Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Структура вариабельного региона легких цепей иммуноглобулинов в патогенезе миеломной нефропатии

На правах рукописи

И/

О

Горчакова Светлана Владимировна

СТРУКТУРА ВАРИАБЕЛЬНОГО РЕГИОНА ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ МИЕЛОМНОЙ НЕФРОПАТИИ

14.01.21- Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 6 июн 2011

МОСКВА 2011 г.

4849998

Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном учреждении Гематологический научный центр Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук

кандидат медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Ведущее научное учреждение: Федеральное Государственное учреждение Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится <С$» ¿¿¿¿»У^Ч?-- 2011 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 208.135.01 при Федеральном Государственном бюджетном учреждении Гематологический научный центр Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу

125167, Москва, Новый Зыковский проезд, 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ Гематологического научного центра Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан » ^¿¿¿^Я-- 2011 года

Бирюкова Людмила Семеновна Никитин Евгений Александрович

Голенков Анатолий Константинович Головкина Лариса Леонидовна

Ученый секретарь диссертационного совета к.м.н.

Зыбунова Е.Е.

Введение

Актуальность проблемы.

Нефропатия является ведущим клиническим проявлением при множественной миеломе (ММ). В момент диагностики ММ признаки почечной недостаточности (ПН) выявляют в 40-50% случаев [Herrera G.A. et al., 2004; Sanders P.W., 2005; Eleutherakis-Papaiakovou V. et al., 2007]. Главным патогенетическим звеном в развитии миеломной нефропатии является секреция легких цепей (ЛЦ) иммуноглобулинов, которые могут вызывать повреждения различных структур нефрона: как канальцев, так и клубочков. Наиболее частым (в 63-87% случаях) вариантом поражения почек при ММ является цилиндровая нефропатия [Ronco P., Aucouturier Р. et al., 2001].

Под термином «цилиндровая нефропатия» (миеломная нефропатия, cast nephropathy) понимают поражение почек вследствие формирования белковых преципитатов (цилиндров или слепков) в дистальных канальцах и собирательных трубках. Цилиндры вызывают обструкцию дистальных канальцев и собирательных трубочек, что приводит к интерстициальному воспалению и фиброзу. Клинически выявляют признаки уремии с высоким уровнем азотемии. Эффективное лечение ММ приводит к улучшению функции почек в 50% случаев цилиндровой нефропатии [Barosi G., Boccadoro М. et al., 2004].

Образование цилиндров происходит при взаимодействии CDR3 (англ. complemetary-determining region) участка вариабельного домена ЛЦ и гликопротеида Тамма-Хорсфолля, секретируемого эпителием восходящего отдела петли Генле [Huang Z.Q., Sanders P.W., 1997].

В патогенезе нефротоксичности определяющее значение имеют физико-химические свойства ЛЦ, их тропность к различным отделам нефрона и степепь адгезии [Solomon A. et al., 1991: Preudhomme J.L. et al., 1994; Stevens F.J. et al., 1999; Sanders P.W., 2005]. В частности, известны случаи высокого уровня секреции белка Бене-Джонса в течение длительного времени без нарушения функции почек [Sanders P.W., 2005]. В то же время при секреции ЛЦ в минимальном количестве может развиться тяжелое необратимое поражение почек. В экспериментальных исследованиях in vitro было обнаружено [Ying WZ, Sanders PW, 2001], что способность ЛЦ взаимодействовать с гликопротеидом Тамма-Хорсфолля различна и зависит от строения CDR3 участка вариабельного домена ЛЦ.

Таким образом, CDR3 участок вариабельного домена определяет нефротоксичные свойства легких цепей и их способность вызывать развитие цилиндровой нефропатии при ММ. Изучение строения CDR3 участка вариабельного домена во взаимосвязи с клиническими проявлениями ММ позволит углубить представления о патогенезе формирования цилиндровой нефропатии, а также степени обратимости почечной недостаточности в каждом конкретном случае.

Цель исследования.

Установить значение структуры вариабельного региона и конкретно CDR3 участка легких цепей и их изоэлектричеекой точки в патогенезе цилиндровой нефропатии у больных множественной миеломой.

Задачи исследования.

1. Определить нуклеотидные последовательности вариабельных регионов легких цепей, синтезируемых плазматическими клетками у больных множественной миеломой с цилиндровой нефропатией и без нее.

2. Провести анализ нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей вариабельных регионов легких цепей, включающий:

• оирпку репертуара используемых V и J генов лггких прпей у больных множественной миеломой с цилицпровой нефропатией и без нее,

• успшовлешс степени гомологии V генов ллких терминальным генам.

• расчет кттекгрической точки для варгейелы юга региона и CDR3 каждой лакш цгпи.

• сравнгние вариабельных репюнов у больных множественной миеломой с пшшнпровой нефрогашей и без нее, используя методы компьютерного моделирования.

3. Проанализировать вероятность развития цилиндровой нефропатии и тяжесть поражения на основании анализа нуклеотидной последовательности вариабельного региона легкой цепи.

4. Исследовать клинические и лабораторные факторы риска развития цилиндровой нефропатии.

Научная новизна.

Установлена первичная структура вариабельного региона и CDR3 легких цепей, а также их изоэлектрическая точка у пациентов с миеломной нефропатией и без нее. Изучено прогностическое значение этих показателей при развитии цилиндровой нефропатии. Выявлен репертуар используемых семейств генов вариабельного региона у пациентов с цилиндровой нефропатией и без нее. Научно-практическая значимость работы.

В результате проведенных исследований многие данные получены впервые: определены закономерности в использовании определенных семейств генов вариабельных регионов в синтезе легких цепей при множественной миеломе, установлено, что у пациентов с миеломной нефропатией и без нее нет различий в репертуаре используемых семейств генов вариабельных регионов. В результате проведенных исследований выявлено, что на основании первичной и вторичной структуры вариабельных регионов легких цепей, аминокислотного состава CDR3, изоэлектрической точки вариабельного региона легкой цепи и CDR3, невозможно установить их способность к образованию цилиндров с белком Тамма-Хорсфолля в почечных канальцах.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Для пациентов с множественной миеломой характерно использование специфического репертуара семейств генов вариабельного региона легких цепей. В группе Ук-генов достоверно чаще представлено I семейство. Среди Jic-генов чаще всего используется MI. В группе больных с секрецией лямбда легких цепей, преобладают V гены I и III семейств. Использование J -генов X осуществляется только за счет II/III семейств.

2. Для пациентов с цилиндровой нефропатией характерно использование того же репертуара генов вариабельного региона легких цепей, что и для пациентов без цилиндровой нефропатии.

3. Гены вариабельного региона легких цепей, используемые миеломными клетками, совпадают с терминальными генами менее чем на 98%, что говорит о многочисленных мутациях. Накопление мутаций с заменой аминокислот в районах CDR свидетельствует о возможном контакте с антигеном.

4. На основании анализа первичной и вторичной структуры вариабельного региона легких цепей невозможно прогнозировать ее способность к образованию цилиндров с белком Тамма-Хорсфолля в почечных канальцах.

5. Развитие цилиндровой нефропатии коррелирует со стадией заболевания, определяемой по Durie-Salmon и по международной системе стадирования. Публикации:

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ. Апробация диссертации:

Основные положения работы доложены в виде стендового доклада и опубликованы на Всемирном конгрессе по нефрологии (Италия, Милан, 2009г.). World Congress of Nephrology. (Italy, Milan, 2009). «Amino Acid Sequence of the Variable Region of Light Chains in multiple myeloma patients». Работа апробирована на заседании проблемной комиссии (ФГБУ ГНЦ Минздравсоцразвития России, Москва, 1 марта 2010 года).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 108 страницах, состоит из введения, обзора литературы, методической главы, главы собственных результатов, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 2 рисунками, 8 схемами и 7 фотографиями. Список литературы включает 143 источника: отечественные - 8, зарубежные - 135. Диссертация выполнена в отделении скорой медицинской помощи, полиорганной патологии и гемодиализа ФГБУ ГНЦ Минздравсоцразвития России (руководитель д.м.н. Л.С. Бирюкова), в лаборатории молекулярной гематологии ФГБУ ГНЦ Минздравсоцразвития России (заведующий лабораторией к.б.н. А.Б. Судариков).

Материалы и методы исследования.

1. Общая характеристика больных, включенных в исследование.

