Автореферат и диссертация по медицине (14.00.06) на тему:Структурно-функциональный анализ ангиотензин-превращающего фермента с помощью моноклональных антител

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

ДАНИЛОВ

Сергей Михайлович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АНГИОТЕНЗИН — ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

14.00.06 — Кардиология; 03.00.04 — Биохимия

Диссертация

на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва 1994

Работа выполнена в лаборатории молекулярной и клеточной кардиологии Института Экспериментальной Кардиологии Кардиологического Научного Центра Российской АМН.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Александр Николаевич Смирнов,

доктор медицинских наук, профессор

Владимир Владимирович Долгов.

доктор медицинских наук, профессор

Олег Стефанович Медведев,

Ведущая организация — Институт биологической и медицинской химии Российской АМН.

Защита состоится « /г®. » ¿¿/эууЦу _ _ 1994 г.

в час. на заседании специализированного совета

Д.001.22.01 при Кардиологическом Научном Центре РАМН (121552, г. Москва, 3-я Черепковская ул., д. 15а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КНЦ РАМН.

Научный доклад разослан « » . 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

Т. Ю. Полеваяя

ОЕ.1АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Ангиотенэсм-преорпчпгстчий фермент - ключевой фермент регуляции :удиетага тонуса. Этот фермент, цинк-заиисимая ^арбокендипепти-эа, с одной стороны катализирует превращения ангяотеиэяна 1 и ли мз наиболее кощиш ааэоконстриктсрои - анпчотенэин 11нс *той стороны - ¡расцепление оязодмллтатора брадмкинина о неакти-ий гептапептид. 1!ео5и шый кнтэрос к этоау ферменту в мире яэаи с теи, что синтезированные ингибиторы АП^> оказались очень фективпыки - сначала для попиления давления у пациенток с новаскулярной формой гипертонии, затеи для терапии сердечная достаточности, а а настоящее время показан очень сильный антн-вроскларотический эффект этих ингибиторов. В настоящей вромя в мире ехеднеоно более 200 млн челоиек инннавт ингибиторы АПФ и число нх осе првия ноимгаалтея. гибмторы АПФ станопятся лекарстиоа ¡юмор I о кардиологии. О связи с такны интересом к ингибиторам АПФ, сстестиенно, что нкцианальныв свойстиа АП4 - ыйханмэм катализа, структура тианого центра - были исследованы очонь дотально. В последние 3 т а нескольких лабораториях клоиироиачи гепи АПФ раапкк нидон, учен аыинокнелотний состав этого фермента. Однако антигенная руктурв АПФ, конформа^ип цопоП иолекуии, функинонироианио и отношение аыино- и карбокси-терыииальнмх доконои, как ни рзнно, абсолютно не изучены. Отчасти это связано с тем, что пороио ( н неудачные ) попытки следования антигенной структуры АЛ4 били преднрии- ги с поиск;!.о пиклонапьных антител - которые, по определенно. не могли помочь исследовании тонкой антигенной структур» АЛ®.

Данная работа и призвана воспсйшнть этот пробел. Ц&ОЫ И задачи и.ССл<?Д01?31ЖЯ

Основной цельо данной работы было разностороннее изучен структуры, функционирования, антигенных свойств ангиотенз! превращающего фермента человека с прыоцьо панели моноклоналы антител (МоАт). Кроне того, в работе ставилась задача нэуче органной специфичности АПФ н создания вектора (на основе МоА-АПФ) для направленного транспорта в легкие. Конкретные задачи:

1. Разработка эффективных методов выделения АПФ из разных орго и тканей человека.

2. Получение ПАНЕЛИ моноклоналышк антител (МоАт) против АПФ.

3. Антигенное картирование АПФ с поницы МоАт.

4. Иимуногнстохммическое изучение АПФ в органах и тканях челеа с помощью МоАт.

5. Разработка метода определения АПФ в биологических жидкостям основе МоАт.

6. Изучение возможности направленного транспорта в легкие с

Ч \

помощью МоАт к АПФ.

Методы исследования

АПФ из разных органов и тканей человека выделяли и характе зооалн гтрм аоиащи аффинной, ионообменной хроматографии и г( фильтрации, хроматофокуснрования и электрофореза о полиакр акндноы геле. Моноклональные антитела получали с помо гибридоыной технологии. Структурно-функциональный анализ нзск >1 реконбниантных иугаитов АПФ с помощью МоАт провод разработанный нами методом иымуносорбции, различными варианп

■диоиммуно- и иымуноферментного аНйЛйай и иммунобноттинга. шуногистохииическое выявление АПФ в органах и тканях человека ювомнлк ПАП-методой с З-х-5-ги кратным 'усиленней*. Для изуче-|ц зкспресии и взаимодействия Л119 с ЫоЛТ в культуре клеток нами 1л разработан метод гшлшюния н длительного культниироаания ■дотемнальных клеток крупных сосудов и капилляров человека. 1лученнап культура эн дотуши» была тщательно охарактеризована на •едыет сохранения осех основных маркеров и функциональных юЙстЦ на протяжении всего периода культивирования. Феномен шек+йниогЬ накопления МоАт 9В9 а легких изучали, используя >тоды радиоаналйэа и иммуносциитиграфин.

шцдая цраизиа вайсзи

Впервые проведено систематические исследование ангиотенэин->епрацающего фермента, выделенного из разных органов человека. >наружена уникальная субстратная специфичность ЛПФ из сердца шопека - только эта изоформа гидролнэует атриопептин 2 и его С-шцевой аналог.

Получена панель МоЛт "узнавшая " 7 различных эпитолоо молекулы 1$, что позволяет проподит тонкий анализ антигенной структуры -ого фермента. Обнаружены глубокие конформациопние различия |<ду амнио- и карбокси-теримналькимм доыепаыи молекулы ЛПФ, >торые приводят к тому, что мммуногенность молекулы АП* |редоляотся, главный образом, амино-терминалышм доиеном АПФ, Обнаружение анти-катапитических МоАт (причем, нигибируощих стивный центр только о И^довене) поэполило понизать, что н ггивной молекуле АПФ функционируют оба потенциальных активных !итра.

Иммуногистохмыическими методами показано резкое увеличен! экспрессии ЛЛ4 макрофагами в миокарде в пограничной зоне мнфар$1 н при внезапной смерти. Это свидетельствует, что активация АГ играет существенную роль > пост-инфарктноц воспалении и реоргг низацни «макадда.

Всесторонне изучен феномен селективного накопления в легк1 МоАт 9В9 при их системном введении.

Полученные результаты существенно расширяют представления структуре и функции ангкатенэин-превралдопщего фермента. Практическая значимость исследования

Показана применимость панели МоАт для имыуногистохимическс диагностики сосудистых опухолей, саркоидоза и для выявлен« ЛПФ в тканях человека. Обнаруженное нами резкое увеличен« экспрессии AJW макрофагами а киокарде в пограничной зоне инфарк! и при внезапной смерти позволяет предполагать, что имыуногистс химическое окрашивание миокарде антителами против ЛПФ (9В9) ноги использовать для диагностики этих датояогиЯ.

Разработаны два щарнаатл иимуноферыепукэго определения АП4 основанные на ношшшимышх антмтемаж li АПФ. Эти вариант позволяют определит актюивс» м #мш)&нтраци0 ЛПФ в лрисутств» ингибиторов ЛПФ.

Высокая спецфпшость » э#4ектишв£ТА ii&vanneкия МоАт 9В9 легких, отсутствно tiaxoлогических изиеьгея*дЗ он заедании, шк валяют предполагать возможность использования этгдо янтнтел дяг а) визуализации сосудистого русла легких радшдаздтздмшми ts&rosi ми с ПОЫО1ДЫ0 «ммунооцинтиграфни; 6) для создания моделей к client повреждения £шс{',дс» дюлких при различных легочных нателогняя; t в качестве япя направленной доставки лекарега a легиии.

фоба» ¡1»я работы

Представленные в диссертации результаты били доложены на ьэличних Всесоюзных и Международных симпозиумах н конференциях, той числе: Псесооэнои съезде кардиологов (Москва,1986), 5 :есоюзном симпозиуме по медицинской эпзтгопигмч (Махачкала, 86), 4 Всесоюзном симпозиуме по жидкостной хроматографии (Алма-■а, 1987), 18 Конгрессе 4ЕБО (ЛпЛлипа, 1987), Советско-[ерикансьои симпозиуме гю биологии легких (Эшвилл, 1987), 8 ждукародном симпозиуме-по атеросклерозу (Рим, 1988), 1, II, П1 >хдународных симпозиумах по ингнбированию ангнотензнП-'«вращающего форионта (Лондон, 1939, 1991, Амстердам, 1993), >нгрессах Европейской (Милан,1988, Страсбург, 1989, >стердам,1990, Вена,1991, Лиссабон, 1992) н Всемирной 1онреаль,1990) Ассоциаций Ядерной Цедицини, Конференциях ропейского (Милан, 1989, 1993), Международного (Мадрид, 1992) и (ернканского (Ны>-Йорк, 1993) Обществ Но Изучепнг» гипертонии, рдоповской конференций (1993). <?ЛУ1«ашЩ

По материала« диссертации огубликооапо 30 работ в ечэствешшх и нюядупаро^нах журналах, пуктура иайшзд

Диссертация изложена в настоящей брошюре а форма научного клада. Основные результаты получены лично автором. В зработке методов, получении и обсуждении результатов принимали астие Е. К>. Алликметс, Н. П. Сахаров, И. Н.Трахт, Е. В. Духанина, И. фаерыан, А. К. Молдобаева, В. Р. Музыкантов, А 1. Мартынов, Н. Аточина, Т. Д. Чуракова, Н. )Нс»1зсЬ, В. А. Гаврилюк, О. В.

Вилойко, П. Чумачвнка, а также J. Stevens, J. Lanzill (Университет Тафта, Бостон, СИА), U. Ehlers (Гарвардски Университет, Бостон, СИА), P. Alhenc-Gelas ,INSEKM, unit 361 Париж, Франция). Всем коллегам автор выражает глубокую благодг рность. Автор также вир жает признательность академику B.I Смирнову за постоянный интерес к работа и ее поддержку.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава t.ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА АЛФ Ю РАЗИН? ОРГАНОВ Чр/ВДЕ»

Для выделения АПФ из разных органов человека ^ыли разработан три новых метопа.

На первом этапе схема выделения АЛ* вклвчала 8 стад^р, оснс вными из которых были: солюбилизация AIW из мембраны р' ро^да трипсина, ионообменная хроматография и хроматофокусиропа^ис Сочетание этих приемов позволило вмделить препарат АГФ (из легк» человека) с высокой удельной активностью 36 ед/мг белка, одна» процедура выделения .снимала больше месяца и выход составил ncei 2% (Сахаров и др., 1986). Поставленная цоло, - всестороннее изу ение АЛ* человека - требовала разработки новых, более,эффектншн методов выделения.

