (тест х . df = 1 )

Генотипы Основная группа Контрольная ipy п па x Р OR

п = 59 п= 137 значение 95% Cl

а/а 0,695 0,394 14,94 0,0001 3,50 1,82-6,72

a/g+g/g 0,305 0,606 0,29 0,15-0,55

Согласно данным, представленным в таблице 6, шансы развития реакций гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков у носителей генотипа А/А в основной группе в 3,50 раза выше, чем в контрольной группе (OR 3,50; 95% Cl: 1,82-6,72; Р=0,0001).

Таким образом, получены статистически значимые различия между группой пациентов с реакциями гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков по полиморфизму гена II^4Ra (rs 1801275) и контрольной группой. Показано, что генотип А/А является генетическим фактором риска развития указанных реакций на бета-лактамные антибиотики в популяции европеоидов Московского региона.

Оценка чувствительности, специфичности, прогностической ценности положительного и отрицательного результатов выявления определенных генотипов по полиморфизму гена IL-4Ra (rsl801275) В ходе исследования определено, что чувствительность выявления генотипа А/А для прогнозирования развития реакций гиперчувствительности немедленного типа составляет 43%, специфичность — 82%.

При расчете PPV (вероятность наличия заболевания при положительном (наличие у человека А/А генотипа) результате теста) и NPV (вероятность отсутствия заболевания при отрицательном (наличие у человека A/G или G/G генотипа) результате теста) получены следующие значения: PPV = 69%; NPV = 61%. Это означает, что с вероятностью 69% у человека с А/А генотипом разовьется реакция гиперчувствительности немедленного типа в ответ на применение бета-лактамных антибиотиков. При этом вероятность отсутствия реакции гиперчувствительности немедленного типа в ответ на применение

бета-лактамных антибиотиков составит 61% у человека с A/G или G/G генотипом.

Этнические различия в частотах аллелей и генотипов полиморфного маркера rsl801275 гена IL-4Ra

При проведении этнического аспекта исследования были изучены частоты аллелей и генотипов полиморфного маркера rs 1801275 гена IL-4Ra в 1 популяциях европеоидов Московского региона и Республики Дагестан.

Исследуемые популяции были прогенотипированы по полиморфному локусу rs 1801275 гена IL-4Ra. В результате было получено следующее j распределение генотипов: в популяции европеоидов Московского региона: А/А - 54 человека (частота 0,394), A/G - 75 человек (частота 0,548), G/G - 8 человек (частота 0,058); в популяции европеоидов Республики Дагестан: А/А - 6 человек (частота 0,15), A/G - 31 человек (частота 0,775), G/G - 3 человека (частота 0,075).

Результаты определения частот аллелей по полиморфному локусу rs 1801275 гена IL-4Ra в различных этнических группах представлены в таблице 7 и на рисунке 3.

Таблица 7 — Частоты аллелей по полиморфному локусу rs 1801275 гена IL-4Ra

в различных этнических группах

Аллель Европеоиды Московского региона Европеоиды Республики Дагестан

А 0,668 0,5375

G 0332 0,4625

Исследована статистическая значимость различий по частотам распределения генотипов полиморфного локуса ге 1801275 гена IL-4Ra в популяциях европеоидов Московского региона и Республики Дагестан. Рассчитанное фактическое значение у? = 8,26 (с!Г = 2) больше табличного и Р=0,02 меньше уровня значимости 0,05.

Рисунок 3 - Частоты аллелей полиморфного локуса rsl 801275 гена IL-4Ra в популяции европеоидов Республики Дагестан

Полученные данные позволили отклонить нулевую гипотезу о том, что частоты генотипов распределены равновероятно между группами, и принять альтернативную о существовании различий в распределении генотипов между исследуемыми группами. Т.е. такой фактор, как этническая принадлежность, может влиять на распределение генотипов.

ВЫВОДЫ

1. Частота реакций гиперчувствительности немедленного типа (крапивница, бронхоспазм, ангионевротический отек, анафилактический шок) при применении бета-лактамных антибиотиков в России, зарегистрированных методом спонтанных сообщений, составляет 35,7% из общего количества спонтанных сообщений о нежелательных реакциях на данные лекарственные средства. В 61,8% случаев реакции гиперчувствительности немедленного типа были серьезными, в том числе приводили к смерти.

2. Определены частоты аллелей и генотипов по полиморфизму гена IL-4Ra (rsl801275) в группе пациентов с аллергическими реакциями по типу гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков (А - 0,831, G - 0,169; А/А - 0,695, A/G - 0,27î, G/G - 0,034) и в группе не имеющих данных нежелательных реакций на бета-лактамные антибиотики в анамнезе (А - 0,668, G - 0,332; А/А - 0,394, A/G - 0,548, G/G -0,058).

3. Выявлено, что генотип А/А по полиморфизму гена IL-4Ra (rsl801275) ассоциирован с развитием реакций гиперчувствительности немедленного типа

на бета-лактамные антибиотики в популяции европеоидов Московского региона (OR 3,50; 95% CI: 1,82-6,72; Р=0,0001).

