Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Свойства овабаин-резистентного Na,K,CI-котранспорта в бета-клетках поджелудочной железы крысы.

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ЛЬВІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ВЛАСТИВОСТІ ІЧА, К, СЬ—КОТРАНСПОРТУ В Й-КЛІТИНАХ ПІДШЛУНКОВОЇ ЗАЛОЗИ ІЦУРА

14.03.03 — Нормальна фізіологія

Авторефер ат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

РІ'В ол 1 О ЙЁВ 1597

На правах рукопису

УДК 612.015.31..611.37.0018.11 —084

БОБРОВНИК АНАТОЛІЙ ДАНИЛОВИЧ

ЛЬВІВ - 1997

Робота виконана у Льзівс^кому державному медичному університеті

Науиом керівники Доктор біологічних наук Мороз Олександра Мирославівна. Кандидат медичних наук, доцент Гжегоцький Мечислав Романович.

Офіційні опоненти Доктор біологічних наук, академік Воробець З.Д.

Доктор медичних наук, професор Шевчук В.Г.

■ Провідна установа Національний університет ім. Т.Г.Шевченка (м. Київ)

Захист відбудеться “,12" /0 1997 р, на засіданні

спеціалізованої вчена ради К 04.19л) 1 у Львівському медичному університеті (290010 м. Львів, вуя. Пекарська,69). / //'є.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Львівського медичного університету (290010 м. Львів, вул. Січових Стрільців, 6)

Автореферат розісланий 1997 р.

/

Вчений секретар спеціалізованої у

вченої ради /ІФ О.М.Мороз

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

______Актуапьність проблеми. Провідними функціями залозисто-

епітеліальних клітин е процеси секреції та всмоктування. Вони тісно пов'язані з транспортом моновалентних іоніа, котрий здійснюється не лише за посередництвом активних механізмів їх перенесення чи внаслідок функціонування іонних каналів, але й завдяки існуванню низки овабаїн-резистентних систем іонної транслокації, в першу чергу тих, що пов'язані з Cf. Наявність Cl-эалежного транспорту Na+ та К+ остановлена для тканин багатьох типів, включаючи різноманітні епітелії, нераи, м язи, асцитні клітини пухлин та еритроцити /Орлов и др., 1988; Epstein et a!!., 1985; Frelin at all., 1986; Del Castillo et all., 1987; Homma et all., 1991/. Стійкий інтерес до вивчення властивостей Ка,К.,СІ-котранспорту та CI/HCOj-протитранспорту підтримується завдяки тому очевидному фактові, що ці механізми є відповідальними за нагромадженням та виділення солей, а також за трансмембранне перенесення молекул ноди шляхом осмотичного спряження, причому Na-спряженому транспорту СІ" належить провідна роль в обміні іонів в епітеліальних клітинах, здатних до абсорбції' чи секреції /Кіт et ail., 1988; Haas, 19Й9/. Вивчення властивостей систем, що забезпечують підтримання трансепітеліальних потоків СІ" дозволило з'ясувати значення цього іону в секреції рідин епітеліальними клітинами трахеї рогівки та деяких інших екзокринних залоз. Встановлено, що регуляція інсулінової секреції панкреатичними [Í-клітинами теж залежить від обміну іонів /Henquin at all., 1984/, ь першу чергу підтриманням мембранного потенціалу цих клітин і їх електричної а ктизмості за одночасного забезпечення високої активності цитоплазматичного Са2+ /Norman at all., 1987; Rongstad, 1991/. Нагромаджуються таком дані, що такі аніони, як хлорид, бікарбонат та фосфат детермінують інтенсивність процесів вивільнення інсуліну. Вдалось ідентифікувати №,К,СІ-котрансПорт в fi-клітинах миші /Lindstrom, 1988; Sandstrom, 1993/ та кроля /Engstroro et all., 1991/ і з ясувати, що подібна іонна транслокація здійснюється в обидоох напрямках, а її швидкість визначається величиною градієнту транспортованих іонів. Існування окремого діуретнк-чутливого катіон- та аніон-залежного котранспорту, який опосередковує трансмембранні рухи іоніа, в Р-клітинах щура не описано.

Мма____¿ . завдання дослідження. Метою роботи с одержання

доказів функціонування механізмів Ыа,К,С1-котранспорту в Р-іиіітинах підшлункової залози щура і вивчення їх властивостей.

Для здійснення поставленої мети вирішували наступні основні завдання:

1 / встановлення чутливості спряженого транспорту Na4", lí+ та СІ'

до фуросеміду та аналіз взаємодії між впливом вмазаного транспортного інгібітора і СІ-заміщенням;

2/ вивчення залежності швидкості Ма,К,СІ-котрзнспорту від іонного складу позаклітинного середовища;

З/ зясування механізмів регуляції На,К,СІ-котранспорту прн зміні об ему Р-клітин і коливанні температури преінкубаційного середовища;

4/ оцінка випромінювання гелій-иеонового лазера як фактору, що здатен модулювати властивості овабаїн-резистентних механізмів транспорту моновалентннх іоніа.

Ниуксва новизна. Вказана праця є результатом вперше виконаного дослідження властивостей овабаїн-резистентного фуросемід-чутлизого №,К,Сі-котранспорту в (3-клітинах острівців Лангерганса щура.

■ Вперше встановлено:

- відносний вклад в загальний трансмембранний іонний потік Иа.К* АТФази і №,К,СІ-котранспорту і швидкість останнього;

- характер залежності "доза - ефект" стосовно дії фуросеміду на №,К,С1-котракспорт;

- подібність ефектіа гальмування швидкості На,К,СІ-котранспорту, зумовлених наявністю фуросеміду в інкубаційному середовищі або відсутності в ньому СІ* ;

- підпорядкування залежності між швидкістю Ма,К,СІ-котранслорту і концентрацією зоанішньоклітинного Иа+ кінетиці насичення;

- обов'язковість відповідного співвідношення концентрацій N3"*", К+ та з позаклітинному середовищі для підтримання максимальної швидкості Ма,К,С!-котранспсрту;

- наяаність об'емно-регуяяторних механізмів, зумовлених функціонуванням Ма,К,СІ-котранспорту.

