Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Сравнительный анализ способов повышения гемосовместимости медицинских изделий

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ

ФГУ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ»

На правах рукописи

НЕМЕЦ Евгений Абрамович

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СПОСОБОВ ПОВЫШЕНИЯ ГЕМОСОВМЕСТИМОСТИ МЕДИЦИНСКИХ ИЗДЕЛИЙ (экспериментальное исследование)

14.00.41 - Трансплантология и искусственные органы

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Центре по исследованию биоматериалов ФГУ «Научно-исследовательского института трансплантологии и искусственных органов»

Росздрава.

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор

Доктор химических наук, профессор

Доктор медицинских наук

Севастьянов Виктор Иванович

Иткин Георгий Пинкусович Валуев Лев Иванович Давыдов Дмитрий Викторович

Ведущая организация:

Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН.

Защита состоится «_»_2005 года.

в часов на заседании диссертационного совета Д.208.055.01

при ФГУ «НИИ трансплантологии и искусственных органов» Росздрава

по адресу Москва, Щукинская ул., д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

ФГУ «НИИ трансплантологии и искусственных органов» Росздрава.

Автореферат диссертации разослан

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.055.01 д.м.н., профессор

О.П. Шевченко

М-ч

9

ZbtiUO

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы

Неповрежденная интима кровеносных сосудов представляет собой активную атромбогенную поверхность с гидрофильно-гидрофобной наноструктурой и с контролируемым выходом биологически активных веществ (БАВ). В результате на границе раздела интима/кровь поддерживается динамическое равновесие между системами активации и ингибирования свертывания крови как на молекулярном, так и на клеточном уровне.

Для предотвращения тромбообразования при контакте чужеродной поверхности с кровью необходимо постоянное введение в кровоток БАВ различной природы. Однако гепарин (Гп), наиболее распространенный в клинической практике антикоагулянт, может вызывать кровотечения, гепарин-индуцирован-ную тромбоцитопению, влиять на метаболизм липидов и т.д. (Greisler Н.Р. et al., 1989; Schräder J. et al., 1990).

Для нейтрализации антикоагулянтного эффекта гепарина и предотвращения постоперативного кровотечения используют введение антагониста гепарина -протамин сульфата. Однако его применение сопровождается рядом побочных реакций от средней тяжести гипотензии до тяжелого сердечно-сосудистого коллапса, вазодиляцией. брадикардией, аккумуляцией тромбоцитов в легких и

рядом других (Katz N.M., et al. 1987; Weiler J.M. et al., 1990;5; Miura Y. et al.,

Избежать или уменьшить отрицательные последствия за счет снижения концентрации антикоагулянтов в кровотоке возможно путем повышения гемо-совместимости применяемых систем и изделий медицинского назначения.

Попытки одновременно достичь оптимальных физико-механических и ге-мосовместимых свойств синтетических биоматериалов на стадии их синтеза успехом не увенчались. В связи с этим, основные усилия исследователей сконцентрированы на повышение биологической безопасности, в том числе, и гемо-совместимости, промышленно выпускаемых материалов и изделий медицин-

1990).

ского назначения.

Существующие и разрабатываемые способы модифицирования медицинских изделий направлены на изменение физико-химических свойств поверхности (химический состав, степень гидрофильности, заряд, структура поверхности и др.) с использованием широкого ряда физических, химических и физико-химических методов.

Последние годы наблюдается интенсивный рост исследований, связанных с разработкой методов модифицирования, способных придавать поверхности физические или биологические свойства клеток и тканей (Севастьянов В.И., Немец Е.А., 1999). Тем не менее многие из предложенных методов модифицирования либо мало эффективны, либо требуют больших затрат для внедрения в существующие технологии промышленного производства медицинских материалов и изделий. С одной стороны это обусловлено сложностью процессов взаимодействия белковых и клеточных компонентов крови с чужеродной поверхностью, с другой, - с отсутствием знаний, касающихся специфики функционирования биологически-активных веществ в иммобилизованном состоянии.

Исходя из концепции «комплементарное™», необходимым и достаточным условием гемосовместимости чужеродной поверхности является попарное равенство и одинаковое распределение полярных и неполярных составляющих поверхностной энергии твердого тела и биологических структур (Севастьянов В.И., 1991 г.). Нами было высказано предположение, что одним из способов реализации концепции «комплементарности» могут быть методы модифицирования, основанные на имитирование антикоагулянтной и антиагрегантной активности эндотелия, а также гидрофильно-гидрофобной наноструктуры клеточных мембран.

Цель исследования:

Целью данной работы было разработать, теоретически и экспериментально обосновать эффективные способы повышения гемосовместимости медицинских изделий, основанные на имитировании основных свойств внутренней поверхности кровеносных сосудов.

Задачи исследования

1. Сформулировать и экспериментально обосновать подходы к повышению гемосовместимых свойств материалов и изделий медицинского назначения.

2. Разработать метод оценки тромборезистентных свойств биоматериалов в условиях in vitro с использованием плазмы крови человека.

3. Провести сравнительный анализ влияния иммобилизации гепарина и ингибиторов агрегации тромбоцитов на изменение характера взаимодействия поверхности биоматериалов с компонентами крови.

4. Изучить механизм взаимодействия иммобилизованных биологически-активных веществ с белковыми и клеточными компонентами крови.

5. Разработать и исследовать биологические свойства аминосодержащих поверхностей и покрытий, обладающих аффинностью к гепарину, а также поверхностей с гидрофильно-гидрофобной наноструктурой.

Научная новизна исследования

1. Сформулированы и экспериментально обоснованы способы повышения ге-мосовместимости биоматериалов, основанные на имитировании биологической активности эндотелия и гидрофильно-гидрофобной наноструктуры клеточных мембран.

2. Разработан экспресс-метод оценки тромбогенности материалов и изделий медицинского назначения в условиях in vitro с использованием рекальцифи-цированной плазмы крови человека.

3. Показано, что ключевую роль во взаимодействии гепаринизированной поверхности с белковыми и форменными компонентами крови играет относительное количество гепарина, сохранившего свою активность в результате иммобилизации;

4. Установлено, что причиной повышения гемосовместимости покрытий в присутствии ингибиторов агрегации тромбоцитов является изменение характера адсорбции белков, а не ингибирование процессов активации клеток.

5. Показано, что для максимально прочного связывания гепарина целесообразно использовать биоматериалы и покрытия с третичными аминогруппами.

Практическая значимость

Метод с использованием рекальцифицированной плазмы крови человека повышает достоверность оценки тромборезистентных свойств поверхности биоматериалов в условиях in vitro.

Предложенные способы модифицирования поверхности биоматериалов, основанные на имитировании гидрофильно-гидрофобной наноструктуры клеточных мембран, позволяют существенно повысить их био- и гемосовместимые свойства.

Разработано три вида модифицирующих покрытий (на основе аргинина, полимочевины и полиамина) с высокой аффинностью к гепарину, обладающих хорошей адгезией к широкому кругу материалов синтетического и биологического происхождения.

Разработанные методы гепаринизации не только улучшают тромборези-стентные свойства поверхности различных изделий медицинского назначения, но и дают возможность снизить уровень системной гепаринизации.

Пути практической реализации результатов работы

Методы модифицирования поверхности биоматериалов, основанные на имитировании биологической активности эндотелия, а также гидрофильно-гидрофобной наноструктуры клеточных мембран, могут быть внедрены на предприятия, выпускающие катетеры, гемодиализаторы, протезы кровеносных сосудов, оксигенаторы крови, интраокулярные линзы, биологические сосудистые протезы малого диаметра и т.д.

Метод с использованием рекальцифицированной плазмы крови человека может быть применен в лабораторно-клинической практике для скриниг-ана-лиза образцов материалов медицинского назначения, а также для оценки эффективности технологии модификации их поверхности. В настоящее время данный метод внедрен в практику испытательной лаборатории биологической безопасности медицинских изделий Центра по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО Росздрава.

Апробация работы

Материалы и основные положения диссертации изложены на:

- 2-м научно-техническом семинаре «Гемо- и биосовместимые материалы» (Суздаль) в 1990 г.;

- Международном семинаре « Искусственные органы: теория и практика применения мембран в гемодиализе» (Варшава, Польша, 1992);

- 11 -ой ежегодной конференции по исследованиям в области биомедицинской инженерии Хьюстонского общества по инженерии в медицине и биологии (Хьюстон, США, 1993 г.);

- 39-м ежегодном заседании ASAIO (Новый Орлеан, США,1993 г.);

- Международном симпозиуме «Биоматериалы и системы доставки лекарств» (Сеул, Корея, 2000 г.);

- Российско-американском научно-техническом семинаре «Биоматериалы: разработка, исследование, применение», (Саров, 2000 г.)

- 1-м, 2-м и 3-м Всероссийских съездах по трансплантологии и искусственным органам, (Москва, 1998,2002,2005 гг.);

- 5-м семинаре научного консультативного комитета ISTC «Нанотехнологии в области физики, химии и биотехнологии», (Санкт-Петербург, 2002 г.);

- ХХХ-ом ежегодном конгрессе ESAO (Краков, Польша, 2003 г.);

- XI-ой научно-технической конференции: Вакуумная наука и техника (Судак, Украина, 2004 г.)

Публикации

Результаты проведенных исследований отражены в 40 печатных работах в отечественной и зарубежной печати, 4 патентах и авторских свидетельствах СССР и РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и приложений. Работа изложена на 226 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы, 36 иллюстраций, список цитируемой литературы из 272 наименований отечественных и зарубежных авторов.

Содержание работы.

Глава 1. Разработка новых методов исследования гемосовместимых свойств материалов и изделий медицинского назначения.

Для отработки методов исследования тромборезистентности биоматериалов были изготовлены поверхности, отличающиеся природой концевой функциональной группы. Образцы стекла в виде гранул (СГ) обрабатывались растворами органосилоксанов, общей формулы:

(ROhSiRj,

гдеЛ = -СНз,-С2Н5;

Rj =: [-СНг-СН=СН2] аллильная группа (Алл);

[-<CH2)3-NCO] изоцианогруппа (Иц);

[-(CI^j-SH] меркаптогруппа (Мер);

KCH2)3-NH2] первичная аминогруппа (Ам1);

КСН2)3- СН —yZHi ] эпоксшруппа (Эп).

Предварительные исследования показали целесообразность использования времени рекальцификации плазмы (ВРП) крови человека. Исследуемые образцы инкубировали в цитратной плазме крови непосредственно в ячейке гемокоа-гулометра («Fibrintimer II», Behring, Германия) при 37 °С, затем плазму крови рекальцифицировали 0,025 мМ СаС12 и регистрировали время свертывания.

При повышении удельной площади СГ с 34 до 170 см^мл наблюдалось увеличение точности определения ВРП в результате уменьшения значений среднеквадратичных отклонений (Рис. 1).

В процесс свертывания крови существенный вклад вносит тромбо цитарный путь активации гемостаза. Было предположено, что время рекальцификации тромбоцитарной плазмы более точно отражает реальный механизм свертывания крови, индуцируемый контактом с чужеродной поверхностью.

В качестве количественного критерия был предложен относительный показатель тромбогенности ОПТ,, не зависящий от индивидуальных свойств плазмы донора и удельной поверхности образца:

ВРП, - ВРП;обр

ОПТ, =--------------------------х 100%,

ВРП, - ВРДСГ

где 1 = о, тр. - бестромбоцитарная или тромбоцитарная плазма, ВРП, и ВРП,о6р (СГ) - время рекальцификации исходной плазмы и плазмы после инкубации с исследуемым образцом (обр.) или не модифицированными стеклянными гранулами (СГ), соответственно.

(а )- СГ; (Е223 ) - СГ-Алк; ) - СГ-Алл; ) - СГ-Иц; )-СГ-Ам1.

34 см2/мл

172 см2/мл

Рисунок 1. Влияние природы поверхности и удельной площади контакта на время рекальцификации плазмы крови. Время инкубащии 3 мин.

Если исследуемая поверхность слабо активирует свертывание, то ВРП,0615 близко к ВРП; исходной плазмы, а параметр ОПТ; стремится к нулю. Чем больше исследуемый образец активирует свертывающую систему, тем выше ОПТ;. Значение ОПТ; может быть и больше 100%, что свидетельствует о более высокой тромбогенности исследуемого образца, по сравнению со стеклом. Для поверхностей, обладающих антикоагулянтными свойствами или активирующих фибринолитическую систему, ОПТ, < 0 (Таблицы 1 и 2).

10

Таблица 1.

Значения ОПТ0 для плазмы, полученной из разных источников

Образец Контр. плазма ВеИгн^ Контр, плазма Яепаш Контр, плазма 81лта Бестромбоцитарная плазма донора Среднее

№1 №2 №3 №4 №5

СГ-Мер 78 81 82 77 79 84 89 90 82,5 ±4.9

СГ-Алл 92 94 89 88 95 97 99 102 94,5 ±4,8

СГ-Иц 49 48 - 44 - 52 47 56 49,3 ± 3,8

СГ-АмЗ 16 29 19 17 10 36 28 35 23,8 ±9,5

Таблица 2.

Значения ОПТ^ для плазмы, полученной от разных доноров.

Образец Тромбоцитарная плазма донора Среднее

№ 1 №2 №3 №4 №5

СГ-Мер 92 100 96 95 94 95,4 ±2,7

СГ-Алл 100 104 100 99 100 100,6 ± 1,7

СГ-Иц 67 64 61 64 65 64,2 ±1,9

СГ-АмЗ 63 54 50 55 56 55,6 ± 4,2

Сравнительный анализ значений параметров ОПТ0 и ОПТ-ф дает возможность определить доминирующую роль контактной активации или тромбоци-тарного пути свертывающей системы в тромбогенность поверхности.

