Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Сравнительная гигиеническая оценка опасности веществ промышленного происхождения и продуктов их трансформации, образующихся при обеззараживании воды

с

На правах рукописи

од

г 9?

ПОЛЯКОВА Елена Евгеньевна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ОПАСНОСТИ

ВЕЩЕСТВ ПРОМЫШЛЕННОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ПРОДУКТОВ ИХ ТРАНСФОРМАЦИИ, ОБРАЗУЮЩИХСЯ ПРИ ОБЕЗЗАРАЖИВАНИИ ВОДЫ

14.00.07-Гигиена

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2002

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор З.И.Жолдакова доктор химических наук А.Т.Лебедев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.АЛСоролев доктор биологических наук, профессор Ю.А.Ревазова

Ведущая организация: Московский научно-исследовательский институт гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана

Защита диссертации состоится «оИ »М&Л' 2002 г. в У/ часов на заседании диссертационного совета Д 001.009.01 в ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН по адресу: 119992, Москва, Погодинская ул. д. 10/15 стр.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН

Автореферат разослан « о1/ » (Ллл,/^*-^*-^ 2002 года

Ученый секретарь

диссертационного совета, д.б.н. хЛ?/^^*^) Беляева Н.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. При водоподготовке, особенно при обеззараживании воды хлорсодержащими агентами, многие вещества, находящиеся в воде, трансформируются с образованием продуктов более опасных, чем исходные соединения (T.A.Bellar et al, 1974; J.Symons et al, 1975; A.M. Chen et al, 1980; S. Maruoka et al, 1980; Г.Н.Красовский, 1985). Процессы, происходящие при хлорировании воды, содержащей природные гуминовые и фульвокислоты, исследованы достаточно хорошо (J.J.Rook, 1974; А.Т.Лебедев и соавт., 1995; Н.А.Синикова, 2000). Особое внимание было уделено также изучению опасности ГСС, образующихся в процессе хлорирования воды, содержащей пестициды и аминофенолы (Ю.А.Рахманнн и соавт., 1985). Однако реально дифференцированный норматив с учетом продуктов хлорирования разработан только для фенолов (З.И.Жолдакова и соавт., 1971). Возможно, что многие другие органические соединения, в том числе поступающие в окружающую среду со сточными водами предприятии, способны трансформироваться при обработке воды хлорсодержащими агентами. До сих пор не было проведено системного обобщения сравнительной опасности веществ промышленного происхождения и продуктов их трансформации под действием активного хлора. Недостаточно изучен вопрос о том, насколько широк спектр соединений, способных давать опасные хлорпроизводные в результате хлорирования.

Для унификации условий изучения стабильности и трансформации веществ в водной среде были разработаны «Методические указания к экспериментальному изучению процессов трансформации химических веществ при их гигиеническом регламентировании в воде» (Г.Н.Красовский, Б.М.Штабский, З.И.Жолдакова и соавт., 1985). Из-за отсутствия в этот период должной аналитической базы в гигиенических учреждениях в Методических указаниях рекомендовано производить идентификацию продуктов трансформации в исключительных случаях, а способность веществ реагировать с хлором оценивать лишь качественно. С развитием

аналитической и информационной базы появилась возможность идентификации продуктов трансформации, однако до сих пор не определены условия и границы применимости биотестирования, роль методов токсикологической оценки и необходимый объем токсикологических исследований для получения информации об их реальной опасности. Поэтому необходимо усовершенствовать методические подходы к гигиенической оценке опасности веществ с учетом их трансформации при хлорировании.

В связи с вышесказанным сформулирована цель работы - сравнительная гигиеническая оценка химических веществ промышленного происхождения и продуктов их трансформации, образующихся при обеззараживании воды.

В соответствии с целью решались следующие задачи:

1. На примере веществ из разных структурных рядов установить состав продуктов трансформации при хлорировании воды и обработке ультрафиолетовым излучением (У ФИ) в зависимости от условий эксперимента.

2. На основании экспериментальных данных, полученных в биологических экспериментах на клеточных культурах, зоогидробионтах и теплокровных животных, обосновать условия и границы применимости токсикологических и химико-аналитических методов для сравнительной оценки опасности исходных веществ и продуктов их трансформации.

3. На основе структурных особенностей молекулы исходного вещества и продуктов трансформации теоретически обосновать возможные пути трансформации (хлорирование, окисление и др.) и выбрать структурные параметры, характеризующие способность веществ к образованию продуктов трансформации.

4. Дать рекомендации к совершенствованию методов сравнительной гигиенической оценки опасности веществ и продуктов их хлорирования.