С целы» использования преимуществ аффиной хроматографии nai был синтезирован сорбент, содержащий иммобилизованный ингибкт! АПФ - CA-Gly-Gly, любоэно предоставленный Б. Холккпнстом i Гарвардского Университета (США). Процедура выделения сократила' с S до 4 стадий, а время выделения - до 5 дней. Увеличение иичи, и упрощение процедур позволило выделить АПФ не только из jicikij но и мозга, печени (Сахаров и др., 1997), сердца (Sakharov i

а1. ■ 15Я7) ■■! «лазим героин человека, легки» толепя. Получьиное количество гоиогй!е«ога препарата АПФ било достаточно не только для определи!»«! всего спектра ыолекупярно-кнпетических характеристик фермента, но к для иммунизации нишей и дальнейшего скрининга гибрид1шх клеток-продуцентов антител к АПФ.

Одно из отобранных и очнценних МоАт. (9В9) имели высокое сродство к АП# (Кд порядка 0. I нМ) н не терпло амт'йк*ом-связыааоцув способность после иммобилизации их на се^ароэв. Используя полученный ииыуносорбент, а также иягккЬ условия элпции, при которых /П* ив теряет активности, мы рАэ'работали третий спо-соб выделения АП», позволяющий получать достаточное количество гомогенного АП+ за относительно небольнб'б в^замя. (Сахаров и др. 1991).

Ьцделенные гомогенные препараты АП& из разных органов чоЛЬ'вСк4 'были охарактеризованы по целому ряду молокулярно-кинетических 'Ла^аметров. Молекулярная масса, изоэлектрнческап точка, '¿'атимум, констант^ иигибирования известными ингибиторами койстанть» ^йхазлис& Для гидролиза приходных и син^ет'йчЪ'с'кйх ЪУбстУ>4тов, степень ¿ктииа1Уин АЛ^ анйб'наии - аса эУн параметры не отличались суа^асУве'йно для 'всех ^ыделеУйУых 'п'реЛа'рЬтон а¥|(У - йз легких, сердца, печени, мо&'га, плазмы Уфо'вй

УсАха'ро» % Цр. Ш'А,

19Н7,ЙркЬагоу с1 а(. 1987а, Ь.).

Глубокие различия между АЛФ из разных органов бйлй о^ий'рУжены при исследовании суСстрагной специфичности виделенных препаратов. Оказалось, что АПФ, выделенный из сердца человека, в отличии от препаратов АП# из других исследованных органов, »-идролизувт атриопептин 2 и его С-кокцеиой аналог Вг-01у-Зег-РЬе-Агв.(Рис.1 и Табл. 1, ЭакЬагоу е! а1. 1988).

I I

О в 12 18 ими

и 1111

О в 12 10

МИН

Рис. 1 Високоэффек-птнал жидкостная хроматография Вг-С1у-5ог-РЬе-Аге, гндроаязовалного АЛ* из сердца человека. Л-В*-01у-8ег- Ъе-Лге. (Ч>~ЭЫ), Б-Вг-Огу-Зсг-РЬе-Аг*, (10"3М) поело 15 хин. инкубации с АПФ сердца (10 Ы).

с

Варьируя начальную концентрацию а реагирующей смеси от 5x10 до 10"3 М, была определена Км для гидролиза1С-концевого аналога, рапнйя 100 сжЫ. Атриопелтин 2 также гидролизовался ферментом выделенным из сердца человека (Табл. 1)

Табл. 1. Гидролиз атрнопептина 2 АПФ из сердца чолопека

Концентрация Источник Каптоприл Степень

АПФ (И) ЛП1> (И) гидролиза*

1 х 1<Г* сердце - 0

3 к 10"' сердце - 10

3 х 10~9 сердце 1 х 10"в. 0

1 х 10~8 сердце - 55

1 х Ю"8 сердце 1 х 10"6 0

1 X 10"8 легкое - 0

Эти данные подтверждает высказанное ранее орпцпшшаинн» (Harria,Wüaoii, 198$), что образование атрмопептина 1 и сердечнрй мышца происходит из атрмацептина 2 при участии АЛФ. Кроме того, обнаруженные фуикпншшныша различия АПФ ceipv-ma -и 'легких по отнования н атрмопоптмту 2 - еще один экспернисйтальний факт свидетельствуемой о еозкожностм существования оргашюй специфичности Aflí».

Гяааа 1.1ЮЛУЧЕШЕ ЛаНЕКИИСНОКЙОНАЛЪНЫХ АНТИТЕЛ <(ИоАт) против А№

Несмотря на интенсивное, и, >си«виоа, изучение первичной структуры АП®, ыеканнэмоа кзтпяиза ст даигибирсааняп, иииуноки-. кическая , антигениния структура АЯФ к пачелу ■мастоящвй (работы была практически на исследована. Отчасти это 'вбьясяиется тем, что предыдущие попытки изучения антигенных свойств АПФ предпринимались с использованием поликлональкых антител '(во'РГет с^ а1. '1976, 1978, 1982), которые являются гетерогенной сывсМя антител 'различной специфичности и аффинности, й, таким ¿браэсгм, •и'й/е'вт 'й1<ра1!йчвнниа возможности.

'Появление Матова ¡¡опучеМЙП ионакпанУЯыШх антител, 'которые 'кйв-от абсо/ттнуй специфичность и единообразие, по 'оравнанив с поликлональной антисииорот«ой, позионяет изучать тонкую антиген-нуо структуру балков гораздо более точно. Ограниченная и невольная поверхность 'отпечатка * МоАт «а беяхлвой молекула (640-750 А*) позволяет предполагать, что 1(оАт ыогут быть очень чувствительным инструментом для изучения функциональной значимости разных эпитопов молекулы АПФ. Хотя к началу этого исследования было описано получение нескольких МоАт к АПФ, каждая из групп имела ЧоАт

к одкому или двум зпнтопам АЦФ, что ив позволяло проводить комплексного изучения антигенной структуры ЛЛФ (Auerbach et al. 1982).

Поэтому, для выяснения антигенных свойств АПФ и для изучения функциональной активное- < антигенных детерминант АЛ* мы попытались получить максимально широкий спектр МоЛт против АПФ. Используя иммунизацию как in vitro, так и in vivo, о результате нескольких гибридизаций нам удалось получить 1S стабильных линий гиОридоы продуцируоких МоЛт против ЛЛ4-

Для пероичного скрининга гибридом использовалась ELISA с очищенными препаратами АПФ из разных органов человека. Цторичнмй скрининг проводили с помсхцьч разработанного наш т.н. метода им-муносорбции (Danilov et al., 1987). (Схема метода - на ^ис. ?, )[

J. АПФ КАК 1125 -МЕЧЕНЫЙ АНТИГЕН 7. АПФ КАК ФЕРМЕНТ

"'^J 3. АПФ - 10 НГ/ЯЧЕЙКУ

2. МоАт - 10 МКГ/ЯЧЕЙКУ

1. АНТИ-МЫШИНЫЙ Ig G _-3 МК.Г/ЯЧЕЙКУ _

Рис. 2 Ивтод нашуяоеорбцки. (Схема)

Используя этот же метод, мы исследовали нипоиур полученной панели МоАт к АЛФ, т.е. определили с АПФ каких видов животных, (из 13 исследованных), взаимодействует МоАт против АПФ.

1 2

Табл. 2

ыдавля специфичность штлк ИоАг лротип ал*

Вид»

Изогнл ItG, ItCj I»0, IgO, U0j, 1(0, 1*0, I(U 1(0, Ito, 1(0, 1(0, |«<U

МОАТ 9В9 505 3AÍ 1C7 mi 7FJ UH5 1011 10* SPI «AI J <H« JCI lei

Ч«ловеи Si It }} 22 4 3 15 г 5 5 11 5 а »

обезьяна I II 11 10 7 5 1« 3 1 15 - - - -

н. с&инна г It ti ♦ 4 J - - - - - - - -

■ риса it - - - - - - - * - - - -

хоияк 4

кошка 1«

кролик - J ) 1

свиньи - 3 1

Сыворотку исследуемых животных (как источник АЛФ) инкубировали а ячейках для микратитронанип 'покрытых* различными МоАт. Посла отмывки несвязавшегосн АПФ, активность адсорбировавшегося Aft® определяли флуорнмегрмчески прямо в ячейках.

Цифры в таблице - превышение активности АПФ в ячейках с тестируемыми МоАт по сравнению с контролем ( ИоАт против ЛНЛ).

По видовой специфичности I4 полученных ЫоАт разбиваются па 5 групп (9В9; 5G5,ЗА5, IC7; Í1A8.7P5; Í2HS,1012,1С6,SP1; 6A12.41I4, ЗОИ,131;). При этом ни одно нэ полученных МоАт не взаимодействовало с АПФ нозпа, Oüioí, собаки, быка н миши. МоАт 9В9 и антитела из второй группы (505, 3AJ. 1С7) узнают наиболее консервативные антигенные детерминанты, тогда как UoAr из пятой группы спязвтеот только ATI* человека. Степень перекрестной реакция зависит от гтрнсутстоня соотвотстоуоедаго эпитопа и от аффинности селз&гаания ЫоАт с этим эпигоном. Отиег^и, наггряые<р, что аффинность ISoAt Í2I15, 1012, SP1 к АГ14> обезмпш выше, чcm К АТ1» четкгоека. Также были определены изотипы полученных МоАт '(Табл. . Эрмтопнан специфичность ШШЙЛИ КРАТ К, A lit-

Для того, чтобы понять, сколько антигенных областей и эпитопов на молекуле АПФ "узнается" полученной панелью МоАт, антитела были проанализированы на предмет конкуренции друг с другом за связывание с АГ1Ф (модифицированный метод иммуносорбции).

АЛФ пре-инкубировали с 200-кратным избытком "насыщающих" антител, и, затем, изучали способность этого комплекса к преципитации "тестируемыми* антителами, сорбированными в ячейках для микротитрования (Рис.3).

)П

ЛИФС 1МЯ

шпотегическммн эпитоплми

насыщающие а<

гытитмые аг

НАСЫНиЮНШК Ат

Л|№МИШ|.МГО«Л.1 СШЬЫКОМ НЛСМИИПШИ.Х А|

* иодлин мня . 1оо1

Рис. 3 Зпловяая пицфгаюсть панели МоАт против АПФ. (Схема эксперимента - основана на методе иымуноссрбцин)

Принято считать, что если "насыщасщсцэ" антитела блокирует преципитации комплекса с тестируемыми МоАт, то оба МоАт из этой пары связываются внутри одной антигенной области (Тваг(ос,1981); т.о. одна антигенная область может содержать несколько зпитопоа, на расстоянии друг от друга меньше, чем диаыотр МоАт (35 А). На рис. 4 представлены результаты такого аналнза. Пара антител на ода» и тот йо шш перекрывающийся эпитоп вызывает более чей 70% ингиОированио преципитации, тогда как неконкурируицап пара антител ингмбирует менее 30%. Представленные результаты проанализирована на основе этих ограничений.