Так, например, наименьшее изменение времени рекальцификации бестром-боцитарной плазмы (наименьший ОПТ0) наблюдается для поверхности СГ-АмЗ с концевой третичной аминогруппой. В то же время, при исследовании этого же образца в тромбоцитарной плазме параметр ОПТтр. в два раза превышает значения ОПТ0. Следовательно, тромбогенность поверхности СГ-АмЗ связана, главным образом, с активацией тромбоцитарного пути свертывания крови.

Для образцов с высокой степенью контактной активации (СГ-Мер, СГ-Алл) переход от бестромбоцитарной плазмы к тромбоцитарной сопровождается лишь незначительным повышением ОПТ^, что свидетельствует о преоблада-

нии внутреннего пути свертывания крови в результате контакта с образцами стекла, модифицированных органосилоксанами с концевыми меркапто- и ал-лильными группами.

Таким образом, для первичного скрининг анализа тромборезистентных свойств биоматериалов имеет смысл применять двухступенчатую систему тестов. Образцы, значения ОПТ0 которых не превышает 50% в эксперименте с применением бестромбоцитарной плазмы, исследуют на тромбогенность в тромбоцитарной плазме здоровых доноров (ОПТтр).

Глава 2. Ковалентная иммобилизация биологически-активных веществ как способ повышения гемосовместимости медицинских материалов.

Гепаринизация материалов заключалась в обработке поверхности распространенных полимеров медицинского назначения - полиэтилена высокой плотности (ПЭ), поливинилхлорида (ПВХ) и полиуретана «Витур» (ПУ) последовательно растворами белка и гепарина с ковалентной фиксацией адсорбированного комплекса белок-гепарин глютаровым альдегидом (Новикова С.П. и др., 1984). Ингибиторы агрегации тромбоцитов (ацетилсалициловая кислота (АСК) или дипиридамол (Дп)) добавляли непосредственно в раствор Гп.

В присутствии АСК количество иммобилизованного Гп падает (Табл. 4), что объясняется конкуренцией за места связывания на поверхности между двумя отрицательно заряженными соединениями. Добавление же положительно заряженного Дп значительно повышает количество иммобилизованного гепарина, вследствие его концентрирования в приповерхностном слое.

В плазме крови присутствуют белки, обладающие способностью к специфическому связыванию гепарина. Это свойство было использовано для концентрирования Гп в приповерхностном слое путем замены при обработке поверхности биоматериалов раствора альбумина на плазму крови человека. В результате количество иммобилизованного гепарина увеличилось (См. табл. 4).

Важной характеристикой модифицирующего покрытия является устойчивость иммобилизованного Гп к десорбции при контакте с кровью. Наименьшая

десорбция в плазму крови свойственна образцам с гепарином, ковалентно связанным непосредственно с поверхностью полимеров (См. табл. 4). Введение АСК и Дп, а также замена СА на плазму, оказывает на иммобилизованный Гп стабилизирующее воздействие.

Таблица 4.

Активность и устойчивость гепарина на поверхности биоматериалов в зависимости от способа его иммобилизации.

Полимер Модификация* Расчетная активность гепарина, Ед/смЧО2 Десорбция Гп в плазму крови

Ед/смЧО2 % от исходного

ПУ Гп 3,89 ± 0,22 0,17 ±0,01 4

СА-Гп 2,39 ±0,07 0,59 ±0,02 25

СА-Гп-АСК 1,40 ±0,03 0,29 ±0,01 21

СА-Гп-Дп 2,89 ± 0,07 0,61 ± 0,03 21

Пл-Гп 2,89 ± 0,06 0,46 ± 0,02 16

ПЭ СА-Гп 3,39 ±0,11 0,94 ±0,02 28

СА-Гп-АСК 2,02 ±0,05 0,40 ± 0,03 20

СА-Гп-Дп 3,99 ±0,12 1,01 ±0,05 25

Пл-Гп 4,03 ±0,12 0,73 ±0,04 18

ПВХ Гп 3,72 ± 0,34 0,09 ± 0,01 3

СА-Гп 2,65 ± 0,06 0,86 ±0,04 32

СА-Гп-АСК 1,78 ±0,01 0,41 ±0,02 23

СА-Гп-Дп 3,82 ± 0,09 0,95 ± 0,07 25

Пл-Гп 3,98 ± 0,09 0,60 ±0,03 15

* - концентрация Дп и А С К -0,5 мг/мл

Другой важной характеристикой гепаринизированной поверхности является активность иммобилизованного Гп. В результате фиксации на поверхности биоматериалов лишь часть молекул гепарина сохраняет активность. Для оценки влияния способа иммобилизации на активность Гп было предложено рассчитывать долю активного гепарина (ДАТ), равную доле молекул Гп, сохранивших

свою активность в поверхностно-связанном состоянии и выраженную в % от общего количества иммобилизованного антикоагулянта (Табл. 5).

Несмотря на большое количество Гп, иммобилизованного непосредственно на поверхности биоматериалов, его активность незначительна (См. табл. 5).

Добавление АСК приводит к уменьшению общего количества иммобилизованного Гп, однако его устойчивость к десорбции и ДАТ при этом повышаются (См. табл. 5). В результате активность Гп на поверхности полимерных материалов, обработанных СА-Гп-АСК, сравнима с результатами обработки СА-Гп. Добавление Дп сопровождается повышением общего количества иммобилизованного Гп, его относительной активности и устойчивости к десорбции.

Таблица 5.

Активность иммобилизованного гепарина

Полимер Модификация* Расчетная активность Гп, Ед/смМО2** Истинная активность Гп, Ед/смМО2** (ДАГ), %

Гп 3,72 ± 0,28 0,11 ±0,02 3

СА-Гп 1,80 ±0,06 0,50 ± 0,03 28

ПУ СА-Гп-АСК 1,11 ±0,04 0,47 ± 0,04 42

СА-Гп-Дп 2,38 ± 0,06 0,74 ±0,06 31

Пл-Гп 2,43 ± 0,07 0,95 ± 0,08 39

СА-Гп 2,45 ± 0,12 0,74 ± 0,07 30

ПЭ СА-Гп-АСК 1,62 ±0,06 0,63 ± 0,02 39

СА-Гп-Дп 2,98 ±0,15 0,98 ±0,09 33

Пл-Гп 3,30 ±0,14 1,45 ±0,11 44

Гп 3,63 ± 0,24 0,17 ±0,01 5

СА-Гп 1,79 ±0,08 0,43 ± 0,03 24

ПВХ СА-Гп-АСК 1,37 ±0,03 0,63 ±0,04 36

СА-Гп-Дп 2,87 ±0,11 1,00 + 0,09 35

Пл-Гп 3,38 ±0,12 1,22 ±0,09 46

* -концентрация Дп и АСК-0,5 мг/мл,

** -сучетом количества десорбированного гепарина.

Замена СА на плазму приводит к формированию покрытия с максимальной концентрацией активного Гп (См. табл. 5) за счет большого количества иммобилизованного гепарина, низкой десорбцией его в плазму крови и высокой ДАТ.

Минимизация количества адсорбированного белка - одно из ключевых направлений при поиске способов повышения гемосовместимых свойств медицинских изделий. Как видно из таблицы 6, иммобилизация гепарина непосредственно на поверхности полимерных материалов приводит к падению количества адсорбированного СА на фоне увеличения адсорбции ФГ.

Таблица 6.

Влияние способа гепаринизации биоматериалов на адсорбцию белков плазмы

крови на их поверхности

Образец Модификация* СА (цг/см2) ФГ (цг/см2) АТ-Ш (цг/см2)

ПУ - 0,78 ± 0,07 0,54 ± 0,03 Н/О

Гп 0,59 ±0,12 0,89 ± 0,06 0,06 ±0,01

СА-Гп 0,45 ± 0,04 0,35 ± 0,01 0,38 ± 0,02

СА-Гп-АСК 0,31+0,02 0,29 ± 0,02 0,46 ±0,01

СА-Гп-Дп 0,23 ± 0,03 0,17 + 0,02 0,68 ±0,03

Пл-Гп 0,29 ±0,02 0,11 ±0,03 0,81 ±0,04

ПЭ - 1,02 ±0,19 0,94 ± 0,07 Н/О

СА-Гп 0,48 ± 0,05 0,29 ± 0,03 0,41 ±0,04

СА-Гп-АСК 0,22 ±0,01 0,19 ±0,02 0,69 ± 0,03

СА-Гп-Дп 0,18 ±0,02 0,14 ±0,03 0,83 ± 0,04

Пл-Гп 0,27 ± 0,04 0,05 ±0,01 1,27 ±0,07

ПВХ - 1,91 ±0,17 0,82 ± 0,06 Н/О

Гп 0,78 ±0,18 1,06 ±0,46 0,05 ± 0,01

СА-Гп 0,82 ± 0,04 0,35 ± 0,04 0,39 ± 0,01

СА-Гп-АСК 0,61 ± 0,03 0,24 ± 0,02 0,45 ± 0,05

СА-Гп-Дп 0,52 ±0,10 0,16 ±0,04 0,77 ±0,04

Пл-Гп 0,31 ±0,07 0,08 ± 0,05 1,11 ±0,05

* - концентрация Дп и АСК -0,5 мг/мл.

Модификация поверхности полимерных материалов покрытием СА-Гп сопровождается снижением количества адсорбированных белков (См. табл. 6). Добавление АСК и особенно Дп приводит к усилению этого эффекта. Замена в составе модифицирующего покрытия альбумина на плазму также приводит к уменьшению количества адсорбированных белков, особенно ФГ.

Результаты исследования влияния состава модифицирующего покрытия на активацию системы комплемента (Кинд) и относительный показатель адгезиро-ванных тромбоцитов (ОПАТ) суммированы в таблице 7.

Таблица 7.

Влияние гепаринизации на параметры гемосовместимости биоматериалов.

Образец Модификация * Кивд ОПАТ

ПУ - 0,92 ± 0,05 0,81 ± 0,05

Гп 0,72 ±0,10 2,44 ±0,29

СА-Гп 0,39 ±0,03 0,66 ± 0,05

СА-Гп - АСК 0,31 ±0,02 0,58 ± 0,03

СА-Гп - Дп 0,27 ± 0,04 0,39 ± 0,05

Плазма - Гп 0,29 ± 0,01 0,29 ± 0,02

ПЭ - 0,56 ± 0,03 1,38 ±0,17

СА-Гп 0,43 ±0,01 0,48 ± 0,02

СА-Гп - АСК 0,25 ± 0,03 0,40 ± 0,04

СА - Гп - Дп 0,22 ± 0,03 0,29 ± 0,03

Плазма - Гп 0,15 ±0,01 0,17 ±0,04

ПВХ - 2,14 ±0,17 0,88 ±0,05

ГП 1,16 + 0,16 1,80 ±0,06

СА-Гп 0,88 ±0,11 0,49 ± 0,08

СА-Гп-АСК 0,55 ± 0,08 0,43 ± 0,02

СА-Гп-Дп 0,49 + 0,07 0,30 ± 0,04

Плазма - Гп 0,29 ±0,04 0,18 ±0,01

* - концентрация Дп и А СК -0,5 мг/ш,

Непосредственная иммобилизация Гп на поверхность приводит к увеличению количества адгезированных тромбоцитов на фоне снижения активации системы комплемента. Гепаринизация поверхности биоматериалов, пассивиро-

ванной альбумином, сопровождается снижением не только критерия ОПАТ, но и активации системы комплемента, причем этот эффект усиливается в результате введения ингибиторов агрегации тромбоцитов. Максимальное же падение адгезии тромбоцитов и активации системы комплемента наблюдается при гепа-ринизации поверхности биоматериалов, пассивированных плазмой.

Статистический анализ полученных экспериментальных данных (Табл. 8) свидетельствует о сохранении иммобилизованным гепарином АТ-Ш-зависи-мого механизма функционирования. Значение Ккорр между общей активностью иммобилизованного Гп и количеством адсорбированного АТ-Ш равно 0,967.

Таблица 8.

Коэффициенты линейной корреляции Пирсона (Ккорр; Р < 0,0005) между исследуемыми параметрами (п=14).

Параметр 1 Параметр 2 Ккорр

АТ-Ш (цг/см2) Общая активность Гп 0,967

ДАТ ФГ (цг/см2) -0,900

АТ-Ш (цг/см2) ФГ (цг/см2) -0,840

ФГ (цг/см2) ОПАТ 0,945

ДАТ ОПАТ - 0,886

АТ-Ш (цг/см2) ОПАТ -0,771

СА (цг/см2) Кинд 0,930

ФГ (цг/см2) Кинд 0,839

ДАТ Кинд -0,759

АТ-Ш (цг/см2) Кинд -0,763

Аналогично не модифицированным материалам, снижение адсорбции белков на гепаринизированной поверхности сопровождается падением активации системы комплемента, а также наблюдается положительная корреляция между количеством адгезированных тромбоцитов и адсорбированного ФГ.

Для гепаринизированных образцов была обнаружена отрицательная корреляция между адсорбцией АТ-Ш, ДАТ и количеством адсорбированного ФГ

(См. Табл. 8). Это позволяет предположить, что в случае потери иммобилизованным гепарином способности взаимодействовать с АТ-Ш , его место занимает преимущественно ФГ, что провоцирует адгезию тромбоцитов. Аналогичная отрицательная корреляция наблюдается между степенью активации системы комплемента, количеством адсорбированного АТ-Ш и ДАТ (См. табл. 8).

