Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Структурно-функциональные особенности микросателлитных повторов как фактор генетической нестабильности

иил]5В829

На правах рукописи

Гасанова Виктория Кабилановна

Структурно-функциональные особенности микросателлитных повторов как фактор генетической нестабильности

(14.00.14 - онкология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

МОСКВА 2007

003056829

Работа выполнена в НИИ канцерогенеза Государственного Учреждения Российского .онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина Российской Академии медицинских наук.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, Якубовская Марианна Геннадиевна;

доктор биологических наук, Попснко Владимир Иванович

Официальные оппоненты: доктор медицинских паук,

Штиль Александр Альбертович

доктор физико-математических наук, Лнфшин Михаил Аронович

Ведущая организация: ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, кафедра молекулярной

биологии и медицинской биотехнологии

Защита диссертации состоится "¿-О '' &1 _2007 г.

в 10.00 часов на заседании Диссертационного совета (К.001.017.01) при ГУ Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (Москва, 115478, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН Автореферат разослан ■75 " ^иСьрТСк. 2007 г.

Ученый секретарь Диссретационного Совета ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В основе онкологического заболевания лежат изменения генома клетки, представленные „генетическими и эпигенетическими нарушениями. Среди различных механизмов репарации повреждений ДНК особую роль в канцерогенезе играет соматическая гомологичная рекомбинация (СГР), которая инициируется при наличии двунитевых разрывов ДНК. Ее биологический смысл заключается в восстановлении поврежденной структуры локуса хромосомной ДНК за счет взаимодействия с интактным локусом, расположенным на гомологичной хромосоме. При этом'в случае гетерозиготности аллелей по данному локусу происходит частичная потеря генетической информации в результате перехода аллелей в гомозиготное состояние. Если в исходной клетке один из аллелей гена-супрессора опухолевого роста является нормальным, а другой - мутантным, то СГР может привести к потере нормального аллеля и фенотипическому проявлению мутантного гена-супрессора опухолевого роста Это и объясняет важную роль СГР в многостадийном канцерогенезе.

Многочисленные данные свидетельствуют о неравномерном распределении по геному рекомбинационных событий, вероятность каждого из которых во многом зависит от локальной структуры ДНК в хромосоме. В ряде -исследований были выявлены «горячие» точки рекомбинации, представленные микросателлитными повторами ДНК, и в частности, СА/ТС-повторами. Так, было показано, что наличие повторов приводит к увеличению частоты рекомбинации в трансфецированной ДНК в культуре клеток млекопитающих, в хромосомах дрожжей, а также к стимуляции внутриплазмидной рекомбинации у бактерий. Кроме того, существуют данные, указывающие на возможную роль СА-повторов в промотировании хромосомных транслокаций, возникающих при различных типах лимфоидных опухолей человека. Однако молекулярные механизмы влияния микросателлитных повторов на рекомбинацию не исследованы. Одним из возможных объяснений служит способность микросателлитных повторов к формированию в результате внутри- и межмолекулярных взаимодействий неканонических структур ДНК, влияющих на инициацию и (или) терминацию гомологичной рекомбинации. В соответствии с этим изучение особенностей структуры ДНК в области СА-повторов, наиболее широко распространенных в геноме млекопитающих, включая человека, является актуальным для современной молекулярной онкологии, и в частности, для понимания механизмов генетических перестроек, ведущих к возникновению опухолевых клеток.

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучение структурно-функциональных особенностей микросателлитных повторов. Соответственно,

конкретными задачами исследования являлись следующие: 1) изучение роли СА-повторов в ДНК-ДНК-взаимодействии гомологичных линейных дуплексов ДНК с образованием структур Холлидея, являющихся одним из промежуточных соединений гомологичной рекомбинации; 2) анализ структурных особенностей ДНК в дуплексах, содержащих СА-повторы; 3) изучение взаимодействия дуплексов с одноцепочечными олигонуклеотидами, аналогичного ДНК-ДНК-взаимодействию на стадии инициации гомологичной рекомбинации, а именно: инвазии одноцепочного конца ДНК в гомологичный дуплекс; 4) изучение особенностей встраивания олигонуклеотидов в дуплексы, содержащие СА-повторы.

Научная новизна. Для изучения структурных особенностей ДНК в области микросателлитных повторов, а также их роли в процессе гомологичной рекомбинации необходимо моделирование различных стадий данного процесса. В связи с этим одной из удобных систем in vitro является модель структуры Холлидея, представляющей собой одно из промежуточных соединений гомологичной рекомбинации. В предыдущих исследованиях лаборатории методов скрининга канцерогенов была продемонстрирована способность природных гомологичных двухцепочечных ДНК к спонтанному взаимодействию" с образованием, структур Холлидея без участия белков. Полученная модельная система раскрыла новые возможности для изучения функциональных свойств повторов ДНК, а также влияния микроокружения на ДНК-ДНК-взаимодействие фрагментов, содержащих повторяющуюся последовательность. В представленной работе впервые исследованы и выявлены структурно-функциональные особенности СА-повторов на модели структуры Холлидея, образованной гомологичными линейными дуплексами ДНК. Так, с помощью электронной микроскопии ДНК показано влияние СА-повторов на положение точки перекреста в структурах Холлидея. Кроме того, впервые in vitro продемонстрирован феномен инвазии одноцепочечной ДНК случайной последовательности в комплементарные концевые участки линейных дуплексов с образованием трехцепочечного комплекса, аналогичного D-петле, образующейся in vivo на стадии инициации гомологичной рекомбинации. Также продемонстрированы особенности инвазии одноцепочечной ДНК в дуплексы, содержащие СА-повторы.

Научно-практическая значимость исследования. Одной из характерных • особенностей опухолевых клеток является нестабильность генома, представленная ' многочисленными соматическими изменениями генов, прогрессивно нарастающими в процессе опухолевого роста. Некоторые изменения, ассоциированные с трансформацией клеток или приобретением ими злокачественного потенциала, появляются на ранних этапах опухолевого роста и могут служить основой для создания диагностических тестов. В связи с этим в современной онкологии для выявления определенных типов генетических нарушений в опухолях используются микросателлитные повторы ДНК, и в частности СА-повторы, с высокой частотой распределенные в геноме человека.

При проведении микросателлитного анализа ДНК опухолевых клеток выявляют два типа генетических нарушений: потерю гетерозиготности полиморфных аллелей хромосомных локусов, приводящую к изменению функционирования генов данного локуса в результате делеции или их перехода в гомозиготное состояние, и микросателлитную нестабильность, связанную с мутациями в пределах повторяющейся последовательности ДНК. Потеря гетерозиготности хромосомных локусов с высокой частотой встречается при раке легкого, желудка, молочной железы и в ряде случаев является маркером малигнизации, метастазирования и других составляющих неблагоприятного прогноза развития рака. Повреждения микросателлитных повторов были обнаружены в интронных областях генов, участвующих в репарации ДНК и контроле клеточного цикла. Для ряда генов было показано, что микросателлитная нестабильность в них приводит к нарушению транскрипции или сплайсинга м-РНК. Однако, несмотря на важную роль обоих типов генетических нарушений в канцерогенезе, механизмы, приводящие к возникновению этих нарушений, мало изучены.

