Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Аутоиммунные механизмы развития инсулин-зависимого сахарного диабета

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР Институт иммунологии

На правах рукописи

ЗЛОШНА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

АУТОИММУННЫЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ ИШУЛИН-ЗАВИСИМОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА

(14.00.35 - Аллергология и иммунология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 1991 г.

Работа виислнона в отделе имиуногенетики Института иммунологии Минздрава СССР (заведующий - профессор £ П. Алексеев) Научный консул-такт - академик АН СССР Р. Е Петров

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Б. К Мороз, академик АН СССР, доктор медицинских наук, профессор

М. И. Балаболкин, доктор медицинских наук, профессор Б. Е Пинегин, доктор медицинских наук, профессор

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Ьторсй Московский ордена Ленина государственный медицинский институт имени Н. И. Пирогова.

Защита состоится "25" сентября 1991г. в 14 час. на заседании Специализированного Совета Л 074.09.01 при Ин- -статуте иммунологии Ыинздрава СССР по 'яй^еу: Москва, 115478, Каширское шоссе, д.24, корн.2.

С диссертацией можно ознакомиться в 'Института

иммунологии Ыинздрава СССР.

Авторе<>зрат разослан "15" августа 1091 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доп'ор биологических наук

«1- Е Колобов

СШСКЕШь-

( 5 Г-';;.; якаа

чссертафф

АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Инсулин-зависимый сахарный диабет (ИЗСД) - широко распространенное заболевание хронического течения, развиваицэеся преимущественно у лиц молодого возраста и характеризующееся быстрым развитием кетоацидоза, ранней инва-лидкзацией и высокой детальностью. Быстрый прогресс иммунобио-технологии позволил подойти к пониманию аутоиммунной природа

с

этого заболевания и обнаружению антигенных структур бета-клеток - возможных мишскей аутоиммунного процесса Особую валкость в последнее время приобрели исследования аутоиммунных механизмов развития ИЗСД. С одной стороны, они имеют принципиальное значение для изучения ранних этапов патогенеза ИГЗСД и создания доклинической иммунодиагностики этого заболевания. С другой стороны, эти исследования являются основой разработки иммунокорригирущей терапии ИЗСД.

В настоящее время клинический диагноз ИЗСД основывается на выявления нарушений покера* слей углеводного иимена. Эти нарушения проявляется при необратимом разрушении подавляющего большнства инсулин-продуцирувдих бета-клеток островков поджелудочной железы. Иммунодиагностика ИЗСД позволяет выяеить наиболее раншс э, доклиническую стадии патологического процесса. Это го.яет рэвающэе значение, постельку своевременная коррекция' начальных сдвигов »метаболизма приводит к длительной ремиссии и значительно более отдаленному по времени развитию осложений заболевания. Кроме того, в случае диагностики ранней стадии развития ИЗСД, до назначения заместительной терапии инсулином, (!ошо применить иммунотерапию, направленную на сдерживание патологического аутоиммунного процесса

В нашей стране иммунобиотехнологмческим исследованиям

ИЗСД до недавнего времени уделялось недостаточное внимание. О г., после принятия Государственной научно-технической программы "Сахарный диабет", иммунология сахарного диабета стала одним из приоритетных направлений исследования.

Насгояизя работа посвящена изучению аутоиммунных механизмов развития КэОД v. ti do ведена в рамках этой програшш.

ЦЕЛЬ К ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. «¿ль настоящей работы состояла в исследовании аутоиммунных механизмов патогенезе ичид, в том числе в обнаружении антигенной структуры бета-клеток -возможной мишени развития аутоиммунного ИЗСД, доказательстве ее участия в секреции инсулина in vitro и развитии ранних этапов диабегогенеза у экспериментальных животных, разработке ишуно-коррекции моделируемого патологического процесса и использовании комплекса подученных данных для обоснования, разработки и внедрения метода доклинической идаунодшгвсстики изед человека В задачи исследования входило:

1. Получение моноклональных антител, аналогичных по специфичности циркулирующим аутоангителам к антигену "р64" у больных иаод. • • • •

2. Выделение и характеристика при помощи моноклональных антител соответствующей антигенной структуры, и после идентификации семейства антигенов рб4-69 бета-клеток проведение его сравнительного анализа с декарбоксилазой глутаминовой кислоты.

3. Изучение взаимосвязи экспрессии семейства антигенов р64-б9 и функциональной активности бета-клеток, а также участия этой антигенной структуры в регуляшм стимулируемой глюкозой секреции инсулина in vitro.

4. йзучеи?? роли семейства антигенов p6i-69 бета-клеток в развитии ранних .этапов патогенеза ИЗСД у экиперннентальных животных. ' .

5. Исследование протективного эффекта предварительного ввэде-

№ антигенного материала рб4-69 и аллоантисыворгчгки к антигены H-2(k) на развитие экспериментального аутоиммунного ИЗСД.

Разработка метода доклинической иммунодиагностики ИЗСД че-эвека на основе обнаружения циркулирующих аутоантител к се-зйству антигенов рб4-б9 бета-клеток, с целью дальнейшего диф-гренцированного подхода к выбору средств профилактики и |фективной терапии.

ДУЧНД-Я НОВИЗНА РАБОТЫ. При выполнении настояпей работы полу-ен ряд новых приоритетных результатов. Впервые при помощи UKA вделен видонеспешфический антигенный комплекс бета-клетоко одаяелудочной жлевы рб4-б9, показано его участие в регуляции екреции инсулина in vitro и проведены эксперименты, подтверж-ащие, что антигенный комплекс рб4-б9 является одной из шше-ей аутоиммунной деструкции бета-клеток, создана биологическая одель ранних этапов патогенеза ИЗСД. На этой модели изучен ротективный эффект предварительного введения антигенного иа-ериала р64- 39 и аллоантисьшоротки к антигенам Н-2, что откры-ает дальнейшую перспективу разработки иммунокорригиругааей те-йлии ИЗСД человека.

Разработан и применен метод доклинической иммуиидиш пис-'ики заболевания, основанный на выявлении аутоантител к свойству антигенов р64-69 бега-клеток. Шлучены данные о воз-южной идентичности антигенной структуры р64-69 и ;екарбоксилазы глутаминовой кислоты (ГДК). Посколысу первичная :труктура ГДК известна, в дальнейшем возможен синтез пептздов-шалогов антигенных детерминант и разработка на их основе но-!ых методов "иммунодиагностики и иммунотерапии ИЗСД.

Таким образом, настоящая работа в целом открывают перс-тективу развития нового научного направления в иммунологии ин-:улин-эавйсимого сахарного диабета

ФАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Инсулин-зависимый сахарный диа-

бет в силу своей распространенности, частоты и тяяести осложнений, необходимости регулярной госпитализации больных, является серьезной медико-социальной проблемой в СССР и за рубежом. Клиническому дебету ИЗСД предшествует необратимая деструкция бета-клеток островков Лангерганса поджелудочной аг-лезы - уникальных продуцентов гормона инсулина. В связи с этим после установления клинического диагноза необходима за!>.эсти-тельная терапия инсулином в течении всей кизяи пациентов.

Установление ключевой роли аутоиммунных процессов в патогенезе ИЗСД позволяет рассматривать проблемы его диагностики и лечения с новой позиции. В результате данного исследования обнаружено семейство антигенов р64-69 бета-клеток, получены данные об их участии в инсулин-секреторной функции in vitro и развитии начальных этапов патогенеза ИЗСД у экспериментальных животных. Тем самым показано, что данная антигенная структура является одной иг возможных мишеней аутоиммунного процесса при ИЗСД. В конечном итоге разработан принцип иммунодиагностики доклинического этапа развития заболевания.

DSSC£cБаКлл На райКсй С70ДИХ ПОЗВОЛЯеТ ЯрИУС"

нить иммуносупрессируюцую терапию, направленную на сдерживание аутоиммунного процесса. Кроме того, полученные результата по предотвращению развития ранних этапов ИЗСД у экспериментальных животных в дальнейшем могут быть использованы для перехода от иммуносупрессируюигй терапии к иимунокоррекции этого патологического процесса у человека.

Результаты проведенного исследования и разработанный метод доклинической иммунодиагностики ИЗСД внедрены в 1S89-199C гг. в практику II Изсковского ордена Ленина государственного медицинского института иыенк Е И Пирогова, Латвийского научно-исследовательского института экспериментальной и клинической медицины МЗ ЛатвССР, Андижанского государственного медициною-

го института"" имени М. Л Калинина, 83 Городской клинической больницы г. Шсквы. Метод доклинической иммунодиагностики ИЗСД апробирован с положительным результатом в 1991г. во Всесоюзном эндокринологическом научном центре АМН СССР. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Апробация диссертации проведена на Межлабораторной конференции и Научном семинаре Института иммунологии Минздрава СССР.