Из анализа полученных экспериментальных данных следует, что чем выше ДАТ, тем меньше адсорбция белков, адгезия тромбоцитов и активация системы комплемента. Введение в состав модифицирующего раствора АСК и ДП, а также замена альбумина на плазму на стадии пассивации поверхности сопровождается существенным снижением количества адсорбированного белка, что приводит к повышению гемосовместимости биоматериалов.

Таким образом, ковалентная иммобилизация Гп на поверхности биоматериалов, обработанных плазмой крови, является наиболее перспективным способом формирования устойчивого гемосовместимого покрытия с высокой активностью иммобилизованного гепарина. Возможность использования для обработки аутологичной плазмы крови пациента снимает вопрос биологической безопасности покрытия.

Для гепаринизации изделий, требующих больших объемов модифицирующего раствора (оксигенаторы, системы вспомогательного кровообращения и др.) вместо пассивации белками аутологичной плазмы целесообразно использовать растворы альбумина. Однако в этом случае активный слой покрытия помимо гепарина должен содержать ингибиторы агрегации тромбоцитов.

Глава 3. Разработка материалов и покрытий, связывающих гепарин посредством комплексообразования.

К настоящему времени синтезировано большое количество материалов, обладающих аффинностью к гепарину за счет повышенного содержания аминогрупп. Однако до сих пор остается не ясным, какие из аминогрупп - первичные, вторичные или третичные - предпочтительнее с точки зрения прочности связывания гепарина. Для исследования влияния природы аминогруппы на характер

взаимодействия амииосодержащей поверхности с гепарином нами были синтезированы модельные образцы на основе шлифованных предметных стекол (ТУ 26-76), модифицированные органосилоксанами с общей формулой (ЯО)3$1 II,, содержащими аминогруппы в боковой цепи: Л = — СНз, — С2Н5;

Я/ =

КСН2)з-Ш2] первичная аминогруппа (Ам1)

НСН2-СН2-СН2->Щ)2--СН2-СН2-КН2] первичная аминогруппа на ножке (Ам2) [-(СН2)з-М(СНз)2] третичная аминогруппа (АмЗ)

Полученные модельные поверхности обладают сходной морфологией и физико-химическим свойствам, но отличаются природой концевой функциональной аминогруппы, а также ее расстоянием от поверхности подложки, а, следовательно, подвижностью. Кроме того, плотность положительного заряда поверхности Ст-Ам2, содержащей дополнительно две вторичных аминогруппы в основной цепи, в ряду синтезированных модельных материалов максимальна.

Было изучено влияние концентрации Гп в растворе (0,1 - 1,0 мг/мл), сдвиговой скорости (50 - 3000 см"1) и ионной силы (0 - 1,0 М ФБС) на параметры адсорбции гепарина на поверхности модельных аминосодержащих образцов. Показано, что для всех типов аминогрупп количество прочно связанного Гп определяется исключительно природой концевой аминогруппы и не зависит от концентрации гепарина в растворе, величины сдвиговой скорости и плотности заряда «ножки». При этом количество Гп, адсорбированного на образцах с третичной аминогруппой (Ст-АмЗ), в несколько раз больше, по сравнению с материалами, содержащими первичные аминогруппы (Ст-Ам1 и Ст-Ам2).

Первой стадией взаимодействия чужеродной поверхности с кровью является адсорбция белков, способных составить гепарину конкуренцию за места связывания на амииосодержащей поверхности.

Независимо от природы концевой аминогруппы в присутствии белков количество гепарина, адсорбированного на поверхности образцов с короткой «нож-

кой» (Ст-Ам1 и Ст-АмЗ) снижается (Рис. 2), а при взаимодействии с аминогруппой, удаленной от поверхности (Ст-Ам2), конкуренции за места связывания между гепарином и белками плазмы не наблюдается. Несмотря на это количество Гп, адсорбированного на Ст-АмЗ, в 2,5 раза выше, по сравнению с Ст-Ам2.

900 800 5 700 j 600 о 500 7 400 3 300

Ь 200 100

0

Ст-Ам1 Ст-Ам2 Ст-АмЗ Ст-Ам1 Ст-Ам2 Ст-АмЗ

ФБС Плазма

Рисунок 2. Адсорбция Гп из ФБС и плазмы крови, разбавленной 1:50.

Таким образом, третичная аминогруппа наиболее перспективна с точки зрения прочности комплексообразования аминосодержащей поверхности с гепарином. Увеличение подвижности концевой аминогруппы не влияет на количество Гп, связанного из индивидуального раствора, но приводит к увеличению доли гепарина, адсорбированного из плазмы крови.

Синтетические гидрогелевые покрытия.

Гидрофильное покрытие на основе полимочевин (ПМ) для пористых и полярных подложек было разработано в Центре по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО совместно с кафедрой химической технологии пластических масс РХТУ им. Д.И. Менделеева. Полимочевины растворяются в амидных растворителях и низших спиртах (МеОН, ЕЮН, изопропанол), обладают пленкообразующими свойствами, адгезией к стеклу, металлам, полярным синтетическим материалам. В итоге проведенной работы был выбран состав, обладающий оптимальным комплексом физико-химических и функциональных свойств, а также наиболее перспективный с точки зрения переработки и последующей гепаринизации - гепаринизируемая полимочевина (ГПМ).

- Щр шЬи Д^

Как видно из таблицы 9 по данным элементной спектроскопии для химического анализа (ЭСХА), обработка поверхности ПУ полимочевиной приводит к увеличению поверхностной концентрации азота, что подтверждает образование азотсодержащего модифицирующего покрытия. При исследовании гепаринизи-рованного образца обнаруживается присутствие на поверхности серы, что может служить доказательством аффинности поверхности к Гп, молекула которого богата сульфогруппами.

Таблица 9.

Элементный состав поверхности ПУ, модифицированной ГПМ и гепаринизированной (атомные концентрации в процентах).

Образец Cls Oís Nls S2p

ПУ 82,49 11,45 5,39 отс.

ПУ-ГПМ 71,33 12,76 14,09 отс.

ПУ-ГПМ-Гп 68,28 16,12 11,35 0,89

Для пленок из ГПМ (толщиной 75-100 мкм) максимальная емкость по гепарину составляет 80 мкг/см2 поверхности. Большое количество связанного Гп свидетельствует о его сорбции в объем гидрофильного покрытия. В то же время десорбция поверхностно связанного Гп как в ФБС, так и плазму крови составила всего 1,7 ± 0,2 мкг/см2 и 2,4 ± 0,4 мкг/см2, соответственно.

Было показано, что покрытия на основе ГПМ позволяют осуществить связывание антикоагулянта не только из индивидуального раствора, но и непосредственно из кровотока как in vitro, так и ex vivo.

Обработка поверхности полиуретана 3%-м раствором полимочевины (ПУ-ГПМ) сопровождается увеличением количества адсорбированных белков: СА с 0,78 ± 0,07 до 12,55 ± 0,94 мкг/см2 и ФГ с 0,28± 0,03 до 19,18 ± 1,78 мкг/см2, что свидетельствует о сорбции белков в объем гидрогелевого покрытия. Последующая гепаринизация ПУ-ГПМ приводит к значительному падению адсорбции белков (СА до 3,16 ± 0,12 мкг/см2 и ФГ до 2,01± 0,09 мкг/см2). В этом случае доминирующим компонентом слоя адсорбированных белков является AT-

III (12,07 ± 0,44 мкг/см2), адсорбция которого на поверхности ПУ и ГТУ-ГПМ незначительна (ниже предела определения метода хромогенных субстратов).

В результате обработки ГПМ-Гп образцов полиуретана, лавсана и угольного гемосорбента СКТ-ба количество тромбоцитов, адгезированных на их поверхности, снижается на 50 ± 12 %, а константа активации системы комплемента, индуцированной контактом с чужеродной поверхностью - в 5,3 ± 1,9 раза.

Повышение тромборезистетности биоматериалов в результате обработки полимочевиной было подтверждено в условиях ex vivo: время окклюзии арте-рио-артериального шунта из полиуретана "Biomer®" (внутр. диаметр 1 мм), имплантированных в сонную артерию кролика в отсутствии системной гепарини-зации, в результате обработки ГПМ-Гп возрастает с 48 ± 2 мин. до 93 ± 8 мин.

Эксперименты по имплантации искусственных желудочков сердца (ИЖС) из полиуретана Витур теленку, проведенные в лаборатории вспомогательного кровообращения и искусственного сердца ФГУ НИИТиИО (руководитель -д.м.н., профессор В.Е. Толпекин), показали, что ИЖС, модифицированные ГПМ-Гп, значительно менее склонны к тромбообразованию, по сравнению с исходными. Сканирующая электронная микроскопия поверхности мембраны и корпуса ИЖС подтвердила уменьшение в результате обработки количества микротромбов, отложений фибрина и степень активации тромбоцитов.

Таким образом, обработка покрытием на основе полимочевины является эффективным способом повышения гемосовместимости поверхности биоматериалов, предназначенных для контакта с кровью. Однако область применения ГПМ ограничена, поскольку она образует устойчивое покрытие лишь при нанесении на поверхность полярных или пористых подложек. Круг изделий медицинского назначения, изготовленных с применением полярных и пористых материалов достаточно широк (гемодиализаторы, гемосорбенты, тканые и вязанные сосудистые протезы и др.) Однако применение ГПМ для полной обработки поверхности изделий и аппаратов медицинского назначения, изготовленных из разнородных материалов, не представляется возможным. В связи с этим возникла необходимость разработки универсального покрытия, пригодного для

создания сплошного гепаринсодержащего слоя на всех рабочих поверхностях, коммуникациях, фильтрах и других конструкционных элементах. Универсальное саморегулируемое гепаринизируемое покрытие.

Принципиальная схема формирования саморегулируемого гепаринизируемо-го покрытия (СГП), разработанного совместно с кафедрой химической технологии пластических масс РХТУ им. Д.И. Менделеева, приведена на рисунке 3.

и-^4»^^ Разветвленный полиамин; *-* Сшивающий агент;

Адгезивы для подложек различной природы (полярности, степени гидрофильности и т.д.);

Элемент, обеспечивающий взаимодействие с адгезивом.

Обрабатываемая поверхность, Рисунок 3. Схема саморегулируемого гепаринизируемого покрытия.

Основу СГП составляет модифицированный полиамин с набором функциональных групп, обеспечивающих взаимодействие как с гепарином, так и с соответствующими адгезивами. Адгезивы способствуют прочному прикреплению модифицированного полиамина к любой из поверхностей, входящих в состав конкретного изделия. Дополнительную устойчивость покрытию придает введение в рецептуру бифункционального сшивающего агента.

23

Таблица 10.

Параметры гемосовместимости биоматериалов, модифицированных СГП.

Полимер/параметр Исходный Модифицированный

Поливинилхлорид

Расчетное количество иммобилизованного гепарина - 0,8 ± 0,1 мкг/см2 0,14 ± 0,02 ед/см2

Десорбция гепарина в плазму крови, ед/см2 - 0,017 ±0,003

Активность гепарина на поверхности, ед/см2* 0,051 ±0,003

Доля активного гепарина (ДАТ), % 41 ±3

ОПАТ 0,94 ± 0,08 0,48 ± 0,05

Адсорбция СА (мкг/см2) 1,2 ± ОД 0,60 ± 0,09

Активация системы комплемента** 2,14 ± 0,14 0,98 ± 0,08

Полиуретан «Витур»

Расчетное количество иммобилизованного гепарина - 1,2 ± 0,1 мкг/см 0,23 ± 0,02 ед/см2

Десорбция гепарина в плазму крови, ед/см2 - 0,031 ± 0,002

Активность гепарина на поверхности, ед/см2* 0,076 ± 0,005

Доля активного гепарина (ДАТ), % 38 ±3

ОПАТ 0,81 + 0,09 0,48 ± 0,06

Адсорбция СА (мкг/см2) 2,0 ± 0,3 0,8 ± 0,1

Активация системы комплемента** 0,92 ± 0,04 0,54 ± 0,03

Полиэтилен

Расчетное количество иммобилизованного гепарина - 0,9 ± 0,2 мкг/см2 0,16 ± 0,04 ед/см2

Десорбция гепарина в плазму крови, ед/см2 - 0,025 ±0,003

Активность гепарина на поверхности, ед/см2* - 0,059 ±0,005

Доля активного гепарина (ДАТ). % 44 ±2

ОПАТ 1,38 + 0,11 0,63 ± 0,04

Адсорбция СА (мкг/см2) 0,80 ±0,10 0,40 ± 0,06

Активация системы комплемента ** 0,56 ± 0,05 0,27 ± 0,02

♦ - с учетом количества десорбированного гепарина,

* * - К ■„ д, контроль - мембрана «Купрофан»

Обработка полимерных материалов СГП приводит (См. табл. 10) к двукратному падению количества адгезированных тромбоцитов и адсорбированного альбумина, а также к значительному снижению активации системы комплемента. Высокая ДАТ на фоне низкой десорбции при контакте с кровью делают СГП привлекательным для обработки изделий медицинского назначения с развитой поверхностью (более 1,0 м2), таких как оксигенаторы крови.