КАРТИРОВАНИЕ ЭПИТОПОВ АПФ

ив » .

В

о н

г* 5

1СТ

юл

7Г5

зса

т

ила

кия

ела

АВ4

т

1 я ГШ! 1 ...И т 1 щ га — па СП ,

] я ЙЙП 1 и и

1 я Я 3 й П я. ч Я

ш Я11. вп я я

1 я Ш Яп п я - 14

1 ,. Яп я п

1 я « п а а я я

ш э п а я п

ЯРЯ аап эя

т ш 0Я9Пя

« п я ся П

336 3 9 ЭЗШ §

НАСЫЩАЮЩИЕ МоА1 '»

юг

¡о

Рис. 4 Алтагтшыа области ЛПФ человека. Как показано на Рис. 3 АПФ инкубировали с 200-крат(шы избытком указашшх 'наси-цапцнх' ЫоАт и затем оценивали связывание этого комплекса с ячейками м!!кротитратора 'покрытыми' указанными тестируемыми НоЛт.

Можно видеть, что панель МоЛт выявляет 3 антигенные области а молекуле АЛ4:две независимых (первая - 5Р1, вторая - 12Н5, 1СI2, 206, ЙА12, 4Н4) и третья - перекрыпавдаяся область (пер остальные ИоАт)

На основе результатов пидопой (Гавл. 2) и эпитопной (Рис.3,4) специфичности МоАт разбивается на % различных групп (1-У), но идентичных группам из видовой специфичности (Рис.5).

видовой и эпитопной специфичности панели МоАт. Конкурентное свяэыванив-перекрываоциеся круги; отсутствие перекрывания свидетельствует о неконкурентной связывании; - МоЛт 'узнают идентичный эпитоп; МоЛт связывают близко расположенные, но не идентичные эпитопы.

Все эти данные позволяют утверждать, что полученная нами панель из 14 МоЛт "узнает* как минимум 7 различных злитопов на

молекуле АПФ, расположенных в одной перекрывающейся и двух

- \

\

удаленных антигенных областях молекулы АПФ. ГЛАВА 3. АНТИГЕННОЕ КАРТИРОВАНИЕ МОЛЕКУЛЫ АПФ.

Для того, чтобы локализовать эпитопы, выявляемые панелью МоАт, на иолекуле АПФ, ыы проанализировали связывание всех получении* МоАт с различными рекоыбинантыими молекулами АЛФ (Рис.6), полученный» в лаборатории проф. П.Корволя (Франция). Для упрощения только одно КоАт из серии идентичных, бу/юг ишшчено в дальнейший анализ. Кроив набора ЫоЛт полученных о нашей лаборатории, в последующий анализ включен набор из 5 МоЛт, полученных к препарату АПФ из почек человека Г. Тоубиным (С1ВА~СЕУСУ, Шпейцария).

1 б

АСЕ,

KOSS,963 I

АСЕ

oeeol

тгпт

1277

ACE (wild-type)

7V /\

HEMQH HEMQH ПОЛНОРАЗМЕРНЫЕ МУТАНТЫ

1 ы 1

1 <1

1

-О—

•УКОРОЧЕННЫЕ* МУТАНТЫ 1 1230

АСЕ

к sei,ras

асе

оэвг

N fragment

рт:

■ 1

732

АСЕ "'дСООН 572 1277

[С fragment

Рис. 6 Доаграыма генвтнческмя конструкций Ali*. Серия стабиллиих клеточных линий (СНО) зкспрессирующих различные «yirtiift'bi рекоибинаптного гена АП+ (Lei et al. , 19)1, а,'Ъ)

Доступность ыутантных АЛФ, каждый из которых содержит только один интактшй доквы, и, особенно, 'укороченные' Ы- и С-фрагиентм позволили локализовать эпитопы дня МоАт сначала на *доиенном* уровне. На рис. 7 представлены результаты такого анализа.

Несколько выводов можно сдолать из зтого эксперимента: 1) ни одно кэ полученным 19 ЫоАт не взаимодействует с карбокситерммнал-ыога доионоы аозгокули АПФ; 2) МоАг ОЪа 1-5 не связывается с пнтактгжуй, каталитической активной «голекул-оЯ АТЮ; З') Зтггап 'для ИоАт С1Ьа * я * заваскиропан в иитактной •ыояаъо/ль 'но

становится зкепонироваы после "отрезания' С-фрагмента'(рис. 71) 'ИЛи посла денатурации АЛ<» (см. ниже, рис. 9).

Рис. 7 Прецнигегздоя рехоабпваигного АПФ к его Н- а С-^рагиеэтса юиокюшлыш» ахггатояакв Результаты выражены'. в виде активности АПФ. преципнтироаашшй дан!шн МоАт (Количестсо Н-, С-фрагмонтов и рекоыбннантного АПФ ураш-лггали по 'ферментативной активности в отношении субстрата 1-РЬе-1Иа-Ьеи). С-фрагаонт АПФ не преципитирсвелся ни однны из исследованных МоАт.

Подобный анализ был проведен со всеыи цутаитниым АПФ, показанмыин ка рис. 6, а таксе с АПФ легких человека, солчбнли-эированюи из менбраиы с поыощьв трипсина (егг;е один вариант •укороченного* АПФ). Результаты этих экспериментов суммированы на ряс. 8. Эти результаты приводят к следующий заключениям: 1) МсАт очопь. чувствительна к дзю незначительны« изменения» коифзриации излому ли АЛФ. Например, МоАт ИА8, 4Н4, 5Р1 значительно уиенынапт соетглзакиа (в 3 раза) со всеми видами АПФ без трансмекбранного "якоря"-ЛСЕ^до^, секрэтируемая форма А5Ж (ЛСЕзесгс^е^ м АПФ из лэгхмх, солв&млизг.роваиный трипсином.

ИТ 100

ЛсосЛ 5С|.

в

с < \*т 100,

X 2 аясге1£(1 50

2 X I- < 5 АСЕ I 100.

X н 5о|

< X

X н

х из О ^ X < § м. 100. 50

ы Ю0|

а. X АСЕ

из ьззе.азз 50

К с;

1

а X юо|

< О АСЕ

н 5 оаво зо '

С о

X X

п о АСЕ 100|

ы 0. 2 К3в1:38в 30

С т 1

±П1

11Р

шз_

Шги,

Е_аЛЛя_

л.

АСЕ

ЧЛЙааЛШЬ

| «о л <

I « О «

МоАТ

а л «о о « «

С—

РИС. 8 Пре^окггадая юутздтшх АЛО шыетав ИоЛт Условии

-эксперимента описаны н подписи к рис. 7. Данные представлены как И актишюстн ыутантного АПФ, сорбироианного данный МоАт, от такового значения для нетинного АПФ.

Еа;» болеа ецрааапно сниааотся связывания атик антитоп с анино-гориннаяыши <$рагоонтом А(1>> (а 3-15 раз); 2) отметин такав драматическое уа-зньиониа преципн-тации антятоиамн 6М1 и 4ЕИ полноразмерного иутаатного АПФ без атома 7.« а активной центра амнно-терминального донэпа АИФ. Это мохет означать что эпитоп для этих ЯоАг распоиозен в или ряд"« с Хп-евязипзящии саЯтон активного центра з Н-доиено.

Результаты иммуносорбции денатурированного АПФ анализируемыми антителами (Рис. 9) показывают, что большинство МоАт из первого набора (кроме 5Р1) узнают комфорнацнонные эпнтопы, тогда как 5Р1 и рее ИоАт С1Ьа направлен < на фрагменты первичной структуры.

ОИНТАКГНЫЙ ,В1АПФ

ДЕНАТУРИРОВАННЫЙ ,3| АПФ

с?«*»«-)

I CHAI GIBA] СКМ С*»«

МоЛт

Рис. 9.Преципитация радиоактивно меченного реко^кнаитного Л№

■юношюн&лышкм антитеяаш против ЛМ 1-125 меченый рекомбинантныи АЛ* денатурировали нагреванием при 70° а течении 30 мин., посла чего оценивали преципитации.

МоАт SF1 также выявляет денатурированный полноразмерный АП* и N-фрагиент в иммуноблоттииге (Рис. 10) Следует отметить, что МоАт 9В9, которое практически не связывает денатурированный АП# и растворе (Рис.9), связывается с денатурированным АПФ (но не с N-фрагмонтом, н отличие от 5F1), иммобилизованным на поверхности (на нитроцеллюлозе).

.МЛ 121212121212

Q ос |sl фр ра!,ф

200 »-»• 97

200

97

69

69 »-«*• МоАГ

два заз иле зов uhs sn

r 1-CMLCbN- И С-ФРАГМЕИТ01)

а 6

juriicumfoitu v 2-АПФ ЛЕГКИХ ЧЕЛОИЕКА

^ис. 10 Имыунивиоттивд- 1нгш<юга м рекоабшшшшх AM Процедуру

блоттинга пропади нч после SDS-злектрофореза в 7.5 % полиакриламидном геле с А) попкклоиальной антисынороткоЛ прогни АПФ, Б) МоАт против АЛ*

Эксперимент!* с денатурированный АПФ а в. а раз показывают, что ■питопы для всех МоАт Ciba скрыты в иитактноы, каталитически жтивноы АПФ, и становятся доступными для МоАт только поел« >азвора> 1вания молекулы АПФ в результате денатурации ими 'отрезания" С-фрагыонта.

Одно из возможных объяснений того факта, что асе МоАт Ciba 'знают сикпепинапыше згштопы, по контрасту с первой наивны ттител, состоит и следу«кцеи. Дли скрининга нашего набора антител 14 клонов) мы использовали двух-ступенчатуо процедуру: первый гюрннннг - CLISA с АПФ из легких, иммобилизованном на пластике. 1атем позитивные клони билн перепроверены а процедуре ммыуно-:орбции (т.е. только МоАт, которые связивапт «нтактный,-катаяи-ически активный АПФ били отобраны). Для скрининга второй панели loАт (Ciba) использовали только ELISA. Известно, что многие ¡елки, и, особенно, ферменты, значительно изменяли конфориацио и, |адо денатурировали, при иммобилизации на полистироле. Не 1Склочено, что это произошло и а случае второй панели МоАт.

В следующей серии экспериментов мы попытались найти причину: почему осе МоЛт направлены против М-домена АПФ и ни одно н< взаимодействует с С-доиеноы, несмотря на очень высокую степеш гомологии Этих двух доые ов молекулы АПФ (5оиЬг1ег е1 а1.1988)1 > Одна из возможных причин - различная нмыуногенность М- и С доменов. ■ Для проверни этого предположения мы сравнили кривы« конкурентного связывания нативного, полноразиерного АЛ® и И- н С-фрагментов в прямом ИМ, используя 3 различных поликлокальных антисыворотки против АПФ -(Я^, У^)- Результаты такого сравнения, представленные на рис. 11, показывают, что М-фрагмещ конкурирует с полноразиориим АПФ, за связывание с поликлональнш антителами, несравнимо более эффективно, чей С-фрагмент. (Подобный результат бая получен также с антисыворотко.й У,- н(

АПФ, (НГ)

.¡Вис. 53 Е^гкхсгЭ ЕЛ& ^^кгггсдекп-п^сярса^зи.'агго форкспгта

САгтвеажхаэз«« «19 и V). В/В«- отношение сиязанного 1-12 «Э<£гззздао ¡^езкоибип^нтпого АПФ в присутствии и -отсутстви мейяедаавдявд«« иутаитпых АПФ.