Исследования механизмов потери гетерозиготности хромосомных локусов в эукариотических клетках свидетельствуют о важной роли в данном процессе соматической гомологичной рекомбинации. С другой стороны, в ряде работ была' обнаружена стимуляция гомологичной рекомбинации микросателлитными повторами ДНК, в частности, СА-повторами, в системах in vitro и in vivo. Таким образом, изучение механизмов регуляции рекомбинации микросателлитными повторами является важным для понимания причин, приводящих к генетической нестабильности в опухолевой клетке.

В представленной работе исследованы структурно-функциональные особенности СА-повторов, получены новые данные об их влиянии на процесс миграции ветвей в структуре Холлидея, образующейся in vivo в процессе гомологичной рекомбинации, выявлены новые закономерности в ДНК-ДНК-взаимодействии как случайных, так и повторяющихся последовательностей ДНК. Полученные данные важны для понимания молекулярных механизмов рекомбинации и закономерностей возникновения генетических перестроек.

Апробация работы состоялась 20 декабря 2006 г. на совместной научной конференции лабораторий методов скрининга канцерогенов, механизмов гибели опухолевых клеток, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, молекулярной биологии вирусов, иммунологии онкогенных вирусов, вирусного канцерогенеза, биохимии опухолей, генетики опухолевых клеток, канцерогенных веществ НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, а также группы электронной микроскопии Института Молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН. Основные положения диссертации обсуждались на конференциях лаборатории методов скрининга канцерогенов и Ученом совете НИИ Канцерогенеза, представлены на 2 устных и 8 стендовых докладах на научных конференциях. По результатам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (№ 03-04-48979а, грант МАС-2003

№ 03-04-06829, № 0б-04-49204а).

Объём работы. Диссертация содержит 139 страниц машинописного текста, состоит из

введения, обзора литературы, описания использованных в работе материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. В работе содержится 4 таблицы, 45 рисунков. Указатель литературы содержит 206 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Литературный обзор

Литературный обзор состоит из двух разделов. Первый раздел посвящен роли соматической гомологичной рекомбинации (СГР) в канцерогенезе с описанием моделей канцерогенеза, в основе которых лежат генетические и эпигенетические повреждения клеток, а также различных факторов, влияющих на скорость мутационного процесса по определенному сайту ДНК, среди которых особое внимание уделено системам репарации двунитевых разрывов ДНК, в частности, механизмам СГР, приводящей при определенных условиях к потере гетерозиготности по различным генам, в том числе супрессорам опухолевого роста, и генетическим перестройкам. Во втором разделе представлены данные о микросателлитных повторах, являющихся «горячими» точками рекомбинации, как то: общая характеристика и распространенность в геномах различных организмов, микросателлитный анализ в клинической онкологии, участие повторов в организации генома и регуляции клеточных процессов, в частности, гомологичной рекомбинации, и наконец, описана модель структур Холлидея, образующихся в процессе гомологичной рекомбинации, для изучения характеристик данного процесса.

2. Материалы и методы

В работе использовалась плазмида рЕЮ, содержащая вставку из (CA/TG)3i-повторов, любезно предоставленная проф. Ф. Строссом (F. Strauss, Université Pierre & Marie Curie, Paris, France), плазмида pCMV, любезно предоставленная проф., д.м.н. П.М. Чумаковым (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН) с клонированной кДНК генар53 дикого типа.

В работе использованы следующие методы: полимеразная цепная реакция; трансформация бактериальных клеток; выделение плазмид; обработка плазмид с помощью эндонуклеаз рестрикции; электрофорез ДНК в агарозном геле; полиакриламидном геле в нативных и денатурирующих условиях; визуализация ДНК в геле с помощью окрашивания бромистым этидием, SYBR GOLD и азотнокислым

серебром; выделение и очистка ДНК из агарозного геля с помощью матрикса на основе мелкодисперсной двуокиси кремния, электроэлюции; выделение и очистка ДНК из полиакриламидного геля; мечение 5'-концов олигонуклеотидов радиоактивным фосфором с помощью полинуклеотид-киназы фага Т4; перенос ДНК из агарозного геля на мембрану НуЬогк! М+; высушивание полиакриламидного геля; авторадиография; реакция формирования гетеродуплексов; химическое расщепление неканонических пар нуклеотидов с помощью последовательной обработки ДНК перманганатом калия и пиперидином; статистическая обработка данных с вычислением среднего значения и доверительного интервала.

3. Результаты н обсуждение

Одной из причин генетической нестабильности опухолевых клеток является репарация двунитевых разрывов ДНК путем СГР, приводящей к потере гетерозиготности по генам-супрессорам опухолевого роста. В настоящее время были получены данные о существовании в хромосомах «горячих» точек СГР, среди которых особый интерес представляют микросателлитные повторы, и в частности, СА-повторы. Однако молекулярные механизмы их участия в рекомбинации не известны. В данной работе изучались структурно-функциональные особенности СА-повторов, которые могут влиять на образование и(или) разрешение промежуточных структур гомологичной рекомбинации, содержащих более 2-х комплементарных нитей

3.1. Особенности взаимодействия гомологичных линейных дуплексов ДНК, содержащих СА/Тв-повторы, с образованием структур Холлидеи

Одним из промежуточных структур рекомбинации является четырехцепочечная структура Холлидея. В предыдущих исследованиях нашей лаборатории было продемонстрировано образование структур Холлидея в растворе гомологичных линейных дуплексов ДНК со случайной последовательностью нуклеотидов (Якубовская М.Г. и соавт., 1999, УакиЬоУБкауа Й а1., 2001). В данной работе с помощью полученной модели были исследованы особенности ДНК-ДНК-взаимодействия линейных гомологичных фрагментов, содержащих СА/ТС-повторы, с образованием четырехцепочечных структур, а также влияние СА/ТС-повторов на образование и разрешение структур Холлидея. Очищенные дуплексы ДНК длиной 166, 464 и 1129 п.о. были получены в ходе ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиды рЕЮ, содержащей (САЛЧЗ)з1 -повторы. При проведении электрофореза ДНК в агарозном геле наблюдалась картина, аналогичная полученной для фрагментов со случайной последовательностью: наряду с основной полосой, соответствующей двухцепочечному фрагменту, была видна дополнительная

полоса удвоенной молекулярной массы (рис 1). Кроме того, данное взаимодействие было также продемонстрировано для очищенного фрагмента плазмшщой ДНК длиной 835 и.о.. полученного в результате рестрикции плазмиды рЕЮ с помощью Рг:«!1 и Я$а\ (рис. I).

Ранее был проанализирован механизм и закономерности образования четырехиепочечпых структур гомологичными фрагментами со случайной последователь-

Рисунок 1. Взаимодействие гомологичных линейных дуплексов содержащие (САТСЬгЛонгоры.

М1 - маркер моле^лярной массы р8Н322/В5(Ж1. М2 - маркер молекулярной массы МЗгНЕИ; 1-3 - очищенные продукты ПЦР; 1 - длиной 166 п.о.; 2 - длиной 1129 по; 3 - длиной 464 п.о. 4 - очищенный фрагмент плазм ид ной ДНК pE'^OfPvu^\,Rsзl длиной 835 г,о. - двунитевые структуры :',1о'.о1е ;. - четырехнитевые структуры

агагк)есГ).