Представленные в диссертации результаты докладывались на 5 Международном рабочем совещании "Тканевые культуры панкреатических остповкоеых клеток" (Трассенхайде, ГДР, 1987г.); Сиу пози>.*е Латвийского научного общества эндокринологов (Рига, 1988); I Всессоюзном съезде иммунологов (Сочи, 1988 г.); XXIV конгрессе Европейской ассоциации по изучение диабета (Париж, 1988г.); Межинститутской научней конференции Всесоюзного эндокринологического Научного центра АМН СССР (Москва, 1989г.); Советско-японском симпозиуме "Рецепторы: структура и функция" (Ыосква, 1989г.); Международной конференции ЮНЕСКО "Биотехнология на пороге XXI века" (Москва, 1939г.); Международной зимней ЕчСОЛЙ ПС ИММуНСДСГИИ И ИНФЕКЦИОННЫМ' ЭйбОЛ^В^РИ^ ( то, Япония, 1990г.); ¡1 Международном симпозиуме "Реабилитация иммунной системы'Ч Дагомыс, 1 У90г.).

По материалам диссертации автором были прочитаны лекции в Шучно-исследовательской лаборатории .Хагедорна (Дания), являющейся центром по изучению патогенеза диабета Всемирной- организации здравоохранения, в Научно-исследовательских институтах

фармакологических: фирм "Ново" (Дания), "Хехст" (Япония).

!

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 31 печатной работе, изданных в СССР и за рубеяом. По материалам диссертации получено 3 авторских свидетельства на изобретение. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующие разделов: введение, обзор литературы, характеристика мате-

риалов я методов исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, указатель литературы. Текст изложен на 281_ стр., включает 56 рисунков и 8 таблиц. Библиография содержит 571. наименование.

Вклад соавторов отражен в публикациях по теме диссертации. Всем коллегам автор приносит благодарность за участие в совместных работах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы нижеперечисленные методы исследования. Культуры островковых клеток человека и грызунов получен! up;: помощи ферментативного перевар?,вания поджелудочных желез. Мэноклональные антитела (ЫКА) к антигенам островковых клето» получены методом гибридоыной технологии. Дня характеристик! реактивности МКА 1СА-1 с бета-клетками применено двухмветио» иммунофлуоресцентное (нРИФ) окрашивание островковых клеток ßpi помощи МКА к инсулину и МКА ICA-1. Проведен компьютерный а^а лиз экспрессии на отдельных бета-клетках антигенной датеpisi канты, выявляемой МКА ICA-1, с помощью анализатора изображен» IBAS 2000 (Opton, ФРГ). Ультраструкгурная локализация cewcic тва антигенов рб4-б9 изучена при помоши трансмиссионной и ска нируиаей электронной микроскопии. Определение молекулярно массы семейства антигенов р64-б9 проведено тремя способами радиоиммунопреципитацией, иммуноблоттингом и электрофорезе после очистки антигенного материала на иммуносорбенте с Mr ICA-1.

Исследование роли антигенов бета-клеток в инсулин-секторной функции in vitro проведено в тьстс ингибиции стицулир: емой гяккозой секреции инсулина культивируемыми островкоЕа клетками под действием МКА ICA-1. Моделирование ИЗСД у зксп<

риментапьных животных осуществлено путем введения аллоксана и зтрептозотоцина, а также ШЛ ICA-1. Концентрация глюкозы s сыворотке крови определена глккозооксидазным методом, С-пептида и инсулина - радиоиммунным (РИА) методом.

Степень выраженности инсулита изучена на парафиновых срезах поджелудочных мелеа. Морфометрический анализ островков и эрганов иммунной системы осуществлен при помощи анализатора изображений (Opton, ФРГ). Экспрессия антигенов главного комплекса гистосовместимости (МНС) I класса исследована на криос-реэах подлклуяочных хелсз при ломода МКА 0x18 непрямым иммуно-перок^идазным методом. Содержание пептидных гормонов в островках охарактеризовано при помощи МКА (Novo, Дания) к инсулину НШ-018, к глккагону 6LU-001, к соматостатину S0B-018, к С -пептиду PEP-030 и к проинсулину HP1-005. Лечение диабетоподоб-кой реакции, вызванной введением МКА 1СА-1, проведено инсулином в лютосомах.

Предотвращение развития ранних г тапов диабетогенеаа в модельных системах изучено при псмсая предварительного введения аффинно очвдэнного антигенного «атсриалз р64 S3 и аллоанхксы-воротки к антигенам Н-2(к). Сыворотки 286 больных ИЗСД тестированы на наличие аутоантител к поверхностным (sICA) и у 150 пациентов - к цитоплазмати-.<?склм (cyICA) антигенам островковых клеток. Разработан и применен у 1243 пациентов способ определения аутоантител к семейству антигенов рб4-б9 флуоресцентным анализом с разрешением во времени (TRFA). Проведен радиоиммунологический анализ связывания антигенного материала р54-б9 с сыворотками пациентов. Охарактеризован мембранный фенотип мо-нонуклеарных клеток периферической крови больных ИЗСД с использованием МКА к кластерам дифференцировочных антигенов лейкоцитов человека CDS, CD4, CD8, CD21, CD57. Для определения содержания активированных Т-клеток применен метод двухцветного

иммунофлуоресцентного окрашивания при помощи УКА к антигенам ПЗ и HLA-DR.

Определение ферментативной активности глутаматдекарбокси-лаэы (РДК) проведено радиометрическими методами по выделение радиоактивного CO., и образованию гамма- аминомасляной кислоты.

Полученные результаты статистически обработаны с помощью программы "STATQRAP* для персонального компьютера IBM PC/AT.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение и характеристика МКА к антигенам бета-клеток

островков Лангерганса поджелудочной железы.

1. кэрфо-функциональная характеристика культуры островко-вых клеток.

В работе использованы переживающие культуры островковых клеток человека, крысы, ыызи и хомяка. Исследования, требувдие большого количества материала, проведены с использованием культивируемых островковых клеток крыс Wistar. В зависимости от способа ферментативного переваривания поджелудочной ж левы, ¡культуры ос1ровкиЬых клеток раяличдйи';* но сгтепйнй диспергирования. При максимальной степени дисперсии островков культуры состояли преимущественно из одиночных неприкрепленных к пластику клеток. Одиночные клетки были округлой формы, диаметров 10-15 мкм а содержали фазовоплотные секреторные гранулы. После культивирования в течение 1 часа эти клетки агрегировали в небольшие ассоциаты - кластеры, содержаще 5-20 клеток, а черев 18 часов в культуре обнаруживались кластеры из 5-100 и более клеток. В последующие 4 сут инкубации культура преимущественно состояла из флотирующих псевдоостровков - шаровидных скоплений плотно лежащих нескольких сотен островковых клеток, с образовавшейся капсулоподобной оболочкой из соединительнотканных волокон. Включение островковых клеток в кластеры и псевдоостров-

ки при удлинении срока культивирования было связано с инсулин-секреторной функцией бета-клеток. Так, стимулируемая 25 мМ. глюкозы секреция инсулина резко возрастала при организации ос-тровковых клеток в кластеры и псевдооетровга, по сравнению с одноклеточной флотирующей культурой. При помощи ША к пептидным гормонам было показано, что в кластеры островковых клеток включаются Н1Л-018(+), РЕР-030(+) бета-клетки (табл.1).

Тактов образом, при культивировании панкреатических островковых клеток, бета-клетки находятся в функционально-активном состоянии и включахтся в состав кластеров, что сопровождается достоирньм (Р<0,01) увеличением уровня стимулируемой глюкозой секреции инсулина.

Табл. 1. Характеристика культуры островковых клеток по составу

эндокринных клеток. Непрямое иммунофдуоресцентное окрашивание при помощи ША к пептидным гормонам.

Иммунореактивность НКА "с культивируемыми островковыми клетками

"Ш культура одиночных флояярухшх octdob-ковых клеток культура кластеров островковых клеток р

n=12, М+т (%) п=12, М+т (7.)

HUI-018 31,6+11,9 56,0+6,8 < 0,05

PEP-030 21,4+4,/' 51,2+8,7 < 0,01

HP1-005* 51,6+7,1 68,3+6,3 > 0,05

GLU-001 ¿1,4+3,8 38,3+5,9 < 0,05

SOW-018 5,9±2,9 11,3+4,9 > 0,05

Специфичность ЫКА:НШ-018( инсулин), PEP-030(С-пептид), 6LU-001 (глхкагон), Б0М-018(соматостатю0 человека и грызунов. * - МКА НР1-005 перекрестно реагируют с альфа-клетками крысы.

• - 12 -

2. 1Ьлучение шноклональных антител к антигенам оетровковых клеток. "

ЫКА ICA-1 к антигенам оетровковых клеток получены в результате гибридизации спденоцитов ш BALB/c, иммунизированной культивируемыми кластерами оетровковых клеток крыс Vista»-, с клетками мышиной миеломы P3X63 Ag8.653. Первичные культуры были скринированы в нРИФ с применением проточной цитометрии.