Научная новизна работы. Установлена зависимость состава продуктов трансформации циклогексена, бутилового спирта, дифенилметана,

фенилксилилэтана, ацетофенона, анилина и метилнафталина от обеззараживающего агента (УФИ, хлорная вода, гипохлорит натрия) и молярного соотношения активный хлор/субстрат. Впервые предложены механизмы трансформации циклогексена и дифенилметана под влиянием активного хлора в воде.

Показано отсутствие закономерной связи результатов сравнительной гигиенической оценки опасности веществ и продуктов их хлорирования в субхроническом эксперименте с данными биотестирования на Daphnia magna.

На примере бутилового спирта и продуктов его хлорирования впервые доказана применимость метода расчета реперных доз на основе зависимости «доза-ответ» для сравнительной оценки опасности веществ

Выделены структурные фрагменты, наличие которых в молекуле определяет способность вещества подвергаться интенсивной трансформации с образованием ГСС.

Практическая значимость работы. Обоснованы возможности и ограничения методов сравнительной оценки опасности веществ и продуктов их хлорирования. Предложена система методов гигиенической оценки продуктов трансформации, образующихся при обеззараживании воды. Предлагаемая система позволит повысить надежность оценки опасности веществ, загрязняющих воду.

Работа выполнена в рамках плановых тем 01.9.70002125 и 048. Материалы диссертации использованы при подготовке трех методических документов: Методических указаний по внедрению и применению Санитарных правил и норм СанПиН 2.1.4.559-96 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества» МУ 2.1.4.682-97 (1998); Методических указаний "Санитарный надзор за обеззараживанием сточных вод ультрафиолетовым облучением 2.1.5.732-99" (1999); Методических указаний «Гигиеническая оценка материалов, реагентов, оборудования,

технологий используемых в системах водоснабжения МУ 2.1.4.783-99» (1999).

Апробация работы. Материалы диссертации обсуждены и одобрены на апробационной комиссии НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН (2002 г.), ее разделы доложены на 46-й Конференции по масс-спектрометрии, Орландо, Флорида (1998 г.); 5-й Международной конференции по загрязнению воды, Лемнос, Греция (1999 г.); 16-й Международной конференции по генотоксикологии окружающей среды, Вильнюс (1999 г.); 4-м Международном конгрессе «ЭКВАТЕК-2000», Москва (2000); научной конференции «Водные экосистемы и организмы-2», Москва (2000); IX Всероссийском съезде гигиенистов и санитарных врачей, Москва (2001); Пленуме Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ, Москва (2001).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 3 в центральной печати, 3 за рубежом и 6 тезисов.

Структура работы. Настоящая работа состоит из введения, шести глав, выводов (занимает 130 машинописных листов, содержит 10 рисунков, 25 таблиц), 38 приложений, списка литературы из 147 наименований, из них 85 отечественных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Объекты, объем и методы исследования.

Основные объекты исследования - модельные химические вещества, обеззараживающие агенты (хлорная вода, гипохлорит натрия, УФИ), лабораторные животные и ветвистоусые рачки Daphnia magna. В качестве модельных соединений были использованы циклогексен (ЦГ), н-бутиловый спирт (БС), дифенилметан (ДФМ), ацетофенон (АФ), анилин (АН), 1-метилнафталин (МН) и фенилксилилэтан (ФКЭ). Содержание примесей в веществах составляло не более 1%.

Для решения поставленных задач использовано 24 мыши и 200 крыс, проведено 16 экспериментов с дафниями, выполнено 65 химических, 96 гистоморфологических, около 2000 биохимических анализов. В тесте Эймса проанализировано 240 чашек Петри, в микроядерном тесте - 144000 клеток.

Вещества подвергали действию хлорсодержащих агентов в дистиллированной воде с добавлением 0,02 М фосфатного буфера рН 6,6-6,8 в течение 24 часов в темноте. Содержание активного хлора в растворах определяли методом иодометрического титрования (Т.А.Белявская, 1986). Концентрация хлора в реакционной смеси варьировала от 10 мг/л (используется при обеззараживании сточных вод согласно СНиП 2.04.03-85 (1996)) до 1400 мг/л в зависимости от цели эксперимента.

Воздействию УФИ подвергали растворы модельных соединений в дистиллированной воде. Установка УФИ, предоставленная фирмой «ЛИТ», включала в себя УФ лампы низкого давления, генерирующие излучение с длиной волны 254 нм, соответствующей оптимуму бактерицидной активности. В работе использовали дозу УФИ, применяемую при водоподготовке (20 мДж/см2) и дозу, в 4 раза ее превышающую (80 мДж/см2).