Основні положення дисерташТ. які викосяться на захист.

1. |)-клітини підшлункової залози щура володіють системою На,К,СІ-котранспорту.

2. Необхідною умовою здійснення транслокації моновалентних іонів в (З-клітинах підшлункової залози щура шляхом №,К,СІ-котранспорту с наявність позаклітинних К+ та С,' у відповідних концентраціях. .

3. Механізм На,К,СІ-котранспорту становить одну із систем об'ємного контролю р-клітим підшлункової залози щура.

4. Випромінювання гелій-неонового лазера пригнічує швидкість Ма,К,СІ-котранспорту о р-кгітинак підшлункової залози щура при застосуванні тих доз лазерного опромінення, котрі призводять до підвищення в них концентрації К+ і вмісту води,

, Теоретичне і практччне 'значення. Одержано докази, що о [1-клітинах остріаціа Лангерганса щура певна фракція нетто-потоків монозалентних іоніз здійснюється шляхом Ма,К,СІ-котранслорту.

Встановлені дані дозволяють розширити уяву про шляхи транспорту іонів Na+, К+ га СІ* в підшлунковій залозі і можуть бути використані для конкретизації ролі моновалентних іонів в її секреторній діяльності. Опрацьовано методи дослідження овабаїн-резистентних спряжених потоків іонів, результати котрих дозволять судити про інтенсивність Ыэ,К,С1-когранслоргу а ß-кпітинах. Встановлено параметри фуросемід-чутливого транспорту іонів, котрі рекомендуються, як біохімічні критерії зміни об'єму клітини. Встановлено наявність у випромінювання гелій-неоноаого лазера властивості змінювати швидкість Ыа,К,С1-котранслорту в ß-клітимах острівців Лангерганса, що вносить вклад в теоретично обгрунтування доцільності застосування вказаного фізичного фактору з лічничою метою у осіб зі захворюваннями підшлункової залози.

Апробація роботи. Результати дисертаційної роботи розглянуті на IV Далекосхідній науково-практичній конференції "Нчзкоинтелсисное лазерное излучение в медицинской практике" /Хабаровськ, 1990/; Всеукраїнській наково-пракгичній конференції "Медична діагностика" /Київ - Львів, 1992/; Міжнародній конференції "Львізські лазери в дерматології, курортології і біології /Льаіа, 1992/; Всесоюзній науково-практичній конференції "Эф^рентные методы з медицина" /Іжевськ, 1992/; Міжнародній конференції "Прикладные проблемы лазерной медицины" /Москва, 1993/; регіональній конференції “Науково-методичні аспекти фізіології" /Львів, 1993/; XIV з'їзді Українського фізіологічного товариства /Київ, 1994/; І з’їзді Українеского біофізичного товариства /Київ, 1994/; IV науково-практичній конференції "Застосування лазерів в медицині та біології” /Киїз, 1995/.

Пубпікаїф'. За матеріалами дисертації опубліковано 11 праць, які відображають основні її положення.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 114 сторінках машинописного тексту. Робота складається з' вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, узагальнення, висновків та бібліографічного покажчика, який включає 215 джерел. Робота ілюстрована 6 таблицями та 13 рисунками.

Декпараиія особистого внеску дисертанте. Особистий внесок автора полягає в аналізі актуальності та ступеня значення проблеми, виборі методик та умов дослідження, проведенні лазерного опромінення піддослідних тварин, аналізі та узагальненні отриманих результатів, формулюванні висновків та положень роботи, які виносяться на захист.

Матеріали і метоли дослідження. Робота виконана на 132 білих щурах-самцях масою 150 - 220 г. Експерименти проводили на ß-клітинах острівців Лангерганса, які ізолювали методом Lacy, ICoslanovsky /1967/ зі застосуванням колагенази фірми "Merck". Життєздатність ß-клітин оцінювали за посередництвом трипанового голубого /Sengten, 1976/.

На стаціонарний стан ß-клітин впливали п'ятьма способами, що їх застосовували окремо і/або поєднано: модифікацією складу сольових розчинів, які використовували для інкубації, змінами концентрації фуросеміду, pH, осмолальності і температури позаклітинного середовища. У вільному від Na+ розчині цей іон заміщали на холінхлорид, у вільному від К'*' - весь НСІ заміщали на NaCI, у вільному від Ct* - NaCI, MgClj або KCl заміщали на еквівалентну кількість нітратів. Значень осмопяльності інкубаційного середовища на рівні 200; 300 та 400 мосМ досягали додаванням до розчинів сахарози у відповідних кількостях, контролюючи названий показник осмометром типу ОМКА Ц-01. Про об'см клітин судили за вмістом внутрішньоклітинної води.

Вимірювання концентрації Na+ та К+ в клітинах та інкубаційному середовищі здійснювали методом полум'яної фотометрії на фотометрі моделі Plapho-4, Carl Ceiss, Іепа. Відповідні стандарти названих іонів готували на розчині хлористого тетраметиламонію і МдСІ}. Швидкість Na,K,CI-Kciтранспорту встановлювали за приростом концентрації Na+ в процесі інкубації клітин за присутності овабзїну та фуросеміду. Про швидкість Na/Li-обміну судили за різницею концентрації Na+ в нульовий та кінцевий час інкубації, що її здійснювали в присутності вказаних транспортних інгібіторів за наявності та відсутності LiCI.

При опроміненні піддослідних тварин розфокусований потік монохроматичного червоного світла, генерований гелій-неоновим лазером типу ЛГ - 75, скеровували на депільовану епігастральну область. Густина потужності випромінювання становила 0,5 мВт • см"г. Дозування проведено шляхом змін експозицій та кількості сеансів лазерного опромінення.