Гибридные клетки, секретирущие антитела, Кигсрые связывались с островковымм клетками крысы, были клонированы, после чего бьи проведен анализ специфической реактивности продуктов секреции по двум направлениям: исключение перекрестной реактивности с культурами других эндокринных клеток (1) и с моно-нукнеарными и ацинарными (экзокринными) клетками, имеющимися в составе культуру оетровковых клеток (2).

Цюдукты секреции клона. C10G7 в кРИФ обладали значительной реактивностью с островковьши клетками (рис. 1а) и практически не взаимодействовали с эндокринными клетками гипофиза (рис.16), щитовидной и слюнных желез, а также с тииоцитами (рио. 1в), спленоцита.мк и иононуклеаралк клетками периферической крови крыс. При сравнении их иммунореактивности с островковьши клетками крысы, мыши, хомяка и человека оказалось, что антитела взаимодействуют с идентичной субпопуляцией оетровковых клеток этих видов. ЫКА, продуцируемые клоном C10G7, получили название ICA- и были охарактеризованы при помощи антисывороток к подклассам Ig мыши как lgïL Дальнейшие исследования: гель-фильтрация, биосинтетическое мечение продуктов секреции клеток гибридомы С-лейцином с последующим полиакриламидныы гель-электрофорезом в присутствии додецилсульфата натрия (ДОй-ПАГЭ) и авторадиографией подтвердили класс ЫКА.

На криосрезах поджелудочной железы ЫКА ICA-1 окрашивали зону расположения бетат клеток. Предварительная обработка кри-

осрезов 1%-ныы трипсином отменяла реактивность с МКА 1СА-1. Однако результаты двойного окрашивания при помонда )ЖА к инсулину и МКА 1СА-1 на криосрезах не дали конкретного ответа о селективном связывании МКА 1СА-1 с бета-клетками, поскольку интенсивность окрашивания продуктов реакции с анти-инсулиновы-ми антителами была значительно более выраженной. Б дальнейшем было применено двойное окрашивание культивируемых островковых клеток МКА к инсулину и биогинилированными ША 1СА-1. • Иятен-сивность флуоресценции окрашенных клеток определяли на проточ-л ном цитометре РАСЗоап. Для анализа брали клетки, локааиэукщие-ся в верхней части двухпараметрической гистограммы показателей »алоуглового и перпендикулярного рассеян!Ш луча лазера На рис. 2 приведены результаты 1 из 5 воспроизводимых экспериментов. Содержание 1СА-1-позктивных клеток в различных культурах островковых клеток варьировало от 20 до 70 7.. В популяции островковых кл*. гок антигенная детерминанта, выявляемая МКА 1СА-1, была экспрессирована на большем проценте клеток (на 10-15%) по сравнению с клетками, содержанию! инсулин на клеточной мембране. Аналогичные результаты получены при двухцветно« окрашивании клеток инсулинош РЛК5АН. Поскольку окрапквание культивируемых бета-клеток при помощи МКА к инсулину происходит за счет взаимодействия с участками экзоцитозз инсулина, предположили, что определэнный процент бета-клеток фенотипа 1СА-1(+) может содержать в цитоплазме бета - гранулы, но. не экспрессн-ровать инсулин на поверхности. Анализ ультратояких срезов культивируемых островковых клеток, окрапенных НКА 1СА-1 ч вторичными антителами, коныогированными с коллоидным золотом показал, что клетки фенотипа 1СА-1(+) содержат в цитоплазме бета-гранулы. Не обнаруяено связывания ЫКА 1СА-1 с зкзокринныыи клетками и в других контрольных препаратах.

Таким образом, МКА 1СА-1 1дМ класса выявляют антигенную структуру, специфическую для бета-клеток человека и грызунов.

- 14 -

Рис. 1. Окрашивание МКА 1Са-1 островковых клеток поджелудочной железы (А), клеток гипофиза СБ), тишцигов (В). По оси ординат - количество клеток (в относительных сравнимых ед.). По оси абсцисс -интенсивность флуоресценции ( в относительных ед.).

Рис. 2. Экспрессия антигенной детерминанты, выявляемой WtA 1СА-1, на бета-клетках поджелудочной железы крыса Двухцветное окрашивание культивируемых островковых клеток МКА к инсу-ину и МКА ICA-1. А - контрольные кдсткк, йгфогюккые только Еторичкы-ми флуоресцирующими реагентами; Б - клетки, окрашеншэ МКА к инсулину (ШЖ-7) и ICA-1; по оси абсцисс - log зеленой флуоресценции; по оси ординат - log красной флуоресценции. Проценты клеток, окрашенных одинарными и. двойной меткой, указаны цифрами в соответствующих квадратах.

Я

! Б

1 »

0.02, 0.00

99.73 л

1.S5

>•> <•> ■■> MTI-nouK Imsrzrz

- 15 -

3. И»<унохимическая характеристика семейства антигенов, выявляемого кКА 1СА-1.

Вначале для определения молекулярной массы антигенов применили метод радиоиммунопреципитации (РКЦ). Для введения радиоактивной метки в бедки островкозих клеток использовали биосинтетическое мечени* З-метионином »культивируемых клеток. Радиоавтограф иымунопреципитата с МНА 1СА-1, разделенного по относительной молекулярной массе в редуцирующих условиях в ДСН-ПАГЭ, показал, что в иымувопреципитате присутствовало* больное количество Б-иетюн-ивченых белков, в том числе с Мг п диапазоне 64-69 кО.

В связи с тем, что получить однозначный результат при помощи РИЛ о молекулярной массе антигена, выявляемого ЫКА 1СА-1, Не удалось, применили иммуиоблоттинг белков из лизатов остров-Ковых клеток крысы с МКА 1СА-1. С этой целью белки лизатов оо-Тровковых к^ток крысы в неионном детергенте КР-40 разделяли по молекулярной массе (Мг) в редуцирующих условиях в ДСН-ПАГЭ. в заеютофоретически переносили из геля на ни?роц9лл??лозные фильтры, которые затем окрашивали ЫКА 1СА-1 с помощью иммуно-фэриентного метода. Йз рис.3 следует, что ЫКА 1СА-1 окрашивали семейство белков с Мг 56, 64, 67, 69 кО. Так как в иммуноблот-*инге ант'теда реагировали с уае разделенными антигенами и скрашивали каждую 5елковую зону с соответствуквдэй молекулярной Кассой, предположили, что антигенная детерминанта, выявляемая ЙКА 1СА-1, локализована на каждом из этих белков.

Выделение и очистку семейства антигенов р64-69 в препаративных количествах проводили с помощью аффинной хроматографии йа вммуносорбенте с ЫКА 1СА-1, ковалентно пришггыми к сефарозе 6 МВ, активированной бромцианом. Изучение субъединичной организации семейства антигенов, выявляемого ЫКА 1СА-1, показало, что в нередуцнрующих условиях антиген имел Мг 55 № и 120 кЛ,а

в редуцирующих - представлял собой семейство из 4 белков с Mr 56 , 64, 67 и 59 kD (рис. 4). Таким образом, в состав димера не входила субъединица с Ыг 56 kD.

Двумерный электрофорез позволил определить изоэлектричес-кую точку антигенного комплекса, которая составила 6,4 (рис.5). Электрофоретическая подвижность белков семейства р64-69 после обработки эндогликозидазой Г не изменялась, в связи с чем заключили, что причиной микрогетерогенности антигенов по Mr не являлась различная степень гликозилирования. С другой стороны, представители семейства антигенов рб4-69 могли быть представлены либо "чистыми" полипептидаш, либо гликозилирова-ны настолько слабо, что разрешение метода не позволило иденти-ф;пдаровать их как гликопротеиды. Из лизатов островковых клеток человека, крысы, xomita. и мьаш на иммуносорбенте с ЫКА ICA-.1 аффинно очистили идентичнее по Mr семейство антигенов р64-69» что подтвердило видонеспецифичность этой антигенной структуры бета-клеток.

Для определения иммунологической активности семейства антигенов рб4-б9 с sICA-позитивными сыворотками больных КЭОД,

антигенный материал йодировали с использованием 1,3,4,6 - тег-

125

рахлор - За, 6а - дифенилгликоурила (Iodo-gen), кзченный I протеин отделяли от киакомолекулярных радиоактивных продутой гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25. Для проверки радиохимической чистоты йодированного антигена проводили ДСН-ПАГЗ с последующей радиоавтографией. Уровень связывания sICA - позитивных сывороток больных ИЗСД с антигенным материалом был достоверно выше, чем в контрольных группах. В то же время из обиегс количества добавленной радиоактивности не более 10Z меченого материала сохраняло способность связываться с антителами.