Как видно из таблицы 11, модифицирование полых волокон из полипропилена - основного функционального элемента оксигенаторов крови - приводит более чем к двукратному снижению адсорбции сывороточного альбумина, почти трехкратному уменьшению количества адгезированных тромбоцитов, а также, что особенно важно, к 25%-му падению активации системы комплемента, индуцированной контактом с чужеродной поверхностью.

Таблица 11.

Параметры гемосовместимости полых волокон из полипропилена, обработанных СГП.

Поверхность/параметр Исходный Обработанный

Адсорбция СА (мкг/см2) 0,92 ± 0,09 0,40 * 0,05

ОПАТ* 1,00 ± 0,12 0,37+0,05

Активация системы комплемента** 0,40 ± 0,03 0,30 ± 0,05

* - относительно исходного полипропилена;

* * - К „ д, контроль - мембрана «Купрофан»

Таким образом, модифицирование саморегулируемым гепаринизируемым покрытием полимерных материалов, входящих в конструкцию медицинских изделий, дает возможность значительно повышать гемосовместимые свойства промышленно выпускаемых изделий на предстерилизационном этапе их изготовления.

Полученные результаты позволяют рекомендовать СГП для полной обработки элементов конструкции систем вспомогательного кровообращения и ок-сигенации крови.

Нами был проведен сравнительный анализ десорбции и антикоагулянтной активности Гп, иммобилизованного на поверхности полых волокон из полипропилена с применением биологического покрытия на основе альбумина, аспирина и гепарина (СА-Гп-АСК), СГП и двух промышленных гепаринизиро-ванных оксигенаторов крови с покрытием Carmeda® Bio Active Surface (Medtronic, США) и Duraflo II® (Baxter, США). В таблице 12 суммированы данные по десорбции и степени сохранения иммобилизованным Гп своей активности в результате контакта с плазмой крови человека (2 часа, 25°С, статика) in vitro.

Таблица 12.

Активность гепарина и его десорбция при взаимодействии модифицированных полых волокон из полипропилена с плазмой крови человека.

Образец Расчетная активность гепарина, ед/см Десорбция Гп в плазму крови Активность Гп на поверхности*

ед/см2 %от исх. ед/см2 ДАТ, %

СА-Гп-АСК 0,034 + 0,002 0,006 ±0,001 18 0,010 ±0,001 35

СГП 0,157 ±0,011 0,027 ± 0,002 17 0,070 ± 0,003 54

Carmeda® 0,076 ±0,004 0,022 ±0,004 29 0,002 ±0,002 4

Duraflo II® 0,142 ±0,014 0,119 ±0,005 84 0,0014 ± 0,0006 6

- с учетом количества десорбированного гепарина,

Полые волокна, обработанные СА-Гп-АСК и СГП, демонстрируют наилучшую устойчивость и высокую относительную активность иммобилизованного Гп (См. табл. 12), однако концентрация активного Гп на поверхности во втором случае в несколько раза выше. Поверхность Сагтес1а® за два часа теряет почти треть иммобилизованного Гп, а степень сохранения активности оставшегося антикоагулянта крайне мала. С поверхности полых волокон, обработанных покрытием ШгаАо И®, десорбция гепарина за два часа контакта с плазмой составляет 84% и, как в случае Сагп^а®, активность иммобилизованного гепарина незначительна.

Полученные экспериментальные данные позволяют сделать заключение о низкой эффективности покрытий Duraflo П и Carmeda® Bio Active Surface. В первом случае повышение гемосовместимости поверхности достигается исключительно за счет массового выделения антикоагулянта в объем, завершающегося уже после 60 минут функционирования. Причина не удовлетворительных гемосовместимых свойств покрытия Carmeda® Bio Active Surface, на наш взгляд, в использовании низкомолекулярной фракции Гп, не обладающей достаточной аффинностью к АТ-Ш, особенно в иммобилизованном состоянии.

Глава 4.

Материалы, имитирующие наноструктуру внутренней поверхности сосудов крови.

Биологические структуры (ткани, клетки, белки) включают в себя гидрофильные и гидрофобные домены, размером от нескольких ангстрем до 10-50 нм. Было предположено, что моделирование такой мозаичности на поверхности синтетических материалов позволит с большей вероятностью добиться необходимых энергетических параметров поверхности и увеличить био- и гемосовме-стимость изделий.

Материалы с гидрофильно-гидрофобной наноструктурой.

Обработка поверхности стекла органосилоксанами с различными концевыми функциональными группами на конце углеводородных радикалов [—(СН2)П—] позволяет получить материалы, отличающиеся степенью гидрофильности и зарядом поверхности и как следствие различной тромбогенностью (См. рис. 1). Однако для создания реальной гидрофильно-гидрофобной наноструктуры нами было предложено проводить обработку поверхности стекла из смеси органоси-локсанов с относительно гидрофильными (СГ-Мер, 9° = 66,1 ± 1,8) и гидрофобными (СГ-Алл, 8° = 82,6 ± 4,4) функциональными концевыми химическими группами. В результате был получен образец СГ-(Алл+Мер) промежуточной гидрофильности (0° = 74,6 ± 3,9), содержащий на поверхности гидрофильные и

гидрофобные микродомены. В Главе 1 было показано, что как гидрофобные СГ-Алл, так и более гидрофильные СГ-Мер образцы имеют низкую тромборе-зистентность.

Соответствующие значения ОПТ, для образцов, модифицированных из индивидуальных растворов органосилоксанов (СГ-Мер и СГ-Алл) и их смеси приведены в таблице 13. Как видно из таблицы образование на поверхности стеклянных гранул гидрофильно-гидрофобной наноструктуры сопровождается повышением тромборезистентности модифицированных образцов: критерий ОПТ| для СГ-(Алл+Мер) значительно ниже, по сравнению с СГ-Мер и СГ-Алл.

Таблица 13.

Влияние образования гидрофильно-гидрофобной наноструктуры на значения тромборезистентность модельных образцов на основе стекла.

Образец ОПТ0 ОПТ^

СГ-Мер 78 ±3 96 ±2

СГ-Алл 89 ±3 103 ±4

СГ-(Алл+Мер) 54 + 2 51 ±3

Кроме того, в случае СГ-(Алл+Мер) значения ОПТ0 и ОГТГф практически не отличаются, что свидетельствует об отсутствии вклада активации тромбоци-тарного звена гемостаза в процесс свертывания крови. Следовательно, образец с гидрофильно-гидрофобной наноструктурой является гемосовместимым как в артериальной, так и в венозной позициях, где преобладают активация внутреннего и тромбоцитарного путей свертывания крови, соответственно. Такие покрытия могут быть рекомендованы для обработки изделий сложной геометрии, для которых свойственно как наличие зон застоя крови, так и областей с высокой сдвиговой скоростью. Сульфированные материалы.

Основным компонентом внутренней поверхности естественных сосудистых стенок является сульфосодержащий мукополисахарид - гепаран сульфат (ГС) эндотелиальных клеток, обладающий антикоагулянтной активностью. Поэтому

в мировой практике были предприняты попытки разработки сульфированных материалов и покрытий, обладающих антикоагулянтной активностью. Однако тромборезистентность таких материалов была не достаточна из-за низкой гепа-риноподобной активности.

Сульфирование поверхности медицинского полиэтилена низкой плотности (ПЭНП) производили обработкой смесью КМПО4 и концентрированной H2S04. Гидроксигруппы, образовавшиеся на поверхности ПЭНП под действием двух сильных окислителей, вступают в реакцию этерификации с молекулами серной кислоты:

ПЭНП-ОН + HOSO3H « ПЭНП-О-БОзН + Н20 Были отработаны режимы, позволяющие получать образцы ПЭНП с концентрацией кислых сульфогрупп на поверхности от 0,05 до 3,2 нМ/см2. На рисунке 4 приведены разностные спектры ИК МНПВО двух образцов полиэтилена с различной степенью сульфирования поверхности: максимально достижимой (3,2 нМ/см2) и низкой (0,3 нМ/см2), полученных вычитанием спектра исходного полиэтилена их спектров соответствующих сульфированных образцов.

Образцы с низкой степенью сульфирования демонстрируют на поверхности меньшую концентрацию кислых групп: сульфо- (-O-SO2-O, дублет 1248,1218 см"1 и 1059 см"') и карбоксильных (-СОО-, 1715 см"1) (Рис. 4а), а гидроксияь-ные группы (-ОН, 3200+3400 см'1) на их поверхности практически отсутствуют (Рис. 46). Полученные данные подтверждают образование в результате обработки на поверхности ПЭНП в основном кислых сульфогрупп, а также карбоксильных и гидроксильных групп. Таким образом, обработка полиэтилена раствором перманганата в концентрированной серной кислоте позволяет получить ряд модельных материалов, отличающихся концентрацией и соотношением гидрофильных функциональных групп на их поверхности.

Одним из подходов к созданию наноструктур, имитирующих структуру внутренней поверхности сосудов крови, является формирование гидрофювных участков на гидрофобном материале или гидрофобных участков - на гидрофильной поверхности. Согласно этому подходу образцы ПЭНП с малой гтепе-

нью сульфирования могут быть отнесены к группе биоматериалов с гидрофоб-но-гидрофильной наноструктурой поверхности, где роль гидрофильных отрицательно заряженных доменов играют участки с привитыми кислыми (сульфо-или карбокси-) группами, а гидрофобных - участки поверхности исходного материала, свободные от привитых гидрофильных функциональных групп.

т,% 101

100

< 99

98

97

96

95

1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800

т,%

103 102 101 100

99

98

Рисунок 4. Спектры ИК МНПВО образцов полиэтилена с разной степенью сульфирования.

-0.6 нМ\см*

-32нМ\см2

Волновое число, см"1

Е

Влияние концентрации поверхностных сульфогрупп ПЭНП на параметры тромборезистентности поверхности представлены на рисунке 5.

Концентрация сульфогрупп (нМсм2)

Рисунок 5. Влияние степени сульфирования поверхности полиэтилена на активацию свертывания плазмы крови человека.

При контакте ПЭНП с бестромбоцитарной плазмой значение ОПТ0, отражающего активацию внутреннего пути свертывания крови, увеличивается с ростом степени сульфирования поверхности. Быстрый рост ОПТ0 при повышении концентрации сульфогрупп до 0,6 нМ/см2 сменяется незначительным изменением величины ОПТ0 в диапазоне концентраций сульфогрупп 0,6- 1,7 нМ/см2. Дальнейшее повышение степени сульфирования вновь сопровождается ростом ОПТ0. Зависимость степени тромбогенности поверхности с учетом вклада активации тромбоцитарного пути гемостаза (ОПТтр) от степени сульфирования поверхности полиэтилена носит выраженный экстремальный характер с локальным минимумом при концентрации сульфогрупп, равной 0,6 нМ/см2.

Поскольку контактная активация, а также адгезия и активация тромбоцитов, определяются процессами адсорбции белков, было изучено влияние степени сульфирования поверхности ПЭНП на адсорбцию альбумина (СА), фибриногена (ФГ) и у-глобулина (ГТл). Результаты представлены на рисунке 6.

I I I I I I I I | и I

I I I I I I I I I I 1 I I I I I I

• Альбумин ■ Фибриноген А у-глобулин

КОНЦЕНТРАЦИЯ СУЛЬФОГРУПП (нМ/см2)

Рисунок 6. Влияние степени сульфирования на количество белков плазмы крови человека, адсорбированных на поверхности полиэтилена.

Основным белком, адсорбирующимся на поверхности как исходного, так и сульфированного ПЭНП является фибриноген. Несмотря на то, что ФГ относится к классу «тромбогенных» белков, преимущественная адсорбция которых снижает тромборезистентность поверхности, обнаружена отрицательная корреляция между количеством адсорбированного ФГ и параметром (ОПТ0) с коэффициентом корреляции, равным - 0,98 (Р < 0,0005). Такая же корреляция обнаружена между параметром (ОПТ„) и суммарным количеством адсорбированных белков (коэффициент корреляции - 0,96, Р < 0,0005).

Аналогичная картина наблюдается при изучении влияния пассивации белками модельных материалов на параметры тромбогенности их поверхности. Как видно из таблицы 14, в подавляющем большинстве случаев обработка поверхности не только альбумином, но и такими «тромбогенными» белками, как фибриноген или гамма-глобулин, сопровождается не ростом, а падением ОПТ0, что свидетельствует о повышении их гемосовместимости.

Таблица 14.

Влияние пассивации поверхности СГ, модифицированных органосилоксанами, на их тромборезистентность (параметр ОПТ0).

Образец Исходный СА ФГ ГТл Плазма крови

СГ 100 ±4 75 ±3 84 + 5 88 ±4 76 ±2

СГ-Алл 95 + 5 74 ±1 80 ±3 83 + 5 72 ±4

СГ-Мер 84 ±3 58 ±2 73 ±4 70 ±5 35 ±1

СГ-Иц 51 ±2 39 ±1 40 ±6 38 ±2 30±3

СГ-АмЗ 20 ±2 22 ±3 24 ±5 23 ±3 8 ± 1

Причина этого, на наш взгляд, состоит в образовании слоя необратимо адсорбированных белков, предотвращающего непосредственный контакт гидрофобной поверхности с белковыми компонентами, участвующими в активации контактной фазы свертывания крови. В отличие от индивидуальных растворов белков, плазма крови содержит большой набор компонент, способных эффективно конкурировать с компонентами внутреннего пути свертывания крови за места связывания на чужеродной поверхности. В результате пассивация плазмой образцов с различной тромбогенностью поверхности приводит к более значительному падению ОПТ0, по сравнению эффектом пассивации индивидуальными белками.