я Остью. Было показано, что взаимодействие фрагментов ДНК происходит за счет ассоциации концевых участков двух дуплексов с образованием структуры Холлидея. миграция ветвей к которой приводит к ее разрешению в новые или исходные дуплексы (рис.2) (НекЪаЙПОУа М аЦ, 2002, Маркина и соавт, 2002). В данной работе для выяснения

Рисунок 2, Схема спонтанного взаимодействия гомологичных линейных дуплексов ДНК с образованием структур Холлищея. 1 - постоянный процесс диссоциации-ассоциации концевых пар оснований дуплексов в раствор; 2 - взаимодействие диссоциированных пар оснований двух гомологичных фрагментов; 3 - миграция ветвей в образовавшейся структуре Холлидея; 4 — разрешение структуры Холлидея в новые дуплексы.

роли ко i тс u i,i х участков дуплексов г> ДН К-ДНК - взанмодей ств и и гомологичных фрагментов, содержащих CA-повторы во внутренних районах, был проведен аналогичный эксперимент с использованием двух типов очищенных продуктов ПЦР длиной 166 п о., содержащих (С A/TG)j[-повторы. Для амплификации одного типа фрагментов использовались праймеры, содержащие АТ-богатые области на 3 "-концах, а для амплификации другого - праймеры с рС-богатыми областями. Выло показано, что у фрагментов с AT-концами количество четырехцепочечных комплексов бгтыпе, чем у фрагментов с GC-концами (рис.3). Это означает, что/ЕНК-ДНК-взаимодействне линейных фрагментов, содержащих СА-повтори, происходи, как и в случае фрагментов со случайной последовательностью, за счет ассоциации концевых участков дуплексов.

Кроме того в нашей работе был изучен суммарный эффект влияния температу ры на концентрацию четырехцепочечных комплексов в растворах гомологичных фрагментов,

М 1 2 3 4 5 6

Рисунок 3. Влияние последовательности концевых участков дуплексов и температуры инкубации растворов на образование четырехцепочечных структур фрагментами, содержащими [САЯСЬ,-повторы. М - маркер молекулярной массы; 1, 3, 5 - очищенные продукты ПЦР с АТ-бсгатыми концевыми участками, инкубированные соответственно при 1 С~С 37°С и 55°С: 2, 4. 6 - очищенные продукты ПЦР с йС-богатыми концевыми участками, инкубированные соответственно при 10°С, 37°С и 55"С. Инкубация проводилась в течение 1 суток.

содержащих СА-повторы. Было показано, что концентрация структур Холл идея в растворах фрагментов с АТ-концами снижается с увеличением температуры инкубации растворов (рис.3). Поскольку плавление концевых пар А/Т происходит при температуре около 26°С (Т">ок1усг е1 а1., 1995), то. по-видимому, на концентрации структур Холл идея при снижении температуры должна сказываться продолжительность их существования в растворе, то есть скорость их разрешения путем миграции ветвей.

Было также интересно выяснить, будут ли взаимодействовать внутренними участками фрагменты Д11К, имеющие гомологию в районе СА-иовторов, но несущих различные концевые последовательности. Для этого были амиллфицироваиы и очищены два типа фрагментов плазмиды рЕ 10 длиной 1129 и 453 п.о (рис 4. А) Если бы ДНК-

ДНК-взаимодействие происходило путем ассоциации внутренних районов дуплексов, то совместная инкубация двух типов дуплексов привела бы к появлению «гибридных» структур ДНК с молекулярной массой, отличной от молекулярных масс дуплексов и структур Холлидея, й бракованных одним типом фрагментов, Было продемонстрировано

Рисунок 4. А. Схема возможного взаимодействий дуплексов с не гомологичным и концам«. Б. Агарозный гель-электрофорез дуплексов с негомологичными концами. !*Л' .-, М2 - маркеры молекулярной массы, 1 ■( очищенный продукт ПЦР длиной 1129 п о , инкубированный при 37°С (1) или подвергнутый РФГ '4; 2, 5 - очищенный продукт ПЦР длиной 464 п.о , инкубированный при 37°С (2) или подвергнутый РФГ (5); 3, 6 - смесь двух продуктов ПЦР, инкубированная при 37 °С (3) или подвергнутая РФ Г (6).

отсу тствие взаимодействия дуплексов с негомологичными концами при 37'С (рис.4, Б). Однако было обнаружено образование относительно Стабильных «гибридных» четырехце лочечных структур а результате реакции формирования гстеродуплексов (РФГ), в ходе которой происходит нагревание растворов ДНК до 95°С с последующим медленным охлаждением до 25"С (рис.4. Б), Выявленное отличие свидетельствует о существовании структурных особенностей ДНК в области повторов, способствующих стабилизации «гибридного» комплекса.

Для подтверждения предположения о том, что четырех цепочечные комплексы ДНК, образованные дуплексами с С Л-но вторам и, представляют собой структуры Холлидея, была проведена электронная микроскопия этих комплексов. Для этого проводился электрофорез очищенных продуктов ПЦР длиной 1129 п.о., содержащих (СЛ/ТОз, -повторы, в агарпзяом геле с последующей экстракцией ДНК из полос, соответствующих двухцепочечным и четырех цепочечным фрагментам. Выло показано, что во фракции ДНК, экстрагированной из полосы дуплексов, наблюдались преимущественно линейные фрагменты (рис.5). Во фракции ДНК, полученной из полосы, соответствующей удвоенной молекулярной массе дуплекса, наблюдалось множество

Рисунок 5. Электронная микроскопия структур Холлидея, образованных фрагментами, содержащими (С A/TGJj,-повтор. I - группа структур Холлидея с локализацией точки перекреста ветвей в области 1-180 п о. II - группа структур Холлидея с локализацией точки перекреста ветвей в области 180-370 п.о. Ill — группа структур Холлидея с локализацией точки перекреста ветвей а области 370-560 п.о.

симметричных х-спруктур с различной локализацией точки перекреста. Кроме того, был провешен сравнительный анализ точек перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных фрагментами, как содержащими, так и не содержащими С А-по вторы. Для этого были получены два типа продуктов П1ДР: фрагменты плазмиды pUC 19 длиной 1430 п.о. и фрагменты плазмиды plilO длиной ! 129 и.о., отличающиеся от первых присутствием вставки из (CA/TG)3i -повторов, окруженных случайной последовательностью. При проведении электронно-микроскопического анализа структуры Холлидея были визуально разделены на 3 группы по локализации точки перекреста. При этом учаСТОК повторов, локализованный в районе 272-333 п.о., принадлежал ко второй группе. Большая часть структур Холлидея, образованных фрагментами со случайной последовательностью, имела точку перекреста вблизи концевых участков дуплексов, в то время как для фрагментов, содержащих СА-повторы, основная масса структур Холлидея имела точку перекреста в области СА-повторов (табл.1).