Таким образом, при помощи ЫКА ICA-1 выделено и охарактеризовано семейство антигенов Р64-69 бета-клеток, специфически

Рис. а Определение гдикози-дирования семейства антигенов р64-б9. Иммуноблоттинг белков лизата островковых клеток крысы с МКА 1СА-1. ДСН - ПАГЭ в редуцирующих условиях 1) иммуиоперсксидазвое окрашивание МКА 1СА-1 белков лизата островковых клеток поджелудочной «елезы крысы, 2) иммунопсроксидазяое окрашивание МКА 1СА-1 интигенного 1сомплекса рб4-69, аффинно очищенного из белков лизата. островковых клеток крысы на иммуносорбенте с МКА ЮА-1 и обработанного звдогликозида-зой Г.

200 — 94 — 67 —

43 — 30 —

и

5 -...

Ei.IL а 10

1 2

Рис. 4. Определение субъединичной организации антигенного комплекса рб4-бЭ. дСН - ПАГЭ вффкнкс 0'с2!?ян0г0 я.ятигршго-го комплекса рб4-69 в редуцирующих и нередуцирушга условиях. Офаиено Кумасси Я-250. 1,5-маркеры молекулярной массы (свержу вниз: 200к0, 94кО, б7к0, 43к0, ЯМ. 20к0,12к0); 2- семейство антигенов рб4~69 в нередуцируюших условиях; 3,4- семейство антигенов р64-69 в редуцирующих условиях (10 мкг; 3 ыкг).

1 2 3 ! 4 '5"

.Л

7

в

6

4

Рис.5. Определение изозлэкт-рической точки (pl) антигенного комплекса рб4-69.

4-

+—рГ

Двумерный электрофорез аф- ь7 фшно очищенного антигенного

комплекса р64-69.

43

Окрашено Кумасси R-250. эо —

взаимодействующее с sICA-позитшзными сыворотками больных -ЮСД. Показана белковая природа семейства антигенов рб4-69 и юс способность к образованию за счет дисульфидной связи динаров 120 kD. Определено, что антигенная детерминанта, выявляемая ЫКА 1СЛ-1, представляет собой участок пйдкйепткдной ;«лскулц. В тс из время не исключено, что близкие по Mr белки могут образовыг ваться за счет ограниченного протеолиза при получении лизатов островковых клеток, с сохранением иммунореактивности всех фрагментов. Этим может об'ьяснятся наличие субъедшицы с молекулярной массой Е6 kD. не входящей в нативную антигенную структуру с Мг 120 kD. Согласно полученным данным, семейство антигенов р64-69 обнаруживается на бета-клетках человека, а также других видов животных. Известно, что эводщконно консервативные клеточные структуры принимают участие в обеспечении ключевых метаболических и рецепторннх функций нейро-эндокрин-ных клеток. В связи с этим, на следующем этапе исследования изучено участие семейства антигенов р54-69 в дасул^ш-секреторной функции бета-клеток.

- 19 -

Изучение Дующий и биологической природы семейства антигенов р64-69 бета-клеток.

1. Изучение роли семейства антигенов рб4-б9 в регуляции

секреции инсулина островковьми клетками in vitro.

Стимулируемая глюкозой секреция инсулина является специфической функцией бета-клеток. Интактные бета-клетки отвечают на повышение концентрации глюкозы усилением секреции инсулина Нарушение инсулин-секреторной функции сопровождается снижением уровня стимулируюмой секреции инсулина. Увеличение концентра^ ции глюкозы в среде культивирования островковых клеток с 6,6 до 25 ыУ через 30 мин сопровождалась возрастанием в 2,3 раза уровня секреции инсулина. Инкубация островковых клеток с ас-цитной жидкостью, содержащей МКА ICA-1, приводила к снижению уровня стимулируемой секреции инсулина в 2,6 раяа (рис.6). Аналогичный эффект на стимулируемую секрецию инсулина оказали sICA- позитивные сыворотки больных ЙЭСД По данным иммунофдуо-ресцентной микроскопии и проточно** цитометрии стимуляция секреции инсулина 25 «М глюкозы сопровождалась возрастанием экспрессия ce«cftrvr53 антигенот на поверхности островковых клеток (рис.7). Инкубация островковых клеток с МКА ICA-1 приводила не только к снижению уровня стимулируемой секреции инсулина, но и к снижению ¿кспрессии антигенов рб4-б9.

Таким образом, семейство антигенов р64-69 участвует в стимулируемой глюкозой секреции инсулина и, возможно, является частью регуляторного комплекса бета-клеток, модулирующего секрецию и метаболизм этого гормона.

2. Исследование глутаыатдекарбоксилаэной (ГДК) активности семейства антигенов рб4-69.

Иммуноблоттинг лизатов островковых клеток, приготовленных в различные сроки по идентичной методике, с ЫКА ICA-1 показал, что в одних лизатах выявлялась только субъединкца с Mr 56kD, в других- 56 и 64-69 kD. б третьит-только 64-69 kD (рис.8). Пос-

Рис. 6. Влияние ША ICA-1 на секрецию инсулина островковы-ыи клетками in vitro при стимуляции 25пМ глюкоза

Сэт

ноишг

ih

i

MS1L. ЯЕСЗСТИ».

IMS ICi-1, ICU* SSttB

ZM>

с

»3 9

-irsa* SBSHI

Рис. 7. Возрастание экспрессии сеиейства . антигенов р64-69 ьа поверхности островковш клеток при стимулируе-

ЕЖЯ ЮИТяксм 25 1« В Гаком 2S *Н 0 Suuwu caxpwti □ Ксмтрбп»

Зпшсмтимое

количество

испм

имииишосл etpckdhk кета

С Н!Я tcft-1 IB) СШПШ Г1ШЭ0Й М VITK0

бпошваыиа инггаааюст» одарЕавздя

Рис.8. Иммуноб ЛОТТ ИНГ лизатов островковых клеток крыса 1,2,3,- различные серии лизатов островковых клеток крысы. Слева - паркеры молекулярной массы (кП).

кольку для лизатов использовали островковые клетки, полученные При ферментативном переваривании ткани поджелудочной железы, предположили, что происходит частичное протеолитическое расщепление антигенного комплекса, причем все обнаруженные фрагменты сохраняет иммунореактивность. Как известно, аналогичный процесс происходит с ферментом ГДК Активность этого фермента обнаружена в антигене "р64", прешшигкрованном при пемовд сывороток бсльглпг ИЭСЛ Е 3. 10^01. ГДК - вилпнеппепифи-чееккй фермент, присутствующий у низших позвоночных в виде белка с Мг 5бк0 и у высших - в виде различных субъединиц или фрагментов протеолиза с Мг в диапазоне 56к0 и 64к0 1Р. Ьегау, 1086]. В культивируемых островковых клетках, из которых аффин-но очищали семейство антигенов р64-69, была определена активность ГДК, катализирующей в присутствии кофактора пиридоксаль-5'-фосфата превращение глутаминовой кислоты в гамма-аминомас-ляную кислоту (ГАЫК) и СО.,. В среду культивирования клеток вносили меченую глутэыиновую кислоту, и отобранные из надоса-дочной жидкости пробы разделяли с помощью тонкослойной хроматограф!®. В зонах, сответствуюших ГАМК и глутаминовой кислоте, определяли радиоактивность. Отмечено уменьшение количества радиоактивной глутаминовой кислоты и возрастание количества ме-

200 -94 -67

¿30

20 14 12

П -К»

20 -14 ■

? 2 3

ченой ГАМК. что свидетельствует об активности фермента ГДК в островковых клетках (рис.fi). Активность ГДК. была также обнаружена в антигенном материале, аффинно очищенном из лизатов островковых клеток при помощи ЫКА ICA-1. В этом случае активность ГДК определяли по выделению радиоактивного СО^( рис. 10).

Известно, что экспрессия ГДК наиболее выражена в ГАЫК-зр-гических нейронах мозлечка. В связи с этим.провели сравнительное исследование иымунореактивности МКА ICA1 и сывороток больных ИЗСД с данными структурами. Во-первых, ЫКА ¡СА1 в нРИФ на криосрезах мозжечка реагировали с ГАЩ-зргическими нейронами головного мозга, аналогично sICA-положительным сывороткам больных ИЗСД, содержащим аутоантитеда к семейству антигенов р64-69. Во -вторых, сыворотки больных ИЗСД и МКА ICA-1 прецилитировали из лизатов мозжечка крыс белки с активностью ГДК. Причем в ряде случаев сыворотки больных диабетом, содержащие антитела к семейству антигенов р64-69 в высоком титре (40-80 ед. JDF), преципитировали белки с высокой активностью ГДК (рис.11).