Таким образом, мы новей закпичить, что доля антител, узнаэдая N- домен, но асея исследоаанных антнсыаоротках, несравненно виш4, чей антител, напраалэигаег против С-домена. Дополнительное подтверждения этоД гипотезы - количествецний нммуноблоттинг ннтакт-ного АПО а М- и С-фрагыеитоэ с набором антксыоораток (Рис. 10).

Эти данные позполяот предполагать, что амино-термнналышй домен - Главная Иммуногепная Область молекулы ЛПФ - или, иными словами, что нниунпгонность АПФ главны» образом определяется аинно-термнналышм доменом. Принимал во внимание, что гидрофига»-ность, доступность и подвижность эпнтоцоп определяет аиттегеюсг, болков (Parker et al., 1986), uosiio предсказать, что Н-домап расположен на поверхности молекула AI1S, а С-домэн упакован поя амино-терминалькыи доменом.

Аипасата. ятачееккв »^{вхты пгишщ НоАт

Ингибыторпая активность МоАт была определена для полноразмерных it • укороченных' мутантных АПФ энэиматическим методой в отпоа-ении различных субстратов (Hip-Ilia-Lcu, Z-Phe-Ilis-Lcu, ангиотан-знна I, врадинилу.иа » ролизнпг -фактор гоэтениизнруюожго гормона), На ряс,12 представлены доэные эависиаости нпгябиропания нвскояь«ики ан+и1геяаии гидролиза Hip-Ills-Leu и X-Fhe-Üls-Leu интактшзы, полнораэяерним АПФ и Н-фрагиептон. (Остальные ИоАт такие были лроанаяизяропаны эти «етодоа, однако они не проявили иикаьссЛ кигибиторноЯ активности).

мл«

10 >0 !оо 1 а ¡о 5о

молярное отношение ( моаг: апф )

Рис. 12 Автикаташтическнй эффежтг ЦоАт на гидролиз Н1р-Н1з-Ье1 (а,Ь) и г-РЬе-Шв-Ьеи (с,<1) ннтактным ЛПФ (а,с) I 'укороченным* Ь-фрагментои. В качестве контроля использовали норм 1ьные мышиные иммуноглобулины.

Эти данные Показывает, что 1) субстратный гидролиз ннтактны! ферментом подавляется антителами гораздо4заметнее в отношении Х-РЬс-Шз-Ьеи, чем для Н1р-Н1а-Ьеи; 2) эффект МоЛт на ингнби-рование гидролиза субстратов гораздо более выражен в отнотени» амино-терминального фрагмента (иневцего только один активные центр), чем для полноразмерного АЛФ, несущего два каталитическ! активных доыена (т.е. имеющего два активных центра); 3) МоАт ЗА! и 12115, принадлежащих к разный антигенным областям, поннастм блокировали активный центр Ы-домена.

Подобный анализ был проведен со всеми (Рис/ 6) мутантными АПФ.

Табл. 3 ЛНТИ-КАТАЛИТИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ НоАт

на гидролиз Z-Phe-His-Leu, Hip-His-Leu, AI " мутантами, несущими интактным только N-домен АЛФ

1С50* [молярное отношение)

Ферцент МоАт Hip-His-Leu Z-Phe-llls-Leu А!

"ISH5...... 22 2 2

N фрагмент

ЗА5 б б 5

12115 22 2 2

aced959 963 ЗА5

б б 6

12Н5 25 1 М0£

асек960 3AS 6 2

Данние представлены как молярное отношение (МоАт:АЛФ) которб'а вызкэаот 50 % ннгнбироааннв активности АЛФ. а Не определяли.

На Табл. 3 представлены результаты сравнения антикаталитнчес»-ого эффекта МоАт ЗАJ и 12Н5 па гидролиз различных субстратов полнораз-ерныии и укороченными мутаптиыми АПФ, имеющими Tom.fttt один функционирукхций активный центр (в Н-домене).

Эти результаты выявляет глубокие» различил между этими дцумй анУик<а+алктическиии антителами. МоАт 3AS н раиной ctoiiCiIh ftbiiatinrtbV гйдролиз различных субстратов исоми иэучонними йу+й-¿iiHiiatill с UViTih-VitilH акТиНпыи центром п N-Домоно (¡50 5

Й^ОйЬйаЛосЬ. tt^tt моЛА^ИЙЙ ctio+rtd&eitHH (ЙЪА*: равной <5. H6\V lltts «ttiW iViA^HVoAbho «"й'Ло'е Vi

ингибировании гидролиза 2-Phc-IUs-l.eu и йМ1-НйтопЗйУ1й Ъ \5'д % ннгибирование при молярном соотношении 1-2), но гораздо менее эффективно для ингибировании гидролиза llip-His-L.au (молярное атпооетю 22-25). МоАт J2HJ было также более эффективно, чем МоАт ЗА5 а ингибировании гидролиза браднкиннна и релизинг фактора лиге-иниэмруевдго гормона.

Эти данные позволяет предполояить. что Х-РЬе-Ша-Ьеи, А1 м брадикинии гидролизуютен в (или связываются с) одной участке актирного центра Ы-доыена, а Шр-Н1Б-1.еи - в другом, и, что МоАт ЗАЗи ИН5 узнают эти разн' о участки.

1 Н, наконец, тот факт, что при 100-кратноы избытке МоАт ЗА5 или i2H5 (т.е. в условиях полного подавления активного центра Н-доиона) сохраняется 50$ первоначальной активности полноразыирпого рекомбимантного АПФ или АПФ выделенного из легких (Рис. 12), является пряным доказательствоы функционирования в интактноЯ молекуле АПФ двух активных центров.

ГЛАВА 4. ШМУИОгаСТОХШИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ АПФ В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ МоАт.

В ряде публикаций была показана структурная и функциональная гетерогенность препаратов АПФ выделенных из разных органов I тканей (Са1с1»о11 еЪ а1. , 1976, 0е[епсНп1 е1 а1. , 1963). Однако, попытки' обнаружить пикунологические различия АЛФ из разных органо< предпринятые с помощью поликлональных антител не были успешными, Коноклональныо антитела, вследствие высокой специфичности I уникальной однородности, гораздо более пригодны как дл> исследования возможности существования изофоры АПФ, так и ял мимуногистохкмического выявления АПФ в тканях человека.

Получив панель МоАт против разных эпитопоо колекулы АПФ, щ попытались обнаружить, иимуногис-гохикичоскиыи иетодами, возиояну иммунологическую ¡готерогенцо'сть АПФ в органах и тканях чэлоаека Во всех исследованных тканях, (кроме мозга), окрашивание (ПАП

методом) ноноклональними антителами против разных эпитопов молекулы АП<5> было сходным и не отличалось от результатов с использованием поликлональных антител - во всех органах окрашивались эндотелиальние клетки сосудов (Danilov et al., 19S7).

Таким образом ЫоЛт против ЛПФ, н, особенно 9В9, можно использовать как иаркер сосудистого эндотелия. Это мояег оказаться оаяньш для изучения происхоидення и развития сосудистых опухолей и других видов сосудистой патологии. Например, имиуногистохиыическое изучение некоторых случаев болезни Такаяаи, проведенное с поыовьа МаЛт 9В9, показало, что патология сопровождается прорастание» waaa vasorua о адвентиций (Принцева и др., 1990).

Вне-сосудистая локализации АПФ показана в эпителии проксимальных канальцев почки и тонкого кишечника. Как и в случае сосудисто-ого эндотелия, характер окрапияаннп бил сходен для псех исследованных а: гит©л.

При окрашивании sa разными МоАт разных отдалои мозга мы обнаружили прннеры ныыупологической гетерогенности АПФ. Так, все МоАт, «рома SCS, ZAS и IC7 (кстати уэнаадщх один и тот же эиитоп) окра-гиаали и зндотелиалыше м пейрозпиталиальные клетки сосудистого сплетения. МоАт указанной группы окрашивали только эндотонианьнмо клетки, лричаи в очень широком диапазоне концентраций. Второй пример: антитела IG12, о отличие от остальных, не окрашивали платок Луркннье а ыозвечке. Эти данные спндотельстнуот о пользу суцзствопаннп изоформ АПФ именно п мозге; ранее быно показано наличие изоформы АПФ (с болыяай молекулярной массой) ■> corpus atria tua »substantia nigra (Hooper, Turner, 1987V

Следует отметить, что ни одно из МоАт по окрашивало ннутронна» часть семявыиослЕцнх канальцев яичек (Danilov et al.,1487,, где

локализована тестикулярная форма АП9.(фактически карбокси-терминальный домен АПФ).

Имиуногистохимическое окрааиаание (ПАП-метод с 3-4 кратным усилением) ыы применили и дл1. исследования локальной активации АПФ в сердца при патологических состояниях. Были исследованы образцы миокарда от тро^ групп: 1) неизмененный миокард (полученной при аутопсии после несчастных случаев -16 образцов), 2) два образца миокарда после внезапной смерти (кардиогеммого происхождения) и 3)

два образца миокарда с верифицированным инфарктом.

♦

На срезах нормального миокарда МоАт окрашивали только эндотелий капилляров и более крупных сосудов. На сразах миокарда двух других групп количество АЛ4-позитианых клеток увеличивалось в 5-10 раз (Рис. 13).

^ .

(Л£16) ВНЕЗАПНАЯ СМЕРТЬ ИНФАРКТ МИОКАРДА

Рис. 13 Иммувогнстозошшгоеской окраймваиие гаакарда человека с

помоцьв ЫоА-г 9В9. Криастатиыо срезы миокарда скраинвали ПАП-методом антителами 9В9 и количество АЛФ-позктивннх клоток (как % от обоего количества клеток) оцсннзали морфометрически.

Это увеличения было наиболее пыраженно о зоне воспаления. Двойное окрашивание с клеточно-специфичес к ими маркерами показывает, что активация экспресии АИФ в зоне воспаления связана с актипацией макрофагов, мигрирующих о зти зоны. Аналогичное увеличение экспрессии АПФ показано нами на мололи экспериментального инфаркта миокарда на крысах (Falkenhahn et al., 1994).