В исследование включено 39 больных миеломной болезнью, проходивших лечение в ФГБУ ГНЦ Минздравсоцразвития России. Диагноз ММ был установлен в соответствии со стандартными клиническими, морфологическими и иммунохимическими критериями. Стадии заболевания определяли по В. J. М. Duríe и S.E. Salmon (1975 г.), а также по международной системе стадирования (ISS). Миеломная нефропатия была диагностирована у 22 (56,5%) больных. Группу сравнения составили 17 (43,5%) больных ММ, у которых миеломная нефропатия отсутствовала.

2. Выделение моноиуклеаров из пунктата костного мозга.

Из костного мозга выделяли мононуклеары стандартным методом центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Hypaque. Мононуклеары костного мозга в количестве 10б—10т мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80°С.

Б

3. Выделение РНК и обратная транскрипция.

№ замороженных мононуклеарсв коспюго мозга выделяли РЖ с гюмощыо набора RNeasy Mini Kit ("Qiagen") в соответствии с инструкций щюизводателя. Концентрацию огределяли спеюрофогометрически. Для обратаюй транскрипции ютальзовали 2 мкг рибонуклеиновой кислоты (РНК) каждого образца. Одшцаючечную комплиментарную дезоксирибонуклеиновую кислоту (кДИК) синтезировали при помощи обратной трашжритгтазы M-MLV ("Promegä") и случайных гекеануклилвдш в качестве праймеров.

4. Анализ генов легких цепей и к.

Определение семейства ЛЦ X и к.

Дтя определения ктюнальной гсрестройки вариабельного региона легких цгпей (VL), кДНК амшифипировали отдельно для 7 семейств ЛЦ к и 11 семейств ЛЦ X. Для этого использовали праймеры, специфичные к VL-семейлвам (табл. 1).

Шшмеразшцепную реакцию (ПЦР) проводили в гцюграммируемом термостате Terkin Elmer" в объеме 25 мкл, добавляя 3 мкл кДНК в 5-крашом разведении, 5 пмоль каждого праймера и смесь для ПЦР ("Promega"). После гсрвоначальшй денатурации'(5 мин при 95°С) цикл с условиями 95°С 30 с, (ХРС 30 с, 72°С 30 с повторяли 35 раз, теле «его следовала 10-минугаая инкубация при температуре 72°С. Ашлиз результатов проводили методом эпейрофореза в 2% агарозюм гак, содержащем бромистый зпздий (1 мптЧш) в TBE буфере (1 Ох TBE: IM Tris, 0,83 М борная кислота, 10 шМ EDTA) при напряжет юсти элемричгсшпо поля 0,10-0,15 В/м. Фрагменты анализируемой ДНК проявлялись в вцдр светящихся потос три возбуждении ультрафиолетовым излучением с длиной волны 310 нм.

Таблица 1

nDaBMeo последовательность

Vk lead 1 cons 5' - ATR GAC ATG AGR GTS CYY GCT CAG - 3'

Vk lead 2 cons 5' - ATG AGG CTC CYT GCT CAG CTY CTG GGG -3'

Vk lead 3 cons 5' - ATG GAA ACC CCA GCG CAG CTT CTC TTC -3'

Vxlead 4 5' - ATG GTG TTG CAG ACC CAG GTC TTC ATT -3'

Vk lead 5 5' - ATG GGG TCC CAG GTT CA С CTC AGC -3'

VKlead 6a 5' - ATG TTG CCA TCA CAA CTC ATT GGG TTT -3'

VKlead 6b 5' - ATG GTG TCC CCG TTG CAA TTC CTG CGG-3'

Vk constant k27 5' - CAA CTG CTC АТС AGA TGG CGG GAA -3'

Vk constant k69 5' -AGT TAT TCA GCA GGC ACA CAA C-3'

Vk lead 1 cons 5' - ATG RCC DGC TYY CCT CTC YTC CTC - 3'

Vk lead 2 cons 5' - ATG GCC TGG GCT CTG CTS CTC CTC - 3'

Vk lead 3 cons 5' - ATG GCM TGG RYC VYW CTM YKB CTS - 3'

VI lead 4ab 5' -ATG GCfC/Tl TGG ACC CfA/C)A CTC CTC CTC - 3'

Vk lead 4c 5' - ATG GCC TGG GTC TCC TTC TAC - 3'

Vk lead 5 cons 5' - AGT GCC TGG ACT CYT CTY CTY CTY CTC- 3*

VI. lead 6 5' - ATG GCC TGG GCT CCA СТА CTT CTC - 3'

VI lead 7 5' - ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTT CGT - 3'

VXlead 8 5' - ATG GCC TGG CTG CTG CTT CTC CTC - 3'

VXlead 9 5' -ATG GCC TGG GCT CCT CTG CTC CTG - 3'

VXlead 10 5' - ATG CCC TGG GCT CTG CTC CTC CTG - 3'

Vk constant X33 5' - GTT GGC TTG AAG CTC CTC AG AGG A- 3'

Vk constant X85 5' - CAC RGC TCC CGG GTA GAA GTC ACT - 3'

Носче определения клонального 11родукта образец нарабапывали в объеме 50 мкл с праймсром, специфичным соответствующему семейству V-генов. Кшналыгый продукт очищали также методом электрофореза в 2% агарозном геле, после чего алюировали с помощью шбора Diatom DNA Elution (Биоком, Москва, Россия).

Секвенироваиие ПЦР- продукта.

ПЦР-продукг секвенировати с праймера, специфичного семейству перестроенных V/.-, Vk-гиюв, с испалъзованжм набора Big Dye Terminator на автоматическом секвенагоре ABI PRISM 3100-Avant (Applied Biosystems, ''Foster City', CILIA).

Множественное выравнивание последовательностей и определение вторичной структуры.

Полученные последовательности анализировали, иегюльзуя открытые базы данных IgBlast [http77v.wv.ncbi.nIm-nih_gov/igblast] и IMGT software P"ittpy/rmgtcines.fr8104]. М[южественное выравнивание последовательностей выпатняли с помошуо программ ClustaIW2 ¡^yMww£biac.uk^oolsfchjsdW2/index.htniI] и KALIGN [Mp'7M\vw.ebL^.ukA'wlslaligrv%idxiitrnI]. Опредоениг вторичной структуры проюдили при помощи алгоритма Phyre [Protein structure prediction on the v.cb: a case study using the Phyre server Kelfey LA and Sternberg MJE. Nature Protocols 4,363 - 371 (2009)].

Расчет изоэлектрической точки вариабельного региона и CDR3.

Изоэлектрическую точку вариабельного региона и CDR3 рассчитывали с помощью программы Calculation of protein isoelectric point [http://isoelectric.ovh.org/]. При анализе расчетной изоэлектрической точки вариабельных регионов ЛЦ и CDR3 сравнивались группы с миеломной нефропатией и без нее.

Статистический анализ.

Достоверность гипотез для непараметрических данных проверяли с помощью критерия х2 с поправкой Йейтса, для параметрических - с помощью критерия Стьюдента. Множественное выравнивание последовательностей и определение вторичной структуры проводились с помощью программ KALIGN и ClustalW2. Результаты.

1. Характеристика больных, включенных в исследование.

В исследование было включено 39 пациентов с множественной миеломой. Среди них были 24 мужчины, 15 женщин (1,6:1). Медиана возраста группы составила 58 лет, разброс от 37 до 82 лет. 28 больных имели стадии ММ III В, стадии III А, II В, II А имели 5, 3 и 3 пациентов соответственно (таблица 2 и таблица 3). Пациентов лечили различными терапевтическими режимами, включая VAD, М2, MP, PAD, высокодозную химиотерапию с последующей трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток крови (ВДХТ с ТСКК). ....... ......

У 22 (56,5%) больных была диагностирована миеломная нефропатия. Из них у 9 она была установлена на основании результатов биопсии почки. У 13 пациентов цилиндровая нефропатия была констатирована на основании разработанных нами в результате длительного наблюдения за больными следующих клинических критериев цилиндровой нефропатии.

Клинические критерии цилиндровой нефропатии.

1. повышение креатинина более 177 мкмоль/л при наличии белка Бенс-Джонса в моче;

2. выявление прямой корреляции между ПН и уровнем моноклональной секреции и ответом на цитостатическую терапию;

3. регресс ПН в течение 3 и более месяцев на фоне цитостатической терапии;

4. отсутствие предсуществующих хронических заболеваний почек.

Группу сравнения составили 17 (43,5%) больных ММ, у которых миеломная нефропашя отсутствовала.

«Золотым стандартом» диагностики поражения почек по типу цилиндровой нефропатии является биопсия. В группе исследованных пациентов биопсия была выполнена всего у 11 из 39 больных. В связи с этим мы пользовались клиническими критериями, выработанными нами на основании собственных наблюдений.