В-третьих, последовательная иммунопреципитация сывороткой больного ИЗСД, которая в предыдущем эксперименте преципитиро-вала белки мозжечка с активностью ГДК, и МКА ICA-1 лизатов мозжечка показала, что аутоантитела больных ИЗСД и МКА IÇA-1 выявляют идентичный антиген с активностью ГДК, т. к. в иммуноп-реципитате лизата мозжечка, предварительно адсорбированного анти-р64-69- позитивной сывороткой, с ЫКА ICA-1 - не обнаружили активности ГДК (табл.2).

Таким образом, семейство антигенов рб4-69 обладает собственной ферментативной активностью ГДК. Аналогичная ферментативная активность обнаруживается в иммунопрецкпитирбванных белках мозжечка при помощи МКА ICA-1 и анти-рб4-59 - позитивных сывороток больных ИЗСД.

Рве. 9. Активность глутаыатдекарбоксилааы в культивируемых ост-ровковых клетках, а- активность ГДК при культивировании в различных средах; б- хро-матографмческое разделение: 1- ГАЫК, 2-глутаминсвая кислота, 3- щ,омеяуточная зона.

I

Ркс. 10. Активность глутамат-декарбоксплазы в антигенном материале рб4-69, аФФинно очищенном с помощью ША 1СЛ-1 и* лизатов культивируемых островковых клеток. ДСН - ПАГЭ антигенного материала р64-68 (Б), в котором определялась активность глуташтдекарбоксилазы (А).

•4

- 24 -

Рис. 11. Преципитация сыворотками больных ИЭСД и МКД 1СА-1 белков лизата мозжечка крысы с активностью глута-матдекарбоксилазы.

«Р

зяором «мор« ЖЯ 1СА—1 шимм» ЮСА

Табл. 2. Определение активности глутаматдекарбоксилазы в 1аг^"пОПрсхд>111>«татах при последовательной преципитации лизатов мозжечка крысы сывороткой больных ИЗСД и МКА 1СА-1.

Иммунопреципитат Активность ГДК С брш) М±гп

ОКА 1СА-1 2. 500*184

Сыворотка больного ИЗСД 6. 400±317

Отрицательный контроль 103+36

ККА 1СА-1 пйсле адсорбции сывороткой больного ИЗСД 328+56

- 25 -

Моделирование ранних этапов патогенеза ИЗСД.

В краткосрочной модели введение в течение 9 дней группе крыс Vistar ежедневно по 250 мкл в/б асцитной жидкости, содержащей МКА ICA-1, приводило к достоверному снижению концентрации инсулина и С-пептида в сыворотке крови, аналогично аллок-сановой и стрептозотоциновой моделям диабета(рис. 12). В отличие от последних, максимальный подъем уровня глюкозы не превы1 шал верхнюю границу нормы. Результаты морфометрического исследования островков показали, что в группе крыс после вве-^ дения ЫКА ICA-1, наряду с признаками дегрануляции и вакуолизации, значительно увеличивалось гсоличёство перегруженных секреторными гранулами бета-клеток. Вокруг части островков и в их составе обнаружена мононуклеарная инфильтрация - инсулит. являющийся характерным признаком ранних этапов патогенеза ИЗСД. При помоош ЫКА 0x18 к антигенам главного комплекса гистосов-ыестимости крысы I класса показана в инфильтрированных островках гиперэкспрессия этих антигенов. Отмечено небольшое снижение массы лимфоидных органов, а в тимусе на фоне уменьиения плотности всех видов клеток, возрастание количества бластных форм тимоцитов ( 18.8i2.32 Сластов ). Количество Т- клеток снижалось такие в тимус- зависимых зонах селезенки, что также свидетельствовало, в по/лзу повышения скорости миграции Т -клеток в островки. Образование аутоантител к антигенам остров-ковых клеток происходило вне зависимости от способа индукции даабетогенеза.

Дополнительное введение комплемента, а также увеличение разовых доз вводимых МКА в пределах 250 - 500 мкл ежедневно и способа введения f в/в, в/б ) не оказывали влияния на степень выраженности патологических изменений.

Таким образом, в краткосрочном эксперименте с введением

Рис. 12. Динамика содержания глгкозы м инсулина в сыворотке крови крыс при введении аыоксана, стрегтояотоцина я МКА 1са-1.

5 - введение МКА 1СА-1 2 - введение аллоксана 2 - введение стрептозо-гошна

Рис. 1а Динамика содержания глюкозы (а) и инсулина (б) при пролонгированном введении МКА 1СА-1.

---введение МКА ИКО-58

.....возрастной контроль

-введение МКА ¡СА-1

МКА ICA-1 in vivo наблюдалось нарушение инсул н-секреторной функции бета-клеток и формирование инсулита, что соответствовало начальной стадии патогенеза ИЗСД.

В пролонгированной модели в течение 2 мес в/б вводили очищенные МКА ICA-1 по 125 мкг на крысу х 3 р. в неделю. Контрольной группе животных вводили МКА к обшелейксцитарному антигену человека. Динамика уровней глюкозы, инсулина ( рис. 13 ) и С- пептида в крови крыс за 8 недель введения МКА ICA-1 практически не отличалась от наблюдавшейся в краткосрочном эксперименте, т.е. наряду со снижением уровня инсулина и С- пептида0' гипергликемия не наблюдалась.

При помощи окрашивания парафиновых срезов поджелудочных иелез МКА к пептидным гормонам охарактеризовали состояние различных типов эндокринных клеток. В результате после 8 недель введения МКА ICA-1 в островках наблюдалось снижение содержания не только инсулина, но и его предшественников. Пролонгированное введешь МКА ICA-1 не вызывало нарушения структуры альфа-и дельта-клеток, а такжг изменений в содержании глюкагона и соыатостатина.

В каждой поджелудочной железе после 8 недель введения МКА ÍCA-1 наблюдался инсулит различной степени выраженности: умеренный инсулит, выраженный инсулит, преобладание деструкции бета- клеток с начальным фибросклерозом и остаточными признаками мононуклеарной инфильтрации. ГЬсле 8 недель инъекций МКА ICA-1 группе крыс ввели перорально липосомальную суспензию инсулина, что привело к нормализации уровня инсулина и С- пептида в сыворотке крови.

Таким образом, . введение ША ICA-1 к рб4-69 семейству антигенов бета-клеток in vivo индуцирует проявление начальных этапов развития аутоиммунного инсулин-зависимого сахарного диабета, не сопровождяндахся нарушениями показателей углеводного обмена.

Протективный эффект предварительного введения аддоантисы-к

воротки против Н-2 на развитие ранних этапов диабетогене-] §§ 2. экспериментальных животных. .. В эксперименте использовали 4 группы линейных мышей следующих гаплотипов: Н-2^ (BALB/c и DBA), Н-2*(СВА) и Ia*(ATL). Цри этом группе мшей BALB/c 2 мес вводили только UKA ICA-1 с целью контроля их диабетогенного эффекта Трем остальным группам в первый месяц трехкратно в/С инъецировали аллсактисыво-ротку против Н-2*. затем в следующие 2 мес вводили UKA ICA-1 по схеме контроля диабетогенного эффекта

Анализ сывороточных и органных изменений проводили аналогично моделированию заболевания при помощи ЫКА ICA-1 у крыс

L-

Vistar. В результате у мышей СВА ( Н-2 ) не наблюдалось снижение уровня инсулина в сыворотке крови по сравнению с контрольной группой BALB/c, которой аллоактисьторотка против Н-2*не вводилась, а также с группой мышей DBA, которым эта ал-лоантисьшоротка инъецировалась, но которые отличались по гап-лотипу (Н-2^). Основной признак развития аутоиммунного ИЭСД -Ипсулйг, в поджелудочных »елсьлл мышеи СБА по сравнению с другими группами практически отсутствовал (рис.14). Заключили, ■ к- ■ ■ к что у мышей гаплотипа Н-2 предварительное введение анти- Н-2

аллоантисыворотки оказывало протективный эффект в отношении

индуцируемого ЫКА ICA-1 диабетогенеза В группе мьшей ATL

к к (1а ), отличающихся, по ШС I класса от гаплотипа Н-2 , ответ

на анти-Н-аллоантисыворотку не был настолько выраженным.

Протективный эффект предварительного введения антигенного материала р64-69 на развитие ранних этапов диабетогенеза у экспериментальных животных.

Группе крыс Вистар триады в течение 1 мес эксперимента

Рис. 14. Протективный эффект предварительно, о введения анти-Н-2 антисыворотки на развитие экспериментального' аутоиммунного диабета Динамика развития инсулита

х островки

78

1

1

п 1 sa. М

3 4

□ норишьиме остриям

ЕЗдемм)

•мугаьтр.

ЕЗоцадеж»« т^иоътр.

□ герийсугит

k -к t

введение анти- Н-2 АС мышам: 1- СВА (Н-2 ); 2- ATL (1а );

3- DBA (Н-2 j. 4- контроль диабетогённого эффекта МКА ICA-1.