Таблица 1. Анализ популяции структур Холлидея, образованных фрагментами, содержащими и не содержащими (СА/ТС)31-повторы.

Популяция структур Холлидея Фрагменты, содержащие (CA/TG)3r повторы Фрагменты, не содержащие повторы

1 - структуры Холлидея с локализацией точки перекреста ветвей в области 1-180 п.о. 35,04% ± 3,89 46,03% ± 9,61

II - структуры Холлидея с локализацией точки перекреста ветвей в области 180-370 п.о. 56,70% ± 4,41 38,09% ± 2,56

Ill - структуры Холлидея с локализацией точки перекреста ветвей в области 370-560 п.о. 8,28% ± 1,20 15,87% ± 2,72

Таким образом, можно предположить, что роль СА-повторов в качестве «горячих» точек рекомбинации может быть обусловлена торможением миграции ветвей структуры Холлидея в районе повторов с последующим ее разрешением в данной области с помощью соответствующих белков рекомбинации.

3,2. Структурные особенности ДНК в дуплексах, содержащих СА/ТС-повторы, полученных в результате ПЦР.

Одной из возможных причин торможения миграции ветвей структуры Холлидея в области СА-повторов могут являться структурные особенности ДНК этой последовательности. Для того чтобы выявить эти отличия, был проведен анализ очищенного продукта ПЦР длиной 166 п.о., содержащего (СА/ТС)з1-повторы, с помощью электрофореза ДНК в полиакриламидном геле, так как в нем фрагменты ДНК разделяются не только по размеру, но и в зависимости от нуклеотидного состава и структуры ДНК. В ходе эксперимента наряду с полосой ДНК длиной 166 п.о. была обнаружена дополнительная полоса приблизительно равной интенсивности длиной 186 п.о. (рис.6). Кроме того, на геле присутствовали еще три дополнительных минорных полосы длиной 242, 264 и 332 п.о. Последняя полоса соответствовала удвоенному размеру двунитевого продукта ПЦР длиной 166 п.о. и, по-видимому, представляла собой четырехцепочечные структуры ДНК. Для выяснения природы остальных полос ДНК была выделена из

Рисунок : А, Агарозный гель-электрофорез очищенного продукта ПЦР длимой 166 п.о. М1 - маркер молекулярной массы рВК322/б5(/Р:1 Б. ПААГ-электрофорез очищенного продукта ПЦР длиной 166 п.о. М2 - маркер молекулярной массы риС19/Мгр1. В. Агарозный гель-электрофорез фрагментов ДНК. очищенных из полиакриламидного геля (рис.6, Б) и соответствующих в нем по размеру 166 (1), 186 (2). 242 (3) и 264 (4)л.о. МЗ ■ маркер молекулярной массы МймЯИ.

по лнакрилйындного геля и очищена с последующим проведением электрофореза в агарозном геле (рис б. В). Было показано, что все четыре фрагмента ДНК имели в агарозном геле подвижность, соответствующую 166 и.о. Было предположено существование ошибок репликации в районе повторов при проведении ПЦР. Однако использование ДНК, очищенной из этих полос в качестве матриц для Г1ЦР-амилификацни

М 1 234567В

П.О.

3311

242' 1001 147 4

те

л!

1 >

'^Ьи

Ыу »' ■*-.-}

;

га ^

Рисунок 7. Амплификация с помощью ПЦР фрагментов ДНК, очищенных из полос, ооотвестеующих 166 и 186 п.о (см рис 6 Б). М - маркер молекулярной массы риС19/№р[; 1 - фрагмент ДНК, очищенный из полосы, соответствующей 166 п.о.; 8 - фрагмент ДНК, очищенный из полосы, соответствующей 186 п.о.; 2 -ПЦР двунитевого фрагмента 1; 3 -ассиметричная ПЦР ТО-содержащей нити фрагмента 1; 4 - ассиметричная ■ ПЦР СА-содержащей нити фрагмента 1; 5 - ассиметричная ПЦР СА-содержащей нити фрагмента 6; 6 - ассиметричная ПЦР ТС-содержащей нити фрагмента 8: 7 - ПЦР двунитевого фрагмента 8.

снова приводило к появлению полос и 166 и 186 и.о. приблизительно равной интенсивности (рис 7). Кроме тога, был проведен рестри кционны Й анализ дуплексов ДНК к 166 н 186 п.о. Очищенные фрагменты были обработаны рестриктазамн Зта1 и !Нп]\, делающими разрыв в ДНК левее начала повтора на расстоянии 26 и 13 п.о. соответственно. Это не приводило к устранению различий в подвижности фрагментов В

то же время обработка дуплексов с помощью рестрнктазы Ват\\\, делающей разрыв в ДНК па расстоянии 5 и.о. от начала повтора приводила к выравниванию подвижности дуплексов (рис.8. А, К}. С помощью электрофореза ДНК в денатурирующих условиях не было выявлено различий в подвижности одноиитевых фрагментов, полученных после обработки каждой то рсстриктаз (рис,8, В). Было предположено, что ДНК длиной 186 п.о., имеет последователь вдеть, гомологичную последовательности дуплекса длиной 166 п.о.,

А.

S/Tjal ^ BamH]

5<саЬ. fir

Б.

М( 1 2

п.о. i

Sí

242 ^

166 и.о.

3 4 5 6 7 8

190 110

67

в.

п.о.

1S4

124 104

Мг 1 г 3 л 5 6 7 8

В i И ш Щ ' % !

S-

«1=!

Рисунок 8. А. Рестрикционная карта продукта ПЦР длиной 166 п.о., содержащего (CA/TGbi-повторы. Рестрикционный анализ фрагментов, очищенных из полос ДНК длиной 166 и 186 л.о. (см рис.6. Б), с помощью ПААГ-элветрофореза в неденатурирующих (Б) и денатурирующих (В) условиях. М1 и М2- маркеры молекулярной массы pUCI&'Mípl и pBR 322/BsuRI; 1 - фрагмент ДНК, очищенный из полосы, соответствующей 186 п.о,; 2 - фрагмент ДНК, очищенный из полосы, соответствующей 166 л.о.; фрагмент ДНК 1, рестрицированный С помощью Smal (3), Hinfl (5); BamH) (7); фрагмент ДНК 2. рестрицированный с помощью Smai (4), Hinfi (В); BamH (8),

за исключением различий в области С А-повторов. Для выяснения природы этих различий, был проведен ряд экспериментов Во-первых, были проанализированы продукты ПЦР, полученные после одного раунда амплификации при использовании очищенной ДНК из обеих полос в качестве матрицы. При этом в растворе наблюдались, в основном, фрагменты с подвижностью, соответствующей 166 п.о., и лишь небольшая доля фрагментов с подвижностью, соответствующей 186 п.о. (рис.9). В результате был сделан выводотом. что при амплификации первоначально образуются дуплексы длиной 166 и.о., но одно цепочечные фрагменты, входящие в его состав, могут давать структуры с подвижностью, соответствующей линейному фрагменту в 186 п.о. Во-вторых, 61.1л проведен анализ температурной стабильности двух типов дуплексов (рис.Ю).