Результати дослідження були обчислені варіаційно-статистичним методом Стьгодемта-Фішера.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Кінепічні характери "ики Иа.К.СІ-котранспорту в ß-клітинах острівців Лангерганса щура

1.1. Чутливість іонної транспокації до дії фуросеміду

Фуросемід с транспортним інгібітором, що в порівняно високих концентраціях втрачає специфічність дії. При застосуванні фуросеміду, як і інших петльоаих діуретинів, з метою вивчення особливостей їх впливу на іонну транслокацію, спостерігають пригнічення всіх трьох СІ-залежних систем: Na,K,CI-, К,С!- та Na.CI-котранспорту /Musch et all., 1980; Palfrey ef all., 1983; Geck el all., 1986/.

В нашому дослідженні чутливість іонної транслокації до дії

фуросеміду вивчали в клітинах, інкубованих за відсутності позаклітинного sla+, оскільки відомо, що вплив Na-вільного середовища на пригнічення }>уросемідом котранспортних потоків е вираженим значно меншою «ірою, ніж середовища, що містить вказаний іон /Dayher et all., 1985; Zade-Oppen et all., 1988/. За дотримання вказаної експериментальної ^мови спостерігали сиґмоїдальне співвідношення між дозою фуросеміду га швидкістю На,К,СІ-котранслорту, Одержані нами дані засвідчують, що «аксимального мірою фуросемідне пригнічення №,К,СІ-котранспорту спостерігається за умови внесення а середовище інкубації р-клітин фіуросеміду в концентрації 1,0 мМ. Ця величина є подібною до такої, здержаної для залозисто-епітеліальних клітин інших типів, зокрема, для -епатоцитів та ентероцитів щура /Панасгок з співавт., 1939; Думальська, 1994/.

Наявність'специфічного ефекту фуросеміду на транспорт Іонія а (і-шітинах, інкубованих в середовищі, вільному від Na4", свідчить про т«, ц о частина чутливого до діуретинів переміщення ionio К+ та Сі" зпосередкоаанз Na-неззлежннм механізмом. Разом з тим, нами додатково одержано спідчення, що поєднання впливу 1,0 мМ фуросеміду та безнатріеаого середовища чинить на діуретик-чутливий «отранспорт іонів в jS-клітинах ефект, подібний до того, що його можна юрівняти з дією застосованого окремо фуросеміду.

Відносний вклад №,К-АТФази і №,К,СІ-котранспорту в загальний онний потік через плазматичну мембрану P-клітини було вивчено шляхом дослідження гальмівного ефекту двох специфічних інгібіторів цих шляхів -звабаїну та фуросеміду. Встановлено, що фуросемід в концентрації 1,0 *М здійснює пригнічення овабаїн-резистентного транспорту іоніа у шазаних клітинах на 59%. За наявності в інкубаційному середовищі івабаїну /5,0 мМ/ максимальне гальмування активності Ма,К-АТФази :ягає 40 %. Поєднана дія фуросеміду та овабаїну за використаних нами гкспериментальних умов була аддитианою, оскільки пригнічення іівидкості іонного потоку становила 80 %. '

Той факт, що фуросемід пригнічує транспорт іонів в присутності звабаїну, свідчить, що даний ефект не пов’язаний з пригніченням Na,K-юмпи, а швидше зумовлений пригніченням №,К;СІ-котранспорту. Порівнянням ступеня гальмівного ефекту фуросеміду за присутності та ja відсутності овабаїну вдалось встановити, що стабільніша і більш іскраво виражена дія фуросеміду є саме за одночасної присутності звабаїну. Нестабільність діі фуросеміду за відсутності овабаїну можна ювснити тим, що пригнічення транспорту іонів фуросемідом сприяє їктивації Na,K-noMrin, внаслідок чого гальмівний ефект фуросеміду є іамаскооаним.

Встановлено, що швидкість овабаїн-резисгснтного фуросемід-

чутпиаого Ыа,К,С1-котранслорту в ß-кпітинах острівців Лангерганса щуріа становить в середньому 32,41 +- 1,14 мкМ • 1 л клітин'1 ■ 1 год-1. її величина с близькою до такої в ентероцитах та гепатоцитах, але значно вищою, ніж в еритроцитах вказаних тварин /Мороз, 1990; Думальська, 1994/.

1.2. Залежність швидкості Ма,К,СІ-котранслорту від іонного складу позаклітинного середовища

Переміщення солей та молекул води через залозисто-епітеліальні клітини є прямим чином пов’язане з виділенням надлишкового Сґ /Lindstrom, 1988; O'Neill et ail., 1985; Endstrom et all., 1991/. В таких клітинах CI“ нагромаджується за допомогою вторинного активного переміщення. Na"*" прямує за СІ~ пграцеллюлярно, а результаті чого створюється осмотичний градієнт для NaCI, котрий ї забезпечує трансепітеліапьне переміщення, іонів. Поступлення СІ- в залозисто-епітеліальні клітини стає можливим завдяки функціонуванню декількох іон-трамспортуючих механізмів, зокрема: І/ Na,K,C!-Korp анспорту /в

деяких тканинах К-незалежного №,СІ-котранспорту/; паралельного Na/H- та СІ/НСОз-антипорту /Ramaswany et all., 1983; Hellmesen et all., 1985; Ranner et all., 1939/. Енергія, ідо є необхідною для активного акумулювання СҐ клітиною, забезпечується декількома способами. Зокрема, такою рушійною силою може бути Na-градієнт, генерованії!* Ка,К-АТФазою, сума хімічних градієнтів для овабаТн-резистемтмих потоків, функція квадрату Cl-градієнту для Иа,К,СІ-котранспорту /De Castillo et all., 1987; Lindstrom, 1988; Geck et all., 1989/. Крім тісно взаємозалежності і зв'язку з іонами Сі~ різні фракції' оазбаїн-резистентних потоків мають недифузійну природу і очевидну залежність від мембранного потенціалу. Однак в деяких тканинах діуретик-чутливий котранс.іорт Na,СІ - К,СІ разом з механізмами обміну внутрішньоклітинних іоніа К'а+ і К+ /натрієва помпа і К-канали/ формує Cl-помпу, яка акумулює СІ" проти електрохімічного потенціалу.