Рис.15. Протективный эффект предварительного введения антигенного материала рб4-б9 на развитие экспериментального аутоиммунного диабета Дикпиика развития кнсудята.

К сстрсвссэ 73 И Я

' 39 28 18 8

щ

¡Ml

Шт

□ Нсрмпым остропи

Шйиреши жрвьтрмю

ЁЗЬфдонкм инрмъгрш!

1 2 3

1- трехкратное введение антигенного материала рб4-69; 2- трехкратное введение инактиЕированного антигенного материал р64-69; 3- контроль диабетогённого эффекта МКА 1СА-1.

инъецировали в/С аффинно очищенный р64-69 антигенный материал. Контрольной группе по той же схеме вводили инактивированный нагреванием антигенный материал. В последующие 2 мес. обеим группам животных инъецировали ЦКА 1СА-1 по схеме пролонгированной модели ИЗСД. В качестве контроля диабетогенного эффекта ША 1СА-1, была использована третья группа животных, которым вводили только ЦКА 1СА-1, также по схеме прс юнгированной модели ЮС Д.

Тестирование сывороточных и органных изменений проводили аналогично моделированию ИЭСД при помощи МКА 1СА-1. В результат е у крыс, которым предварительно вводили очищенный антигенный комплекс рб4-б9. в отличие от контрольных групп не отмечалось снижение уровня инсулина в сыворотке крови. Кроме того, в этой группе животных подавляюще большинство островков оставалось интактными, в то время как в обеих контрольных группах наблюдалась различная степень выраженности инсулита в большей части островков с рис. 15). Заключили, что предварительное введение антигенного матешала о64-69 бета-клеток оказывает про-тективный эффект при последуюоей провокации развития ранних стадий ИЗСД.

Таким образом, моделирование начальных этапов диабетоге-неза у экспериментальных животных, опосредованное семейством антигенов р64-69, можно расценить как доказательство участия этой антигенной структуры в патогенезе ИЗСД. Поскольку семейство антигенов р>64-69 не видоспецифическое, данный маркер бета-клеток может являться одной из мишеней аутоиммунной агрессии при развитии ИЭСД человека В связи с тем, что сыворотки больных ИЭСД специфически взаимодействуют с семейством антигенов рб4-69, на его основе можно разработать тест - системы для иммунодиагностики ИЭСД человека.

- 31 -

Иммунодиагностика ИЗСД на основе выявления иарудений гуморального иммунитета.

1. Определение аутоантител к цитоплазматическим антигенам островковых клеток.

cylCA были обнаружены у 47,5Z больных ИЗСД с длительностью заболевания менее 5 лет при тестировании сывороток на криосрезах человека - донора I группы крови в нРИФ с использованием в качестве вторых антител антисыворотки к IgG человека. В результате тестирования сывороток больных ИЗСД на криосрезах®' поджелудочной лклсзы ирисы процент cyJCA- положительных случаев в группе больных ИЗСД с длительностью заболевания менее 5 дет практически не отличался, (табл.3 ). В то яэ время процент cylCA- положительных случаев в группах больных не ИЗСД и здоровых доноров был значительно ниже. Несмотря на высокий процент ■ выявдяемости cylCA у больных ИЗСД, этот метод не оказался пригодным ды массового обследования населения.

Табл. 3. Определение cylCA в сыворотке крови больных сахарикм диабетом и здоровых доноров.

Клинический диагноз Тестирование сывороток на криосрезах п/ж чел. Тестирование сывороток на криосрезах п/ж крыс

количество ■ (+)-случае^ ___—""общее коллчество тестированных случаев частота выявления признака (23 количество (+)-случаев^- ^общее количество тестированных случаев частота выявления признака (Z)

ИЗСД (длит, заболевания менее 5 лег) 33/69 47,8 31/71 43,7

не ИЗСД 11/58 19,0 2/60 3,3

здоровые доноры 3/19 1.6 0/19 0

- 32 -

2. Определение аутоантител к поверхности антигенам ост-

ровковых клеток.

Определение sICA при помощи нРИФ сывороток больных с ост-ровковыми клетками крькы и последующим учетом реакции на проточном цитофлуорииетре оказалось более доступным для скрининга больного количества образцов и подбора референс - сывороток. Связывание сывороток больных ИЗСД с островковыни клетками сравнивалось с сывороткой здоровых доноров и контролем вторичных антител в отсутствие тестируемой сыворотки. Процент выяв-ляемости sîCA и cylCA у больных ИЗСД был сопоставим. Данные в табл.4 суммировали по результатам тестирования sICA и в дальнейшем сопоставили с тестом на определение антител к семейству антигенов p64-69 бета-клеток. С этой целью исследовали 238 сывороток больных ИЗСД, 77 - не ИЗСД и 57- здоровых доноров.

Табл. 4. Определение sICA в сыворотке больных сахарным

диабетом и здоровых доноров.

Клинический диагноз обследованных групп Аутоантитела,определяемые в нРИФ (sICA)

количестве ^^OOj^y^gl.__ общее количество тестированных случаев частота выявления признака U)

ИЗСД (длит, заболевания менее 5 лет) п-97 48/97 49,5

ИЗСД (длит.заболевания более 5 лет) п-141 13/141 9,2

не ИЗСД с развитием по требнос-ти в инсулине п-16 16/16 100

не ИЗСД п-61 6/61 13

здоровые доноры п-57 5/57 8,8

3. Определение аутоантитед к семейству антигенов рб4-б9 " бета-клеток.

эГСА (+) и э1СА (-).референс - сыворотки использовали для сравнительного анализа в тесте ТИПА на выявление антител к семейству антигенов рб4-69 бета-клеток "(табл. 5 ). Конкурентный иммунофлуоресцентный анагяа с разрешением во времени (ТИПА) был основал на принципе конкуренции ЫКА 1СА-1, меченых европием. и сывороток, содержащих антитела к рб4-69 семейству антигенов бета-клеток, за связывание с обшей антигенной детерми^ нантой.

Табл. 5. Определение антител к семейству антигенов рб4-69 в сыворотке больных СД и вдорозых доноров.

Клинический диагноз обследованных групп Антитела к р64-6Я антигену, определяемые в ТРР1А

количество (-0-случаев__ ""общее КОЛЗГ.ЗСТВО тестированных случаев частота выявления признака (%)

ЯЗСД.(длит, заболевания менее 5 лет) п-97 41/84 48,8

ИЗСД (длит, заболевания более 5 лет) п-141 10/96 10,4

не ИЗСД с развитием потребности в инсулине п-16 15/15 ,100

не ИЗСД п-61 • 0/61 0

здоровые доноры п-57 1/40 **

тестировались сыворотки тех я? пациентов, данные

по которым приведены в таблице 4. ** выявление аутоантител к рб4-69 ммейству антигенов бета-клеток в этом случае совпало с диагностикой клинического дебюта ИЗСД.

Построение калибровочной кривой показало возможность количественного определения антител к зпитопам рб4-69, идентичным ил,, близко расположенным к антигенной детерминанте, выявляемой МКА ICA-1. За отрицательный контроль (отсутствие в сыворотке больных антител к рб4-69) принимался средний уровень связывания МКА ICA-1, меченых европием, при тестировании с сыворотками здоровых доноров (100% связывания; п - 39).

При ИЗСД со сроком заболевания менее 5 лет обнаружили циркулирующие аутоантитела к антигенному комплексу p64-6ô ( 4- 20Z связывания, Р<0,005). Данные, полученные в результате тестирования больных не ИЗСД, практически не отличались от донорского контроля. Б группе больных не ИЗСД с развитием потребности в инсулине обнаружили аналогичные аутоантитела (11 -14 2 связывания, достоверно ниже донорского контроля). Обнаружение антител к семейству антигенов рб4-б9 коррелировало с наличием s ICA (г-+0,9) у больных ИЗСД и в группе больных не ИЗСД с приобретением потребности в инсулине.

Таким образом, у Сольных ИЗСД с длительностью заболевания менее 5 лет, процент sICA- позитивных случаев в результате тестирования в нРИФ с островковыми клетками и выявления cylCA на криосрезах поджелудочной железы крысы сопоставим с обнаружением аутоантител к р54-69 антигенам при постановке теста на основе конкурентного связывания с ЫКА ICA-1, меченых европием. В то- же время в тесте TRFIA практически отсутствуют ложнопо-ложительные результаты при тестировании sICA-негативных сывороток больных не ИЗСД и здоровых доноров, что можно расценит! как его высокую специфичность. В 1 случае при положительно* результате тестирования донорской сыворотки.непосредствен»: после обследования на обнаружение анти-р64-б» антител был поставлен клинический диагноз ИЗСД.

Диагностировать состояние приобретения потребности в ин-

суяине в ряде случаев не ИЗСД модно как при помощи тестов на обнаружение sICA, cylCA, так и на аутоантитела к семейству антигенов р64-69.