При изучении влияния степени сульфирования на тромбогенность поверхности в присутствии тромбоцитов, корреляция между параметрами адсорбции белков и тромборезистентности (ОПТ-ф) отсутствует (См. рис. 6, 7). Так, адсорбция белков значительно ниже в случае ПЭ с степенью сульфирования 3,2

нМ/см2, по сравнению с образцом с плотностью сульфогрупп 0,6 нМ/см2, однако параметр ОПТтр в первом случает гораздо выше (82 ± 5 и 35 ± 11, соответственно). Поскольку полиэтилен с малыми степенями сульфирования может быть отнесен к классу поверхностей с гидрофильно-гидрофобной наноструктурой, существование локального минимума зависимости ОПТ^, от степени сульфирования поверхности полиэтилена объясняется образованием оптимальной наноструктуры, с точки зрения соотношения гидрофильных и гидрофобных участков, при концентрации сульфогрупп ~ 0,6 нМ/см2.

Таким образом, формирование на поверхности гидрофильно-гидрофобной наноструктуры является перспективным методом повышения гемосовместимых свойств биоматериалов. Полученные экспериментальные данные позволяют сделать вывод, что сульфирование эффективно в лишь случае введения сульфогрупп малой концентрации. С повышением степени сульфирования вклад контактной активации в процесс свертывания крови растет несмотря на наличие незначительной гепариноподобной активности. В результате тромборезистент-ность материалов с высокими степенями сульфирования оказывается ниже по сравнению с исходной поверхностью.

Глава 5.

Примеры практического применения результатов работы.

Исследование тромборезистентных свойств полимерных материалов и покрытий.

Был проведен сравнительный анализ влияния природы полимерных материалов на время рекальцификации бестромбоцитарной (ОПТ0) и тромбоцитар-ной (ОПТ^) плазмы крови (Таблица 15). Среди изученных образцов полимерных материалов в случае ПЭ контактная активация (значение ОПТ0) минимальна, а для поверхности ПДМС - максимальна. В результате обработки поверхности ПУ гидрофобизатором (шифр ПУ-Фоб), разработанным совместно с кафедрой химической технологии пластических масс РХТУ им. Д.И. Менделеева, на-

блюдается уменьшение значения ОПТ0 с 46 ± 2 до 26 ф 1 таблицей)« а к

£,. 1 'ПЕКА

1<п !',

34

Таблица 15.

Влияние природы биоматериалов на показатели их тромбогенности (ОПТ,).

Образец ОПТ0 ОПТтр.

ПЭ 20 ±2 64 + 3

ПВХ 52 + 3 67 ±4

ПДМС 71 ±5 74 ±6

ПУ 46 ±2 69 ±5

ПУ-Фоб 26 + 2 27 ±3

Для образцов ПВХ, ПУ и ПЭ значения показателя ОПТтр превышают соответствующие значения ОПТ0, что свидетельствует о значительном вкладе активации тромбоцитов в процесс свертывания плазмы крови, индуцированного чужеродной поверхностью (См. табл. 15). В то же время в случае ПДМС и ПУ-Фоб показатели тромбогенности ОПТ0 и ОПТтр практически не отличаются, что свидетельствует об отсутствии вклада тромбоцитарного пути активации свертывания крови.

В последнее время при разработке изделий медицинского назначения широко применяется природный биодеградируемый сополимер оксибутирата с окси-валератом (П(ОБ-ОВ)), технология получения которого предполагает его экстракцию его из клеточной массы и очистку от компонент клеточных мембран переосаждением.

Как видно из таблицы 16, уже после двукратного переосаждения исходного сырья тромборезистентность поверхности пленок П(ОБ-ОВ) вполне удовлетворительна.

Таблица 16.

Влияние технологии очистки П(ОБ-ОВ) на параметры тромбогенности

его поверхности.

ОПТ0 ОПТтр

Однократное переосаждение 66 + 7 73 ±6

Двукратное переосаждение 37 ±4 49 ± 5

Трехкратное переосаждение 31 ± 1 35 ±2

После третьего переосаждения значения ОПТ0 и ОПТтр практически совпадают, что говорит об отсутствии активации тромбоцитов поверхностью трижды очищенного ПОБ-со-ОВ. Дальнейшая очистка не приводит к снижению тром-богенности образцов сополимера. Полученные результаты были применены при разработке гемосовместимого биодеградируемого материала ЭластоПОБ®, предназначенного для замещения дефектов мягких тканей и в качестве носителя для трансплантации клеток.

Метод регистрации времени рекальцификации плазмы крови включен в качестве теста первого уровня отбора в двухуровневую систему тестов по исследованию гемосовместимости биоматериалов, предназначенных для контакта с кровью, используемую в практике испытательной лаборатории биологической безопасности медицинских изделий Центра по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО Росздрава.

Кроме того, высокая чувствительность метода позволила доказать функциональность разработанной ФГУ НИИТиИО трансдермальной терапевтической системы ацетисалициловой кислоты относительно ингибирования тромбоцитарно-го звена гемостаза.

Гепаринизация гемодиализаторов

В ходе сеансов гемодиализа происходит активация свертывающей системы крови, сопровождающаяся рядом побочных эффектов: отложением фибрина, активацией системы комплемента, тромбо- и лейкопенией. Риск подобного рода побочных явлений снижают, многократно применяя гемодиализатор для одного и того же пациента.

В состав белков, необратимо адсорбирующихся после первого сеанса на поверхности гемодиализной мембраны, входят белки, имеющие аффинность к Гп, что может быть использовано для его иммобилизации (см. Главу 2).

Гемодиализ на повторно используемых (без гепаринизации поверхности мембран) гемодиализаторах приводит к снижению уровня лейкопении, но, аналогично 1-му сеансу, сопровождается падением количества тромбоцитов (Таб-ли. 17).

36

Таблица 17.

Снижение концентрации форменных элементов крови на 15-ой минуте гемодиализа (в % к исходному уровню).

Гемодиализатор Тромбоциты Лейкоциты п

Исходный 20 ±5 23 ±4 32

Повторно используемый (01аПпа®) 15 + 5 10 ± 2 14

Повторно используемый (гепаринизир.) 0,5 ± 0,3 10 ± 2 18

В то же время повторное применение гепаринизированных гемодиализато-ров не приводит к возникновению тромбоцитопении и, в отличие от исходных и повторно используемых, не влияет на агрегационную способность тромбоцитов (25 ± 3 и 26 ± 4 %, соответственно до и после сеанса гемодиализа), что свидетельствует о повышении гемосовместимости поверхности мембраны.

Степень активации свертывания крови в результате контакта с поверхностью полых волокон оценивали по изменению концентрации АТ-1П после окончания сеанса гемодиализа. При гемодиализе на исходных и повторно используемых не гепаринизированных гемодиализаторах наблюдается падение концентрации АТ-Ш в плазме на 34 ± 4 и 26 ± 2%, соответственно, что говорит о значительной активации внутреннего пути свертывания крови. Гепаринизиро-ванные гемодиализаторы не приводили к изменению концентрации АТ-Ш в крови даже в случае десятикратного снижения уровня системной гепариниза-ции. Полученные экспериментальные данные позволили предположить, что ге-паринизированные гемодиализаторы могут быть использованы для проведения процедуры гемодиализа со значительно меньшими дозами системного гепарина.

Гепаринизированные протезы кровеносных сосудов малого диаметра,

Одной из актуальных проблем сердечно-сосудистой хирургии остается поиск адекватных заменителей кровеносных сосудов малого диаметра. В настоящее время функционально надежные протезы малого диаметра отсутствуют.

Обычно при подготовке биотканей для имплантации их фиксируют глюта-ровым альдегидом (ГА). Однако, материалы, полученные в результате такой обработки, цитотоксичны из-за остатков не прореагировавших альдегидных групп. Нами было предложено использовать аргинин (Apr), насыщенный аминогруппами, для обработки биопротезов сосудов крови. Такая обработка позволяет нейтрализовать не прореагировавшие альдегидные группы и обогатить поверхность протеза аминогруппами, способствующими иммобилизации гепарина. Прямая гепаринизация биопротеза сопровождается связыванием незначительного количества Гп (0,06 ± 0,05 мкг/см2) за счет ковалентной иммобилизации в результате взаимодействия антикоагулянта со свободными альдегидными группами. В то же время обработка аргинином в несколько раз повышает количество связанного гепарина (0,27 ± 0,08 мкг/см2).

В таблице 18 приведены параметры in vitro гемосовместимости исходных и модифицированных биопротезов. Гепаринизация снижает степень гемолиза, индуцированную контактом с образцами сосудистых протезов в 2,5 - 3 раза, независимо от наличия аргинина. Прямая гепаринизация исходного биопротеза сопровождается снижением активации системы комплемента, не смотря на небольшое количество иммобилизованного Гп. Введение аргинина приводит к дальнейшему снижению активации системы комплемента.

Таблица 18.

Параметры гемосовместимости исходных и модифицированных биопротезов.

Образец ГА ГА + Гп ГА +Арг + Гп

аг, % 1,38 ±0,08 0,44 ± 0,06 0,50 ± 0,09

KU-106 1,5 ±0,3 0,6 ± 0,2 0,2 ±0,1

Гемосовместимые свойства биопротезов были исследованы ш vivo на базе Центральной научной лаборатории Смоленской государственной медицинской академии, руководитель профессор А.В. Бельков.

Сегменты биопротезов, внутренним диаметром 2,5-3 мм, имплантировали в брюшной отдел аорты 58 кошек. Первой группе животных имплантировали не

гепаринизированные биопротезы, фиксированные ппотаровым альдегидом, второй, - обработанные гепарином, а третьей, - обработанные Гп + Арг.

Тромбирование протезов первой группы происходило в 100% случаев в течение 33,8 ± 27,9 мин после момента восстановления кровотока по аорте (без системной гепаринизации). При этом 8 из 10 протезов тромбировались в первые 30 минут. Во второй и третьей группах в течение всего эксперимента (более трех суток) тромбирования протезов не наблюдалось. Однако, исследования с применением сканирующей электронной микроскопии продемонстрировали различия в гемосовместимости между группами (Рис. 7): после 3 суток функционирования, на внутренней стороне протезов третьей группы наблюдаются полное отсутствие или лишь единичные адгезированные тромбоциты, а поверхности протезов группы 2 количество адгезированных тромбоцитов гораздо больше, причем наблюдаются образование агрегатов.

Группа 2 Группа 3

Рисунок 7. Адгезия тромбоцитов in vivo на гепаринизированных биопротезах.

Сканирующий электронный микроскоп Jeol Т-330 (Япония).

Разработанный способ модификации биологических протезов малого диаметра аргинином и гепарином позволяет значительно улучшить их тромборези-стентные свойства как по сравнению с образцами, фиксированными ппотаровым альдегидом, так и с материалами, обработанными индивидуальным Гп.

Метод обработки биологических сосудистых протезов защищен двумя патентами РФ.

Гепаринизация для повышения биосовместимости интраокулярных линз (ИОЛ).

В последнее время для снижения риска осложнений, сопровождающих имплантацию ИОЛ, с успехом применяют гепаринизацию их поверхности. Иммобилизация Гп позволяет взять под контроль образование фибрина, подавить адсорбцию белков, снизить риск развития воспалительных реакций.

Саморегулируемое гепаринизируемое окрытие (СГП) применили для обработки поверхности упруго-элластичных ИОЛ «Флекс» (ЗАО ЭТП «Микрохирургия Глаза», Россия) на основе полиуретанметакрилата. Количество иммобилизованного Гп составило 0,31 ± 0,03 цг/см2. В результате модифицирования поверхности ИОЛ «Флекс» количество адсорбированного альбумина в условиях in vitro уменьшилась с 8,7 ± 0,7 до 1,1 ± 0,2 цг/см2.

После 3 суток имплантации фрагментов ИОЛ в переднюю камеру глаза кролика не обработанные образцы демонстрируют массивные белковые отложения (Рис. 8а), в то время как на поверхности модифицированных фрагментов ИОЛ белковые коньюгаты и нити фибрина отсутствуют (Рис. 8 б).

Рисунок 8. Влияние гепаринизации поверхности ИОЛ «Флекс» на острую реакцию глаза.

Таким образом, гепаринизация поверхности ИОЛ «Флекс» с применением саморегулируемого гепаринизируемого покрытия позволяет значительно повысить биосовместимость их поверхности.

Полученные результаты позволили сформулировать основные положения подхода к разработке гемосовместимых биоматериалов, основанной на имитировании структуры внутренней поверхности кровеносных сосудов:

1. При имитировании антикоагулянтных свойств внутренней поверхности кровеносных сосудов следует стремиться не столько к увеличению количества иммобилизованных биологически-активных веществ, сколько к сохранению их активности.

2. Необходимо учитывать, что механизм действия иммобилизованных агентов может существенно отличаться от механизма их функционирования в свободном состоянии.

3. Имитирование гидрофильно-гидрофобной наноструктуры кровеносных сосудов позволяет минимизировать отрицательное воздействие материала на компоненты крови.

4. Сульфирование поверхности гидрофобных материалов эффективно при условии малых концентраций привитых сульфогрупп.

Заключение

Основными требованиями к биоактивным покрытиям являются универсальность относительно природы модифицируемого материала и сохранение функциональных свойств при длительном контакте с кровью.