124-W 104

s

Рисунок 9. Проведение 1 цикла ПЦР для амплификации фрагментов, очищенных из полос, соответствующих 1S6 и 186 п.о. (см рис 6. Б). ГЛ -маркер молекулярного веса; 1 - фрагмент ДНК. очищенный из полосы, соответствующей 166 п о.; 8 - фрагмент ДНК, очищенный из полосы, соответствующей 1S6 п.о.; 2 - односторонняя ПЦР TG-содернсащей нити фрагмента 1; 3 - односторонняя ПЦР СА-содержащей нити фрагмента 1; 4 - односторонняя ПЦР СА-содержащей нити фрагмента 8 5 -односторонняя ПЦР TG-оодержащей нити фрагмента 8; 6 - ПЦР двунитевого фрагмента 1; 7 - ПЦР двунитевога фрагмента В.

Рисунок 10. Температурная стабильность фрагментов, очищенных из полос, соотвествующкх 166 и 186 П.о. 1 - фрагмент ДНК, очищенный из полосы, соответствующей 166 п.о.; 2, 3, 4 - фрагмент 1, инкубированный соответственно при Ю'С. 37'С, 65'С в течение 1 суток; 5 - фрагмент 1 после РФГ. 6 - фрагмент ДНК, очищенный из полосы, соответствующей 186 п.о.; 7, 8, 9 - фрагмент ДНК 6, инкубированный соответственно при Ю'С. 37'С. 65'С в течение 1 суток; 10 - фрагмент ДНК 6, после РФГ

Было показано, что появление в геле двух полос одинаковой интенсивности й обеих пробах происходит лишь при проведении реакции формирования тетерону плексов. Полученные данные свидетельствуют либо о существовании альтернативных структур ДНК у фрагментов с СА-повторами. либо о том. что к ходе ПЦР могут происходить делении иливставки повторов в небольшой доле ампляфиката, Тогда в результате последующих циклов ПЦР полная денатурация дуплексов до о ли оцеп очечных фрагментов и их [»ассоциация должна приводить к формированию гетероду апексов с нарушением структуры ДНК в области повтора и с более низкой мектрофорети ческой подвижностью в полиахриламндном геле, по сравнению с гомо дуплексам и. Данное предположение было подтверждено с помошыо более длительного электрофореза продуктов ПЦР в денагурнрующнх условиях. Для этого радиоаютпо меченый продукт ПЦР обрабатывали

ркстриктазами £соШ или С1аI. осуществляющими разрыв ДИК слева или справа ог повтора соответственно {рис.11. Л). При Проведении электрофореза было выявлено присутствие в амллификатс около 10% фрагментов длиной 164 и.о. п около 1% длиной 168 и 162 и.о. (рис.11, Б).

А.

EeoRl Cfsl

-'■ -: <САЬ;-—

-■ (TG)s,1-—

EcoRI/

Б.

TG-нить-

CA-HWTb-

EcoRI , Ctoí

-(CA),,-* ' ■<CA)11—

JCTG>j,'-* -(TG)3,—

i"" i"

m i

Рисунок 11. А. Схема получения дуплексов для анализа ошибок ПЦР с помощью электрофореза ДНК в денатурирующих условиях. Б. Электрофорез в денатурирующих условиях радиоактивно меченого

продукта ПЦР длиной 166 г.о. и рестрицированного

фрагмента плазм ид ной ДНК длиной 120 п.о. 1—4 - продукт ПЦР, амплифицировзнный с помощью Гад-полимеразы; 69 - продукт ПЦР. амппифицироаанньгй с

помощью иМТтм-лолимеразы; 1,6 - 5 нг продукта ПЦР: 2,7 -2 нг продукта ПЦР: 3,8 обработка продукта ПЦР рестриктазсй ЕсоИ; 4,9 -обработка продукта ПЦР рестриктазой С/з1 5,10 -ЕсоИ -С?а1-фрагмент плазмидной ДНК.

При этом использование ДНК-пол и мерю с повышенной точностью воспроизведения не приводило к изменению содержания в а.чплификатс фрагментов с делениями и вставками повторяющихся единиц. При анализе фрагмента плазм идной ДНК не было выявлено делений и инсерций нуклеотидов. Полученные результаты согласуются с данными других авторов, продемонстрировавших существование повышенной вероятности репликационных ошибок в области СА-повторов, по сравнению со случайными последовательностями не только in vilro (Eckert et al, 2002), но и in vivo (Slreismger and Owen, 1985, Wierdt et al„ 1997, HaiT and Schlotterer, 2000). Образование в ходе ПЦР смеси гомо- и гстеродуплексов также было продемонстрировано для мнкросателлитных маркеров геномной ДНК человека ддиноН142 н 186 пл., содержащих соответственно 25 и 29 СА-иовторов. а также для сш ггетическ и хго м о- и гстеродуплексов (рис. 12).

Рисунок 12 Реакция формирования гетеродуплексов для продуктов ПЦР и синтетических дуплексов, содержащих различное количество CA/TG-повторов. 1,2 - очищенный продукт ПЦР, содержащий (САЯС)3,-повторы; 3,4 - очищенный продукт ПЦР. содержащий (CA/TG]t повторь 5 -очищенный продукт ПЦР, содержащий (САП" G)»-повторы; 6 -синтетические гомодуплексы. содержащие (СА)И/(ТС)И- и (СА)и/(Т6)к-повторы; 7 - синтетические гетеродуплексы, содержащие iCA}2i,'(TChs- и (CA)^(ТС)21-повторы; 2, 4, 5- продукты ПЦР. подвергшиеся РФГ. М1 и М2 - маркеры молекулярной массы pUC19/Msp1 и pBR322i8suRI соответственно.

Анализ фрагментов ДНК. содержащих (С A'TG)31-повтори и соответствующих но подвижности линейным фрагментам длиной 242 и 264 п,о, (см рис 6, Б и В), в данной работе не приведен Однако, по предварительным данным, эти фрагменты представляют собой гстеродуплексы с большем количеством делений повторов в TG- или CA-нитях.

С учетом полученных результатов преимущественную локализацию точек перекреста структур Холл идея в области СА-новторов можно объяснить присутствием в них нсспаренных нар оснований при делсини или инсерции повторов, что приводит к торможению процесса миграции ветвей в зоне i etepo.noгни

3.3. Взаимодействие лrvxнепочечных ДНК, содержащих случайную или повтор я гашу №с я последе загадь «есть, с одноцепвчечяымн алигонуклеотвдвик.

Одним из этапов гомологичной рекомбинации является инициация взаимодействия между двумя дуплексами ДНК за счет инвазии одной из цепей ДНК в гомологичный участок дуплекса. Механизм инвазии не был изучен, и мы считали важным проанализировать возможность спонтанного ДНК-ДНК взаимодействий однопепочечпой ДНК с дуплексом, а также влияние последовательности нуклеотидов на данный процесс

3.3. i. Взаимодействие между одноцёпочечными олигонуклеотндамн к дуплексами ей случайной последовательностью.