Таблица 2.

Общая характеристика больных, включенных в исследование.

Показатель С цилиндровой нефропатией Без цилиндровой нефропатии Всего

Число больных 22 17 39

М:Ж 14:8 10: 7 24:15

Возраст, годы (разброс) 62(40-82) 52(37-69) 58(37-82)

Стадии по Durie-Salmon N % N %

ПА ИВ IIIA IIIB 0 2 0 20 0 9 0 91 3 1 5 8 18 6 29 47 3 3 5 28

VAD+альтернативная терапия 7 32% 8 47% 15

VAD+бортезомид содержащие курсы 3 14% 5 29% 8

альтернативная терапия 9 41% 2 12% 11

ВДХТ+ТСКК 2 9% 2 12% 4

безХТ 1 5% 1

Число больных на диализе 16 2 18

Концентрация креатинина мкмоль/л (медиана, мин-макс) 858 (203-2420) 135 (66-756)

Уровень моноклональной секреции иммуноглобулинов в плазме г/л (медиана, мин-макс) 33,8 (10,5-78) 57,8 (4,6-84)

Концентрация белка Бенс-Джонса г/л (медиана, мин-макс) 2,0(0,21-7,5) 0,63(0,01-3,9) 1,46 (0,01-7,5)

По нашим данным, наблюдающаяся у части пациентов ПН разрешается в течение 1 месяца после начала лечения (госпитализации). В таких случаях речь идет об острой почечной недостаточности (ОПН), обусловленной комплексом факторов, в том числе гиперкальциемией, дегидратацией, септическими осложнениями, гиперурикемией, возникающей при повышенном распаде опухолевых клеток на фоне химиотерапии. Как правило, при коррекции данных нарушений функция почек полностью восстанавливалась в течение 3 недель - 1 месяца.

Истинная цилиндровая нефропатия не купируется столь быстро. Ни у кого из наших пациентов она не разрешилась ранее 3-месячного срока. 90% больных с поражением почек при ММ в качестве ведущего патогенетического механизма имеют именно миеломную (цилиндровую) нефропатию. Руководствуясь данными критериями, мы распределили пациентов на две группы: с цилиндровой нефропатией и без нее. Из 39 пациентов, включенных в исследование, 11 была проведена биопсия почки. Из них у 9 была диагностирована цилиндровая нефропатия, у 2 пациентов -редкие варианты поражения почек при ММ: бзлезнь депозитов тяжелых цакй (БДТЦ) и иммунотактоидный гломерулонефрит. У 1 пациента было выявлено сочетанное поражение почек: батиш депозитов ЛЦ (Б ДЛЦ) и цилиндровая нефропатия. Остальным пациентам биопсию не выполняли.

1.1. Характеристика больных с цилиндровой нефропатией.

В группу с поражением почек по типу цилиндровой нефропатии были отнесены 22 пациента. У 13 пациентов цилиндровая нефропатия была констатировала на основании выработанных нами клинических критериев, у 9 - на основании данных биопсии. В дебюте заболевания 16 больным потребовалось проведение заместительной почечной терапии (ЗПТ). Из них у 2 пациентов с доказанной биопсией цилиндровой нефропатией, произошло постепенное улучшение функции почек (в течении 3 месяцев), позволившее прекратить проведение гемодиализа. В обоих случаях улучшение функции почек происходило на фоне снижения уровня моноклональной секреции в результате проводимой полихимиотерапии (ПХТ).

У 14 пациентов с цилиндровой нефропатией на фоне проводимого лечения функция почек не улучшилась, и они остались зависимыми от заместительной почечной терапии.

У 6 пациентов в дебюте заболевания была выявлена ПН, не требующая проведения заместительной почечной терапии. В данной группе улучшение функции почек, коррелирующее с уровнем моноклональной секреции, отмечалось у 3 больных. У одного из этих пациентов цилиндровая нефропатия была верифицирована с помощью биопсии почки.

1.2. Характеристика больных без цилиндровой нефропатии.

В группе сравнения из 17 пациентов у 2 отмечались редкие варианты

поражения почек: иммунотактоидный гломерулонефрит и БДТЦ. Варианты поражения почек верифицированы на основании исследования биоптата почки. Данные пациенты нуждались в заместительной почечной терапии. Также у 6 пациентов наблюдали нарушения функции почек, обусловленные гиперкальциемией - у 2 пациентов, дггвдратацжй - У 1, гиперурикемией - у 1, септическими осложнениями у 2 пациггоов. Как правило, данные нарушения носили приходящий характер и быстро купировались на фоне проводимой терапии.

Таблица 3.

Сводная таблица по результатам исследования (начало). Пояснения к таблице 3: УЬ-У ген вариабельного региона, .1Ь-3 ген вариабельного региона, 1р УЬ- изоэлектрическая точка вариабельного региона, 1р СРЯЗ- изозлектрическая точка СРЮ._

№ пол возраст тип Стадия по цилиндровая УЬ 1Ь 1р 1Р Аминокислотное

п/п цепи Рипе-8а1топ нефропатия УЬ СРЯЗ строение СРЮ

М1 м 57 к ША нет ЮКУ1-33*01 ЮЮ2*01 4,17 3,75 СХЗУРМЬРУТ

М2 м 48 к ШВ нет ЮКУ2-30*01 ШЮ1*01 6,49 7,55 М<ЗСТН\УРРОТ

мз ж 37 к ШВ нет ЮКУЗ-20*01 ЮЮ2*01 4,88 3,75 <5С?УСР8Р>)Т

М4 м 68 к ШВ нет ЮКУЗ-15*01 ЮЮ2*01 8,69 9,14 д<?у1к\уррут

М5 м 59 к ША нет ЮКУЗ-20*01 ЮКЛ*01 8,7 9,35 СХЗУСБЗРРЯЗ

Мб м 43 к ШВ нет ЮКУ 4-1*01 ЮКЛ*01 7,24 6,09 ООУУТТР!^

М7 м 54 к 111В нет ЮКУ4-1*01 ЮЮ4*01 8,16 6,09 ООУУЗГРЬТ

М8 ж 52 к 1НА нет ЮКУ1-№Л*01 ЮК15*01 8,17 6,09 ддуут8РР1т

М9 ж 57 к И1А нет ЮКУ1-9*01 ЮЮ5*01 7,25 6,1 С>дЬ^РР1Т

М10 м 52 к 11В нет ЮКУ1-5*03 КЖЛ*01 8,69 6,09 00YNTЬSWT

М11 ж 41 к ШВ нет ЮКУ 1-33*01 ЮКЛ*01 4,49 7,55 <}(}УШЬУ>УТ

М12 м 45 к ШВ нет ЮКУ1-33*01 1004*01 4,59 6,4 ОРУЕЗЯТРЬТ

М13 ж 46 к НА нет ЮКУ1-33*01 ЮЮ4*01 4,22 3,75 ООУРЭЬРЬТ

М14 м 61 к ШВ да ЮКУ2-28*01 ЮЮ4*01 4,84 6,1 М(?СЬЬТРЬТ

М15 ж 70 к ШВ да ЮКУЗ-20*01 ЮЮ2*01 7,24 6,09 ОРУСБЗРЬУТ

М16 м 18 к ШВ да ЮКУЗ-20*01 ЮЮ5*01 9,13 9,35 Одусизыг

М17 ж 67 к ШВ да ЮКУЗ-20*01 ЮЮ5*01 8,72 6,1 0дрср8рр1т

М18 м 71 к ШВ да ЮКУЗ-11*01 ЮЮ2*02 4,96 6,4 OERSNWPPGT

М19 м 40 к ШВ да ЮКУЗ-11*01 ЮЮ4*01 6,47 10,55 ООЯЗШРРУТ

М20 ж 68 к ШВ да КЗКУЗ-15*01 ЮЮЗ*01 7,42 7,55 QQYHNWPPLT

М21 ж 64 к ШВ да ЮКУ1-5*03 ЮЮ2*01 6,44 6,09 (ЗРУТЗРРРУТ

Таблица 3.

Сводная таблица по результатам исследования (продолжение). Пояснения к таблице 3: VI.-V ген вариабельного региона, ген вариабельного региона, 1р УЬ- изоэлектрическая точка вариабельного региона, 1р СОЮ- изоэлектрическая точка СЦГ13.