Поскольку белки необратимо адсорбируются практически на любой поверхности, ковалентная иммобилизация гепарина с использованием белковой подложки применима для обработки изделий, состоящих из разнородных материалов. Недостатком метода является использование препаратов плазмы крови человека, что представляет потенциальную биологическую опасность. Кроме того, при контакте с кровью иммобилизованный гепарин необратимо инактивируется за счет его взаимодействия с рядом компонент циркулирующей крови. Как следствие, активность гепарина на поверхности, максимальная в первые минуты контакта с кровью, в дальнейшем постоянно снижается.

Этого недостатка лишены синтетические покрытия, обладающие аффинностью к гепарину и способностью к обмену антикоагулянта, иммобилизованного на поверхности, на молекулы гепарина, циркулирующего в крови.

Ковалентная иммобилизация аргинина позволяет придать поверхности биотканей, фиксированных глютаровым альдегидом, не только аффинность к гепарину, но и нейтрализовать не прореагировавшие альдегидные группы. Иммобилизацию аминосодержащих низкомолекулярных агентов, подобных аргинину, планируется применить и для модифицирования поверхности синтетических материалов.

Гепаринизируемая полимочевина образует на поверхности биоматериалов гидрофильный слой, способный сорбировать большие количества гепарина. Это делает покрытие привлекательным при разработке устройств, способных удалять гепарин из кровотока. Однако это покрытие имеет низкую адгезию к гидрофобной поверхности. Дальнейшие шаги в области разработки гидрогелей, способных эффективно удалять гепарин из кровотока, предполагают синтез покрытий, способных вытеснять АТ-П1 из комплекса с гепарином, возвращая ингибитор протеаз обратно в кровоток.

Саморегулируемое гепаринизируемое покрытие позволяет модифицировать изделия сложной конфигурации, состоящие из полимерных материалов с различной гидрофильностью. Актуальной задачей остается расширение набора ад-гезивов-якорей, что позволит обеспечить формирование устойчивого аминосо-держащего покрытия на поверхности не только синтетических полимеров, но и металлов, керамики, стекла и др.

ВЫВОДЫ

1. Сформулированы и обоснованы экспериментальные подходы к повышению гемосовместимых свойств изделий медицинского назначения, основанные на имитировании антикоагулянтной и антиагрегантной активности эндотелия, а также гидрофильно-гидрофобной наноструктуры внутренней поверхности кровеносных сосудов.

2. Разработан новый метод определения тромбогенности поверхности биоматериалов и изделий медицинского назначения с использованием рекальци-фицированной плазмы крови человека. Показано, что предложенные количественные критерии оценки - нормированный и относительный показатель тромбогенности не зависят от индивидуальных особенностей свертывающей системы донора.

3. Проведен сравнительный анализ влияния способов иммобилизации гепарина на процессы адсорбции белков плазмы крови, адгезии тромбоцитов и активации системы комплемента, индуцированные поверхностью модифицированных материалов. Установлено, что чем выше доля активного гепарина, тем меньше количество адсорбированных альбумина и фибриногена, адге-зированных тромбоцитов, а также активация системы комплемента.

4. Показано, что наибольшая доля активного гепарина достигается в случае ко-валентной иммобилизации гепарина на поверхность, пассивированную плазмой крови.

5. Доказано, что гепарин, иммобилизованный на поверхности биоматериалов, сохраняет антитромбин-зависимый механизм функционирования. Потеря иммобилизованным гепарином способности взаимодействовать с АТ-Ш приводит к увеличению количество необратимо адсорбированного бежа, обогащению адсорбционного слоя фибриногеном, что сопровождается ростом количества адгезированных тромбоцитов и активации системы комплемента.

6. Установлено, что первичной причиной повышения гемосовместимости ге-паринизированных покрытий в присутствии иммобилизованных ингибито-

ров адгезии и агрегации тромбоцитов является уменьшение количества необратимо адсорбированных белков, а не ингибирование процессов активации клеток.

7. Изучено влияние природы аминогруппы на характер взаимодействия амино-содержащих материалов с гепарином. Показано, что для максимально прочного связывания гепарина следует использовать третичные аминогруппы.

8. Разработано три вида модифицирующих покрытий (на основе аргинина, полимочевины и полиамина) с высокой аффинностью к гепарину. Эксперименты в условиях in vitro и in vivo доказали эффективность их применения для повышения гемосовместимых свойств широкого круга материалов синтетического и биологического происхождения.

9. Показано, что имитирование гидрофильно-гидрофобной наноструктуры клеточных мембран прививкой органосилоксанов на гидрофильное стекло или сульфогрупп на гидрофобный полиэтилен сопровождается значительным повышением тромборезистентности их поверхности.

10. При исследовании сульфированной поверхности полиэтилена найдена оптимальная степень сульфирования поверхности (0,6 нМ/см2), обеспечивающая минимальную активацию внутреннего пути свертывания крови и тром-боцитарного звена гемостаза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Обнаруженные корреляции между активностью иммобилизованного Гп и параметрами гемосовместимости поверхности гепаринизированных биоматериалов позволяют рекомендовать при тестировании их гемосовместимых свойств ограничиться измерением двух параметров:

- количества адсорбированного альбумина, что позволяет прогнозировать степень активации системы комплемента, индуцированную контактом с модифицированным образцом;

- относительного количества молекул гепарина, сохранивших свою активность в иммобилизованном состоянии (ДАТ). Помимо прямой взаимосвязи анти-

коагулянтной активности иммобилизованного Гп с тромборезистентностью биоматериала, чем выше ДАТ, тем меньше адсорбция ФГ и, как следствие, -количество адгезированных тромбоцитов.

2. Применение аминосодержащих материалов и покрытий, обладающих аффинностью к гепарину, предполагает их гепаринизацию непосредственно перед использованием изделия. Полученные экспериментальные данные позволяют сделать следующие заключения:

- в случае связывания Гп из индивидуального раствора нет необходимости в удалении концевой аминогруппы от поверхности на длинной «ножке»;

- в целях экономии при гепаринизации изделий, модифицированных амино-содержащими покрытиями, нет необходимости в использовании раствора Гп в высокой концентрации.

- обработку аминосодержащих изделий гепарином можно производить в статике.

3. Гепаринизация поверхности изделий и аппаратов, эксплуатирующихся в условиях высокой концентрации системного гепарина, например, оксигенаторов крови, не целесообразна, поскольку большая часть АТ-Ш оказывается связана с гепарином, циркулирующим в крови пациента, и не способна взаимодействовать с Гп, фиксированным на поверхности. Положительное влияние иммобилизации гепарина на поверхности такого рода изделий проявляется лишь при условии снижения системной гепаринизации.

4. В качестве альтернативы иммобилизации БАВ для повышения гемосовме-стимости медицинских изделий целесообразно применять другие методы модифицирования, например, основанные на формировании гидрофильно-гидрофобной наноструктуры.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:

! Немец Е.А., Кульчицкий Ю Л, Севастьянов В.И. Влияние способа иммобилизации гепарина на взаимодействие биоматериалов с компонентами крови // В сб.: Синтетические полимеры медицинского назначения - Киев,-1989.- С. 96-98.

2. Немец Е.А., Новикова С.П.,. Беломестная 3 М. Взаимодействие гепаринизированной поверхности биоматериалов с тромбоцитами // В сб • Вопросы трансплантологии и искусственных органов / Под ред.: В.И. Шумакова - М - 1989 - С. 173-175.

3 Иванченко М.И., Черкасова Т.А., Лейкин Ю.А., Немец Е.А., Севастьянов В.И. Выбор оптимальных параметров модификации полимерных поверхностей эпокси-производными гепарина // Деп. ВИНИТИ № 2869-90 от 25.05.90 г.- 18с.

4. Иванченко М И., Новикова С.П., Черкасова Т.А., Лейкин Ю.А., Немец Е.А., Севастьянов В И. Модификация полимерных поверхностей эпокси-производными гепарина // Материалы 2-го НТС «Гемо- и биосовместимые материалы» .- Суздаль,-1990,- С. 9.

5 Беломестная З.М., Немец Е.А., Цейтлина Е.А., Городков А.Ю. и др. // Сборник методических рекомендаций по оценке биосовместимых свойств искусственных материалов, контактирующих с кровью / Под ред.: Н.Б. Добровой, Т.И. Носковой, С.П. Новиковой и В.И. Севастьянова - М,-1991,- 70 с.

6. Немец Е.А., Новикова С.П., Севастьянов В.И. Адгезия тромбоцитов на гепаринизиро-ванных материалах // В сб : Экспериментальная сердечно-сосудистая хирургия - М -1991.- С. 143-144.

7. Иванченко М.И., Новикова С.П., Черкасова Т.А., Лейкин Ю.А., Немец Е.А., Севастьянов В.И. Повышение тромборезистентности полимерных материалов производными гепарина // В сб.: Экспериментальная сердечно-сосудистая хирургия.- М,- 1991.- С. 135-136.

8. Е.А. Nemets, V.I. Sevastianov The interactions of heparinized biomaterials with human serum albumin, fibrinogen, antithrombin-Ш and platelets // Artificial Organs.- 1991- V. 15 - P. 381385.

9. Sevastianov V.I., Nemets E.A., Novikova S.P., The interaction of heparin-containing materials with blood and its components// In: Lecture notes of the ICB seminars. Artificial Organs: theory and practice of membranes in hemodialysis and plasmapheresis.- ICB:Warsaw.- 1992 - P. 9-18.

10. Nemets E.A., Karelskaya E., Sevastianov V.I., Anderson J.M., Eberhart R.C. A new hydiophilic coating with high affinity to heparin // Proceeding of 11-th annual conference on biomedical engineering research in Houston.- Published by the Houston society for engineering in medicine and biology.- 1993.-P. 125-129.

11. Nemets E.A., Karelskaya E„ Sevastianov V.I., Anderson J.M., Harasaki H., Kim S.W. A new hydrophilic coating with high affinity for heparin IIASAIO Abstracts.-1993.- V. 22,- P. 20.

12 Nemets E.A., Karelskaya E., Sevastianov V I., Anderson J.M., Harasaki H., Kim S.W. An N-substituted polyurea coating with high affinity for heparin // ASAIO J. - 1993.- V. 39 - P. M319-M321.

13. Nemets E., Karelskaya E., Sevastianov V., Anderson J., Harasaki H., Kim S.W. An new coating with high affinity for heparin // ASAIO Transaction - 1993.- V. 39 - P. 731-733.

14. Nemets E.A., Belomestnaya Z.M., Strokov A G., Poz Ja.L., Sevastianov V.I. Application of hemodialyzer in reuse I/ Biomaterial-Living System Interactions.-1995.- V. 3.- P. 65-72.

15. Sevastianov V.I., Zhuravleva I.Yu., Belomestnaya Z.M., Nemets E.A., Salomatina L.A., Krik-ovtsov A.A., Novikova S.P., Barbarash L.S.. The effect of conservation and heparinization on their mechanism interactions between small vesel xenoprostheses and blood components // Biomaterial-Living System Interactions.- 1995.- V. 3.- P. 119-132.

16. Немец E.A.. Порунова Ю.В., Севастьянов В.И. Сравнительный анализ коагулогической активности иммобилизованных функциональных химических групп // Трансплантология и искусственные органы,- 1998 - № 4,- С. 100.

17. Немец Е.А.. Порунова Ю.В., Друшляк И.В., Беломестная З.М., Севастьянов В.И. Влияние природы функциональных химических групп поверхности на медико-биологические свойства материалов для контакта с кровью // Перспективные материалы,-1999.- № 6,-С. 36-41.

18. Немец Е.А., Севастьянов В.И. Сравнительная эффективность применения гематологических методов для анализа прокоагулянтной активности медицинских материалов II Медицинская техника -1999-№ 6.- С. 18 -22.

19 Севастьянов В И., Немец Е.А. Пути повышения гемосовместимости медицинских изделий // В кн. Биосовместимость // Под ред. Севастьянова В.И.- М : «ИЦ ВНИИГС»

1999.-С. 295-352.

20 Севастьянов В.И., Немец Е.А., Касатов Д.А. Особенности взаимодействия белков плазмы крови человека с гепаринизированной поверхностью // Перспективные материалы,-

2000,-№3,-С. 65-69.

21. Sevastianov V.I., Rosanova I.B., Vasin S.L., Nemets E.A., Vasilets V.N. Protein Adsorption as a Bridge Between the Short-Term and Long-Term Blood Compatibility of Biomaterials // Biomaterials and Drug Delivery toward New Mellenium / Eds: K.D. Park, I.C. Kwon, N. Yui, S.Y. K. Park. Yan Rim.- Won Publ. Co.:Seoul.- 2000.- P. 497-515.

22. Немец Е.А., Егорова В.А., Кузнецов А.В., Севастьянов В.И. Влияние сульфирования поверхности полиэтилена на адсорбцию белков плазмы и активацию внутреннего пути свертывания крови // Перспективные материалы - 2001.- X» б.- С. 70-75.

23 Немец Е.А., Касатов Д.А , Севастьянов В.И. Взаимодействие гепарина с аминосодержа-гцими материалами // Вопросы медицинской химии - 2001.- Т. 47.- № 5.- С. 526-536.

24. Севастьянов В.И., Перова Н.В., Довжик И. А., Титушкин И. А., Немец Е.А. и др. Медико-биологические свойства полиоксиалканоатов - биодеградируемых бактериальных полимеров // Перспективные материалы.- 2001.- № 5 - С. 46-55.