Нами було також прийнято до уваги той факт, що в котранспортни» процесах поступлення К+ стимулюється натрієм, а поступлення Na'* стимулюється калієм і подібна взаємна стимуляція транспорту іоніе повністю залежить від наявності відповідних кількостей Сґ /Sachs, 1981; Turner et all., 1988/.

Вплив позаклітинного Na* на переміщення іонів шляхом Na,K, СІ-котранспорту З метою вивчення участі іоніа Na+ в здійсненні СІ-катіонногс котранспорту, чутливого до фуросеміду, досліджували аплие позаклітинного Na+ на швидкість №,К,С!-котранспорту в ß-клітинах

і ід LU лунное ої залози ицура. ;

Визначення котранслортної величини як функції концентрації озаклітинного Na+ при постійних концентраціях К4 та СГ в інкубаційному ередовнщі показує, що швидкість фуросемід-чутлиаого тетраіонного отранспорту зростає зі збільшенням вказаного параметру, поки не .осягне максимуму. Подальше підвищення концентрації Na+, однак, іменшус величину швидкості вказаного котранспортиого потоку. Одержані дані дозволяють заключити, що залежність між такою ранслокацісю іоніо і позаклітинною концентрацією Na+ підпорядковується іінетииі насичення. Одним з пояснень подібної поведінки аналізованого іроцесу може бути виникнення стехіометричних змін, оскільки при іисоких концентраціях Na'+ останній зв’язується з К-центрами. Крім того, ;умка, що позаклітинний Na"1' приймає активну участь о детермінуванні швидкості Na,К,СІ-котранспорту, базується на даних, що посилення ічреміщення Na+ у внутрішньому напрямку знижує інтенсивність нагромадження в ß-клітинах іоиіа СІ", а дефіцит На4" збільшує К-іроникність плазматичних мембран цих клітин, імітуючи дію Д-глюкози на жазаний процес /120, 187/.

Слід також прийняти до уваги ту обставину, що проаналізований зище тил іонної залежності є характерним для клітин, функціонуючих за умоа in vitro. Що ж стосується умов in vivo, то при збільшенні концентрації Na4- а позаклітинній рідині для збалансування підвищеного осмотичного тиску в організмі починає посилено використовуватись сечовина, яка, циркулюючи у великій кількості, має здатність проникати а клітини різних типів /110/, і швидкість овабаїн-резистентних іонних потоків може залишатись незмінною.

Вплив позаклітинного Ct на переміщення іонів шляхом Na,H,СІ-котранспорту

Cf" є аніоном, якому належить важлива роль в нормальному функціонуванні ß-клітин, про що свідчить той факт, що in vitro фуросемід пригнічує індуковане глюкозою вивільнення інсуліну з ізольованих панкреатичних остріаціа /Norman et all.,1987; O'Grady et all. ,1987; Kinne, 1988/.

Відомо, що якщо при зміні позаклітинного Ct" на аніон, що не транспортується через плазматичну мембрану, швидкість фуросемід-иутливих потоків іонів змінюється, це є додатковою ознакою наявності в клітинах конкретного типу механізмів Na,К,СІ-котранспорту /Singh et all., 1981; Parifrey et all., 1983; Sandstrom, 1993/, вивчення властивостей механізмі» оаабаїн-резистентного фуросемід-чутлиаого транспорту моновалентних іонів в ß-клітинах підшлункової залози щура включало аналіз особливостей впливу повної або часткової заміни позаклітинного СГ

іншим аніоном на швидкість Na.K.CI-KorpaHcnopTy.

Як засвідчують результати досліджень, за умови замін позпнпітинного СГ на нітрат механізм Na,K,CI-KOTpaHcnopTy лригнічуеть« Вказаним процес має сигмоїдальну залежність від концентрації СГ. цьому відношенні р-клітими щура не проявляють органної чи видоа< специфічності. .

Паралельно досліджували вплив одночасної зміни позаклітиннії концет рацій Na'*' та СГ за умови постійної концентрації Н4" на швндкіст фуросемід-чутлизих потокіа в ¡1-кпітинзх щурз. Встановлено, що найбільї. інтенсизними потоки є при інкубації клітин п середовищі за наявності іоні Na+ та СГ в оптимальних для фізіопогічнаї активності концентрація* /Na

- 140 мЛ\, СГ - 135 мМ/, тоді як відсутність позаклітинних Na+ та С проявляється різким пригніченням швидкості іонної транслокації.

Випив позаклітинного К4" на переміщення іонів шляхом Ne,K,СІ-котранспорту

Ст;роючись на дані, що в еритроцигзх та деяких інших клітина швидкість Na,K,СІ-котранспорту е функцією “іонного добутку" INa+j [К+] • [СГр /Case ef ail., 1982, 1984; Garay, 19&8/ і сдєржавиі потвердження залежності швидкості Ма,К,Сі-котраиспорту ні, концентрації позаклііиниих Na+ та СГ, завданням нашого дослідженн було встановлення зв-язку між концентрацією позаклітинного К+ інтенсивністю перенесення іонів за посередництвом вказаногі механізму.

Напівмаксимапьну стимуляцію швидкості На,К,СІ-котрамспорту в |1 клітина» щура спостерігали при концентрації позаклітинного К+ на рівні 1 мМ, а в цілому залежність між обидвома вказаними параметрами мал лінійний арактер.

При встановленні особливостей впливу поєднаної змін' концентрацій К+ та СГ на швидкість оаабаїн-рвзистентних потокі моновалвнгник іоніа одержано результати, що підтверджую!;

положення, згідно якого необхідною умовою для максимальної активац фуросемід-чутлиаого №,К,СІ-иогранслорту с наявність в позаклітинном середовищі іонів Н+ та СГ у иідпоищннх концентраціях /Duhm, Gobel \Ш/.