Поскольку диссоциация концевых пар в дуплексе происходит чаще, чем во внутренней области (Зепгер. 1987). представлялось наиболее вероятным взаимодействие

однбцепочечных оли го ну клеотидов с концевыми участками дуплексов. Для постановки данного эксперимента очищенный продукт ПЦР кДНК гена р53 длиной 1249 и.о. инкубировали с парой праймеров (5'-р53-АТ и 3'-р53-АТ), с помощью которых он был получен, в мольном соотношении 1:100 для каждого из них. В качестве не гомологичного олигонуклеотида использовали 18-звенный праймер к последовательности гена Кигаз (3'-1%-К1-гха). После инкубации проб при 37°С в течение I суток в Трис-1 ¡О-буфере (рН 7,5), содержащем 0,3 М НаС1 и 1 мМ НО ГА, проводили электрофорез ДНК в агарозном геле. В пробе, содержащей дуплексы н гомологичные олигоиуклеотиды, наблюдается снижение количества структур-Холл идея в растворе но сравнению с контрольными пробами ДНК (рис. 13, А).

А. Б.

М 1 2 3 М 1 2 3 4 5

Рисунок 13. Влияние олигон у клеотидов на интенсивность образования структур Холл идея дуплексами со случайной послед овательностью. А. Агароэный электрофорез очищенного ПЦР-лродукта кДНК гена р53 длиной 1249 п о., инкубированного в отсутствии олигонуклеотидов (1), с 5'-р53-АТ-и 3-р53-АТ (2), с 3'-1 а-К/гая (3). М - маркер молекулярной массы. Л1£соН1Н1п(Л\\. Б. Зависимость ДНК-ДНК-взаимодействия дуплексов от количества комплементарных оли гону клеотидов. Агарозный электрофорез очищенного ПЦР-продукт а, инкубированного в отсутствии Оли гону клеотидов (1). с 5'-р53-АТ- и 3'-р53-АТ в соотношении: 2 - 1:50; 3 -1:25; 4-1:5; 3 -1:2 М - маркер молекулярной массы, рБР322/7ач1

Была также изучена дозовая зависимость интенсивности ДНК-ДНК-взаимодействия от количества олиго ну клеотидов. Для этого ПЦР-иродукт смешивали с парой гомологичных оли гону клеотидов в мольных соотношениях 1:50, 1:25, 1:5 и 1:2 соответственно для каждого олигонуклеотида, Но результатам электрофореза наблюдается снижение количества структур Холл идея в растворе при увеличении концентрации оли го ну клеотидов (рис.13, Б), Это свидетельствует о конкуренции между двумя процессами - взаимодействием дуплексов и взаимодействием дуплекса с одноцепочечным олнгонуклеотцдом. Было предположено, что одноиепочечные олигоиуклеотиды, комплементарные концам нитей дуплекса, могут взаимодействовать с ними с образованием трехцепочечных структур, что приводит к конкурентному

ингибированию взаимодействия дуплексов и к снижению количества структур Холлидея (рис. 14). Замещение одной из нитей дуплекса комплементарным олигонуклеотидом

Рисунок 14. Схемы процессов ДНК-ДНК-взаимодействия гомологичных дуплексов между собой и с олигонуклеотидами. А. ДНК-ДНК взаимодействие гомологичных линейных

дуплексов. Обозначения цифр аналогичны указанным на рис.2. Б. Конкурентное ингибирование образования структур Холлидея в присутствии олиго-нуклеотидов, гомологичных концам дуплекса. 1 - процесс диссоциации-ассоциации концов дуплексов,' 2 - взаимодействие дуплексов с олигонуклеотидами; 3 -ингибирование образования структуры Холлидея.

может происходить путем последовательного вытеснения одной из нитей дуплекса или за счет процесса диссоциации-ассоциации в зависимости от его длины и температуры инкубации раствора (КепаМо е1 а!., 2000). Поскольку в данной работе опыты проводили при 37°С и наблюдали уменьшение степени взаимодействия дуплексов при добавлении олигонуклеотидов длиной более 20 о., мы предположили, что в нашей системе взаимодействие дуплекса с олигонуклеотидом происходит путем последовательного вытеснения одной из нитей дуплекса. Для анализа механизмаза мещения ПЦР-продукт смешивали в мольном соотношении 1:50 с олигонуклеотидами различной длины, несущими на 5'-концах разное количество некомплементарных оснований. Уменьшение количества структур Холлидея наблюдали при использовании полностью комплементарных олигонуклеотидов длиной 26 о. (рис.15,2). Эффект ингибирования уменьшается при использовании 21-звенных олигонуклеотидов, содержащих на своих 5'-концах некомплементарные 3-4 о. (рис.15, 4). В случае комплементарных 7-звенных олигонуклеотидов, а также 26-звенных олигонуклеотидов с некомплементарными семьюнуклеотидами на 5'-концах такого эффекта не наблюдали (рис.15, 3 и 5 соответственно). Эти данные подтверждают предположение о взаимодействии дуплекса с олигонуклеотидом путем последовательного замещения нитей.

по М 1 2 3 4 5 6

ш Щ Щ ts

202? _ ■ ■ . — —.

1304

1584

1375 --- «м«м ds

347

Риоунок 15. Влияние длины и последовательности олигонуклеотидов на количество структур Холл идея 1 - очищенный ПЦР-продукт кДНК гена р53; 2—6 - очищенный ПЦР-продукг, инкубированный с олигонуклеотидами: 2 - 5'-р53-АТ- и 3'-р53-АТ; 3 - 5'-7-АТ- и 3 -7-АТ; 4 - 5-21-р53- и 3'-21-р53; 5 - б'-р53-ОС- и 3'-р53-СС; 6 - ЗЧв-^-гаг. М - маркер молекулярной массы, А/£со1-и,Н|Л(Л11.

Для подтверждения гипотезы об олигонуклеотидпои ипвазпи в дуплекс использовали радиоактивно меченые олигонуклеотиды, инкубированные с продуктом ПЦР при 37°С в течение ] суток. Было показано, что происходит встраивание гомологичного олигонуклеотида З'-рЗЗ-АТ, гомологичного концу дуплекса (рис.16, А и Б). Инвазии в дуплекс не происходит, ссли использовать олигонуклеотид 3'-5ех-/;35,

А. Б. в г.

м 1 2 3 1 2 3 М 1 2 3 4 5 6 7 12 3 4 5 6 7

гоет.-Ш - гзг2чГ| дуплексы праймеры

1 И 1НШ * Е тшшт

Рисунок 16. Образование комплекса ДНК с инвазией олигонуклеотида в концевой участок дуплекса. A. Afа розный гель-электрофорез смесей ПЦР-продуктов с радиоактивно мечеными олигонуклеотидами. Очищенный ПЦР-продукт кДНК гена р53, инкубированный в мольном соотношении 1:50 с олигонуклеотид ом: 1 - негомологичным; 2 - 3'-р5Э-АТ; 3 -3'-5ех-р5Э Б. Радиоавтограф геля А. 0, Агарозный гель-электрофорез смесей ПЦР-п род у кто в с различным количеством радиоактивно меченого оли гонуклеотида. 1 - очищенный ПЦР-продукт кДНК гена р53, инкубированный без ол и гонуклеотида; 2-7 - очищенный ПЦР-продукт, инкубированный с опигонуклеотидом 3"-р53-АТ в мольном соотношении: 2 - 1:5; 3 - 1:1: 4 - 2:1: 6- 5:1, S - 10:1; 7 - очищенный ПЦР-продукт. инкубированный с негомологичным олигонуклеотидом а соотношении 1:5. М - маркер молекулярной массы, A/Hindtt], Г. Авторадиография геля В.