При увеличении длительности ИЗСД частота выявления sJCA и анти-рб4-69 аутоантител уменьшается, что связано с деструкцией основной массы бета-клеток и исчезновением соответствующих антигенных структур.

Разработанный метод выявления аутоантител к семейству р64-69 антигенов в дальнейшем бь-я применен для обследования с групп риска рагвития ИЗСД. Тестировали сыворотки 967 детей и подростков возрастом от 3 до 17 лет. Все они перенесли i и более вирусных инфекций, у 14% зарегистрированы случаи заболевания ИЗСД в семье. Оказалось, что у 13,32 (средний возраст 16 + 0,6 лет) в сыворотке крови присутствовали анти-рб4-69 аутоан-титела. При этом у 15,32 зарегистрированы один и более семейных случаев заболевания ИЗСД. Кроме того, в 19,7% случаев обнаружено нарушение толерантности к в/в введению глюкозы, что является признаком нарушения инсулин-секреторной функции.

ТаКИМ Образом, аШ&ЛИНхе аучиапгихсм п семсйОТЬУ сЛ7ИГ с нов р64-69 бета-клеток может быть вариантом иммунолрогноэиро-вания развития ИЗСД Тест на основе конкурентного связывания аутоантител и моноклональных антител с семейством антигенов Р64-69 - одним иа патогенетических маркеров ИЗСД, позволяет диагностировать доклиническую стадию заболевания, на его основе можно проводить популяционные обследования населения с целью выяления групп риска развития ИЗСД.

4. Характеристика иммунного статуса у больных ИЗСД.

Иммунопрогнозирование ИЗСД основывается на обнаружении в сыворотке крови специфических аутоантител- У больных с вновь выявленным ИЗСД, при длительности заболевания менее 5 лет и у пациентов с диагнозом "не ИЗСД", у которых развилась потреб-

ность в инсулине, обнаруживается высокий процент случаев с наличием аутоантител к семейству антигенов рб4-69. Оказалось, что присутствие этих аутоантител коррелировало с повышением количества зрелых В-лимфоцитов, зкспрессирующнх антиген 0021 и (табл.6). У большинства больных при этом наблюдались нару-

Табл. 6. Частота нарушений иммунного статуса у больных

сахарным диабетом.

Группы Сольных Изменения показателей иммунного статуса

Ауто-антитела к р64-69 Умен, к-ва СЮ+ Т-кл. Увел, к-ва зрелых В-кл. Увел, к-ва з1д(3+ В-кл. Нарушение соотношения С04/СШ клеток Увели-.чение к-ва СБ57+ Ж-кл. Появление акт. Т-кл.

КЗСД вновь выявленные 12/14 2/14 8/14 8/14 8/14 4/14 3/14

КЗСД до 5 лет 11/13 3/13 10/13 9/13 Ю/13 8/13 4/13

КЗСД более 5 лет 7/22 13/22 7/22 7/22 16/22 11/22 11/22

На КЗСД с инсулин-за ВИСИМОСТЬЕ 8/8 3/8 4/8 3/8 7/8 2/8 6/8

Не ИЗСД 0/12 1/12 1/12 1/12 1/12 1/12 0/12

Здоровые доноры 0/22 0/22 2/22 0/22 2/22 0/22 1/22

Примечание: в числителе - количество положительных случаев; в внам-нателе - количество тестированных лиц.

пения соотношения регуляторкых субпопуляций Т-клеток, как в сторону преобладания Т11. так и Тз/с субпопуляций. У ряда больных в этих группах присутствовали такте НЬА-ПК позитивные активированные Т-клетки.

фи длительности заболевания ИЗСД более 5 лет практически отсутствовали аутоантигела к семейству антигенов рб4-б9, в то же время у этих пациентов не только отмечалось изменение г соотношении регуляторных субпопуляций Т-лимФсцитов, но и развивалась Т-пения. Подобные нарушения практически не наблюдались у больных не ИЗСД, ' у которых .не развилась потребность в инсулине, а так*® у здоровых доноров.

Таким образом, показатели иммунного статуса больных ИЗСД отражают особенности развития этого заболевания: после дест^. рукции бета-клеток и элиминации антигенов - мишеней аутоиммунной агрессии, изменяется удельный вес нарушений, клеточного и гуморального иммунитета и происходит; генерализация патологического процесса в системе иммунитета, однако не следует исключать, что прогрессировали^ нарушений иммунного статуса с увеличением длительности заболевания может быть связано с постоянным введением экзогенных инсу.танов.

ВЫВОДЫ

1. Получено моноклонэлы!ое антитело 1СА-1, аналогичной" специфичности с цир^дчрзгспщиии яугпантитрляыи бохън'ну ипстг к антигену р64-69 и конкурирующее с этими аутоантителами за участки связывания на бета-клет1сах островков Лангергалса поджелудочной железы. При комок! ЫКА 1СА-1 выделен видонеспецифи-ческий антигенный комплекс белковой природы, т. н. семейство антигенов р64-69, в состав которого входят субъединицы с мол. массой 56, 64, 67 и 69 кБ.

2. Семейство антигенов р64-59 является одной из регуляторных структур бета-клеток, модулирующих стимулируемую глюкозой секрецию инсулина. Установлено, что экспрессия антигенов р64-Б9 связана с секреторной активностью бета-клеток и возрастает при стимуляции секреции инсулина глюкозой. . МХА к семейству антигенов р64-69, аналогично сывороткам больных•ИЗСД, со-

держащим аутоантитела к антигену - мишени развития аутоиммунно процесса, подавляют in vitro стимулируемую глюкозой секрецию инсулина, которая восстанавливается после удаления МКА.

3. Семейство антигенов р64-69 бета-клеток имеет ферментативную активность декарбоксилазы глутаминовой кислоты, катали-зуюией синтез гамма-аминомасляной аминокислоты, которая участвует в регуляции функций ксйро-эндокринной системы. Аналогичная ферментативная активность обнаруиэна в иь2.1унопреципи-тированных при помощи ША ICA-1 и анти-р64-69- позитивных сывороток больных ИЗСД белках из лизата мозжечка. Получены данные в пользу идентичной антигенной специфичности семейства антигенов р64-69 бета-клеток и декарбоксилазы глутаминовой кислота- в иммунопреципитатах белков мозжечка, предварительно адсорбированных &нти-р64-69- позитивной сывороткой больного ИЗСД, МКА ICA-1 не обнаруживает белков с активностью этого фермента.

4. Разработана экспериментальная модель ранних этапов развития аутоиммунного инсулин-зависимого диабета, свидетельствующая об участий антигенной структуры рб4-69 в патогенезе этого заболевания. Кратковременное введение МКА ICA-1 приводит к нарушению секреции инсулина и начальным проявлениям инсуля-та; при пролонгированном введении этих антител наблюдается прогрессирование патологического процесса, характеризующееся нарушением секреции инсулина и синтеза его предшественников,. дальнейшим развитием инсулита и селективной деструкции бета-клеток. Разработаны варианты экспериментальной иммунокор-рекции, основанные ка предварительном введении аллоантисыво-ротки к . антигенам ШС и антигенного материала р64-69 и оказывающими протективный эффект на развитие индуцированного МКА ICA-1 экспериментального аутоиммунного диабета

5. Разработан специфический метод доклинической иммуноди-

агностики инсулин-эаЕиеимого сахарного диабета, основанный на конкурентном связывании меченых МКА ICA-1 и сывороток пациентов. Определение анти-р64-69 аутоантител может быть использовано для иммунопрогно?ирования развития этого заболевания.

_ СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЙ

1. Злобина Е. Н., Демин Ю, М., Есенин В. И., Брыкова С. Е , Злобина Е. R , Рябкова а И. Изучение гуморального иммунитета при инсулин-зависимом сахарном отечете // IX межинститутскаш-науч. конференция "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологичесузос и патологических состояниях". -Тез. докл.- Челябинск.- 1988,- С. 49.

2. Злобина Е. Н. , Демин Ю. í¿ , Есенин R И., Брыкова С. Е , Рябкова Е И. Подходы к иммунодиагностике инсулин-зависимого сахарного диабета // Симпозиум Латвийского научного общества эндокринологов. - Тез. докл. - Рига. - 1983. - т. 1. - С. 58-59.

3. Злобина Е. HL , Бачурик П. С. , Россельс А. Н., Демин Ю. М. , Рябкога ЕЙ., Борзова п.Б. Получение и характеристика монокло-

НоЛЬНЫл ¿ш'ТлТ'бЛ ¿СА"1 К йлО/ЛИН" ПрОдУЦИру*лдг1м KJI6TKÓM

дочной желевы // Клиническая иммунология и иммуногенетика. -Новосибирск. - 1988. - С. 35-38.