1.3. Швидкість №,К,СІ-котранспорту а [5-клітннах щура при зміні рі-позаклітинного середовища

В цьому експерименті середня різниця швидкості Na,K,CI котранспорту при витримуванні р-клітим щура в інкубаційном'

середовищі з низьким /6,4/, фізіологічним /7,4/ і високим /8,4/ ph була мінімальною. Одержані дані свідчать, що водень не може служиті

субстратом для обміну будь-якого з іонів, що сумісно транспортуються механізмами Ыа,К,С1-нотраиспорту, хоча с очевидним, що самі) цей іон мас високу спорідненість до зовнішнього транспортного центру плазматичних мембран, особливо э електрично збудливих клітинах /Cala et all., 1988; Hoffman et all., t989; Ceionge ef at!., 1990; Latson of all., 1991/. Відсутність реакції механізмів Na.K,СІ-котранспорту о р-клітинвх на зміну pH позаклітинного середовища становить, на нашу думку, важливу ознаку в'дмінності вказаного тилу іонної транслокдц» від активного транспорту Na+ та К*-, оскільки позаклітинний водень і важливим модулятором базальної активності Na,K-ATcba3>i /Case af all., 1982; Р.аплег et all., 1989/.

1.4, Механізми регуляції' Na,K,Cl котрамспорту в р-клітинах при зміні їх об ему

З даному дослідженні (5-клітини підшлункової залози щура були використані як модельна система для вивчення осмотичних рухів води. Про об ем клітини судили за вмістом в них внутрішньоклітинної ООДН.

p-клітини підшлункової аалози щура інкубувалн в середовищі, що містило іони Na'*', К+ та Сґ за наявності овабаїну /5,0 мМ/. Після 20-хвилиііного зрівноважувального пе.ріоду клітинний об см залишався практично незмінним. Однак, після 30-хвклннного періоду інкубації індуковане овабаїном набухання Р-кяітин стас статистично значимим і залишається таким протягом усього подальшого періоду спостереження, котре в цілому тривало 60 хв.

При вивченні особливостей овабаїн-залежмого набухання клітин за присутності в інкубаційному середовищі фуросеміду /1,0 мМ/ встановлено, що фуросемід у вказаній концентрації запобігає овабаїн-залежному набуханню (i-клітин, інкубованих а ізоос мотичному середовищі. Об'ємна залежність може бути результатом сукупних змін а котрамслорті, однак ймовірним с те, що остання викликана механічними пертрубаціями мембран, '

Одержані результати підтверджують наявність об смно-

регулягормкх механізмів в fi-клігимах підшлункової залози щурз, зокрема, присутність в цих клітинах фуросемід-чутлиаого Na,K,CI-нотранспорту, залежного від величин градієнту Na+, К+ та СІ'.

Регуляція об ему клітин більшості типів t. динамічного і контролюється змінами іонних транспортних потоків. Враховуючи, що про тип об емного контролю можна судити, аналізуючи особливості фуросемід-чутливої Na,K,CI-KOTpaHcnopTMoi' системи в клітинах, інкубозаних а ізо-, гіпер- та гіпотонічному середовищах, мами виконано спостереження за змінами об єму (5-клітнн, зумовленими дією овабаїну та поєднаним впливом овабаїну і фуросеміду, котрі входили в склад розчинів різної осмоляльнос-

ті /200, 300, 400 мосМ/.

Вппиа г¡перосмотичного стискання на розміри ß-клітин я процесі їх інкубації в середовищі, осмоляльиіств котрого осладае 400 мосМ, за відсутності овабаїну і фуросему^у проявляється зменшенням їх об єму на 12 %, що с величиною, значмо нижчою від такоі в еритроцитах щуре імкубованих зз аналогічних умов, коли подібне зменшення сягас 30 % /Орлов и др., 19£8/. Додаткова присутність опабаїну /5,0 мМ/ сприяє: поверненню об'єму ß-клітин в межі контрольних значень, оскільки зменшення інкубоааних в гіперосмоляльному середовищі клітин не перевершує 3 %. Одержані нами дані можна розглядати як вказівку на наявність в ß-клітимах щура механізму, який впливає на зворотне набухания ліспа гіперос мотичного зморщування, Необхідно також врахувати, що такий тип об’ємного контролю в клітинах інших типів часто базується на дії діуреіик-чутливої Ыа,К,С1-котранспортнсТ системи /Levinson, 1967; Kim el alt., 1958; Geck et alt., 1989/. Додаткова присутність в середовищі інкубації другого транспортного інгібітора -фуросеміду - проявляється зморщуванням ß-клітин до того попереднього об’єму, яний був зареєстрований за відсутності обидаох інгібіторів. Очевидна, еплио фуросеміду за таких умов проявляється підвищенням калієвої проникливості ß-клітин, хоча, згідно даних літератури, спосіб дії гіпертонічного иіону є невідомим /Garay ei all., 1988; Weltstein et alt., 1990/,

При інкубації ізольованих ß-кпітин в гіпотонічному розчині /200 мосМ/ вміст води в клітинах через 60 хе від її початку збільшувався від 1,17 до 2, t0 г • t г сухої ваги"1. Вплив овабаїну за відсутності та за присутності фуросеміду на ефечт гіпертонічного шоку проявлявся поверненням об'єму клітин до вихідного рівня /1,20 і 1,15 г- 1 г сухої ваги'1, відповідно/. Однак при поясненні механізму розвитку подібного явища слід мати на увазі можливу здатність ß-клітин до регуляторного зменшення їх об'єму навіть аа відсутності інгібіторів іонної транслоиац». Подібне міркування можна обгрунтувати тією обставиною, що в клітинах інших тип із гілоосмоляльність не впливає на вихідний потік К+, транспортованого за участю Na,K-AT<Da3H, але пригнічує овабаїн-резистентний потік вказаного іону, одночасно збільшуючи швидкість його вихідного потоку, котрий спряжений з перенесенням молекул води. Отже, коли б навіть зміна обєму ß-клітин, тобто стискання чи набухання, не була пов язана з котранспортом, остання може бути результатом зміни активного транспорту іонів К+. Регуляторне зменшення об'єму, яке компенсаторно виникає за впливу гіпертонічного стискання клітин, в основному залежить від активації Na,Cl- і Na,K,СІ-котранспорту або від функціонування Ма/Н-' і CI/HCOj-обміну. З іншого боку, відновлення

клітинного об ему після набухання здійснюється завдяки регуляторному зменшенню об ему, що забезпечується К,СІ-котранспортом, провідністю И+ і СІ", а також К/Н- та CI/HCOj-обмінами /Chipperfield, 1984; Duhm et all., 1984; Cata ef all., 1988; Garay el all., 1988/.