4. Установлено, что выявление генотипа А/А по полиморфизму гена IL-4Ra (rs 1801275) с чувствительностью 43% и специфичностью 82% прогнозирует развитие реакций гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков. Прогностическая ценность положительного результата составляет 69%; прогностическая ценность отрицательного результата - 61%.

5. Определены частоты аллелей и генотипов по полиморфизму гена IL-4Ra (rsl801275) в популяциях европеоидов Московского региона (А - 0,668, G -0,332; А/А - 0,394, А/G - 0,548, G/G - 0,058) и Республики Дагестан (А - 0,5375, G - 0,4625; А/А - 0,15, A/G - 0,775, G/G - 0,075).

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Рекомендуется использовать сведения о полиморфизме гена lL-4Ra (rs 1801275) для разработки алгоритма выбора бета-лактамных антибиотиков с целью снижения риска развития реакций гиперчувствительности немедленного типа.

2. Рекомендуется проводить активный мониторинг безопасности бета-лактамных антибиотиков в регионах, в которых выявлена высокая частота генотипа А/А по полиморфизму гена IL-4Ra (rs 1801275).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Грознова, И.Е. Генетические предикторы лекарственной аллергии на бета-лактамные антибиотики [Текст] / И.Е. Грознова, Д.А. Сычев, Н.Г. Бердникова, А.О. Чикало // Биомедицина. - 2013. -№1. - С. 123-130.

2. Грознова, И.Е. Ассоциация полиморфизма гена IL-4Ra с развитием реакций гиперчувствительности немедленного типа на ß-лактамные антибиотики [Текст] / И.Е. Грознова, А.О. Чикало, Н.Г. Бердникова, Д.А. Сычев, В.Г. Кукес //Молекулярная медицина. -2013.-№1. - С. 51-53.

3. Чикало, А.О. Генетический предиктор реакций гиперчувствительности немедленного типа, вызванных ß-лактамными антибиотиками [Текст] / А.О. Чикало, И.Е. Грознова, Т.Д. Исмагилов, Н.Г. Бердникова, Д.А. Сычев, В.Г. Кукес // Врач. - 2013. - №3. - С. 87-88.

Тезисы:

1. Грознова, И.Е. Полиморфизм гена IL-4Ra у российских пациентов с аллергическими реакциями на бета-лактамные антибиотики [Текст] / И.Е. Грознова, Д.А. Сычев // Первая всероссийская научная конференция молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века»: Материалы конференции. - М.: РООИ «Здоровье человека», 2012. -С. 97-98.

2. Грознова, И.Е. Влияние полиморфизма гена IL-4Ra на развитие гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков [Текст] / И.Е. Грознова, Д.А. Сычев // Сборник тезисов I Молодежного международного форума медицинских наук «MedWAYS» / Под редакцией Николенко В.Н. - М.: Издательство Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова, 2012. - С. 73-74.

3. Грознова, И.Е. Оценка ассоциации полиморфизма гена IL-4Ra с развитием аллергических реакций при применении бета-лактамных антибиотиков [Текст] / И.Е. Грознова, Д.А. Сычев // Научные подходы к повышению

качества экспертизы лекарственных средств: реалии и перспективы: Материалы второй научно-практической конференции молодых ученых. -М.: ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, 2013. - С. 38-43.

4. Groznova, I.E. Effect of gene polymorphism lL-4Ra to development of allergic reactions of beta-lactam antibiotics in Russian patients [Текст] / I.E. Groznova, D.A. Sychev // Г' Meeting of the Baltic physiological societies. Kaunas, Lithuania. May 10-11, 2013. - Kaunas, Lithuania, 2013. - P. 67-69.

5. Mirzaev, K. CYP2C19*2 allele associated with resistance to clopidogrel: the prevalence in Dagestans Highlanders [Текст] / К. Mirzaev, D. Sychev, S. Mammaev, D. Gafurov, R. Kazakov, I. Groznova // 20,h International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations. Stuttgart, Germany. May 1822, 2014. - Stuttgart, Germany, 2014. - P. 258.

Благодарности

Автор выражает огромную благодарность всем, кто оказывал помощь в проведении исследования. Особенно хочется выразить искреннюю признательность и благодарность своему научному руководителю Сычеву Дмитрию Алексеевичу за неоценимую помощь в проведении исследования, за непрерывную поддержку на протяжении всего периода выполнения работы и профессиональные советы при ее написании. Также выражаю благодарность Чикало Александру Олеговичу, Казакову Руслану Евгеньевичу, Романову Борису Константиновичу, Бердниковой Надежде Георгиевне, Мирзаеву Карину Бадавиевичу за профессиональную помощь на разных этапах исследования.

Подписано в печать 22 января 2015 г. Формат 60x90/16.

Заказ 1791. Уч.-изд. л. 1. Тираж 100 экз. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96