Сходное резкое увеличение количества АПФ-позитивных клеток мы также наблюдали п грануляционной слое крысиной кожи поело экспериментального повреждения. И. наконец, мы наблюдали очень четкое окрашивание гранулем (состоящих из эпителиоид|Ых и гигантских клеток иакрофагального происхождения) я лимфатических узлах пациентов с саркоияозом. Эти три различных патологии инеют обще'о свойство - воспаление и экспрессия на-эндотелиального АПФ. Эти данные позволяют предположить, что АПФ повлечен в пост-ипфарцтпоо воспаление и реорганизацию, в связи с чем детальное изучение эффектов'ингибиторов АПФ на резко повышенную экспрессию АПФ в сердце представляется очень актуальный. i

ГЛАСА 5. ИШУНОФЕРМЕИТНИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АПФ IIA ОСНОВЕ ИоАт.

В настоящее вреня активность АПФ о сыворотке и тканях является одним из прогностических н диагностических признаков при целом ряде заболеваний ( Ro-hatgi , t 9 82 ) . Особенно интересным представляется недавно обнаруженный факт корреляции активности АПФ п плазме крови, генотипа но гену АПФ и риской инфаркта миокарда (СапЫсп et al. , 1992). Однако, анализ активности АПФ н биологических жидкостях и тканях имеет ряд недостатков.

Определению истинной ферментативной активности АПФ мешает наличие эндогенных и экзогенных ингибиторов этого фермента. Кроме того, для клинической практики необходимо определить активность АПФ у больных, длительно принимающих ингибиторы АПФ. Нам удалось преодолеть эти сложности, опять *е применив метод иммуносорбцин.

В перзоы варианте метода сначала АПФ из определяемого образца сорбировали в ячейки микротнтратора с иммобилизованными МоАт 9В9, а затем, после отмывки исех ингибиторов, определял» фермаитатнвнув активность. Сказалось, что активность сорбированного АПФ прямо пропорциональна, в широком интервале значений, активности вносимо^ го в ячейки иикротитратора растцора АПФ. Коэффициент корреляции не яду активностью АПФ, определяемый флуоринатрнческнц методом

2 97Й) и активность», опрзделя&ыой после сорбции АПФ на МоАт, равен 0.986 (Рис. 14).

40

14 0-о

И

Б <

сЭ о°

'со О Х>

АКТИВНОСТЬ АПФ НА ПЛАСТИКЕ (ФЛУОР.ОТН.ЕД.)

Рид. 14 Коррешщяя ке.-гду активность» АПФ о растворе и активность» АПФ, сорбированной на пластка с ЦоАт 9В9.

Добавление ингибиторов, АПФ (каптоприла, зпалапрнла) в ячейки ыикротитратора доэозависимо подавляла активность АПФ а растворе, не влияя на активность сорбированного АПФ. Видимо, при промывках лупок, содержащих сорбированный АПФ, ферыеит-ингибнторный комплекс разрушается за счет смещения равновесия в сторону свободного фермента н ингибитора. Кзобходимо отметить, что имиуносорбцнонный мо-тод не уступает по чувствительности гомогенному методу анализа. Йто позволило продемонстрировать применимость разработанного нами метода для определения активности АП4> в сыаоротке крови здоровых доноров и больных саркоидозоы (Рис. 15). I

12

<3

а: а. аз О

Х>

<

ю

У

ги 40 бз an toa о бо «о too

С51£Ц СЫВОРОТКИ, аня

Рис. 15 CjtpsR3.K"3í5KS sííTKc««jCTtí АПФ a ctstcpo-rsta jsoiropon (t) и

C.onvrcm: capt:crtsj533:iKS (2). А - посла сорбции на МоАт 9В9; Е - з растиориа.

Вид:ю, что ггстипнстсть АПФ и кровгв больного препьяяает нормалышй урапеиь а 2 раза, что подтпзрсдает данные пояучонныо при определении активности АПФ флоориметрическн.

С большой уверенностью можно утверждать, что иснользу» калиброиочную кривую но известному препарату можно с высоко точностью определять активность АПФ и 6'браэцах. При зтом устра ннется неизбежное влияние на Определение АПФ, с помоцы традицирнных методов, присутс^гиуЬОДЬ и смиоротке ипгибигороо, также ряда оецесто, внося^йк ЙЬИса*сния в определение продукте реакции.

Второй вариант ыото'ДА (V.u. 'сэндвич') позволяет определят! количество иимунорсйкт№Л'юга болк& All®, а но его актииность. Ието; основан на дну* MöAt к АПФ, "узнааоцих* разные згштогш молекулы АГК - УВ9 и 1012 (см. Рнс. 4,3 но эпитопной специфичности напели UoAi к АПФ). АПФ из опродолломого раствора сорбируется п ячейка микротитратора с сорбированными антителами 989 (в варианте иммуносорбции). Зато» специфически соязавшийся АПФ определяли, (с варианте ELISA) с помощь» антитела на другой знитоп молекулы АП4 (1012) коньвгнрованный со целочной фосфаТйзой и качестве 'проявляющего* реагента. Щелочная фосфатаэа гидролнэуоУ WAD1* до NAD. Соответственно, NAD nocToAiiVi'd nopto*ö)itoV М» ИкноШМ V восстановленную» форму с помоцьо пары алКйгйлЫи>1'Й№ок-о)|&:кй/ диафораэа. При кавдоы цикле иоднитрототразоленый фАолстоиь-Г превращается в окрашенный продукт (ф'ормаэан), который дагке определяется спокторофотометричоски, Чуистиитолмюсть jiailjiorc мотола составляла порядка 100 пикограмм натинпого, нодопатуриро-панного АПФ/мл (Рис. 16 .Stevens et at., 1990).

Рис. 16 Стандартная кривая тмгровалня для определения АПФ.

На врезке даннмо представлены в линейной шкало.

Как и в первом варианте, на определение АПФ не олиялн ни эндо-, ни экзогенные ингибиторы. С разработкой этого метода появилась возможность проводить автоматизиролапиый первичный скрининг содержания АПФ в болыэих популяциях, т.к. определение генотипа АПФ, и, даже определение активности АПФ применяемыми ранее флоориметрическин (Frieiilandl,Si 1 verstcin, 1976) или спектро-фотоиетрическим методом (Cusliman, Cheung, 1972) не может быть массовый.

ГЛАВА б. НАПРАВЛЕННЫЙ ТРАНСПОРТ В ЛЕГКИЕ С ПОМОЩЬЮ МоАт 9В9.

Фецонан специфического НЗИОТДЗНИЯ U ЛЕГКИ* МРАТ ПВЙТИИ AOÍ

Поиск векторов, специфично связывавшихся в организме с клетками, тканями и органами мишенями являются необходимый этапом а осуществлении направленного транспорта лекарств (Gregoriadis et al., 1977). Весьма привлекительныыи кажутся попытки использования в качество векторов моноклональных антител (ЫоАт) к антиганаи, преимущественно экспроссириванных в органе-шшганм.

Одним из таких антигенов макет быть аыгиотензии-превраца«)1г>ий фермент (АЛ4). Известно, что концентрация АПФ резко увеличена в легких (Cushman and Cheung, 1971). Крона того, AJIÍ расположи на внешней мембрана эпдотелнальнмх клеток сосудов и, следовательно, доступе» дли веществ циркулирующих D кропи (Ryan at al., 1975).

Монаклональные антитела 913V, взаимодействовали не только с АПФ человека и обезьяны, а такке с АЛФ крысы, сирийского хонячка, котки (Табл. 2), что дало возможность проследить супьйу этих антител in yivo.

125

При введении в кроиотск криси ( 1 J-моченых МоАт 9S9 нратми АПФ наблюдается селективная аккумуляция этих антител te легких крысы. Это накопление специфично как лс* отношении к нормальное)' иммуноглобулину, так н по оглоиэнню к другим органам и крови (Рис. 17). Аналогичное селективное накопление МоАт 9В9 отмечено и легких хомячка, кошки. Накопление в легких указанных животных меченых ЫоАт 9В9 резко уменьшалось при введении избытка нояачвнмх МоАт 9В9. Эти результаты доказывают насыщаемость антигене я легких (АПФ), что свидетельствует о специфичности этого процоссо.

п5чао с£лзэг!-ма печки с&ма легкоа иозг

Рис. 17. Распределение [ ,2511-ввчетшя МоАт 9П5 к коитрольгаах

по органам гуиси. Крысам через хвостовуо пену вводили по 1 иг<г (10 иип/мнм1 МоАт 9В9 или контрольных иниупогло-булинов нече:мх Через 4 часа после сведения ука-

занных препаратов крыс забивали и определяли радиоактивность пнутрегап»* органов и крови на гаама-счетчике.

Ми сравнили такие три различных способа введения ' МоАт 9В9 а кровоток крысы: через катетер в бедренной йене, через катетер о бодренной артерии и игольной инъекцией а хеостооуо сену. Клиренс антител из кропи и специфическое накоплении в легких НоАт 9П9 во всех трех случаях практически не различались.

Это означает, что соязыаанпе антител а легких на лоляется артефактом перфузии через венозное русло, при которой перпьм перфузируоиыы органом могут быть легкие, а обеспечивается за счет специфического сродства антител 9В9 к АГ№.

Преимущественное накопление МоЛт 9В9 ииенно в легких может объясняться высокой концентрацией ЛПФ в этой органе (Cushaan and Cheung, 1971) и доступностьо этого антигена для циркулирующих антител. Высокая концентрация ЛПФ в легких, в свои очередь, ыожот объясняться тем, что на дош легких приходится значительная часть площади эндотелиаяькых клеток капилляров тела (Fishaan et al, 1963), на внеаней мембране которых и локализован АПФ (Ryan et al, 1975; Caldwell ot al, 1976a).

({а рисунке П показана кинетика накоплении ИоАт 9В» в легких

крисы и сирийского хомячка и выведения их из крови.

Рис. 18. Кинетмха накоплении ВоАт 90» а легких (Л) н кш«-

ткка выведения ЦоАт мэ крови (В) крысы (1) и хомячка (2).

В хвостовые цены .крыс и, интраорбитально, хомячкам, вводили по 10 ыкг ('"I |-меченных МоАт 9В9 (10 мып/ииц). Хнвотных забивали через указанные промежутки вреиенм м определяли радиоактивность о легких н крови.

Хотя максимальное накопление антител в легких наблюдается- через 1-1,5 часа после их введения, максимальная специфичность^ по отношению к крови достигается только через 24 часа после введения препарата.

Результат этого эксперимента имеет, как нам кажется, весьма важные следствия. Концентрирование в легких какого либо действующего агента коньогироваиного с МоАт 9В9, начнется непосредственно после введения (при условии, что конъюгирование существенно не иэыенкт аффинные свойства препарата).

С другой стороны, визуализацно сосудистого ! русла легких с помощь» радиоактивнонеченннх антител, например, 1***1п}-9В9, при поиощн гамма-сииптиграфим целесообразно проводить через несколько часов после введения препарата, когда специфичность накопления максимальна, поскольку для визуализации снижение фона циркулнрувицих в крови свободных антител более критично, чем достижение больсих абсолютных значений связывания метки в оргзне-мипенн (Begent еЪ а!, 1985).