№ п/п пол возраст тип цепи Стадия по Оипе- 8а1шоп цилиндровая нефропатия УЬ ]Ь 1Р УЬ 1Р СБЯЗ Аминокислотное строение СОЯЗ

М22 м 48 к ШВ Да ЮКУ1-5*03 ЮЮ2*01 8,68 6,09 <3(}У№1ХУТ

М23 ж 76 к ШВ да ЮКУ1-5*01 ЮКЛ*01 6,21 9,35 нду.^нькт

М24 м 57 к пв да ЮКУ1-39*01 ЮЮ2*01 4,72 6,09 (^УКРУТ

М25 м 50 к ШВ да ЮК.У1-39*01 юкл*01 8,03 5,92 ддТУСТРРТ

М26 м 63 к ПА да ЮКУ1-33*01 ЮЮ5*01 5,44 6,1 00Р(№Р1Т

М27 ж 67 к ШВ да ЮКУ1-33*01 1СЮ2*01 6,43 3,75 QOYDNLPFT

М28 ж 51 к ШВ да ЮКУ2-28*01 ЮЫ2*01 4,87 6,09 мдАгдлрп

N1 м 68 X ШВ нет ЮЬУ 1-40*01 Ю1Л*01 4,82 6,33 дзуптвьясву

N2 ж 69 X НА нет ШЬУ1-44*01 Ю1ЛЗ*02 4,82 3,5 AAWDDSLNGPV

N3 м 42 X НА нет ЮЬУЗ-21*01 ЮЫ2*01 4,5 4,11 <5У\У00880НУ1

N4 ж 49 X ША нет ЮЬУЗ-1*01 Юи2*01 4,31 6,1 QSWATTTVL

N5 м 53 X ШВ да ЮЬУ1-44*01 ЮЫЗ*02 4,77 3,5 AAWDDTLNGPV

N6 м 52 X П1В да ЮЬУ1-44*01 ЮЫ2*01 7,42 3,51 ATWDDTLNGVI

N7 м 74 X ШВ да ЮЬУ1-47*01 Юи2*01 4,31 3,5 ATWDDTLSGУI

N8 м 62 X ШВ да ЮЬУЗ-21*01 ЮЫЗ*02 4,56 4,17 <ЗУ\У01580Н\УУ

N9 ж 51 X ШВ да ЮЬУЗ-21*02 ГС1Л2*01 4,28 5,29 QVWDSTTAHAL

N10 м 65 X ШВ да ШЬУ2-14*01 Ю1Л2*01 4,91 9,31 88У1КАТЬУ

N11 м 69 X ШВ да ЮЬУ1-40*01 Юи2*01 4,53 3,75 дЯУ08ТЬ80НУУ

2. Анализ использованных генов вариабельных регионов ЛЦ.

При анализе последовательностей генов вариабельного региона у всей группы больных ММ была установлена разная степень гомологии с терминальными VL-генами. В подавляющем большинстве случаев процент гомологии терминальным V генам к и X составил менее чем 98% за счет многочисленных мутаций (медиана 89%, мин -71%, макс - 97%). Таким образом, VL-гены, используемые миеломными клетками, во всех случаях обнаруживали признаки перенесенной соматической гипермутации, что свидетельствовало о постфолликулярном происхождении клеток этой опухоли.

В ходе мутационного процесса в терминальных центрах происходит селекция клонов, обладающих наибольшей аффинностью к данному антигену. В ходе созревания антител происходит неслучайное накопление мутаций, приводящих к аминокислотной(несино11имной) замене в районах, определяющих комплементарность (CDR). В каркасных районах (FWR) мутации распределены случайно. В случае VL-генов человека, в распоряжении исследователя имеется одна последовательность, и поэтому факт отбора мутаций можно выявить при сравнении частоты мутаций с аминокислотной заменой в CDR и FWR.

В отсутствие отрицательного или положительного селекционного воздействия на ген, мутационный процесс должен приводить к случайному и равномерному распределению мутаций. В случае иммуноглобулинов, селекционное воздействие осуществляется по белковому продукту, то есть отбираются мутации, приводящие к аминокислотным заменам (несинонимные).

В нашей группе исследованных пациентов выявляется кластерирование (накопление) несинонимных мутаций в районах CDR, т.е. последовательность VL имеет признаки целенаправленной селекции антигеном.

Характер использования VL-генов в нашей выборке больных ММ отличается от репертуара у здоровых доноров (табл. 4, 5).

В группе Vk -генов преимущественно представлено I семейство (50%), за счет IGKV1-33*0I (21%), семейства VkII и VkIII представлены не достаточно по сравнению с репертуаром у здоровых доноров. Среди JK-генов чаще всего использованы MI (42%), за счет IGKJ2*01{43%).

В группе больных с секрецией лямбда ЛЦ, преобладали гены I (55%), за счет ¡GLVl-44*0l(21%), и III (36%) семейств, VXII было представлено не достаточно, VXVI, VXV, VXVI, VXVII, VX.VIII, VXIX и VWi не были представлены вообще по сравнению с здоровыми добровольцами. Использование J -генов X. осуществлялось только за счет Ш1/Ш (100%), в то время как у здоровых добровольцев представлены преимущественно J).VT(54%) и в меньшей степени Ш(7%). Встречавшиеся сочетания V- и J-генов не повторялись чаще 2 раз.

Таблица 4.

Семейство V -генов к Пациенты с ММ абс.(%) Лимфоциты здоровых людей (%) [711 Р*

Ук1 14(50%) 21% <0,0001

УкП 3(11%) 24% 0,02

УкШ 9(32%) 50% 0,01

Ук1У 2(7%) 5% 0,76

Семейство ] -генов к Пациенты с ММ абс.(%) Лимфоциты здоровых людей (%) [711 Р*

М 5(18%) 29% 0,09

ЛкЛ 12(42%) 23% 0,005

МИ 1(4%) 8% 0,39

МУ 5(18%) 24% 0,38

1кУ 5(18%) 18% 0,9

Представленность УХ и JX-генов в нормальном Tai репертуаре и при

Семейство V -генов). Пациенты с ММ абс.(%) Лимфоциты здоровых людей (%) Г441 Р*

УХ1 6 (55%) 29,1% 0,002

VJ.II 1 (9%) 33,1% 0,001

УХШ 4 (36%) 15,7% 0,012

УХУ] - 5,8%

УХУ 3,5%

3,5%

УХУН 4,1%

УХУШ 1,2%

УХ1Х 0,6%

УХХ 3,5%

Семейство ] — генов X Пациенты с ММ абс.(%) Лимфоциты здоровых людей (%)Г441 Р*

т 7%

JX.II/III 11(100%) 39% <0,0001

ЯУ1 54%

■ достоверность гипотез проверяли с помощью критерия % с поправкой Иейтса на непрерывность. Статистически достоверные различия выделены полужирным начертанием.

Таким образом, при анализе использованных генов вариабельных регионов ЛЦ, мы установили факт постфолликулярного происхождения клеток опухоли, а также признаки целенаправленной селекции антигеном. Репертуар использованных генов вариабельного региона отличается от репертуара в популяции.

3. Сравнение использования УЬ и ЛЬ генов у больных с цилиндровой нефропатией и без нее.

Результаты представлены в таблицах 6 и 7. Различий в использовании конкретных V- и 1-генов ЛЦ в группе больных миеломной нефропатией и без нее получено не было.

Таблица 6.

Использование семейств У-генов )■ и к типов у больных с миеломной нефропатией н без нее.

Семейство V -генов Группы больных х2, Р

Семейство V -генов к Пациенты с ЦН, . абс.(%) Пациенты без ЦН, абс.(%)

Ук1 7(47%) 7(54%) р>0,05 Х2=ЗД р—0,36

УкП 2(13%) 1(8%)

УкШ 6(40%) 3(23%)

Ук1У 0 2(15%)

Семейство У -генов X Пациенты с ЦН, абс.(%) Пациенты без ЦН, абс.(%)

УМ 4(57%) 2(50%) р>0,05 Х2=0,9 р=0,63

УХП 1(14%) 0

УХШ 2(29%) 2(50%)

Таблица 7.

Использование семейств Л-генов X и к типов у больных с миеломной нефропатией и бо нее.

Семейство I-генов Группы больных г р

Семейство ¡-генов к Пациенты с ЦДабс. (%) Пациенты без ЦП,абс. (%)

3к1 4(31%) 1(7%) р>0,05 ¿=4,91 р=0,29

М1 4(31%) 8(52%)

МП 0 1(7%)

МУ 3(23%) 2(14%)

1кУ 2(15%) 3(20%)

Семейство I -генов X Пациенты с ЦН, абс. (%) Пациенты без ЦН, абс. (%)

Ш 0 0 р>0,05 Х2=0,016 р=0,898

1X11 3(75%) 5(71%)

ШП 1(25%) 2(29%)

4. Множественное выравнивание.