Таким чином, e цілком можливим, що Ма,К,СІ-мотранслортнз система має важливу ропь а об ємній регуляції' ß-клітин підшлункової залози щура. Для додаткової перевірки правильності цього положення

було здійснене вммірговання швидкості іонної транслокащї, що

відбувається за посередництвом вказаної системи, в ß-клітинах, інкубоааних в середовищах різної осмоляльності: 200, 300 і 400 мосМ,

Як втпивас з резуяьт? тів дослідження, інкубація клітин а гіперосмоляяьному середовищі приводить до їх стискання, котре

супроводжується вірогідним зростанням швидкості На,К,СІ-котранспорту. При інкубації клітин о гіпоосмоляльному середоаищі, коли відбувається їх набряк, що утримується протягом всього періоду спостереження, швидкість виходу іонів шляхом Na,K,СІ-котранспорту зменшується на 35 %. , _

Сукупність наведених вище даних дозволяє дінти висновку, що система Na,К,СІ-котранспорту належить до механізмів, за

посередництвом котрих відбувається регуляи>'я об ему ß-клітин

підшлункової залози щура.

1.5. Вплив температури середовища преінкубації на концентрацію Na4" та К+ і швидкість Na,К,СІ-котранспорту в p-клітинах підшлункової

залози щура

В даному дослідженні вивчали профіль змін іонограми та швидкість На,К,СІ-котранспорту о ß-клітинах підшлункової залози щура, інкубоааних в ізоосмопяльному /300 мосМ/ та гіперосмоляльному /400 мосМ/ середовищах при температурі 37, 40 і 43° С.

Вимірювання швидкості Na, К, СІ-котранспорту 8 (’-клітинах, преінкубоааних за вказаних вище умов, здійснювали у за Язку з тим, що активність овабзїн-резистентнмх систем іонного транспорту, незалежних від функціонування натрісяої помпи, може різко змінюватись за наявності іонних збурень у внутрішньоклітинному середовищі /Панаоск та спіаавт., 1991; Geek el all., 1986; Duhm, 1987/.

Вказані клітини щурів, що складали групу порівняння, преінкубовані при температурі 37° С, містили Na+ в кількості 105,2 +- 11,4 мкМ • 1 г сухої ваги'1 і К+ о кількості 335,0 "*■- 16,5 мкМ ■ 1 г сухоі ваги"1. Витримування клітин а середовищі, що мас температуру 40° С, на 40-ій хвилині інкубації проявляється втратою 22 % К+ та накопиченням 41 % Na4-. Подальше витримування ß-кяітин, іонний склад котрих намагались змінити температурною абробігкою, в інкубаційному середовищі при

температурі 43° С не приводило до такого поглиблення виявлених відмінностей, котрі можна було б вважати істотними.

З ясовано, іцо обробітка р-клітин у вибраному нами температурному режимі, коли вміст іонін Иа+ та К+ в них вірогідно змінюється, практично не відбивається па швидкості іонної транслокації, що здійснюється іиля»ом №,К,СІ-котранспорту. Очевидно, зрушення іонної асиметрії, які були індуковані впливом температури інкубаційного середовища, відбувалися або модуляцію властивостей Ка,К-АТФази, або зміного пасивної проникності плазматичних мембран для іонів Ма+ та И+. Цей висновок с справедливим для клітин, чікубованих в середовищі фізіологічної осмоляльності /300 мосМ/, Витримування ж стиснутих Р-клітнн в гіперосмоляльному середовищі /400 мосМ/ проявлялось спочатку збільшенням швидкості На,К,СІ-к.атранспорту /за температури 40° С/, а потім до її зменшення до величин, ідо £ нижчими вщ вихідного рівня /за температури 43й С/. Таким чином, реакція (і-клітин щуре на зміни температури інкубаційного середовища різної осмоляльності е подібною до тачої, що її спостерігали з еритроцитах цих же тварин /Орлов идр., 1988/.

Одержані нами дані ще раз засвідчують можливості об смно’і регуляції Ка,К,СІ-котранспорту в р-клітинах щура, оскільки відповідною зміною температури преінкубаційного середовища повністю вдається зняти вплив стискання цих клітин на швидкість даної іонної транслокації.

1.6. Чутливість Ка,К,СІ-котранспорту в ^-клітинах підшлункової залози щура до дії випромінювання гелій-неоноаого лазера

Визначення чутливості фуросемід-чутливого №а,К,СІ-котранспорту в [ї-клітинах підшлункової залози щура до впливу випромінювання гелій-неонового лазера здійснювали б діапазоні доз 0,29 - 5,72 Дж • см‘2. Встановлено, що у вказаних клітинах процеси перенесення моновапентних Іонія за посередництвом механізму Иа,К,СІ-котранспорту після опромінення тварин монохроматичним червоним світлом в долі

0,286 Дж • см'2, розподілених на п’ять трихвилинних сеансів, є вірогідно пригнненими, про що свідчить зменшення швидкості вказаної іонної транслокащї на 25,4 %. Одночасно а р-кпітинах підвищувались

концентрація К4 до 119,44 мМ та вміст води до 1,52 г • 1г сухої ваги'1. Концентрація №а+ залишалась незмінною на рівні 13,42 - 15,0 мМ. Надмірне нагромадження полереджусться шляхом активації ЬІа,К-

АТФази. Даний висновок підтверджується збільшенням індексу К^/Ма^ на 19 %, що свідчить про посилення гідролітичної функції натрієвої помпи.