Учитызая тот факт, что указанный феномен (селективное накопление МоАт 9В9 в легких) может стать основой визуализации гсагкнх при помоги ииыуносцинтиграфни (РапНоу а1, 1989), мы решили сравнить эффектннность и специфичность накопления а легких <рнсы МоАт 909 меченых разными изотопами подходлндони для гамма-гцинтиграфии: 1,25-1}, (1,£1п| и |99аТс).

Результаты показывает, что несмотря па соаераешш различную процедуру мечения, МоАт 9В9, иеченио разными нэотопры» достаточно эффективно накапливается в легких (Шев1зсЬ с1 а1. , 1993). Специфичность и эффективность накопления ЦоАт, мечены» этими изотопами была столь высока, что позволила получат! изображение этого накопления в легких в гаииа-какерэ (Рис. 19).

Рис. 19 Изобравенкэ иамоПи»еина « Ымззъ-ямз ЫоАт SB9,

о гаш-а казаере Изобрахгниа cripaua - контрольное иымунэ-оглобулины; слева - МоАт SB9.

Мы надеемся, чго этот новый подход молот найти применение для оценки сосудистого русла легких при пересадке этого органа", а гкк-<а при различных патологиях легких (например, при респираторной дистресс синдрома). Но ис-.sпечена нозмоаносгь нспольэоиання этого подхода для диагиостнкн саркоидоза. Известно, что при саркоидоэе возникают (и о перпув очередь п легких) гранулемы, эпителиендлыз и гиганскне клетки, которые экспрессиру&т необычайно больыле количества АПФ (Silversteln et al, 1919\.

Поэтому, ыоано било озндлть, что накоплении радиоактивной иетки в легких .больных с саркондозоы будет значительно иное, чем, в

ормя. Таите, кояно было предполагать» то у вольных сархоудакэо» удот резко пмрахенна задержка меченых антител протии

рогко», обусловленная увеличенный колнчветваи антмгена ц«<шо и глубшге ткани. Аналогичный ивхзниэи для визуализации гаухолрй с поягецы» специфичных МоАт уже описан »погний авторами СЬа1а1 е* а1, 1986; !.агзоп, 1985). И, хотя результат пилотных ксперкмеитов бия обратен ожидаемому - накопление радиоактивномач-нмх МоАт 9В9 в легких пациентов с саркоидозоы было значительно гнев выражено, чем в норме - разница в полученном изображении ила столь значительна, что позволяет надеятся на использование того подхода для сцинтиграфии лег-ких.

Ранее» было показано, что ввэдвмие в кровоток кролика к крысы зянклонавьик;» аятител. против АПФ приводит к быстрому развития гека логввя » гибели большей части животных (СаЫ»е11 е1 а1, 976,, 1931-; Всеогга1ск сЬ а®, 1980). Авторы показали, что пвтежа проти» ЛПФ вызывали фиксацию комплемента на адатамальних кгаткэг, который вероятней всего и вызывал щреяяэние- эндотелкальных клеток.

Ню в. одном случае введения крисаы моноклональнчх антител 9В9 !аяо ври введении 100 иг антител на крысу) не происходило :хакнх изменений в поведении и виз носпосоОностн жмнотннх, а при :крцткн г::з из обнаруживали патологических изменений а лвгкю-;. •сутстние попрзждаск^ого эффекта МоАт иожэт быть евнзано с фактом, что ':< 1:: антитела ¡шдуЕ^нрузэт комплемент-зависимого шреждения эндотелия (БапЛоу ек а!., 1988).

Введение МоАт 9В9 при отсутствии повреждающего эффекта, тем не менее, вызывает значительное падение активности ЛПФ в легких, сопровождающееся увеличением активности М1Ф в сыворотке крови крысы. Эффект возрастает при шлптнии дозы и достигает максимума при введения 10 Mr fia кг веса тела. Аналогичны« эффект вызывает ввеяеяие 10 мг UoAt 9В9 на кг веса тела в организм сирийского Ччжмк* (ne показано). Дальнейшее испытание дозы (до 300 мг/кг веса теиа крысы и до 30 мг/кг веса хомячка) не приводит к увеличении эффекта, возможно, из -за насьжцения центров связывания в легком.

Многократное введение МоАт 9В9 в организм крысы в течении трех дней, так же вызывало аналогичный эффект (рис. 20).

го

10

02

01

i г з дни введения

Рис. 20 Эффект многократного ваедеовя МоАт 9119 на активность Ш р гокогенате легких ■ сыворотке крови крысы. Крысам через хвостовую вену вводили 10 ыг/кг/день МоА1 9В9. Через 24 часа после одного, двух- к трехкратногс введения МоАт 9В9 крыс забивали и определял» активность АПФ в гомогенате легких и сыворотке крови флжюрикетрическн.

Учитывал, что в нормальном легком АПФ синтезируется и экс-трессируетсп исключительно на эндотелии сосудов, механизм уменьа-;ння активности АПФ о легких и увеличения в крови после введения 4оЛт 9В9 in vivo был исследован на модели эндотелия сосудов -культуре эндотелиальных клеток.

Следует отметить, что получение длительно живущей, пассируемой, активно функционирующей культурм эндотелия сосудоп человека само ю себе явилось большой трудоемкой задачей, так как на начало работы в Советском Союзе не существовало налаженных методов 1асскрования эндотелиальных клеток сосудов человека, а в мировой литературе имелись только единичные случаи успешного длительного тяссирования этих чрезвычайно капризных клеток (Maciag et al., 1982, Thornton et al.,19ЯЭ).

Мы выделили ряд ростовых факторов и разработали достаточно простой и технологический метод длительного культивирования эндотелиальных клеток сосудов человека (Alliknets, Danilov, 1986, äadovnikova et al., 1991). Эндотелиальные клетки в культуре сохраняли все основные функции и метаболические характеристики (Resink, et al. , 1987, Geling et al. , 1987, Bregestovsky et al. , 1987, Pistsov et al. , 1988, Ryan et al., 1988, Gregorian et al. , 1989, Voino-Vasenetskaya et al. , 1989, Print3eva et al. , Farber et al., 1990, 1992).

Добавления МоАт 9B9 к культуре таких клеток (которые активно жспресснровали АПФ), также зызыэало уменьшение активности АП<9 на лембрапе и увеличение в «уяьтуральной среде (Danilov et al., 1938). По-видимому, ЯоЛт 9В9 могут значительно стимуннропати 'сяуцмвапке* антигена с поверхности эндотелия капнляров mi'Kiot. Исчезнооеттеэ ЛЛФ с поверхности эндотелиальных клеток под

влиянием специфических антител, по-видииому, является еце одн! примером 'антигенной модуляции* (Schreincr et al, 1976). hüäi ?b9 - ш ptisiiwh повреждения сосупов дегкил

Обнаруженный нами факт селективного накоплены» МоАт (¡рог АПФ (9В9) в легких, может стать основой для нового подхода диагностике поражений сосудов легких.

Антиген для WoAt 9В9 - ангиотонзни-превращающий фгрмен' (АПФ) - локализован на поминальной поверхности эндотелия сосуmoi (Ryan et al 197S; Caldwell et al, 1976a). В последнее upoi обнаружено, что при различных легочных заболазаниях активное! ЛИФ в легочной ткани, бронхо-альвеолярной лаиахо и в cuaopOTi кроан может меняться (Hollinger et al, 1980). Как клинически наблюдения, так и' эксперименты на животных позволяет предлолг гать, что поиреждение легочного эндотелия сопровождается сниж< иней активности АПФ в ткани легкого на фоне трамзиторного повш синя в сыворотке (Fourrier et al, 1983; Kelley, 1988; Nuki« et al, 1982; Corin et al, 1981). Все эти данные позволш рассматривать АПФ в качестве маркера повреждения неточно! эндотелия (Fourrier et al, 1983; Hollinger, 1983).

.Учитывая, что а) тканевой легочный АПФ в норме ■локалнэоцг исключительно на поверхности зндотелиальпых клеток; б) активное легочного АПФ меняется при легочной патологии; и) накопление Мо/ <JB9 и легких нормальных животных в 10-20 раз выше, чем и крови I в 30-40 раз выше, чем а других органах (Данилов и др, 1981 Danilov et al, 1989а) им предположили, что аккумуляция в легкш ЫоАт 9В9 может снижаться при повреждении легких и отражат! степень повреадения эндотелия легочных капиляров.

Используя самые разные модели повреждения легких ( введение льфа-нафтилгномочеаины, эндотоксина, форбол ыиристоип йцетата, актора агрегации тромбоцитов, асбестоз, силикоз, пневмония) мы равняли накопление МоАт 9В9, меченых радиоактивным иодом, в егких нормальных и пораженных крыс. Как видно из рис. 21, досле нутривенной иньекцни крысам эндотоксина Е.Coli 0127:В8 а оэе 4 мг/кг наблюдается снижение накопления МоАт .ÖB9 в легАих рыс, при что» распределение антител по другим органам не зменяется (не показано). Аналогичное уменьшение накопления в егких МоАт 9В9 было обнаружено и по всех других исследованных оделях (Muzykantov et al., 1989, Danilov et al., 1990, Muzykantov t al., 1991, Muzykantov, Danilov, 1991)

3

8a ttg

о и

sS Я « Q ti 3 a> Я и ß4

ш M

5 M

15

10

1 у/. ЕЗЗ коитрота

СП эндотоаст1

#

9

S '.'у

•

'С/

/у

V' V//

BE9

Кент lsG

ис. 21. Накоплен«!« ИсАт 9B9 игчеп кггяунагиобу пинов ючетдк» введения тдатоксина,

|UtIn| в

и контрольны« яепоя крис после

5

Таких образом, проведенные эксперименты показывают, что лр исех . исследованных моделях повреждения легких отмечаете статистически достоверное снижение накопления в легких МоАт 9В9 В случае повреждения легких эндотоксином это накопление был наиболее чувствительным 'маркером* повреждения, так как в это модели не изменяется ни весовой коэффициент легких, ни накоплены контрольных иммуноглобулинов, а только изменяется накопление в легких МоАт 9В9.

Причины уменьшения накопления МоАт 9В9 в легких пр повреждении остаются не ясными. Существует несколько аозможны причин, объяспяшцих уменьшение накопления антител 989 в легки при повреждении. Поореждаацкв агенты Могут: I) модифицировать ч молекуле АПФ эпитопы для МоАт 9В9, 2) изгонять синтез М секрицм: АГ1Ф эндотелием легких (Кс11еу с! а1 1987), 3) вызывать гибель 'слущмвание* эндотелий /гегкнх (ЙоШш(ег с! а1, 1980), 4 'прикрывать* АПФ адгезировй1й1ыми к эндотелии лейкоцитами (Вг^еПа с! а1, 1986).

Однако, незаписныо от причин, эти результаты указииаог, что накопление о легких МоАт 9В9 может оказаться очень чувстиителъны 'маркером* повреждения сосудов легких при различных 'легочны патологиях.