При проведении множественного выравнивания аминокислотных последовательностей ЛЦ с помощью программ С1из<а^2 и КАЬЮК значимых

различий между белками, полученными от больных ММ с цилиндровой нефропатией и без цилиндровой нефропатии, не наблюдалось (рис. 1,2,3,4). Наряду с этим, у больных ММ, не осложненной цилиндровой нефропатией, отмечалась несколько более высокая вариабельность последовательности, в особенности в 1\1-концевых районах белков, в сравнении с группой больных ММ и цилиндровой нефропатией.

Кластерные схемы являются графическим изображением попарного сравнения аминокислотных последовательностей с числовым эквивалентом - процентом схожести. Чем больше процент схожести аминокислотных последовательностей, тем ближе они расположены друг к другу в графической схеме. Независимый кластерный анализ первичной структуры вариабельного региона ЛЦ дает возможность объединить в группы больных, со сходной первичной структурой и общим филогенетическим происхождением ЛЦ. Ожидалось, что ЛЦ пациентов с цилиндровой нефропатией образуют отдельные кластеры, что позволит установить закономерности в аминокислотном строении вариабельных регионов, определяющие способность ЛЦ образовывать белковые цилиндры. В группе больных с секрецией ЛЦ Х-типа выделено 3 кластера, а в группе больных с секрецией ЛЦ к-типа 4 кластера. При этом оказалось, что больные с миеломной нефропатией равномерно распределены и не образуют отдельных кластеров (рис. 1,2).

Аналогичные результаты были получены в отношении гипервариабельных фрагментов ЛЦ - С0113, СР112 и С1Ж1. Различий в распределении полученных аминокислотных последовательностей СОЯЗ у больных с миеломной нефропатией и без нее не получены (рис. 3,4).

Помимо этого, нами была предпринята попытка обнаружения специфических мотивов в структурах вариабельных регионов у больных с миеломной нефропатией и без нее. Определение вторичной структуры этих фрагментов при помощи алгоритма РЬуге не позволило выявить никаких специфических участков — все имеющиеся в нашем распоряжении полипептиды распознавались программой как стандартные ЛЦ иммуноглобулинов, без каких бы то ни было значимых различий во вторичной структуре.

Таким образом, полученные нами данные не позволили выявить определенных закономерностей или различий в первичной и вторичной структуре ЛЦ у больных с миеломной нефропатией и без нее, которые могли бы служить предикторами развития нефропатии.

5. Анализ расчетной изоэлектрической точки вариабельных регионов и СБЮ.

В ранее опубликованных исследованиях пытались установить взаимосвязь между нефротоксичностыо ЛЦ и их изоэлектрической точкой, причем определяли как изоэлектрическую точку уропротеинов, так и расчетную на основании аминокислотного строения вариабельного региона ЛЦ. В нашем исследовании при анализе расчетной изоэлектрической точки вариабельного региона ЛЦ и СОИ.З достоверных различий в значениях изоэлектрической точки у больных с миеломной нефропатией и без нее получено не было (табл. 8).

Рисунок 1.

Независимый кластерный анализ структуры вариабельных регионов ЛЦ лямбда.

—тра.У1-40'щ_шг011_н -[жцшш'оГшгчньУ!

■ТЕ

-Иау1-47'01_ши2'01]_у|

-ГЩ10-УМ4,01_1СЦЗ'021_Н

-0И|1ОУ1.44'О1 „КиЗШ _У| -—щшиш.киг-од у|

-мзра.уз-21'Д1_ш2Р1ц<

-|Н8[1ст.2У01_киз'ог| у) —1«9|1<а.уз-21 ■ог.шг'о'я.П

НМ1Щ1С1.У2-14'01_Юи2'В11_У|"

Рисунок 2.

Независимый кластерный анализ структуры вариабельных регионов ЛЦ каппа.

-мцгекуюз'ш.кмг'ши Чмгедскушчи.юштиД

-М13[ЮКУ1-33*01 ККМиЦ N

-рнецшмочи внушил ■-|м 1 д юкуз^го *о 1 _Ю1С15 *о ТОП

Н1Щ1«<УЗ-114)1 _Ш4'01]_У |"

—шисю/з-К'оиаигчтл

—^Л20[ЮКУЗ-15^1 ЮЩ'ЙО!

-М8[ККУ№Г01_КК.К'01)Л -щюкутиаш'рщ

—мбцбкуз-го'с^ккл'о^н - М6ВС№4-1'а1 _Ш2'011_Н - М7[1СЮ/41 "01 "01 ^

Г"-2

-цштащз

- И10[ЮКУ Г-5 ТО JGK.il '011,Н

-У.12211СКУ1.5'03 №2'011 1.

НГ.123|1СКУ1-5'0Ц(ЖЛИ1ЬУ|

М2»[1СКУ1-39ЧИ_ЮКЦ2'01|.У

М25ра<У1-39'01_>аи2,ОМ_У

-М12ЦЙ(У143,01.Ш4ТИ)_И

-Ц12711СКУ1-33'01.К1и21111_У|

Пояснения к рисункам 1, 2: N1-11, М1-28 - порядковые номера, присвоенные пациентам; ЮЬУ_Юи, ЮКУ_ШК1 - гены, кодирующие вариабельный регион; N -пациенты без МН, У и выделенные рамкой - пациенты с МН.

Рисунок 3.

Независимый кластерный анализ структуры СБЮ ЛЦ лямбда.

—нца.ушш.кал'ао

ЧНИНО-УЩРПа-КРЦ У1

Г--И21Ш1.44,111_ШЗ'021_Н

ЦОДШИ-МТИ Ю1ДЧ21 У|

—Щдущ'щ кигчЩ

И9|1ауз-г)|П2_йи2чи1_у|

-вдштиошиц!

-¡нш[ау2-1щ_ш2'щ|_у|

Рисунок 4.

Независимый кластерный анализ структуры СОЮ ЛЦ каппа.

-шрсюм-ззицшгтщн -чедти-ззтй ктг-оц У|

-ташл-ззчн ют5чщ у|

-ШЦтЛ-ЗЗ'Ш.ШтЦ)

-М10|ИКУ1-5113_ККЛ111ЬН

-ШЗ[Ш1-И'01_Ш4и1и

-М71ККУ4-1,01.10Ц4101иН

-|М16|16КУ3^101.1Ш5|01) У|_

ЧМ22ЦСКУ1-5РЗ_Ш21И]_У|

-|М28[ЮКУ2-2В'01_ЮК02ЧИ

Ащшгарпа<лч)1|_у

3

—|Ы2<[1СКУ1-ЗЭ,Р1_Каи2'01ЦУ|

-|М25[К]КУ1-39'011Ш2'011У]

-МДЮКУ2-30«С1 ЮКЛШ] N

|М[Ю1№11'01_1Ш21021_У|

Ньчздскуяпи.ютчиьу!

->Л15|ШЗ-2ПЧ]1_т2'01)_У|

-кдакуз-япи.кйигчии!

-щкжд-гот юитц_

-МЧШтиЯШ'ШЩ

ЧМ2Ц1Ш1-6-СЗ_161Ц2И1ЬУ|

-цидакуз-к'оишгрц.и

-Ц20|ТОЗ-15-01_1С1ЦЗ'011,У|

Пояснения к рисункам 3,4: N1-11, М1-28 - порядковые номера, присвоенные пациентам; ЮЬ\МС!Ш, ЮКУ_ЮЮ - гены, кодирующие вариабельный регион; N -пациенты без МН, У и выделенные рамкой - пациенты с МН.

Таблица 8.

Анализ изоэлектрической точки вариабельного региона ЛЦ и CDR3._

Тип ЛЦ Изоэлектрическая точка вариабельного региона, Me Р

Больные ММ с МН Больные ММ без МН

X 4,56 3,75 р>0,05

к 6,44 7,24 р>0,05

Изоэлектрическая точка CDR3, Me

Больные ММ с МН Больные ММ без МН

X 4,66 5,1 р>0,05

к 6,1 6,09 р>0,05

Таким образом, можно утверждать, что расчетная изоэлектрическая точка вариабельного региона и CDR3 не может служить предиктором развития цилиндровой нефропатии.

6. Диализ клинических и лабораторных факторов, предсказывающих развитие цилиндровой нефропатии.