За умови збільшення дози опромінення до 2,86 і 5,72 Дж • СМ"г зареєстровано повернення величин швидкості транслокацн іонів а межі

фізіологічного діапазону».

Наведені факти можна po-згллдаги як додатковий доказ правильності положення, згідно котрого тривалий вплив лазерної енергії проявляється розпитком в опроміненому організмі біохімічного синдрому адаптації’.

При виконанні нашого дослідження враховували, що концентраційний градієнт моновапентних іонів на плазматичній мембрані підтримується не лише завдяки функціонуванню натрієвої помпи і фуросемід-чутлнвих механізмів іонної транслокації, але й системою Na/Li-лротитранспорту.

Хоча швидкість, з якою в ^-клітинах інтактних тварин здійснюється Na/Li-протитранспорт, перевершус таку стосовно Na,К,СІ-котранспорту, тим не менше перший з них характеризується більшою резистентністю до впливу лазерної енергії, оскільки я жодному зі спостережень не було зареєстровано вірогідних змін обміну внутрішньоклітинного Na+ на позаклітинний Na+, про який власне і судять не основі вимірювань швидкості Na/Li-лротитранспорту.

Одержані дані засвідчують, що вплив певних доз випромінювання гелій-неонового лазера на епігастральму ділянку тіла щура проявляється порушеннями обміну моновапентних іонів в ß-клітинах підшлунково? залози щура. Характер виявлених в цих клітинах змін вказує, що вони виникають не лише внаслідок модуляції властивостей механізмів, що забезпечують оаабаїн-чутливу екструзію Na4", але можуть бути результатом впливу вказаного фізичного фактору ма фуросемід-чутливий Нз,К,СІ-котранспорт. На основі відомостей, згідно котрих овабаїн-резистентні системи транспорту моновапентних іонів забезпечують регуляцію клітинного об'єму /Duhm, 1987; Zade-Open et all., 1988; Geck et all., 1989; Engsfrom et all., 1991/ та даних щодо їх потенційної роги в усуненні іонних збурень /Орлоа и др., 1988; Мороз, 1990; Пащенко, 1991/, обгрунтовано можливість участі фуросемід-чутлиаого Nj,K,СІ-котранспорту в перерозподілі іонів з обидвох сторін плазматичної мембрани ß-клітин підшлункової' залози.

ВИСНОВКИ

1. Овабаїн-резистентний потік монооалентних іоніа, що здійснюється в ß-юіітинах підшлункової залози щура, пригнічується фуросемідом, причому найбільш стііжий гальмівний ефект вказаного інгібітора проявляється при концентрації останнього 1 мМ. Поєднання впливу фуросеміду і безнатрієвого середовища, фуросеміду і безхлорного середовища чинить на цей потік такий ефект, що його можна порівняти з дією окремо застосованого фуросеміду.

- IG -

2. Залежність між швидкістю фуросемід-чутливої транслокаці момовйлемтних іоніа і позаклітинною концентрацією Na+ підпорядковується кінетиці насичення. Цей процес мас сигмоідапьну залежність від концентрації СІ" в позаклітинному середовищі. Залежність між його швидкістю і позаклітинним К+ носить лінійний характер. Необхідною умовою для максимальної активації фуросемід-чутливого №,К,СІ-котранслорту і наявність в позаклітинному середовищі іонів К+ та Ch у відповідних концентраціях.

3. Водень не може служити субстратом для обміну будь-якого з іонів, що сумісно транспортується в ß-клітима* підшлункової залози щура механізмами №,К,СІ-котрвнспорту. Це становить важливу ознаку відмінності вказаного типу іонної траислокаціі від активного транспорту Ма+ та К+.

4. Фуросемід здатен запобігати овабаїн-залежному набуханню ß-клітин підшлункової залози щура, інкубованих в ізоосмотичному середовищі, що свідчить про наявність в цих клітинах об-емно-регупяторннх механізмів, зокрема, фуросемід-чутлиаого Na,К,СІ-котранспорту. Цей механізм іонної транслокащї може впливати на зооротмс набухання ß-клітин після їх гіперосмотичного зморщування. Вплив овабаїну за відсутності та за присутності фуросеміду на ефекти гіпотонічного шоку проявляються зменшенням об'єму ß-клігин до вихідного рівня.

5. Інкубація ß-клітин підшлункової залози щура а гіперосмолальному

середовищі приводить до їх стискання, нотри супроводжується зростанням швидкості Na,K, СІ-котранспорту на 52 %. Na,K,CI-

котранспорт в таких клітинах припиняється за відсутності позаклітинного

. К+. При інкубації ß-клітин в гіпоосмоляльному середовищі їх набухання супроводжується зменшенням швидкості Na,К,СІ-котранспорту на 35 %.

6. Зміною температури інкубаційного середовища, в якому витримували стиснуті внаслідок гіперосмотичного шоку ß-клітини підшлункової залози щура, від 40° до.43° С можна зняти аплиа стискання цих клітин на швидкість №,К,СІ-котранспорту. Цей факт засвідчує здатність вказаного котранспорту до об-емної регуляції.

7. Хронічний вплив на щурів випромінювання гелій-неонового лазера може проявлятись пригніченням швидкості Na,K,CI-KOTpaHcnopry в ß-клітинах. Цей ефект спостерігається за умови збільшення об'єму вказаних клітин, коли в них зростає концентрація іонів К+ та вміст води. Відсутність коливань концентрації Na+ в таких клітинах забезпечується посиленням активної екструзії Na+ на фоні стабільної швидкості Na/Li-обміну.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Панасюк Е.Н., Мороз А.М., Пащенко Н.И., Боброеник А.Д, Активный транспорт натрия и фуросемид-чувстеительный натрий-кллиевый когранспорт в эритроцитах при воздействии излучения гепий-неоноеого лазера //Тез. докл. научно-лракт. конф. "Низконнтенсивное лазерное излучение в медицинской практике". - Хабаровськ, 1990. -С.125 - 127.