МдДт 1В2. нал вектоя для направленного транспорта цсместв а ласи

В настоящее время поли- и моноклинальные антитела шире применяется для приготовления агентов несущих со/юкгнаи токсичность. Мы попытались использовать для этой цели коньпг МоАт 9В9 и фермента глюкозоксидазы. В присутствии глюкозы

¡нсиорада этот фермент генерирует перекись кислорода, которая н |беспечиваот токсический (тумороцидный или бактерицидный) эффект.

Получешшй ноиьюгат сохранял и антнгсн-связывэпцу» и ферментат-1впуо активность и после введения в кровоток эффективно ■акаплнваяся и легких, в противоположность свободному фкрыенту или :оньпга-г]> глжжозооксидаэы с контрольными иммуноглобулинами (Мшу-:ап(оу е^ а^. , 1989, 1991. Такой коныогат может найти применение ^ля создание оксидативкых моделей легочного повреждения. На фимере глокозооксидазы мы показали возможность направленной юставкн различных препаратов а легкие. |

Цесыотря на успешное применение в терапии МоАт коньоги-юванных с лекарствами, ферментами , эти препараты имеют и ряд 1едостаткоа. Необходимо заметить, что не всегда " удается [рисоедииить достаточно больше число молекул лекарственного |репарата к МоЛт, так как это сказывается на способности антитела ■знавать мишень и специфично с ней связываться. В тоже время |еобхг>димость применения определенного числа лекарственных юлокул для достижения терапевтического эффекта в зоне поражения, едет к использование достаточно больших количеств антител. Этот южет стать опасным, если антитело способна вызвать (ежелательный иммунный ответ. Одним из возможных подходов решения той проблемы является использование контейнеров, (включапдио в ебя необходимое лекарство), с иммобилизованными на их юпврхности специфическими антителами.

В качестве контейнера для лекарства удобно использовать нпые клетки, а частности эритроцит. Другим перспективным ¡несовместимым контейнером для лекарств нвлят-ся липосомы (МасЬу Л а1, 1982).

На рис. 22 представлены результаты эксперимента но изучея распределения а организме крысы лиыосом с иымобилыэов&ни! антителами. Видно, что МоАт 9В9 даже после иыиобилизацин липосоиах сохраняют способность к селективной аккуыулицш легких. Аналйг'йчн'ый результат был получен на эритроцита; иыыобш1изопан)&»4и НоАт 9В9.

3

«В

# I

о р 2

2. Ч о>

1

989

] Е205:

1

I

I

Ж

'Ирбвь лёгкяо печень селезенка йотаа сердца

Рйс. 22 'ВкИрИсИрёН&ЗхПШа ЧЫ^ЬсИ&И&С&Ы 'в 'ИргаИмзИо ^¡Юса. 'РаННо ЫктивносУь 'в органах 'и Ыроии !крЦсЦ мзмсрялй чсрей !1 и&с поело 'й^ут'рйиеИййго введений 'радиб&кТипно "меченых липос с нымоб1^И1&дЬЫ|1пьЫй НоАт против ¿¿Л (9В1)) Йли контроль!» ми иммуноглобулина^* (Е^'О^.

Можио надентся, что такой подход может быть услсЕИШы ) создания высокой локальной концетрацин а легких иротииоопухолв! агентов, например, при раке легкого или при метастазах в легкое Особенна перспективным, на нав взгляд, является применен таких лилосои, с гкококортикоищшми гормонами внутри, для лочо| астмы.

В

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

Разработаны методы выделения, и детально охарактеризованы >епараты атиотопэин-нрспращающего фермента из разных органов шовека. Обнаружено, что ЛП4, выделенный из сердца человека,, в гличие от препаратов АЛ* нз других исследованных органов (легких, >чек, печени и ыозга) имеет у|мкальную субстратную специфичность гилролизуег атрнопеитин 2 и его С-конц0оой аналог e-Gly-Ser-Plic-Arg.

Получена панель МоАт (15 клонов гибридом) против АПФ человека, »учена пндопая и эпигопная специфичности полученных МоАт. жазано, что МоАт "узнает" как минимум 7 эпитопоа (антигенных этерминант) принадлежащих к 5 различным антигенным областям >лекулы АПФ. Большинство МоАт (13 из 15) "узнавт" конформаци-шые эпитопы; два антитела - 9В9 и 5F1 реагируют с участками ¡рвичной структуры молекулы АПФ.

Опмтопы для веек исследованныех МоАт, в том числе еще для пяти г CIBA-GEYGI, расположены на анино-терминальном домене (N-домено) 1лекулы АПФ. Пряной RIA с различными поликноналышми антителами ютив АПФ также показывает, что основная масса антител в орг-шзие при иммунизации вырабатывается на Н-домен молекулы АЛФ -е. по-цидныоку , имиукогенность молекулы АПФ определяется глав-■м образом, амино-тернинальним доменом.

Обнаружены 2 МоАт. принадлежащие разным антигенным областям 1*, избирательно блокирующие только один активный центр-в N-энцепоы доыене АПФ. При полном мнгнбировании активного центра «ино-теркипальиого домена (о 100-кратном избытке МоАт) [блюдалось только 50% уменьшение активности натипного АПФ - щ

т. в. впервые доказано, что а молекуне иатишюго Ali'í функцмоннру) оба - N- и С-концевой активные центры. '

5. Икмуно'гистохимическими методам» обнаружены иэоформы АП4> тестикуллрну», а сосудистой сплетении и в клетках Пуркинье.

6. Показана применимость панели ЫоАт для иммуногистохимиче'ск! диагностики сосудистых опухолей, саркоидоза н для выявлен! АПФ в тканях человека.

7. Обнаружено резкое увеличение экспрессии Aflt макрофагами миокарде в пограничной зоне инфаркта и при внезапной сыерти. Это; факт свидетельствует, что активация АЛ# играет существенную роль пост-инфарктном аоспаленин и реорганизации миокарда.

8. Разработаны два варианта и ым Ун бфе^рмен т'н ого определения АП% основанные на ыоноклональных антителах 'к Alllk. Эти вариант позволяют определят активность и концентрацию ш в npHcVVcVa'i ингибиторов ЛЛР.

9. Моноклональиые антитела против АПФ человека ^Уй^) избиратель! накапливается а легких при ввзденим их а кровоток. ЗфФэктцшюсть накопления этих антител в легких - до 40% от введенной позы; спенифичнрсть накопления (концентрация МоАт 9В9 в легких) - о 20 40 раз выше, чем в крови и других тканях.

10. Исследована фарыакокинетика МоАт 9В9, введенных в кровот< различных видов животных (крысы, сирийского хомячка, кошки обезьяны) и изучены количественные параметры накопления эт| антител в легких. Введение МоАт 9В9 в дозе до 300 мг/кг веса i вызывает (в отличие от поликлональных антител) никаких поврежден! легких; правда, при введении насыщающих концентраций МоАт 91 активность АПФ в легких падает на 40-60 а в сыворотке крови

активность All1» достоверно повышается на 50-100 Я (вследствие антигенной! модуляции).

11. МоАт 9В9 сохраняют янтигеи-связыпающие свойства после мечения изотопами i'^, In'", Тс9'", что позволяет получать графическое, изображения накопления МоАт о легких п гамма-камере; коньвгиров-энные с МоАт 9В9 вещества (ферменты, яды) и даже биоконгейнеры (лнпосомм, эритроциты) также селективно накапливаются в легких при их системном оведении.

12. 1|акоплениР MPAj 9Р' в легких существенно снижается при всех

I

иссло/jonariHijx моделям |10нреждоннй легких; в некоторых моделях' jt^fj/jorpKCffH) .Hfjienijo накопление МоАт 9В9 является наиболее '•tyncrpiifeffbi/f^u' маркером повреждения легких.

J3. Рцсркая сцеци^и^ость и эффективность накопления МоАт 9В9 в легких, pfcyrCfnMe выраженных патологических изменений при их введении розволяют предполагать возможность использования этих антитед ^ля: а) визуализации сосудистого русла легких радччрзотопными методами с иомслцьо мммуносцинтмграфии; б) для с^здация модепей и оценки попрежления сосудов легких при различных ^ргочцых jj^jo;im««x; н) и качестве вектора для направленной доставки лекарств к легким.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сахаров И.П., Духанина Е.А., Данилов СМ. Выделение и свойства ангиотензин-превращающего фермента из легких человека. БИОХИМИЯ, 51: 946-951, 1986.

2. Музыкантов В., Сахаров Д., Домогатский С., Гончаров Н., ..Данилов С. , Смирнов В. Защита зндотелиальных. клеток от Цито-

токсического действия перекиси водорода посредством нммуно-эритроцитов. ДОКЛ. АН СССР, 288: 748-751, 1986.

3. Сахаров И. Ю. , Данилов С.Ы., Духанина Е.А. Получение и молекулярно-кинетические свойства ангиотензин-превращающего фермента из сердца человека. БИОХИМИЯ, 51: 1836-1842, 1986.

4. Allikmets E.Yu and Danilov S.U. Hi togcn-induced disorganisation of capiilary-iike structures formed by human large vessel endothelial cells in vitro. TISSUE A CELL 18: 481-489, 1986

5-9.Алликметс E.И., Данилов С.M, Сахаров И.В., Духанина Е.А, Трахт И. Т. , Смирнов В.Н. Штаммы гибридных культивируемых клеток ыыши Низ Dusculus, нспользуеыые для получения моноклональных антител к ангиотензин-превращакнцему ферменту. Авторские свидетельства NN 1308625, 1312097, 1315473 за 1987 г. и 1496266, 1989 г.

10. Сахаров И.О., Данилов С. М. , Духанина Е. А. , Саканделидзе О. Г. Способ получения ангиотензин-проараацаощего фермента. Авторское свидетельство N1389056, 1987.

11. Сахаров H.U., Данилой С.М., Сухова Н.В. Очистка и исследование физико-химических свойств ангиотенэин-превращающего фермента из печени человека. БШШ. ЭКСГ1. БИОЛ. МЕД. 103: 308-310,198/.

12. Данилой С.М. , Алликыетс Е. D. , Сахаров И. Ю. , Духанина Е.А. , Трахт И. Н. Моноклональные антитола против ангиотензин-преврашаощего фермента легких чепоиека. БШЛ. ЭКСЛ. БИОЛ. МЕД. 103: 699-701, 1987.

13. Сахаров 11. К}. , Духанина Е.А. , Данилов' С. И. , Саканделидзе-О. Г.. Исследование некоторых спьйств ангиотепэии-превращающего фермента тюленя. БИОХИМИЯ, 52: 1990-1993, 1987.

14. Сахаров И. , Молокоедов А. , Титов U., Духанина Е., Данилов С., Овчинников И., Бсспалопа X. Гидролиз атриопоптина II (натрий уретического фактора) и его С-концеоого аналога аигиогвизин-прввращавциы ферментом сердца человека. ДОКЛ. All СССР, 297: 12611269, 198?.