Цилиндровая нефропатия является самым частым и потенциально обратимым вариантом поражения почек. В связи с этим представляется особенно важным исследовать клинические/лабораторные показатели, которые позволяли бы предсказывать развитие этого осложнения миеломной болезни. Кроме того, в случае выявления устойчивой ассоциации между развитием цилиндровой нефропатии и структурой ЛЦ, был бы необходим анализ потенциальных вмешивающихся факторов. С учетом изложенного выше, в исследовании предусматривался моно- и многовариантный анализ факторов, ассоциирующихся с цилиндровой нефропатией.

В моновариантный анализ были включены пол, возраст (больше или меньше 65 лет), тип ЛЦ (каппа или лямбда), стадия Durie-Salmon, стадия по международной системе стадирования, семейства VL-генов, изоэлектрическая точка вариабельного региона ЛЦ, изоэлектрическая точка района CDR3, уровень pig в плазме, тип pig, количество белка Бенс-Джонса в моче, уровень белка в крови, уровень кальция в сыворотке, уровень бета-2-микроглобулина, уровень гемоглобина, уровень лейкоцитов, уровень тромбоцитов (табл. 9,10).

Таблица 9.

Критерий х2 Р

Пол 10 0,99

Возраст (больше или меньше 65 лет) 3 1,0

Тип ЛЦ каппа или лямбда 24,5 0,96

В таблицах представлены отдельно качественные и количественные признаки в связи с различием в критериях, использовавшихся для исследования ассоциации. Из всех проанализированных параметров достоверное значение имели только стадия по Випе-8а1топ, стадия по международной системе стадирования, количество белка в моче и уровень бета-2-микроглобулина.

В группе больных с уровнем белка Бенс-Джонса в моче более 2 г/л цилиндровая нефропатия наблюдалась в 12 (85%) случаях из 14. Если уровень белка в

моче составлял менее 2 г/л, нефропатия развивалась в 42% (11 больных из 26). Рубеж 2 г/л хорошо дискриминирует группы больных, однако индивидуальная предсказующая способность теста не велика (индекс Юдена 0,4).

Таблица 10.

Количественные признаки, включенные в моновариантный анализ.

Показатель Критерий Спирмена Р

Стадия Durie-Salmon 0,52 0,0006

Стадия по международной системе стадирования 0,47 0,003

Семейства VL-генов 0,14 0,38

Изоэлектрическая точка VL 0,14 0,39

Изоэлектрическая точка CDR3 0,052 0,745

Уровень pig в плазме -0.24 0,185

Тип pig 0.23 0,144

Количество белка Бенс-Джонса в моче 0,45 0,003

Уровень белка в крови -0,25 0,12

Уровень кальция в сыворотке 0,059 0,72

Уровепь бета-2-микроглобулииа 0,68 0,000008

Уровень гемоглобина -0,106 0,51

Уровень лейкоцитов 0.05 0,737

Уровень тромбоцитов -0,21 0,192

В группе больных без цилиндровой нефропатии медиана уровня бета-2-микроглобулина составила 5,3 мг/л (разброс 2,1 - 14,3, 25 - 75 персентиль = 3,6 - 10,5 мг/л). В группе больных с цилиндровой нефропатией медиана уровня бета-2-микроглобулина составила 15 мг/л (разброс 4,9 - 35, 25 - 75 персентиль = 11,8 - 22 мг/л). Различия между группами высоко достоверны (р=0,000001, X2).

Бета-2-микроглобулин входит в оценку стадий по международной системе стадирования. Концентрация этого белка повышается при ПН, поэтому этот показатель не может быть включен в многовариантный анализ. Концентрация белка Бенс-Джонса в моче входит в оценку стадий по Випе-8а1топ. В связи с этим проведение многовариантного анализа оказалось невозможным.

Таким образом, нам не удалось идентифицировать клинических и лабораторных факторов, не включенных в существующие системы стадирования, которые независимо предсказывали бы вероятность развития цилиндровой нефропатии.

Заключение.

Проведенный нами анализ структуры ЛЦ позволил установить определенные закономерности в использовании семейств VL и JL-генов миеломными клетками. Репертуар Vk и VX-генов, а также Jk и JX-генов носит специфический характер и не совпадает с частотой использования генов в нормальной популяции. В то же время различий в репертуаре семейств VL и JL генов у пациентов с цилиндровой нефропатией и без нее получено не было.

При анализе последовательностей генов вариабельного региона было установлено, что гомология терминальным генам была менее 97%. VL-гены, используемые миеломными клетками, во всех случаях обнаруживают признаки перенесенной соматической гипермутации, что свидетельствует о постфолликулярном происхождении клеток этой опухоли. У каждого пациента с множественной миеломой плазматические клетки синтезируют свой уникальный моноклональный продукт, его уникальность обеспечивается именно прошедшей соматической гипермутацией. Ранее существовала гипотеза, что миелома возникает на уровне стволовых клеток. Если бы это было так, то плазматические клетки были бы гетерогенны по секретируемому продукту. Проведенный анализ показал, что структура опухоли горизонтальная, поскольку плазматические клетки гомогенны, секретируют одинаковые по структуре иммуноглобулины.

Также в группе исследованных пациентов выявляется кластерирование несинонимных мутаций в районах CDR, т.е. последовательность VL имеет признаки целенаправленной селекции антигеном.

Таким образом, опухоль возникает из клетки, прошедшей антигензависимую дифференцировку. Полученные нами данные совпадают с литературными [Hadzidimitriou A. et al., 2006, Kosmas С. Et al., 1999, Sahota S.S. et al., 1997].

Цилиндровая нефропатия является, безусловно, лидирующим вариантом поражения почек при ММ, но это не позволяет исключить вероятность развития других типов нефропатии. Причем, именно цилиндровая нефропатия считается потенциально обратимой разновидностью поражения почек. В связи с этим, вариант нефропатии необходимо установить в дебюте заболевания, т.к. это влияет на выбор тактики лечения пациента. Например, в последнее время множество исследований посвящено использованию в заместительной почечной терапии фильтров, позволяющих селективно удалять свободные ЛЦ [Basnayake К. Et al., 2008, Hutchison С.А. et al., 2008]. Раннее применение данного вида терапии позволяет увеличить вероятность обратимости ПН.

В настоящее время единственным достоверным методом, с помощью которого можно установить вариант поражения почек при ММ, является биопсия почки. Безусловно, данный метод исследования является потенциально опасным, особенно, учитывая склонность пациентов с ММ к развитию кровотечений, дорогостоящим, требующим особого внимания к пациенту и наличия необходимой патологоанатомической базы. Исследование структуры ЛЦ могло бы быть эквивалентом, альтернативой биопсии почки, позволяющим упростить верификацию типа поражения почек.

На основании многолетнего опыта наблюдения за пациентами с ММ и поражением почек также возможно предположить тип поражения почек с

определенной долей вероятности, но только ретроспективно, анализируя характер течения заболевания. Поэтому мы провели в нашей работе моновариантный анализ с целью выявить клинические/лабораторные показатели, которые позволяли бы предсказывать развитие этого осложнения миеломной болезни. Кроме того, в случае выявления устойчивой ассоциации между развитием цилиндровой нефропатии и структурой ЛЦ был бы необходим анализ потенциальных вмешивающихся факторов. С учетом выше изложенного, в исследовании предусматривался моно- и многовариантный анализ факторов, ассоциирующихся с цилиндровой нефропатией. Нам не удалось идентифицировать клинические и лабораторные факторы, которые независимо предсказывали бы вероятность развития цилиндровой нефропатии.

Несмотря на огромное количество исследований, посвященных моделированию различных вариантов поражения почек при ММ, установлению связей между свойствами конкретной ЛЦ и формирующимся типом нефропатии, проведенное нами исследование абсолютно исключает наличие корреляции между вероятностью и тяжестью цилиндровой нефропатии и первичной структурой ЛЦ а также предсказанной вторичной структурой. Таким образом, основным фактором, который определяет способность ЛЦ связываться с белком Тамма-Хорсфолля, является третичная структура ЛЦ. Известно, что способность антител специфически связывать те или иные антигены может определяется их третичной структурой. Возможно, что нефротоксичность ЛЦ при цилиндровой нефропатии обусловлена структурными особенностями моно- или олигосахаридов, присоединяющихся к белку Бенс-Джонса, или другими причинами, для поиска которых необходимы дальнейшие исследования. По всей видимости, в данном случае имеет место именно такой механизм. К сожалению, имеющиеся в настоящее время в распоряжении молекулярных биологов биоинформационные инструменты не позволяют проводить сколько бы то ни было достоверное предсказание третичной структуры белка по его аминокислотной последовательности.