25 Nemets Е.А., Egorova V.A., Porunova Yu. V., Sevastianov V.I. The comparative analysis of procoagulant activity of immobilized function chemical groups // Abstracts of Fifth ISTC Scientific Advisory Committee Seminar "Nanotechnologies in the area of physics, chemistry and biotechnology" .- St. Petersburg.- May 27-29,- 2002,- P. 71-72.

26. Немец E.A., Полухина O.C., Егорова B.A., Кузнецов А.В., Василец В.Н., Севастьянов В.И. Современные подходы к созданию биосовместимых материалов для искусственных органов // Вестник трансплантология и искусственных органов - 2002.- № 3.- С. 116.

27. Rozanova I.B., Nemets Е.А., Remeeva Е.А., Sevastianov V.I. Influence of biomaterials surface on platelets release ATP in vitro // Int J.Artif. Organs - 2003,- V. 26 - P. 634.

28 Егорова В А.. Немец E.A., Севастьянов В.И Сравнительный анализ двух подходов к оценке тромбогенности биоматериалов в условиях in vitro //. Медицинская техника.-2003.- Xs 2,- С. 29-32.

29. Севастьянов В.И., Егорова В.А., Немец Е.А., Перова Н.В., Онищенко Н.А. Биодегради-руемый биополимерный материал ЭластоПОБ™ для клеточной трансплантации // Перспективные материалы.-2004.- № 3,- С. 35-41.

30. Тихобаева А.А., Дуплякин Е.О., Немец Е.А., Саломатина Е.А. Экспериментальное исследование чрескожной матричной системы ацетилсалициловой кислоты // Материалы XI научно-технической конференции «Вакуумная наука и техника» / Под ред.: Д.В. Быкова.- М.:МИЭМ,— 2004,- С. 246-250.

31. Егорова В.А., Немец Е.А., Беломестная З.М., Перова Н.В. Разработка и исследование биодеградируемого пленочного материала ЭластоПОБ™ для рансплантации клеток // Материалы XI научно-технической конференции «Вакуумная наука и техника» / Под ред: Д.В. Быкова.- М. МИЭМ.- 2004.- С 255-259.

32. Елинсон В.М., Лямин А.Н., Сибекин А.В., Немец Е.А. Импульсная плазменная очистка поверхности полимеров от микробиологических объектов // Материалы XI научно-технической конференции «Вакуумная наука и техника» / Под ред.: Д.В. Быкова,-М.:МИЭМ.- 2004,- С. 210-214.

33. Волынец Л.И., Немец Е.А., Бельков A.B., Севастьянов В.И. Использование биопротезов кровеносных сосудов малого диаметра с гепаринсодержащим покрытием // Вестник трансплантологии и искусственных органов - 2004 .- № 1- С. 41-44

34. Ремеева Е.А., Немец Е.А., Розанова И Б., Севастьянов В.И. Методика тромбоцитов в присутствии чужеродной поверхности // Вестник трансплантологии и искусственных органов,-2004,-№ 1.-С. 19-23.

35. Севастьянов В.И., Егорова В.А., Немец Е.А., Перова Н.В., Оншценко H.A. Медико-биологические свойства биодеградируемого материала ЭластоПОБ // Вестник трансплантологии и искусственных органов,- 2004.- № 2,- С. 47-52.

36. Volynez L.I., Nemets Е.А., Bel'kov A.V., Sevastianov V.l. Natural vascular grafts treated by hepatin containing coating И Int. J Artif. Organs - 2004.- V. 27.- P 604.

37 Remeeva E.A., Nemets E.A., Rozanova I.B., Sevastianov V.I Platelet activation: aggregation, ATP release and adhesion induced by biomaterial surface // Int J. Artif. Organs.- 2004.- V. 11- P. 605.

38. Егорова В А., Перова H.B., Немец E.A., Онищенко H.A., Севастьянов В.И. Биодегради-руемый материал «ЭластоПОБ» на основе бактериальных полимеров для реконструктивной хирургии // Тезисы докладов XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - 2005 - Москва.- С. 660.

39. Немец Е.А. Изучение влияния гидрофильно-гидрофобной наноструктуры поверхности на биологические свойства материалов медицинского назначения // Перспективные материалы.-2005,-№ 4,- С. 58-63.

40. Немец Е.А. Экспресс-метод оценки тромборезистентности материалов и изделий медицинского назначения // Вестник трансплантологии и искусственных органов.- 2005.- № 2.-С. 48-52.

Авторские свидетельства и патенты на изобретение:

1. Авторское свидетельство 1391652 (СССР) М. Кл. А61К/725. Способ повышения тромборезистентности полимерных материалов / Новикова С.П, Немец Е.А., Беломестная З.М. - Опубл. 30.04.88 - Бюлл. Изобр - № 6.

2. Трансумбиликальный интрапортальный катетер длительного применения // № 2071791, от 20.01.97 г. / Шумаков В.И., Севастьянов В.И., Немец Е.А., Гайдамакина Г.В., Евсеев ЮН.

3. Способ обработки биологических протезов сосудов // № 2228030 от 10 05.2004 г. / Бельков A.B., Севастьянов В.И., Немец Е.А., Волынец Л.И.

4. Способ обработки биологических протезов сосудов // № 2228031 от 10.05.2004 г. / Бельков A.B., Севастьянов В.И., Немец Е.А., Волынец Л.И.

Заказ №163. Объем 2 пл. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш» г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.po9tator.rn

PUB Русский фонд

2007-4 4649

л Г

к 1 '

Актуальность проблемы.

Неповрежденная поверхность кровеносных сосудов, в отличие от искусственной поверхности, представляет собой активную атромбогенную поверхность за счет контролируемого выхода биологически активных веществ - простациклина, окиси азота и АДФазы, ингибирующих, например, активацию тромбоцитов [35, 77]. Помимо этого гепариноподобные высокосульфи-рованные вещества инкорпорированы в состав мембран эпителиальных клеток [35, 53, 77]. Определенную роль играет наличие на внутренней поверхности кровеносных сосудов доменной гидрофильно-гидрофобной наноструктуры, аналогичной существующей в циркулирующей крови. В результате на границе раздела внутренняя поверхность кровеносных сосудов/кровь поддерживается естественное равновесие между системами активации и ингиби-рования свертывания крови.

Повреждение внутренней стенки кровеносного сосуда или имплантация сосудистого протеза вызывает сдвиг данного равновесия, что может приводить, например, к тромбообразованию за счет активации внутренней системы свертывания крови, адгезии и активации тромбоцитов.

Для предотвращения фатальных последствий в результате тромбирования изделий медицинского назначения необходимо постоянное введение в кровоток веществ, препятствующих тромбообразованию: антикоагулянтов различной природы или биологически-активных веществ (БАВ), воздействующих на тромбоцитарное звено гемостаза.

Введение в кровоток антикоагулянтов сопровождается многочисленными побочными эффектами. Так гепарин (Гп) - наиболее распространенный в клинической практике антикоагулянт крови естественного происхождения -может вызывать кровотечения, особенно у пациентов высокого риска с язвами кишечника, перикардитами, многочисленными травмами или после хирургических вмешательств. Другим недостатком применения антикоагулянтов является его воздействие на тромбоциты, индивидуальная вариабельность зависимости доза-эффект, гепарин индуцированная тромбоцитопения, ухудшение уремической анемии вследствие микротромбозов и скрытой кро-вопотери, а также влияние на метаболизм липидов и костей [213, 222].

Для нейтрализации антикоагулянтного эффекта гепарина и предотвращения постоперационного кровотечения используют введение антагониста гепарина - протамин сульфата (ПС). Хотя протамин и одобрен к клиническому применению, тем не менее, он токсичен и его использование сопровождается рядом побочных реакций: от средней тяжести гипотензии до тяжелого сердечно-сосудистого коллапса, вазодиляцией, брадикардией, аккумуляцией тромбоцитов в легких и рядом других [134, 179, 267].

Избежать или уменьшить отрицательные последствия за счет снижения концентрации антикоагулянтов в кровотоке возможно путем повышения ге-мосовместимости биоматериалов, применяемых для изготовления изделий медицинского назначения, предназначенных для контакта с кровью.

К характерному свойству гемосовместимых материалов относится отсутствие отрицательного воздействия на кровь или ее компоненты. Такие материалы (изделия) не должны: провоцировать образование тромбов и тромбо-эмболий, активировать свертывающую, фибринолитическую системы и систему комплемента, оказывать отрицательное действие на белковые и форменные элементы крови, нарушать электролитический баланс крови и т.д.

Существует два основных пути повышения гемосовместимости медицинских изделий - создание новых материалов и модификация существующих материалов и изделий.

Попытки одновременно достичь оптимальных физико-механических и гемосовместимых свойств синтетических биоматериалов на стадии их синтеза успехом не увенчались. Поэтому в настоящее время модификация поверхности биоматериалов, обладающих необходимым комплексом физикомеханических свойств, является наиболее распространенным способом повышения гемосовместимости изделий медицинского назначения. ^

Свойства поверхности биоматериалов, такие как ^шмизм^гидрофильно- Х гидрофобный баланс, заряд, морфология, доменная структура и др., способны влиять на стадию адсорбции белков и последующую реакцию клеток. Поэтому первоначально внимание исследователей было обращено на физические и химические способы модификации поверхности биоматериалов, позволяющие минимизировать активацию процессов свертывания крови.

Последние годы-наблюдается интенсивный рост исследований, связанных с разработкой биомедицинских материалов, способных имитировать те или иные свойства биологических структур, в том числе и характерные для внутренней поверхности кровеносных сосудов. Так широкое распространение лабораторной и клинической в практике получили методы модификации поверхности изделий биологически-активными веществами, позволяющими имитировать антикоагулянтную и антитромбоцитарную активность естественных сосудов крови. Сравнительно недавно выделилось направление, ориентированное на имитирование доменной наноструктуры сосудистой стенки, позволяющее эффективно подавлять процессы активации свертывания крови, индуцированные контактом с поверхностью биоматериалов.

Однако многие из предложенных методов модифицирования мало эффективны, либо технология из получения слишком сложна для промышленного воспроизводства. Кроме того, практически отсутствует информация, касающаяся как специфики функционирования биологически-активных веществ в иммобилизованном состоянии, так и механизма взаимодействия белковых и клеточных компонентов крови с модифицированной поверхностью.

Цель исследования:

Целью данной работы было разработать, теоретически и экспериментально обосновать эффективные способы повышения гемосовместимости медицинских изделий, основанные на имитировании основных свойств внутренней поверхности кровеносных сосудов.

Задачи исследования

1. Сформулировать и экспериментально обосновать подходы к повышению гемосовместимых свойств материалов и изделий медицинского назначения.

2. Разработать метод оценки тромборезистентных свойств биоматериалов в условиях in -vitro с использованием плазмы крови человека.

3. Провести сравнительный анализ влияния иммобилизации гепарина и ингибиторов агрегации тромбоцитов на изменение характера взаимодействия поверхности биоматериалов с компонентами крови.

4. Изучить механизм взаимодействия иммобилизованных биологически-активных веществ с белковыми и клеточными компонентами крови.

5. Разработать и исследовать биологические свойства аминосодержащих поверхностей и покрытий, обладающих аффинностью к гепарину, а также поверхностей с гидрофильно-гидрофобной наноструктурой.

Научная новизна исследования

1. Сформулированы и экспериментально обоснованы способы повышения гемосовместимости биоматериалов, основанные на имитировании биологической активности эндотелия и гидрофильно-гидрофобной наноструктуры клеточных мембран.

2. Разработан экспресс-метод оценки тромбогенности материалов и изделий медицинского назначения в условиях in vitro с использованием рекальци-фицированной плазмы крови человека.

3. Показано, что ключевую роль во взаимодействии гепаринизированной поверхности с белковыми и форменными компонентами крови играет относительное количество гепарина, сохранившего свою активность в результате иммобилизации;

4. Установлено, что причиной повышения гемосовместимости покрытий в присутствии ингибиторов агрегации тромбоцитов является изменение характера адсорбции белков, а не ингибирование процессов активации клеток.

5. Показано, что для максимально прочного связывания гепарина целесообразно использовать биоматериалы и покрытия с третичными аминогруппами.

Практическая значимость

Метод с использованием рекальцифицированной плазмы крови человека повышает достоверность оценки тромборезистентных свойств поверхности биоматериалов в условиях in vitro.

Предложенные способы модифицирования поверхности биоматериалов, основанные на имитировании гидрофильно-гидрофобной наноструктуры клеточных мембран, позволяют существенно повысить их био- и гемосовме-стимые свойства.

Разработано три вида модифицирующих покрытий (на основе аргинина, полимочевины и полиамина) с высокой аффинностью к гепарину, обладающих хорошей адгезией к широкому кругу материалов синтетического и биологического происхождения.

Разработанные методы гепаринизации не только улучшают тромборези-стентные свойства поверхности различных изделий медицинского назначения, но и дают возможность снизить уровень системной гепаринизации.

Пути практической реализации результатов работы

Методы модифицирования поверхности биоматериалов, основанные на имитировании биологической активности эндотелия, а также гидрофильно-гидрофобной наноструктуры клеточных мембран, могут быть внедрены на предприятия, выпускающие катетеры, гемодиализаторы, протезы кровеносных сосудов, оксигенаторы крови, интраокулярные линзы, биологические сосудистые протезы малого диаметра и т.д.

Метод с использованием рекальцифицированной плазмы крови человека может быть применен в лабораторно-клинической практике для скриниг-ана-лиза образцов материалов медицинского назначения, а также для оценки эффективности технологии модификации их поверхности. В настоящее время данный метод внедрен в практику испытательной лаборатории биологической безопасности медицинских изделий Центра по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО Росздрава.