2. Мороз О.М., бархомій Т.П., Думапьська І.Ф., Боброеник А.Д. Бидоаа та органна специфічність механізмів овабаїн-резистентного транспорту натрію та капи- 1 /Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції "Медична діагностика". - Київ-Львіа, 1992. - С. 246.

3. Думальська І.О., Вархомій Т.П., Бобровий« А.Д., Лазоренко

Л.М. Світло гелій-неонового лазера як ксенобіотик //Тези доповідей міжнародної конференції "Львівські лазери в дерматолог», курортології і біології”. - Львів, 1992. - С. 34 - 35. ->

4. Мороз А.М., Павлюст Л.П., Бобровнич А.Д. О целесообразности исследования параметров нон-транспортнрующих функций эритроцитов при вмутрисосудистом лазерном облучении крови //Тезисы докладов научно-практической конференции "Эферентные методы в медицине“. - Іжевськ, 1992. - Ч. 2 - С. 79 - 80.

5. Мороз А.М., Боброеник А.Д. Чувствительность механизмов осуществляющих в железисто-эпителиальных клетках транспорт одновалентных ионов, к действию излучения гепий-неомового лазера //Тезисы докладов международной конференции "Прикладные проблемы лазерной медицины". - Москва, 1993. - C. S9.

6. Мороз О.М., Павлюст Л.П., Думальська І.Ф., Вархомій Т., Лазоренко Н.М., Бобровннк А.Д. Кінетичні характеристики оуабаі’н-резистентних механізмів транспорту нагрію та калію в залозисто-епітеліальних клітинах //Матеріали регіональної конференції "Науково-методичні аспекти фізіології". - Львів, 1993. - C. 1 20 - 121.

7. Мороз О.М., Лисюк О.., Боброеник А.Д. Ма,К,СІ-котраиспорт в бета-клітинах підшлункової залози щура за випромінювання гвлій-неоноиого лазера //Тези доповідей XIУ З'їзду Українського фізіологічного товариства. - Київ, 1994. - С. 167 - 168 .

8. Бобровнин А.Д., Павлюст Л.П. Особливості Na, К, СІ-

котранспорту в бета-клігинах підшлункової залози щура //Тези доповідей 1 З'їзду Українського біофізичного товариства. - Київ, 1994. -С. 39 - 40. ■

9. Боброеник А.Д., Лисюк О.І. Іон-транспортуючі функції клітин

підшлункової залози, як вирішальний фактор у розвитку біологічних ефектіві індукованих випромінюванням гелій-неонового лазера //Тези доповідей 1У науково-практичної конференції "Застосування лазерів в медицині га біології”. - Київ, 1995. - С. 22.

10. Боброеник А.Д. Швидкість Na,K, СІ-котранспорту в бета-клітинах підшлункової залози за впливу випромінювання гелій-неонового лазера //Тези доповідей міжнародної конференції “Применение лазероо в биологии и медицине". - Київ, 1995. - С. 16.

11. Боброаник А.Д., Лисюк О.І., Павлюст Л.П. Механізми впливу випромінювання гелій-неонового лазера на іон-транспортуючі функції' незбудливих мембран / /"Acta medica Leopoliensia". - 1996. - т. 2., N 1., С. 93 - 97.

SUMMARY

Bobrovnix A.D, The ouabain-resistent Na,K.,CI-cotransport properties in rat pancreatic (i-cells. The manuscript of dissertation for receiving scientific dtigree of Medical Sciences’ Candidate as specialist 14.03.03 - Norma! physiology. Lviv State Medical University. Lviv. 1996.

Obtained resulti prove thet a certain traction of monovalent ions netfo-streams takes place in Langergan'S p-cells islets by means of furosemid-sensitive Na,K.,CI-cotranspod. There is presented characteristics of ion franslocafion mechanism, kinetics of its activation and inactivation under condition of changes of ion composition, pH and temperatture of extracellular medium, and during the process of normocyte transformation info macrocytes and microcytes. Na,K.,CI-cotransport was shown to belong to the mechanisms, regulating the volume of the cells in question of the above-mentioned cells. There was analyzed the interrelation between Na,K,CI-cotransport and other mechanisms of ion exchange. Modulation of Na.K.CI-cotransport in (З-cells was determined to be caused by the indirect influence of helium - neon lazer radiation on the organism.

АННОТАЦИЯ

Боброаник А.Д. Свойства овабаин-резистемтного Na,K,CI-котранспорта в fi-клетках поджелудочной железы крысы. Диссертация /рукопись/ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.03 - нормальная физиология, Львовский

медицинский университет, Львов, 1996. '

Получены доказательства, что о ^-клетках островков Лангерганса крыс определенная фракция нетто-потоков моновалентных ионов осуществляется путем фуросемид-чувствительного Na,K,CI-котрамспорта. Представлена характеристика данного механизма ионной

транслокаи^ии, кинетика его активации и инактивации я условиях изменения ионного состааа, pH и температуры внеклеточной среды, при превращении нормои,итоа а макрои^ты н мнкроциты. Показано, что Ыа,К,С1-котранспорт принадлежит к механизмам, посредством которых происходит регуляция объема указанных клеток. Проведен анализ связи Ыа,К,С1-котранспортэ с другими механизмами ионного обмена. Установлено, ^то опосредованное влияние на организм излучения гелии-неоноаого лазера может реализоваться путем модуляции сэоиств Ыа,И,С1'КОтранспорта в р-кпетках. .

^лючов/ слова: р-клггини, №,К,С1-котранспорт, ‘юногрзма, pH, осмоляльн1сть, температура, випромнюэання гелм-неоноаого лазера.

Шяплсано до друку СТ.97р. Формат бСхяа/т6.

Обем 1друк.лист. Еаи.1. Тир.ТОО. Бэзп.гатнс.

ЛлчекГвсыта.З. ¿рукаряя 7.Ц !и.1в.Федором.