Учитывая все вышесказанное, можно сделать вывод, что данное исследование является одним из первых шагов в данном направлении.

Выводы

1. Строение первичной и вторичной структур вариабельных регионов легких цепей иммуноглобулинов, включая аминокислотный состав районов CDR и FWR, изоэлектрическую точку вариабельного региона и CDR3, распределение аминокислот с разным зарядом, не коррелирует с цилиндровой нефропатией. Вероятность развития цилиндровой нефропатии и тяжесть поражения почек невозможно прогнозировать на основании анализа нуклеотидной последовательности вариабельного региона легкой цепи иммуноглобулинов.

2. Использование семейств генов вариабельного региона легких цепей миеломными клетками носит специфический характер. В группе Vk -генов достоверно чаще представлено I семейство - 50% (р<0,0001) по сравнению с репертуаром у здоровых доноров. Среди jk-генов чаще всего использовалось jkII - 42% (р=0,005).

3. В группе больных с секрецией лямбда легких цепей, преобладали V гены I -55%(р=0,002) и III - 36%(р=0,012) семейств, II семейство было представлено не достаточно - 9%(р=0,001) по сравнению с репертуаром у здоровых доноров. Использование J -генов ). осуществлялось только за счет II/III семейств -100% (р<0,0001), в то время как у здоровых доноров представлены преимущественно VI (54%) и в меньшей степени I (7%) семейства.

4. Различий в репертуаре используемых генов вариабельного региона легких цепей у пациентов с цилиндровой нефропатией и без нее получено не было.

5. Используемые миеломными клетками гены вариабельного региона легких цепей во всех случаях обнаруживают признаки перенесенной соматической гипермутации, что свидетельствует о постфолликулярном происхождении клеток этой опухоли. Кластерирование несинонимных мутаций в районах CDR свидетельствует о возможном контакте с антигеном.

6. Статистический анализ позволил выявить достоверную корреляцию между стадией заболевания, определяемой по Durie-Salmon (р=0,0006) и по международной системе стадирования (р=0,003) и развитием цилиндровой нефропатии.

Список используемых сокращений.

CDR- complemetary-determining region FR - framework region VL - вариабельный регион легкой цепи БДЛЦ - болезнь депозитов легких цепей БДТЦ - болезнь депозитов тяжелых цепей

ВДХТ с ТСКК - высокодозная химиотерапия с трансплантацией стволовых клеток крови

ФГБУ ГНЦ Мипздравсоцразвития РФ - Федеральное Государственное

бюджетное учреждение гематологический научный центр Министерства

здравоохранения и социального развития Российской Федерации

кДНК - комплиментарная дезоксирибонуклеиновая кислота

ЛЦ - легкие цепи

ММ - множественная миелома

ОПН - острая почечная недостаточность

ПН - почечная недостаточность

ГОСТ - полихимиотерапия

ПЦР - полимеразноцепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

XT - химиотерапия

Список опубликованных работ по теме диссертации

1) Горчакова С.В., Рехтина И.Г. Современные представления о патогенезе миеломной нефропатии. Гематология и трансфузиология, 2008, т.53, №4, с. 20-24.

2) Горчакова С.В., Рехтина И.Г., Яцков К.В., Суханова Г.А., Голицина Е.П., Варшавский В.А., Бирюкова Л.С. Болезнь депозитов моноклональных иммуноглобулинов как редкий вариант поражения почек при множественной миеломе. Терапевтический архив, 2009, №7, С.78-82.

3) Горчакова С.В., Рехтина И.Г., Никитин Е.А., Каменский П.А. , Судариков А.Б., Бирюкова Л.С. Первичная структура вариабельного региона легких цепей в патогенезе миеломной нефропатии. Гематология и трансфузиология, 2009, т.54, №6, с. 28-33.

4) Рехтина И.Г., Голицина Е.П., Варшавский В.А., Горчакова С.В., Бирюкова Л.С. Обратимость тяжелой почечной недостаточности при миеломной болезни. Нефрология и диализ. T.l 1, №3, 2009, с. 257-262.

5) Gorchakova S. V., Rehtina I. G., Nikitin E. A., Biryukova L. S. «Amino Acid Sequence of the Variable Region of Light Chains in multiple myeloma patients». World Congress of Nephrology, Milan, May 22-26. 2009. Abstract 430.

Подписано в печать:

25.05.2011

Заказ № 5618 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499)788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность темы

Нефропатия- является ведущим клиническим проявлением^ при множественной ■ миеломе (ММ). В момент диагностики ММ- признаки, почечной» недостаточности (ПН) выявляют в 40-50%; случаев [10,28,31, 42,57,66,68,116,119,122]. Главным- патогенетическим' звеном в развитии миеломной нефропатии' является секреция • легких цепей (ЛЦ) иммуноглобулинов, которые могут вызывать повреждения различных структур нефрона: как канальцев, так и клубочков. Наиболее частым» (в 6387% случаях) вариантом поражения почек при ММ является цилиндровая нефропатия [111]. Под термином «цилиндровая нефропатия» (миеломная нефропатия, cast nephropathy) понимают поражение почек вследствие формирования* белковых преципитатов, (цилиндров или слепков) в дистальных отделах канальцев и собирательных трубках. Цилиндры вызывают обструкцию дистальных отделов канальцев и> собирательных трубочек, что приводит к. интерстициальному воспалению и фиброзу. Клинически выявляют признаки уремии с высоким уровнем азотемии. Эффективное лечение ММ приводит к улучшению функции почек в 50%. случаев цилиндровой нефропатии [18].

Образование цилиндров происходит при взаимодействии CDR3 (англ. complemetary-determining region) участка вариабельного домена ЛЦ и гликопротеида Тамма-Хорсфолла, секретируемого эпителием восходящего отдела петли Генле [63].

В патогенезе нефротоксичности определяющее значение имеют физико-химические свойства ЛЦ, их тропность к различным отделам нефрона и степень адгезии [8,37,106,117,128]. В частности, известны случаи высокого уровня секреции белка Бенс-Джонса в течение длительного времени7 без нарушения функции почек [119]. В то же время при секреции ЛЦ в минимальном количестве может развиться^ тяжелое необратимое поражение почек. В экспериментальных исследованиях in vitro было обнаружено [143], что способность ЛЦ взаимодействовать с гликопротеидом Тамма-Хорсфолла различна и зависит от строения CDR3 участка вариабельного домена ЛЦ.

Таким образом, CDR3 участок вариабельного домена, возможно, определяет нефротоксичные свойства ЛЦ и их способность вызывать развитие цилиндровой нефропатии при ММ. Изучение строения CDR3 участка вариабельного домена во взаимосвязи с клиническими проявлениями ММ позволит углубить представления о патогенезе формирования цилиндровой нефропатии в каждом конкретном случае. Цель исследования

Установить значение структуры вариабельного региона и конкретно CDR3 участка ЛЦ и их изоэлектрической точки в патогенезе цилиндровой > нефропатии у больных ММ. Задачи исследования

1. Определить нуклеотидные последовательности вариабельных регионов ЛЦ, синтезируемых плазматическими клетками у больных ММ с цилиндровой нефропатией и без нее.

2. Провести анализ нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей вариабельных регионов ЛЦ, включающий:

• оценку репертуара используемых V и J генов ЛЦ у больных ММ с цилиндровой нефропатией и без нее,

• установление степени гомологии V генов ЛЦ терминальным генам

• рассчет изоэлектрической точки для вариабельного региона и CDR3 каждой ЛЦ, сравнение вариабельных регионов у больных ММ с цилиндровой нефропатией и без нее, используя методы компьютерного моделирования.

3. Проанализировать вероятность развития цилиндровой нефропатии и тяжесть. поражения на; основании анализа нуклеотидной последовательности вариабельного региона ЛЦ.

4. Исследовать клинические и лабораторные факторы риска развития? цилиндровой нефропатии.

Научная новизна:

Установлена первичная структура вариабельного региона и СОК.З легких цепей; а также их изоэлектрическая точка у пациентов с миеломной нефропатией ,и без нее. Изучено прогностическое значение этих показателей при развитии цилиндровой нефропатии; Выявлен репертуар используемых семейств генов вариабельного региона у пациентов с цилиндровой . нефропатией и без нее.

Практическая ценность.