Образующиеся в результате хлорирования и УФИ летучие продукты выделяли из водного раствора методом выдувания-улавливания и анализировали на хроматомасс-спектрометре фирмы Hewlett Packard "MSD 5973". В качестве внутренних стандартов использовали 4-бромфторбензол, фторбензол и пентафторбензол. Полулетучие продукты экстрагировали из водного раствора свежеперегнанным хлористым метиленом, упаривали до минимального объема и анализировали на хроматомасс-спектрометре фирмы Hewlett Packard "Engine". Внутренние стандарты - пердейтерированнные 1,4-дихлорбензол, нафталин, аценафтен, фенантрен, хризен, перилен.

Биотестирование растворов ЦГ, БС, ДФМ и продуктов их хлорирования проводили с использованием 2-3 - дневной молоди дафний согласно ПНД Ф Т 14.1:2:3:4..3-99. ЛК50по всем срокам эксперимента рассчитывали по методу Личтфилда и Уилкоксона (М.Л.Беленький, 1963).

Особенности токсикологического влияния БС и продуктов его хлорирования на организм исследовали в двух субхронических 30-дневных экспериментах. Действие БС изучали в дозах 5; 1; 0,2 и 0,04 мг/кг, продуктов хлорирования БС - в дозах, эквивалентных 1; 5 и 20 мг/кг. Состояние животных оценивали на 5, 12, 20 и 30 сутки опыта.

В экспериментальных исследованиях на животных использовано более 30 показателей, характеризующих общее состояние организма (масса тела, СПП, морфологический состав крови), состояние различных ферментных систем в сыворотке крови, гомогенатах печени и почек, морфофункциональные изменения в ткани печени, почек, надпочечников и тучных клетках соединительной ткани.

Оценка возможного мутагенного эффекта ЦГ, БС и продуктов их хлорирования проводилась с помощью теста Salmonella/микросомы (тест Эймса), а также в микроядерном тесте в соответствии с «Методическими указаниями по изучению мутагенной активности химических веществ при обосновании их ПДК в воде» (1986).

Результаты, полученные в экспериментах, обрабатывали с помощью компьютерных программ "Statistica", "Diasta" и STATISTICA for Windows (4.3). Достоверность различий определяли по критерию t, X и Манна-Уитни.

Установление величин реперных доз и их доверительных границ осуществляли с использованием статистической программы BMDs (US.EPA) (K.S.Crump, 1984).

Личный вклад автора составляет не менее 80%. Часть исследований проводили совместно с д.б.н. Л.П.Сычевой, д.б.н. Н.Н.Беляевой, к.м.н. З.И.Кагановой.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе работы изучали закономерности трансформации веществ под действием хлорсодержащих агентов и УФИ. Качественный и количественный состав производных в большинстве случаев возрастал по

мере увеличения содержания активного хлора в реакционной смеси. В таблице 1 приведены примеры динамики изменения концентраций некоторых продуктов трансформации ЦГ, БС и ДФМ в результате повышения содержания активного хлора в растворе.

Таблица 1

Некоторые продукты хлорирования ЦГ, БС и ДФМ (мкг/л)

Модельное вещество Продукты хлорирования Гипохлорит натрия | Хлорная вода

Молярное соотношение активный хлор/субстрат (концентрация активного хлора, мг/л)

2:1(56) 50:1(1400) 2:1 (56) 50:1 (1400)

ЦГ 2-Хлорциклогексанол 29580 7868 29928 20840

1,2-Дихлорциклогексан 88 220 32,8 2082

Дихлорциклогександион 832 52,8 - -

Трихлорциклогексан (сумма изомеров) - - . - 174

2-Хлорциклогексанон 8,8 17,2 17,3 178

Дихлорированный димер - - - 1736

Хлороформ 24 62,8 334 1940

1,2-Дихлорэтан 0,16 0,12 - 24

БС 1,1 -Дихлорпропанон-2 2,0 - 2,2 14

1,1,1-Трихлорпропанон-2 6,3 - 9,6 30

Тетрагидрофуран 26,8 0,80 1,9 10,8

Хлортетрагидрофуран - 8 - 26,4

4-Хлорбутанол-1 - 28,8 44 120

Хлороформ 408 293 41,2 48

Бутаналь 915 112 - -

ДФМ Хлордифенилметан (сумма изомеров) 92,4 1498 870 50960

Дифенилметанол 206 134 - -

Бензофенон 1642 8253 400 9600

Хлороформ 249 386 231 357

Бензальдегид 2,7 13,8 - 50

При взаимодействии ЦГ с хлорной водой увеличение молярного соотношения активный хлор/субстрат от 2:1 до 50:1 приводило к возрастанию содержания хлороформа и 1,2-дихлорциклогексана в реакционной смеси на 1-2 порядка, а при высоких концентрациях хлорной воды среди производных ЦГ появлялся дихлорированный димер. Концентрация дихлорциклогександиона, напротив, снижалась более чем на порядок при увеличении содержании хлора от 56 до 1400 мг/л, причем это