15. Sakharov I.Yu. , Danilov S.M. , Dukhanina Е.А. Affinity chromatography and some properties of the angiоtensin-converting enzyme from human heart. BIОСИIM.ВIOPHYS.ACTA,923 : 143-149, 1987.

%

16. Resink Т., Grigoriar» О. , Moldobaeva A. .Danilov S. , Buhler-F.

Hi s t anine-induced phosphоinositide netabolisn in cultured hunan umbilical vein endothelial cells. Association with thromboxane and prostacyclin release, ßIOCHEM.ВIOPIIY5.RES. COMMUN. 144: 438-446, 19Я7.

17. Satharov D.V. , Domogatsky S. P., Danilov S. M. , Muzykantov V. R Protection of cultured endothelial cells fro« hydrogen peroxide-induced injury by antibody-conjugated catalase. BIOCIIIU. BIOPIIYS. ACTA 930: 140-144, 1987.

18. Uuzykantov V. R. , Sakharov D.V., Domogatsky S.P.,Goncharov N.V, Danilov S.U. Directed targeting of immunoerythrocytes provides local protection of huaan endothelial cells from damage by hydrogen peroxide. AM. 1.PATHOL. 128:276-185, 1987

19. Danilov S.M. , Alii bract ч E.Yu., Sakharov I.Yu., Dukhanina E.. Trakht I.N. Monoclonal antibodies to hunan angiotenain-converting enzyme. BIOTECH. APPI.. В10СНЕИ. 9:319-312,' 1987

20. Sakharov I.Yu., Danilov S.M., Sukhova N. Isolation of human liver angiotens in-converting enzyne by ehronatоfocusing. ANALYT. ВIOCIIEM. 1 16:14-17, 1987.

21. Danilov S. M. . Faernan A. I., Printseva 0. Yu. , Martynov A. V. , Sakharov l.Yu., Trakht 1.N. Iunohistocheaica1 study of angiotensin-converting enzyme in human tissues using monoclonal antibodies. HISTOCHEMISTRY 87:487-490, 1987.

22. Reling N.. Moldobaeva A., Martynov A.V., Jarving I., Vahenets A., Allikaeta E.Yu., Danilov S.U., Orekhov A.N. Is prostacyclin a major prostaglandin produced by endothelial cells in culture? FOLIA BIOLOOICA 33:335-141, 1987.

23. Данилов С., Музыкантов В. , Мартынов А. , Сахаров Ы., АтОчина Е. , Молдобаева А. , Духанина Е. , Литвин 4>. Специфическое накопление коноклональных антител против ангнотонзни-препращаогцего фермента в легких крысы. ДОКЛ. АН СССР, -301: 1003-1007, 1988.

24. Bregestovsky P.D., Bakhraraov A., Danilov S.M., Moldobaeva Л.Б. Takeda К. Histamine induced invard currents in cultured endothelial cells fron hunan unbilical vein. BR.J.PHARMACOL. 95:429-436, 1988.

25. Muzykantov V.R., Sakharov 0.V., Sinitsyn V., Donogatsky S.P., Goncharov N.V. , Danilov S.M. Specific killing of human endothelial cell by antihod у-conjugated glucose oxidase. ANAL.BIOCHEW. 169:383-389, 1988.

26. Piatsov U,Гц., Sadovnikova E.Yu., Danilov S.M. Hunan corneal endothelial cells: isolation, characterisation, and long-terra cultivation. EXP. EYE RES. 47:403-414, 1988.

n. Ryan U.S. Avdonin P., Posin E.,Popov E., Danilov S.U., Tkachuk V.A. Influence of vasoactive agents on cytoplasnic free calcium concentration in Endo-I loaded vascular endothelial cells. J. APPL.PHYSIOL. 65:22 21-22 27, 1988.

28. Trube tskfciya 0., Trubetskoy V. , Domogatsky S.P., Rudin A., Popov N.. Danilov S.U., Nikolaeva U., Klibanov A. L. , Torchi I in V.P. Monoclonal antibody to human endothelial cell surface: internalisation and liposono delivery in eel1 culture. FEBS LETT. 228:131-134, 1988.

29. Sakharov I.Yu., Molokoedov A., Dukhanina E.A., Danilov S.U., Ovchinnikov U. , Titov M. , Uespalova J. Atriopeptin 2 is hydrol-ized by cardiac, but not pulmonary angiotensin-converting enzyme. BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. 151: 109-113, 1988.

30. Klibanov A.L., Martynov A. V. , Slinkin U.A., Sakharov I.Yu. , Snirnov U.D., Muzykantov V.R.," Danilov S. M. , Torchi 1 in V. P. Blood clearance of radiolabeled antibody enchancement by lactosanination, treatment with biotin-avid in or ariti-nouse IgG antibodies. J.NUCL.MED., 29:1251-1256, 1988.

31. Danilov S.U., Sakharov I.Yu., Martynov A, V. , Faeraa n A.I.", Muzykantov V.R.,, Klibanov A. L. , Trakht I.N. Monoclonal antibody to angiotens in - converting-enzyme: a powerful tool for lung and vessel studies. J . MOLEC. CELL CARDIOL. 21:suppl.1, 165-170, 1989.

32. Grigorian G.Yu., Mirzapoyazova T., Resink T.J., Danilov S.U., Tkachuk V.A. Regulation of Phosphoinositide turnover in huaan pulmonary artery, aorta and umbilical vein. Antagonistic action on the beta-reccptor coupled adenylate cyclasc ayatcn. J. MOLEC. CELL CARDIOL. 21: suppl. I, 1 19-123, 1989.

33. Voino-Yasene tskaya T.A., Grigorian O.Yu.. Danilov S.U., Resink T.J., Tkachuk V.A., Repin V.S. Synergistic potentiation of polyinositide breakdown by adenylate cyclase coupled receptors In human endothelial ceils. J. MOLEC. CELL CARDIOL. 21: suppl. I, 145149, 1989.

34. Printseva O.Yu., Peclo U.M., Tijru'in A.V., Paeraan A. I.. Danilov S.M., Repin V.S., Smirnov V.N. A 90-kd Surface antigen iron a subpopulation of smooth muscle cells iroo human athcros-clcrotic lesions.AM.J.PATHOL.134:305-313, 1989.

35. Muzykantov V.R., Martynov A. V. , Puchnina E. A. , Danilov S. M. In vivo administration of glucose oxidase conjugated with monoclonal antibody to human angiotens in-converting enzyae: the tissue distribution, blood clearance and targeting to the rat Jung. AM.REV.RESP. DlS.136:1464-1473, 1989.

36. Muzykantov V.R., Puchnina B. A. , Atochina E. N. , Sakharoy I.Vu Danilov S.M. Evaluation of the lung aicrovascu1 ar status using rati i o label 1 cd monoclonal antibody to angiotensin-converting enzyae. in: "Advances in vascular pathology*. (A.Strano, S.Novo, Eds.) Elsevier Sei. Publ. , 1989, 1195-1200

37. Danilov S.M. , Martynov A.V., Klibanov A.L. , Slinkin H.A., Sakharov I.Yu., Malov A.G., Sergicnko V.B., Vedernikov A.Yu. Muzykantov V.R., Torchilin V.P. Radioimunoiaaging of.lung vessels: an approach using 111-In-labe led Monoclonal antibody to angiotensin-converting enzyae. J.NUCL.MED. 30:1688-1692, 1989.

38. Torchilin V.P., Klibanov A. L., Slinkin M.A. , Danilov S.U., Levitsky D.O., Kha» B.A. Antibody-1 inked chelating polymers for irutauno imaging in vivo. S. COhfTROL. RELEASE It: 297-303, 1989.

39. Sadovnikova E.Yu., Martynov A. V. , Danilov S.M. Long-tern aerial cultivation of hunan vascular endothelial cells. BIOMED.SCI. 1:199-20S, 1990. >

40. Farber H.W., Center D.M., Rounds S., Danilov S.M. Components of the angiotensin systen cause release of neutrophil cheaoattractant froo cultured bovino and hunan endothelial cells. EUR.HEART J. ll(Suppl. B):100-107, 1990.

41. Danilov S.M., Muzykantov V.R. Monoclonal antibody to angiotensin-converting enzyme: development of a net approach for the investigation of lung vessel injury. In: VFidimaky J. He'rget J. (eds.): Pulmonary Blood Vessels in Lung Disease.

PROG. RESPIR. RES. Basel, Karger,26:8S-93,1990.

42. Stevens J., Danilov S. , Fanburg B. L. , Lanzillo J.J. A sensitive two-site sandwich enzyae innunoassay for human angiotensin-converting enzyae utilizing monoclonal antibodies. J. IMMUNOL. METll. 132:263-273, 1990.

43. Muzykantov V. , Puchnina E. , Atochina E. , Slinkin M. Ilienish II., Meertsuk F., Danilov S. Endotoxin reduces specific pulaonary uptake of radiolabeled monoclonal antibody to angiotensin-converting enzyae. J.NUCL. MED. 32:453-460, 1991

44. Danilov S.U., Muzykantov V.R., Martynov A.V. , Atochina E.N. , Sakharov I.Yu., Trakht I.M., Sairnov V. H. Lung is the target organ for a nonoclonal antibody to angiotensin-converting enzyae. LAB.INVEST. 64:118-124, 1991.

45. Muzykantov V.R., Danilov S.M. New Approaches to investigations of oxidative injury to the pulnonary endothelium: a olni-review. BIOMED.SCI. II: 11-22, 1991.

■!6. Muzykantov V.R., Danilov S.U. Glucose oxidase conjugated with anti-endothelial monoclonal antibodies; in vitro and in vivo studies. INT.J.RADIAT.BIOL. 60: 11-15, 1991

47. Färber ll.W. , Kozlova U. , Moldobaeva A. , Charles A. , Danilov SM. Production of ncutrophil-specific lipid chcmoattractant activity by cultured endothelial cells ; heterogeneity dependent on species, I ieand or endothelial cell site of origin. TISSUE & CELL 24: 355-366, 1992

48. Atochina E. N. , liieiaisch II., Uuzykantov V.R., Danilov S.U. Systecic administration of Platelet-Activating Factor in rat Reduces Specific Fuliionary Uptake of Circulating Monoclonal antibody to angiotenain-convertina enzyme. LUNG 170: 349-358, 1992

49. lliemisch Ii., Gavrilyuk. V., Atochina E., Slinfcin U. . Torcliiiin V., Uujykantov V., Danilov S. Purification of radiolabeled aouoclonal antibodies to angiotensin-converting enzyme significantly iaproves specificity and efficacy of its targeting into the lung. NUCL.MED. BIOL. 20: 435-441, 1 993.

50. Danilov S., Churakova T. Savoie F., Jaspard E., Corvol P., Alhenc-Gelas F. Structure-functions analysis of angiotensin-converting enzytae using conoclonal antibodies.

J.DIOL.CHEW. 1994