Апробация работы

Материалы и основные положения диссертации изложены на:

- 2-м научно-техническом семинаре «Гемо- и биосовместимые материалы» (Суздаль) в 1990 г.;

- Международном семинаре « Искусственные органы: теория и практика применения мембран в гемодиализе и плазмаферезе» (Варшава, Польша, 1992);

- 11-ой ежегодной конференции по исследованиям в области биомедицинской инженерии Хьюстонского общества по инженерии в медицине и биологии (Хьюстон, США, 1993 г.);

- 39-м ежегодном заседании ASAIO (Новый Орлеан, США, 1993 г.);

- Международном симпозиуме «Биоматериалы и системы доставки лекарств» (Сеул, Корея, 2000 г.);

- Российско-американском научно-техническом семинаре «Биоматериалы: разработка, исследование, применение», (Саров, 2000 г.)

- 1-м, 2-м и 3-м Всероссийских съездах по трансплантологии и искусственным органам, (Москва, 1998, 2002, 2005 гг.);

- 5-м семинаре научного консультативного комитета ISTC «Нанотехнологии в области физики, химии и биотехнологии», (Санкт-Петербург, 2002 г.);

- ХХХ-ом ежегодном конгрессе ESAO (Краков, Польша, 2003 г.);

- XI-ой научно-технической конференции: Вакуумная наука и техника (Судак, Украина, 2004 г.)

Публикации

Результаты проведенных исследований отражены в 40 печатных работах в отечественной и зарубежной печати, 4 патентах и авторских свидетельствах на изобретение.

ВЫВОДЫ

1. Сформулированы и обоснованы экспериментальные подходы к повышению гемосовместимых свойств изделий медицинского назначения, основанные на имитировании антикоагулянтной и антиагрегантной активности эндотелия, а также гидрофильно-гидрофобной наноструктуры внутренней поверхности кровеносных сосудов.

2. Разработан новый метод определения тромбогенности поверхности биоматериалов и изделий медицинского назначения с использованием ре-кальцифицированной плазмы крови человека. Показано, что предложенные количественные критерии оценки - нормированный и относительный показатель тромбогенности не зависят от индивидуальных особенностей свертывающей системы донора.

3. Проведен сравнительный анализ влияния способов иммобилизации гепарина на процессы адсорбции белков плазмы крови, адгезии тромбоцитов и активации системы комплемента, индуцированные поверхностью модифицированных материалов. Установлено, что чем выше доля активного гепарина, тем меньше количество адсорбированных альбумина и фибриногена, адгезированных тромбоцитов, а также активация системы комплемента.

4. Показано, что наибольшая доля активного гепарина достигается в случае ковалентной иммобилизации гепарина на поверхность, пассивированную плазмой крови.

5. Доказано, что гепарин, иммобилизованный на поверхности биоматериалов, сохраняет антитромбин-зависимый механизм функционирования. Потеря иммобилизованным гепарином способности взаимодействовать с AT-III приводит к увеличению количество необратимо адсорбированного белка, обогащению адсорбционного слоя фибриногеном, что сопровождается ростом количества адгезированных тромбоцитов и активации системы комплемента.

6. Установлено, что первичной причиной повышения гемосовместимости гепаринизированных покрытий в присутствии иммобилизованных ингибиторов адгезии и агрегации тромбоцитов является уменьшение количества необратимо адсорбированных белков, а не ингибирование процессов активации клеток.

7. Изучено влияние природы аминогруппы на характер взаимодействия ами-носодержащих материалов с гепарином. Показано, что для максимально прочного связывания гепарина следует использовать третичные аминогруппы.

8. Разработано три вида модифицирующих покрытий (на основе аргинина, полимочевины и полиамина) с высокой аффинностью к гепарину. Эксперименты в условиях in vitro и in vivo доказали эффективность их применения для повышения гемосовместимых свойств широкого круга материалов синтетического и биологического происхождения.

9. Показано, что имитирование гидрофильно-гидрофобной наноструктуры клеточных мембран прививкой органосилоксанов на гидрофильное стекло или сульфогрупп на гидрофобный полиэтилен сопровождается значительным повышением тромборезистентности их поверхности.

10. При исследовании сульфированной поверхности полиэтилена найдена оптимальная степень сульфирования поверхности (0,6 нМ/см ), обеспечивающая минимальную активацию внутреннего пути свертывания крови и тромбоцитарного звена гемостаза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Изучено влияние способа иммобилизации Гп, присутствия ингибиторов адгезии и агрегации тромбоцитов на количество иммобилизованного гепарина, устойчивость его на поверхности при контакте с плазмой, степень сохранения гепарином своей активности в поверхностно связанном состоянии, а также на параметры гемосовместимости модифицированных материалов (адсорбция белков плазмы крови, адгезия тромбоцитов, активация системы комплемента).

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что механизм функциональной активности БАВ в процессе иммобилизации способен претерпевать существенные изменения. Так причиной повышения гемосовместимости гепаринизированных покрытий в присутствии иммобилизованных ингибиторов адгезии и агрегации тромбоцитов является уменьшение количества необратимо адсорбированных белков, а не ингибирование процессов активации клеток.

Статистический анализ полученных экспериментальных данных (14 гепаринизированных образцов, 3 вида полимерных материалов, модифицированных 5-ю различными способами) позволил прийти к заключению, что при определении гемосовместимых свойств гепаринизированных биоматериалов степень сохранения гепарином своей активности играет ключевую роль. Чем выше доля активного гепарина, тем меньше количество адсорбированных альбумина и фибриногена, адгезированных тромбоцитов, а также активация системы комплемента.

На основании обнаруженных взаимозависимостей параметров гемосовместимости был сделан вывод о том, что для тестирования гемосовместимых свойств гепаринизированных биоматериалов можно ограничиться применением двух методов:

1. Определения доли активного гепарина (ДАТ), определяющей не только эффективность модифицирующего покрытия с точки зрения инактивации факторов свертывания крови, но и характер взаимодействия гепаринизи-рованных материала с тромбоцитами;

2. Регистрации количества адсорбированного С А, определяющего степень активации системы комплемента, индуцированной контактом с гепаринизированной поверхностью.

Изучение характера взаимодействия модельных материалов на основе стекла, модифицированного органосилоксанами с различными концевыми аминогруппами, с гепарином показало, что использование третичной аминогруппы предпочтительнее. В этом случае количество иммобилизованного Гп значительно выше, а комплексообразование более прочно. Увеличение длины «ножки», на конце которой расположена аминогруппа, повышает эффективность взаимодействия аминомодержащих материалов с гепарином, циркулирующим в крови. Это особенно актуально при разработке устройств, обеспечивающих постоперационное удаление антикоагулянта из кровотока.

Отсутствие при обработке аминосодержащих модельных материалов заметного влияния концентрации гепарина в растворе (в диапазоне концентраций с 0,1 до 1,0 ед/мл) и сдвиговой скорости (в диапазоне от 50 до 3000 см"1) позволило рекомендовать производить предоперационную гепаринизацию поверхности изделий медицинского назначения с нанесенными аминосодер-жащими покрытиями в статике и использовать низкую концентрацию антикоагулянта в растворе.

Опираясь на данные, полученные при изучении параметров взаимодействия модельных материалов с гепарином, были разработаны покрытия, обладающие аффинностью к гепарину:

- синтетическое гидрофильное покрытие на основе полимочевины с третичными аминогруппами в боковой цепи полимера (ГПМ);

- синтетическое универсальное саморегулируемое гепаринизируемое покрытие (СГП), синтезированное на основе частично замещенного полиамина;

- покрытие для гепаринизации биотканей на основе аминокислот с аминогруппами в R-rpynne.

Обработка поверхности биоматериалов ГПМ является эффективным способом повышения гемосовместимости поверхности биоматериалов, предназначенных для контакта с кровью. Высокая аффинность синтезированного покрытия к Гп позволяет применить его для создания фильтров крови, способных эффективно нейтрализовать гепарин в раннем постоперационном периоде за счет быстрого удаления антикоагулянта, циркулирующего в кровотоке. Однако область применения ГПМ ограничена, поскольку она образует устойчивое покрытие при нанесении на поверхность полярных или пористых подложек.

Этого недостатка лишено саморегулируемое гепаринизируемое покрытие (СГП), образующего прочный комплекс с гепарином и обеспечивающего прочное взаимодействие с поверхностью любого биоматериала за счет введения в состав модифицирующего раствора соответствующих адгезивов.

Сравнительный анализ активности гепарина, иммобилизованного на поверхности полых волокон из полипропилена с применением саморегулируемого гепаринизированного покрытия, с гепаринсодержащими покрытиями Duraflo II и Carmeda® Bio Active Surface, показал преимущество применения СГП за счет низкой десорбции иммобилизованного гепарина при контакте с кровью, а также высокой доле активного антикоагулянта. Быстрая потеря связанного антикоагулянта покрытием Duraflo II и крайне низкая относительная активность гепарина в покрытии Carmeda® Bio Active Surface позволяет объяснить неблагоприятные результаты попыток коммерческого использования этих продуктов в клинической практике.

Иммобилизация гепарина и аспирина на поверхности повторно используемых гемодиализаторов позволило многократно снизить системную гепа-ринизацию при проведении сеансов гемодиализа на беспородных собаках на фоне нормализации агрегационной способности тромбоцитов, уменьшения лейко- и тромбоцитопении, а также к снижения активации внутреннего пути свертывания крови.

Гепаринизация сосудистых протезов малого диаметра биологического происхождения позволяет вообще отказаться от введения гепарина в кровоток при имплантации модифицированных протезов в эксперименте на животных.

Иммобилизация гепарина на поверхности интраокулярных линз снижает риск постоперационных осложнения за счет минимизации адсорбции белков.

Разработан новый метод определения тромбогенности поверхности биоматериалов и изделий медицинского назначения, предназначенных для контакта с кровью. Отличительной особенностью разработанного метода является использование рекальцифицированной плазмы крови человека, что позволяет регистрировать параметры гемосовместимости в условиях, максимально приближенных к естественным. Предложены количественные критерии оценки - нормированный и относительный показатель тромбогенности, не зависящие от индивидуальных особенностей свертывающей системы донора/пациента. Нормированный показатель тромбогенности (НПТ); применим при сравнении образцов с одинаковым соотношением площадь поверхности/объем плазмы крови и его использование целесообразно при изучении однотипных материалов, а также влияния модификации на гемосовместимые свойства изделий медицинского назначения. Относительный показатель тромбогенности (ОПТ); не зависит, от соотношения площадь поверхности/объем плазмы крови и использование его предпочтительнее при сравнении изделий различной формы.

Сравнение результатов, полученных при использовании бестромбоцитар-ной и тромбоцитарной плазмы крови человека, позволяет сделать вывод о преобладании активации внутреннего пути свертывания крови или тромбо-цитарного пути гемостаза при контакте крови с поверхностью исследуемого материала.

Эффективность, воспроизводимость и повышенная чувствительность разработанного метода определения тромбогенности биоматериалов и изделий медицинского назначения к изменению физико-химических характеристик их поверхности доказана с использованием ряда модельных материалов, отличающихся исключительно природой концевой функциональной химической группы, а также при сравнении параметров тромбогенности ряда коммерческих биоматериалов, широко используемых в клинической практике.

С применением предложенного метода:

- доказано положительное влияние пассивации поверхности белками плазмы крови, даже такими «тромбогенными», как фибриноген и у-глобулин, на способность биоматериалов активировать внутренний путь свертывания крови;

- показано, что формирование на поверхности стекла доменной гидрофильно-гидрофобной наноструктуры сопровождается значительным снижением показателей тромбогенности при контакте как с тромбоцитарной, так и бестромбоцитарной плазмой крови человека, что позволяет рекомендовать такого рода покрытия для обработки изделий сложной геометрии, для которых свойственно как наличие зон застоя, так и областей с высокой сдвиговой скоростью;

- обнаружено, что с повышением степени сульфирования увеличивается активация внутреннего пути свертывания крови, причем значения параметра ОПТ0 коррелируют с количеством белков, адсорбированных на соответствующем образце. В присутствии тромбоцитов зависимость параметра ОПТхр. от степени сульфирования поверхности ПЭНП имеет ярко выраженный локальный минимум при концентрации сульфогрупп, равной 0,6 нМ/см ; - показано, что в результате применения трансдермальной формы ацетилсалициловой кислоты имеет место ингибирование прокоагулянтной активности тромбоцитов. Полученные результаты позволили сформулировать основные положения подхода к разработке гемосовместимых биоматериалов, основанного на имитировании структуры внутренней поверхности кровеносных сосудов:

1. при имитировании антикоагулянтных свойств внутренней поверхности кровеносных сосудов следует стремиться не столько к увеличению количества иммобилизованных биологически-активных веществ, сколько к сохранению их активности. Это особенно актуально в случае иммобилизации гепарина, поскольку степень сохранения им активности в результате иммобилизации определяет не только антикоагулянтные свойства поверхности, но ее гемосовместимость в целом;

2. необходимо учитывать, что механизм действия иммобилизованных агентов может существенно отличаться от механизма их функционирования в свободном состоянии;

3. имитирование гидрофильно-гидрофобной наноструктуры кровеносных сосудов позволяет минимизировать отрицательное воздействие материала на компоненты крови;

4. Сульфирование поверхности гидрофобных материалов эффективно малых концентраций привитых сульфогрупп.