соединение образовывалось только в результате взаимодействия ЦГ с гипохлоритом натрия. Следует отметить также, что содержание в реакционной смеси основного продукта (2-хлорциклогексанола) четкой закономерности не подчинялось.

При хлорировании БС хлорной водой высокие концентрации активного хлора в реакционной смеси приводили к появлению ди-, три-, пента- и гексахлорэтанов, три- и тетрахлорпропанов. Повышение содержания этого реагента в растворе вызывало увеличение концентраций ди- и три-хлорпропанонов. В то же время при высоких концентрациях гипохлорита натрия в растворе эти производные не образовывались, а бутаналь синтезировался в меньших количествах.

При взаимодействии ДФМ с гипохлоритом натрия в максимальной концентрации образовывались ди- и трихлорбензолы, тетра- и пентахлорпропены, а с хлорной водой - изомеры три- и тетрахлордифенилметанов. По мере увеличения содержания обоих хлорирующих агентов в реакционной смеси существенно возрастали концентрации бензофенона, бензальдегида и изомеров хлордифенилметана. Схема трансформации ДФМ, изображенная на рисунке 1, иллюстрирует сложность и многообразие путей превращения вещества под действием активного хлора.

Данные, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что набор продуктов трансформации вещества прежде всего зависит от его структуры, а также природы и дозы обеззараживающего агента.

Таким образом, что концентрация активного хлора при хлорировании вещества должна выбираться в зависимости от целей эксперимента. Например, для изучения опасности смеси продуктов при нормировании веществ следует ориентироваться на дозы активного хлора, соизмеримые с используемыми при водоподготовке. В то же время, при изучении механизмов трансформации веществ целесообразно выбирать хлорирующие

Рисунок 1. Схема трансформации ДФМ

1 - ДФМ (исходное соединение); 2 - дифенилхлорметан; 3 - дифенилметанол; 4 -фенилхлорфенилметанол; 5 - ди(хлорфенил)метанол; 6 - фенилхлорфенилметан; 7 -фенилхлорфенилхлорметан; 8 - бензофенон; 9 - хлорбензофенон; 10 - дихлорбензофенон; 11 - фенол; 12 - хлорфенол; 13 - ди(хлорфенил)метан; 14 - хлорфенилдихлорфенилметан; 15-трихлорпропан; 16- 1,1,1- трихлорэтан; 17 - гексахлорэтан; 18-тетрахлорпропен; 19

- пентахлорпропен; 20 - дихлорфенилфенилметан; 21 - тетрахлордифенилметан; 22 -дифенилдихлорметан; 23 - бензальдегид; 24 - хлорбензальдегид; 25 - хлороформ, бромдихлорметан, дибромхлорметан; 26 - бензол; 27 - хлорбензол; 28 - дихлорбензол; 29

- трихлорбензол; 30 - дихлорметан; 31 - хлорметилбензол; 32 - бромдифенилметан; 33 -хлорбромдифенилметан.

агенты и набор концентраций активного хлора (или молярных соотношений активный хлор/субстрат), способные приводить к образованию максимального количества производных. В этом случае допустимо использование доз хлора, превышающих концентрации, применяемые в экспериментах по обоснованию нормативов, на 1 -2 порядка.

Согласно литературным данным, УФИ оказывает на большинство химических веществ гораздо более слабое трансформирующее действие, чем активный хлор (UV Light Disinfection Technology in Drinking Water Application, 1996). Полученные нами результаты в целом коррелируют с данными литературы - модельные вещества либо вообще не трансформировались под действием УФИ в дозе 80 мДж/см2, либо давали весьма незначительное число продуктов. В то же время, активный хлор в концентрации 56 мг/л, оказал интенсивное трансформирующее действие на все изученные модельные соединения.