гомологичный внутреннему участку фрагмента ДНК, иди не гомологичный олигонуклеотид. Следует отметать, что при инкубации дуплекса с различными количествами гомологичного олигопуклеотида встраивание последнего наблюдается даже при его количестве, в 10 раз меньшем, чем количество дуплекса (рис. 16, В и Г).

Феномеи влигонукл&утидкой иншик также подтвержден с rtomtuhto метода химического расщепления неканонических пар нуклеотидов. Поскольку при формировании комплекса ДНК с одноцепочечной инвазией в дуплекс должно происходить вытеснение одно цепочечного участка дуплекса, остатки тимииовых оснований в этом участке доступны л;]я модификации КМпОч. При последующей обработке пиперидином это приведет к расщеплению полннукяеотндной цепи по точкам модификации. В опыте использовали 11ЦР-продукт ¡сиа Ki-ms длиной 13"? п.о., инкубированный совместно с гомологичным 34- или 18-ЗВенным олигонуклеотидом с последующей химической обработкой и проведением 10 раундов асимметричной амплификации, В результате электрофореза ДНК в денатурирующих условиях в пробе, содержащей смесь ПЦР-продукта с 34- «ли 18-звенным олигонуклеотидом, помимо полосы, соответствующей пол норазмерном у Г1ЦР-продукту, обнаруживаются дополнительные полосы, соответствующие продуктам расщепления вытесненного одно не почечного участка по каждому остатку тимина (рис: 17). Полученные результаты свидетельствуют о том, что в растворе образуется смесь структур с различной степенью нетраннапня олитонуклеошда в дуплекс.

Рисунок 17. Анализ структуры комплексов ДНК с однонитевой инвазией в дуплекс методом химического расщепления неканонических пар оснований. А. Обработка комплекса при различной температуре и разной продолжительности инкубации ПЦР продукта гена Ю-гз^ с З'-ЗФЮ-газ; 1, 5 -Пробы без добавления олигонуклестида; 1-4 - пробы, обработанные КМлСЬ при 4°С; 5-Я - пробы, обработанные КМпО„ при 1С°С; 2, б - 5 мин. 3,7 — 15 мин; 1, 4, 5, В - 30 мин. 6. Обработка комплексов ПЦР-продукта гена Кг-га$ с 34-звекнылк м Тй-звенныл* опигонуклеотмдаш (при 25°С): 1 -контрольная проба без добавления олигонуклеотида: 7 - контрольная проба с добавлением негомологичного олигонуклеотида; 2-4 - обработка комппекСА с олигонуклеотмдом; 3, £ - обрадоткз комплекса с

18-звенным олигонуклеотидом; 2, 5 - 6 мин; 3-15 мин; 1,4, 6, 7 - 30 мин М - маркер молекулярной массы рБК 322/ВзиН1.

3.3.2, Особенности олигокукяеотндной инвазии в дуплексы, содержащие СЛ-повторы.

Для анализа особенностей олигонуклеотидной инвазии в дуплексы, содержащие СА-повторы, линейные фрагменты ДНК были смешан^ с одним из следующих радиоактивно меченых о лигону клеотидов: 1) 5'-СЛ-1129 (в случае продукта ПЦР длиной 1129 п.о.) или У-Pvu II (а случае рсстрпцированнот фрагмента плазм иды pEIO/PvKtt, Rsa I длиной 835 по), гомологичным копну дуплекса: 2) d(CA)i¿ 3) не гомологичным оютонукяеотидом З'-l 8-Ki-ras. I \рн анализе смесей было продемонстрировано встраивание олигонуклеотида не только в гомологичный концевой участок дуплекса, но и во внутреннюю повторяющуюся область (рис. 18).

Кроме того, был проведен эксперимент по изучению ол и го ну клеотидной инвазии в кольцевую плазмиду pEJO. инкубированную в соотношении 1:5 или !:10 с каждым из следующих радиоактивно меченых олиго ну клеотидов: 1) гомологичным

случайной последовательности илазмиды, находящейся на расстоянии 217 п о. от начала СА-повтора; 2) 5'-£coRl, гомологичным случайной последовательности плазмиды, находящейся на расстоянии 41 и.о. от начала СА-повтора; 3} <)(СА)]0; 4) d(TG)10; 5) него-

Рисунок 18. Демонстрация олигонуклеотидной инвазии е различные типы линейных дуплексов, содержащих -повторы, при проведении

агарозного гель-электрофореза. А. Агарозный гель-электрофорез смесей ПЦР-продуктов с радиоактивно мечеными олигонуклеотида ми. 1 -очищенный ПЦР-продукт, инкубированный без олигонуклеотидов; 2-4 -очищенный ПЦР-продукт, инкубированный с олигонухлеотадом в соотношении 1:50 соответственно: 2 - негомологичным: 3 - 5'-СА-1129; 4 -ю- Б. Радиоавтограф геля А. В. Агарозный гбль-электрофорез смесей фрагментов ллаэмиды рЕ 10/Руи\Iс радиоактивно мечеными олигонуклеотидами в соотношении 1:20 соответственно; 1 - 3'-18-КУ-гз5; 2 -5'-Р^иН; 3 —Ь(СА)1г- Г. Радиоавтограф геля 8. М - маркер молекулярного веса А/Н1псН\\\.

мологичным оли гону клеотидом, В результате авторадиографии геля было показано встраивание с1(СА))<>- и с! (ТО )ю-ол и гону клеотидов преимущественно в кольцевую супере крученную форму ДНК (рис. 19, Б). Встраивания гомологичных оли гону клеотндо в

Рисунок 19. Демонстрация олигонуклеотидной инвазии в кольцевую л лаз миду.

содержащую (САЯОл-

повторы. А. 1% агарозный гель-электрофорез смесей (шазмиды рЕЮ с

радиоактивно мечеными олигонуклеотидами: 1 -негомологичным; 2 - Ь'-РуцЛ; 3 - 5'-ЕсоИ; 4 - <1(СА)10; 5 -С|{Т6),0 М - маркер молекулярной массы А/бз^ЕМ. Б. Радиоавтограф геля А.