В результате проведенных исследований; многие данные получены впервые: определены закономерности в использований определенных семейств генов вариабельных регионов в синтезе легких цепей при множественной миеломе,: установлено, что у пациентов с миеломной нефропатией и без нее нет различий в репертуаре используемых семейств генов вариабельных регионов. В результате проведенных исследований выявлено, что на основании первичной и вторичной структуры вариабельных регионов легких цепей, аминокислотного состава СОЮ, изоэлектрической: точки вариабельного региона легкой цепи и СОКЗ, невозможно установить их способность к образованию цилиндров с белком Тамма-Хорсфолля в почечных канальцах.

Положения, выносимые на защиту.

1. Для пациентов с множественной миеломой характерно использование специфического репертуара семейств генов вариабельного региона легких цепей. В группе Ук-генов достоверно чаще представлено I семейство. Среди .Гк-генов чаще всего используется 1кП. В группе больных с секрецией лямбда легких цепей, преобладают V гены I и III семейств. Использование I —генов X осуществляется только за счет ПЯП семейств.

2. Для пациентов с цилиндровой нефропатией характерно использование того же репертуара генов вариабельного региона легких цепей, что и для пациентов без цилиндровой нефропатии.

3. Гены вариабельного региона легких цепей, используемые миеломными клетками, совпадают с терминальными генами менее чем на 98%, что говорит о многочисленных мутациях. Накопление мутаций с заменой аминокислот в районах СОЯ свидетельствует о возможном контакте с антигеном.

4. На основании анализа первичной и вторичной структуры вариабельного региона легких цепей невозможно прогнозировать ее способность к образованию цилиндров с белком Тамма-Хорсфолля в почечных канальцах.

5. Развитие цилиндровой нефропатии коррелирует со стадией заболевания, определяемой по Оипе-Бакпоп и по международной системе стадирования.

Выводы1

1. Строение первичной и вторичной структур вариабельных регионов легких^ цепей.иммуноглобулинов, включая аминокислотный состав районов CDR и FWR, изоэлектрическую точку вариабельного региона и CDR3, распределение аминокислот с разным1 зарядом, не коррелирует с цилиндровой нефропатией. Вероятность развития цилиндровой нефропатии и тяжесть поражения почек невозможно- прогнозировать на основании, анализа нуклеотидной последовательности- вариабельного региона легкой цепи иммуноглобулинов.

2. Использование семейств« генов вариабельного региона легких цепей миеломными клетками носит специфический характер. В группе Ук -генов достоверно чаще представлено I семейство - 50% (р<0,0001) по сравнению с репертуаром у здоровых доноров. Среди JK-генов чаще всего использовалось JkII - 42% (р=0,005).

3. В группе больных с секрецией лямбда легких цепей, преобладали V гены I -55%(р=0,002) и III - Зб%(р=0,012) семейств, II семейство было представлено не достаточно - 9%(р=0,001) по сравнению с репертуаром у здоровых доноров. Использование J -генов X осуществлялось только за счет II/III семейств - 100% (р<0,0001), в то время как у здоровых доноров представлены преимущественно VI (54%) и в меньшей степени I (7%) семейства.

4. Различий в репертуаре используемых генов вариабельного региона легких цепей у пациентов с цилиндровой нефропатией и без нее получено не было.

5. Используемые миеломными клетками гены вариабельного региона легких цепей во всех случаях обнаруживают признаки перенесенной соматической гипермутации, что свидетельствует о постфолликулярном происхождении клеток этой опухоли. Кпастерирование несинонимных мутаций в районах CDR свидетельствует о возможном контакте с антигеном.

6. Статистический анализ позволил выявить достоверную корреляцию между стадией заболевания, определяемой по Durie-Salmon (р=0,0006) и по международной системе стадирования (р=0,003) и развитием цилиндровой нефропатии.

Заключение.

Проведенный, нами анализ структуры» ЛЦ позволил установить определенные закономерности в использовании* семейств УЬ и 1Ь-генов миеломными клетками. Репертуар Ук и- УА,-генов, а также .Гк и А-генов • носит специфический характер и не совпадает с частотой использования генов в нормальной популяции. В! то же время различий в репертуаре семейств УЪ и Л, генов у пациентов с цилиндровой нефропатией и без нее получено не было.

При- анализе последовательностей генов вариабельного региона было, установлено, что гомология-терминальному гену была менее 97%. УЪ-гены, используемые миеломными клетками, во всех случаях обнаруживают признаки перенесенной соматической* гипермутации, что свидетельствует о. постфолликулярном происхождении клеток этой опухоли. У каждого* пациента с множественной миеломой плазматические клетки синтезируют свой уникальный моноклональный продукт, его уникальность обеспечивается, именно прошедшей соматической гипермутацией. Ранее существовала гипотеза, что миелома возникает на уровне стволовых клеток. Если бы это было так, то плазматические клетки были бы гетерогенны по секретируемому продукту. Проведенный анализ показал, что структура опухоли горизонтальная, поскольку плазматические клетки гомогенны, секретируют одинаковые по структуре иммуноглобулины.

Также в группе исследованных пациентов выявляется кластерирование несинонимных мутаций в районах СОЯ, т.е. последовательность УЬ имеет признаки целенаправленной селекции антигеном.

Таким образом, опухоль возникает из клетки, прошедшей антигензависимую дифференцировку. Полученные нами данные совпадают с литературными [55,81,115].

Цилиндровая не фропатия является безусловно лидирующим вариантом поражения^ почек при ММ, но это не позволяет исключить вероятность развития^ других типов4 нефропатии. Причем, именно^ цилиндровая нефропатия. считается* потенциально обратимой разновидностью» поражения, почек [79.131]. В связи с этим вариант нефропатии необходимо установить в дебюте заболевания, т.к. это* влияет на выбор тактики лечения пациента. Например, в последнее время множество исследований посвящено использованию в заместительной почечной терапии фильтров, позволяющих селективно удалять свободные ЛЦ [20,64,112]. Раннее применение данного вида терапии позволяет увеличить вероятность обратимости почечной недостаточности.

В настоящее время единственным достоверным методом с помощью^ которого можно установить вариант поражения почек при ММ является биопсия почки. Безусловно данный метод исследования является потенциально опасным, особенно учитывая склонность пациентов с ММ к развитию кровотечений, дорогостоящим, требующим особого внимания к пациенту и наличия необходимой патологоанатомической базы. Исследование структуры ЛЦ могло бы быть эквивалентом, альтернативой биопсии почки, позволяющим упростить верификацию типа поражения почек.

На основании многолетнего опыта наблюдения за пациентами с ММ и поражением почек также возможно предположить тип поражения почек с определенной долей вероятности, но только ретроспективно, анализируя характер течения заболевания. Поэтому мы провели в нашей работе моновариантный анализ с целью выявить клинические/лабораторные показатели, которые позволяли бы предсказывать развитие этого осложнения миеломной болезни. Кроме того, в случае выявления устойчивой ассоциации между развитием цилиндровой нефропатией и структурой ЛЦ был бы необходим анализ потенциальных вмешивающихся факторов. G учетом изложенного* выше, в исследование предусматривался моно- и многовариантный анализ факторов, ассоциирующихся* с цилиндровой^ нефропатией. Нам не удалось- идентифицировать клинических и» лабораторных факторов; которые независимо предсказывали бы вероятность развития цилиндровой нефропатии.

Несмотря на огромное количество, исследований посвященных моделированию различных вариантов поражения почек при ММ, установлению связей, между свойствами конкретной ЛЦ и формирующимся-типом, нефропатии, проведенное нами исследование абсолютно исключает наличие корреляции* между вероятностью' и тяжестью цилиндровой нефропатии и первичной структурой ЛЦ, а также предсказанной вторичной структурой. Таким образом, основным фактором который определяет способность ЛЦ связываться с белком Тамма-Хорсфолля является третичная структура ЛЦ. Известно, что способность антител специфически связывать те или иные антигены- может определяется их третичной структурой. Возможно, что нефротоксичность ЛЦ при цилиндровой нефропатии обусловлена структурными особенностями моно- или олигосахаридов, присоединяющихся к белку Бенс-Джонса, или другими причинами для поиска которых необходимы дальнейшие исследования. По всей видимости, в данном случае имеет место именно такой механизм. К сожалению, имеющиеся в настоящее время в распоряжении молекулярных биологов биоинформационные инструменты не позволяют проводить сколько бы то ни было достоверное предсказание третичной структуры белка по его аминокислотной последовательности.

Учитывая' все вышесказанное можно сделать вывод, что данное исследование является одним из первых шагов в данном направлении.