4. Злобина Е. Н., Демин Ю. М. , Есенин Е И. , Брыкова С. Е , Злобина Е.Е Иммунологическая диагностика инсулин-зависимого сахарного диабета // Клиническая иммунология и иммуногенетика. - Швосибирск. - 1988.- С. 38-41.

5. Злобина Е. Е , Есенин Е И., Демин KL М., Ыинкин С. А. Аутоантитела к островковым клеткам поджелудочной железы при сахарном диабете 1 Tima // Советская медицина. -1988. - N. 12.-С. 21-25.

6. Петров Р. Е , Хаитов Р. tí., Алексеев JL Е , Злобина Е. Е , Бачурмя п. с., Дубинкин И. Е , Россельс А. R , Демин 1й Ы. Дсс-

тижения и перспективы использования иммунобиотехнологии в изучении инсулин-зависимого сахарного диабета // I Всес. съезд иммунологов. - Тез. докл. - Сочи. - 1988. - С. 168.

7. Zlobina Е., Demin Yu. , Rossels А., Bachurin P., Petrov R. Modelling of diabetes type 1 using ronoclonal antibodies, ICA-1 // 8th International Congress of Endocrinology.- Kyoto. -Japan.- 1988.- P.508.

a Zlobina E. N., Rossels A.N., Yesenin V. I. , Demin Yu.M., Bachurin P. S.. Filatov A. V., BrikovaS. V.. Pancreatic islet cells in tissue culture: function and immunoreactivity with serum autoantibodies from diabetes type-1 patients and monoclonal antibodies ICA-1 // Exp. Clin. Endocrinol. -1989.-V. 93. - N. 2/a- P. 161-165.

9. Злобина E. H. Моноклональные антитела к рецепторам бета-клеток поджелудочной железы // Дурнал ВХО им. Д. И. Менделеева. -1989,- Т. XXXIV. - К.1. - С. 80-85.

10. Petrov R.V. , Khaitov R. М., Alekseev L. P., Gudima йО., Zlobina E.N.. Approaches to investigation of the role the' membrane eoimlex of beta cells* pS4-S3 antigens in Lho: development of insulin-dependent diabetes mellitus // USSR-Japan Simposlum "Receptors: structure and function". - 1989.-Moscov, P. 45.

11. Petrov R. V., Khaitov R. M. , Alekseev L.P., Zlobina E. N., Bachurin P.S. , Hubinkin I. V., Rossels A. N., Demin Yu.M. Advances in immunobiotecnologic study of insulin-dependent diabetes mellitus // 7th Intern. Congress of Immunology, Berlin.- 1989.- P.856.

12. Zlobina E. , Dubinkin I., Bachurin P., Demin Yu., Rossels.A.. An approach to-investigation of the role of p54 antigen in the development of insulin-dependent diabetes mellitus using monoclonal antibodies ICA-1 // 1st Intern.

Simposium on Iroiunotherapy of Type 1 Diabetes.- Italy.- 1989.

13. Zloblna E.. Dublnkin I., Demin Yu., Rossels A. Modulation of insulin-secretory function of pancreatic beta-cells via p64 antigen family - monoclonal antibody 1CA-1 Interaction // 6th Intern. Simposium "Signals and signal processing in the immune Cistern". - 1989.- Hungary.

14. Zloblna E., Gudima G., Igonin E., Pichugin A.,

Dublnkin I.. Brikova S. , Ryabkova V. , Guseva N., Khaitov R. ,

Petrov R.. Immunoreactivity of cultured pancreatic islet cells

tf

with monoclonal antibodies 1CA-1 // Blomed. Science. - 1990.-Y.I.- N. 1.- P. 48-54.

15. Petrov R., Zlobina E. , Demin Yu., Rossels A., Bachurin P., Dubinkin I.. Rvabkova V., Brikova S., Gudima G.. Modelling of type 1 diabetes with monoclonal antibody ЗСА-1 Л' Biomeu. Science.- V.l.- N. 2.- P. 144-150.

16. Брыкова С. a , Чуканов* С. a , Злобина E. E Иммунный статус больных инсулин-зависимым счхарным диабетом //IX научная конференция "Факторы клеточного и гуморального :я.о.!укитета при различны?. Физиологических и патплогических состояниях". - Челябинск.- 1990.- С. 20-21. '

17. Zlobina Е. N.. Dvonun Y. М. , Rossels А. N. , Gudima G. 0. , Bachurm P. S. , Dubmki., I.V., 1 fron in E. L. , Petrov R. V. Modulation of the irjnune response against, pancreatic beta cells based on p64-69 antigen fanily and correspondent monoclonal antibody JCA-I / Proceedings, Winter advanced courses for immunology and infectious diseases.- Japan. - 1990, P. 75.

18. Петров P. В. . Хаитов P.M. .Алексеев 11 , Караулов A.E , Злобина E. H. Мониторинг показателей иммунного статуса при ИЗОД: применение в иммунодиагностике, прогнозировании и лечении // II Международный симпозиум "Реабилитация иммунной сие-

- 42 -

-г«мы. - ДаГошс.-г 4930, - С. 13.

19. Есенин а И., Злобина Б. Е , Демин ¡0. М., Дедов И. И. Кли-щжо-иммунологические аспекты сахарного диабета // Советская медицина. - 1990.- N. а - С. 100-101.

20. Zlobina Е., Gudima а, Dubinkin I., Rossels А.. Alexeev L. , Khaitov R., Petrov R. Monoclonal antibody ICA-I modulates the insulin secretion by pancreatic beta cells in culture // 10th Meeting of European Federation of Immunological Societies. - Edinburgh. - 1990.- P. 57.

21. Petrov R., Zlobina E. Induction of insulin-dependent diabetes and its iummoirodulation based on pancreatic beta cell p64-69 antigen family // Immunology of Diabetes.-10th Intern.Workshop.- Israel.- 1990.

22. Zlobina E., Dubinkin I., Rossels A. , Denun Yu., Gudim Б. Approaches to imnunodiagnostics of IDDm based on p64-69 beta cell antigen family and corresponding monoclonal antibody ICA-1 //Immunology of Diabetes. - 10th Intern. Workshop.- Israel.- 1S90.

23. Злобина E. a. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus Musculus - продуцент моноклональных антител к антигену бета клеток поджелудочной железы с молекулярной массой 64 кД. // Авт. свидет. - N. 4395435/30-13. - 1988.

24. Злобина Е.Н. Штамм гибридомы C10G7 - продуцент монок-лональных антител к семейству антигенов бета-клеток поджелудочной железы,-."имеющему молекулярную массу 64-69 кД // Решение о выдаче авт. свидет. по междунар. заявке N 89/00021 от 25.01.89.

25..-Злобина "Е. R , Демин 1Q.IL , Есенин В. И. Способ диагностики инсулин-зависимого сахарного диабета // Авт. свидет. N. 1527594.- 1989.

26. Петров Р. Е , Злобина Е. Н.\ Демин Ю. Ы. , Россельс А. Н. ,

Борзова Е Е Способ моделирования инсулин-зависимого сахарного • диабета // Авт.свидет. N. 1558219.- 1989.

27. Петров Р. Е , Хаитов Р. М., Алексеев Л. П., Злобина Е. Е , Бачурин П. С., Дубинкин И. Е , Россельс А. Е , Демин К111, Дедов И. И. Способ диагностики инсулин-зависимого сахарного диабета // Авт. свидет. N 1637538. - 1990.

28. Петров Р. В.. Хаитов Р. 11 , Алексеев Л. Е , Злобина Е. Е Дубинкин И. Е , Бачурин Е С., Меркулов А. Е , Гудит Г. О., Иго-нин Е. Л., Пичугин А. Е Способ выделения комплекса антигенов^ рб4-69, являющегося патогепетичесюш картером инсулин-зависи-могс сахарного диабета // Решение о выдаче авт.свидет. по заявке N 4726222/30-14/106899.- 1990.

29. Дедов И. И., Злобина Е. К , Смирнова 0. )1 , Брыкова С. Е , Гудима Г. О. Изучение сывороток больных сахарным диабетом и а даровых лиц на наличие аутоантител к рб4-59 антигену бета-клеток поджелудочной железы // II Всерос. съезда зндокри-золгов.- Тез. докл.- Челябинск.- 4991.

30. Злобина .К, Е , Потемкин ЕЕ, Никонова Т. Б.. Вуыкцда, С. Е Иммунологические аспяктч ояучрт?пго дмаб^т? Г типз с длительный и осложненным течением // Сборник научных трудов Саратовского государственного медицинского института. - 1990. -С. 20 - 22.

31. Брыкова С. Е , Андреев Е Н , Злобина Е. Е , Смирнова 0. С., Ккконова Т. Е , Есенин И. К Динамика нарушений показателей клеточного и гуморального иммунитета у больных инсулин-зависимым сахарным диабетом // I Научно-практическая конференция !3 СССР "Многопрофильная больница - сегодня и завтра".-1991.-С. 38