со случайной л о следов ател ьноегьюн с наблюдалось. Одним из объяснений олигонуклеотидной инвазии в СА-повторы в случае продуктов ПЦР может быть существование в растворе гетеродуппексов, в область искажения которых происходит встраивание гомологичного олигонуклеотида. Однако подобное предположение не объясняет инвазии олигонуклеотида (!(СЛ)|2 в ппазмидиую ДНК. Как уже было показано выше, в этих фрагментах не наблюдалось делений или инсерций повторов, а следовательно, и образования гетеродуплекеов

Для анализа встраивания ол и го нуклеоти дов в гомо- и(или) гетероду пле ксы ДНК были поставлены эксперименты с проведением электрофореза ДНК в нативном полиакри-ламидпом геле, позволяющем выявить различия в подвижности гомо- и гетеродуплекеов. Для этого был использован продукт ПЦР длиной в 166 п.о., содержащий (СА/ГО.и-повторы, а также очищенный фрагмент плазмидной ДНК длимой N5 п,о,, полученный в результате рестрикции плазмиды рЕ 10 с помощью и ШтЛИ. Каждый из

фрагментов был смешан В мольном соотношении 1 2 с одним из следующих радиоактивно меченных оли го ну клеоти до в: 1) 5'-СА-166 (в случае продукта ПЦР) или 5'-£соШ (в случае фрагмента плазмидной ДНК), гомологичным концу дуплекса; 2) (З(СА)ш, 3) с1(ТО)[о; 4) негомологичным оли го ну клеоти дом. Образование радиоактивных комплексов ДНК было обнаружено при инкубации продукта ПЦР с оли го ну к.1 коти дом, гомологичным концу дуплекса, и ¿(ТС)ю (рис,-10), При пом в первом случае наблюдалось появление радиоактивности как гомо-, так и гетеродуплсксах. Радиоактивные комплексы не могли быть дпукитеиой структурой, образованной в результате взаимодействия олигонуклеотида с комплементарной нигыо дуплекса, так как в этом случае наблюдалось бы появление лишь одной «радиоактивной» полосы вместо двух. В то же время при его инкубации с <1(ТС)|о наблюдалось появление радиоактивного комплекса с более низкой эяектрофорстаческой подвижностью по сравнению с подвижностью дуплекса. В смесях.

А.

Б.

М 1 234 5678 9

1 234 5678 Э

300 2 DO 100

п.о.

Рисунок 20. Демонстрация олигонуклеотидной инвазии в различные типы линейных дуплексов, содержащих (С А/TGb,- повторы. А. ПААГ-электрофорез смесей ПЦР-продуктов с радиоактивно мечеными олигонуклеотндами и фрагментов плээмидной ДНК с радиоактивно мечеными ол угону клеотидами. М - маркер молекулярной массы; 1-4 -очищенный пцр-лродукт длиной 166 п.о., инкубированный с олигонуклестидом; 1 - 5'-СА-166. 2 - негомологичным; 3 - d(CA),0; 4 -d(TG),0: 5-9 - очищенный фрагмент плаамидкой ДНК длиной 115 и.о.. инкубированный с олигонуклеотйдом; 5 - 5'-£coRI; 6 - негомологичным: 7 -а(СА),0; В - d(73)i0; 9 - d{CA)m и d(TG),0. Б Радиоавтограф геля А.

Содержащих ¿1{СА)ю или не гомологичный олигонуклеотид, образовании радиоактивных комплексов ДНК не наблюдалось. Это может объясняться тем, что при проведении эксперимента в агарозном геле использовалось соотношение дуплекса к олигонуклеотид)' 1:50. в то время как при проведении эксперимента в I юл иакр идам идиом геле - всего лишь 1:2. Такое количество олигонуклеотида может быть ниже значения константы связывания для реакции взаимодействия дуплекса с й(СА)ш. В случае с фрагментом плазмидной ДНК фсхцепочечные комплексы с олигонуклеотйдом, гомологичным концу дуплекса, <3(СА)№ с1(ТО)к>, а также со смесью сК*СА)10 и ё(ТО)10 шли выше уровня дуплекса (рис.21. А, ]>), Подвижность комплексов одинакова как в пробе с (¿(СА)^ так и в пробе с <1(ТО)|& в то время как при инкубации с обоими олигонуклеотидами наблюдается появление двух радиоактивных комплексов, что означает, по-видимому, одновременное встраивание в дуплекс обоих олигонуклеотидов.

Выводы

1. Впервые обнаружен феномен спонтанной инвазии одноцепочечной ДНК в гомологичный концевой участок линейного дуплекса со случайной последовательностью с образованием трехцепочечного комплекса, аналогичного структуре, которая формируется in vivo при репарации повреждений ДНК путем гомологичной рекомбинации, играющей важную роль в канцерогенезе.

2. Продемонстрирована инвазия гомологичной одноцепочечной ДНК во внутренний район СА-повторов линейных и кольцевых дуплексов, что свидетельствует о существовании конформационных особенностей ДНК в данной области, важных для функционирования микросателлитных локусов в качестве точек инициации процесса гомологичной рекомбинации.

3. Одним из механизмов взаимодействия гомологичных линейных дуплексов, содержащих СА-повторы, является ассоциация концевых последовательностей с образованием структур Холлидея, миграция ветвления в которых приводит как к их разрешению в новые или исходные дуплексы, так и к формированию популяции структур Холлидея с преимущественной локализацией точки перекреста в области повторяющейся последовательности, что может свидетельствовать о влиянии СА-повторов на терминацию процесса рекомбинации in vivo.

4. Повышенная вероятность динуклеотидных делеций, выявленная при ПЦР-амплификации дуплексов, содержащих СА-повторы, является одной из причин торможения миграции ветвления в структурах Холлидея в области СА-повторов.

5. Формирование "гибридных" четырехцепочечных структур дуплексами, содержащими СА-повторы и имеющими негомологичные концевые последовательности, свидетельствует о существовании структурных особенностей ДНК в области СА-повторов, способствующих стабилизации данного комплекса.

Список работ Гасановой (Маркиной') В.К., опубликованных по теме диссертации

1. A.A. Neschastnova, V.K. Gasanova, V.l. Popenko, A. Lambrinakos, G.A. Belitsky, R.G.H. Cotton and M.G. Yakubovskaya. Spontaneous DNA-DNA interaction of homologous duplexes and factors affecting the result of heteroduplex formation. // Biol. Chem. -2 006 -N 387-P 257-261.

2. B.K. Гасанова, A.A. Несчастнова, Г.А. Белицкий, М.Г. Якубовская. Специфическая инвазия олигонуклеотида в концевой участок дуплекса ДНК. // Молекулярная биология-2 005-N40(1)-стр. 132-138.

3. Маркина В.К., Данилова O.A., Несчастнова A.A., Белицкий Г.А., Якубовская М.Г. Роль концевых участков дуплексов в спонтанном взаимодействии гомологичных линейных фрагментов ДНК. // Молекулярная биология - 2002 - N 36(5) - стр. 862867.

4. Neschastnova A.A., Markina V.K., Popenko V.l., Danilova O.A., Sidorov R.A., Belitsky G.A., Yakubovskaya M.G., Mechanism of spontaneous DNA-DNA interaction of homologous linear duplexes. //Biochemistry-2 002 - N 41 - Pr7795-801.

5. Якубовская М.Г., Несчастнова A.A., Маркина В.К., Данилова O.A., Попенко В.Й., Белицкий Г.А. Образование структур Холлидея при проведении реакции формирования гетеродуплексов для выявления точковых мутаций неизвестной локализации. // Сб. трудов симпозиума "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении", Москва - 2002 - стр. 143-148.

Участок множительной техники ГУ РОНЦ РАМН Подп. к печати 15.03.2007 Заказ 385 Тираж 100 экх