Детальный химический анализ реакционных смесей дал возможность провести гигиеническую оценку образовавшихся производных по литературе и базам данных. В таблице 2 представлены суммарные результаты гигиенической оценки продуктов трансформации семи модельных веществ, образовавшихся под действием хлорной воды (концентрация активного хлора в реакционной смеси 56 мг/л). Как видно из табл. 2, далеко не все производные ранее изучались, и данные о них в информационных источниках отсутствуют. Однако удалось установить, что среди продуктов трансформации изучаемых соединений присутствует от 2 (БС) до 6 (МЫ) канцерогенов, а также не нормированные в воде вещества. Наиболее опасным оказался МН - в процессе трансформации под действием активного хлора из него образовалось 6 продуктов, обладающих канцерогенной активностью и 5 не нормированных в воде соединений.

Оценка сравнительной опасности исходного вещества и продуктов хлорирования затруднена также и тем, что в процессе водопотребления на организм человека оказывает влияние комплекс веществ. Их комбинирован-

Таблица 2.

Количество продуктов, образовавшихся в результате хлорирования модельных веществ хлорной водой (концентрация активного хлора 56 мг/л)

Исходные вещества Количество образовавшихся продуктов

Всего Ранее не изучались и не нормированы в воде Известны как канцерогены

ЦГ 10 4 4

БС 8 3 2

ДФМ 5 1 3

АФ 9 1 5

АН 12 3 5

МН 13 5 6

ФКЭ 13 5 4

ное действие невозможно предсказать только по результатам химического анализа и гигиенической оценки отдельных производных. Поэтому в дальнейшей работе при изучении сравнительной опасности веществ и продуктов их трансформации были использованы токсикологические эксперименты.

В экспериментах с применением биотестирования ЦГ, БС, ДФМ и продуктов их хлорирования на дафниях показано снижение острой токсичности продуктов хлорирования этих веществ для гидробионтов по сравнению с самими веществами по величинам ЛК50. Динамика изменения ЛК50 ЦГ и БС свидетельствовала о повышенной способности продуктов трансформации этих веществ к кумуляции по сравнению с, исходными соединениями. Что касается ДФМ, подобная закономерность прослеживалась менее четко. Очевидно, это связано с тем, что вещества, имеющие в составе молекулы два бензольных кольца, как правило, высококумулятивны (Е.В.Кустова, 1994).

Г.Н.Красовский и соавт. (1991) считают, что данные, полученные на гидробионтах, на человека следует экстраполировать с осторожностью, в первую очередь потому, что ряд биологических эффектов при биотестировании вообще не воспроизводим - например, влияние на

отдельные органы (печень, почки и т.д.) и системы (костную, кроветворную), аллергенное действие и ряд других. Исходя из вышеизложенного, биотестирование на гидробионтах мы рекомендуем рассматривать как дополнение к химическому анализу реакционных смесей, а также как возможность получения первичной, весьма приблизительной информации о кумулятивных свойствах вещества (смеси веществ).

В 30-дневном субхроническом эксперименте на теплокровных животных поступление БС приводило к повышению активности АДГ и каталазы в 1, 2 и 3 группах животных, получавших дозы БС 5,0; 1,0 и 0,2 мг/кг соответственно (рисунки 2А и 2Б). Это совпадает с данными литературы, согласно которым превращения БС в организме начинаются под действием АДГ и каталазы (С.Н.Голиков и соавт., 1986; Л.Ф.Панченко и соавт., 1981). О повреждении клеточных и внутриклеточных мембран в частности, гепатоцитов, митоходрий и лизосом, свидетельствует обнаруженное в сыворотке крови животных 1 группы повышение активности ЛДГ и Ы-ацетил-Р-глюкозаминидазы. В сыворотке крови животных 1 и 2 групп отмечено повышение содержания триглицеридов. Очевидно, это объясняется избыточным накоплением жирных кислот, приводящим к возрастанию концентрации а-глицерофосфата и, соответственно, к стимуляции синтеза триглицеридов в печени (С.Н.Голиков и соавт., 1986).

По результатам субхронического эксперимента дозу БС 1 мг/кг можно было бы оценить как пороговую. Вместе с тем, при действии БС в дозе 0,2 мг/кг наблюдалась некоторая стимуляция активности АДГ и каталазы в крови. Хотя эти изменения проявились однократно и не сопровождались нарушениями в состоянии животных по другим показателям, их нельзя игнорировать, так как они связаны с механизмом интоксикации БС. Очевидно, пороговая доза этого вещества находится в диапазоне между 1,0 и 0,2 мг/кг.

Рисунок 2. Динамика изменения активности ферментов в сыворотке крови белых крыс, получавших БО А - алкогшвдегвдрогаизь? Б - каталазы

А

время, сутки

Б

время, сутки

Контроль - О -5 мг/кг —А -1 мг/кг —* -0,2 мг/кг —• -0,04 мг/кг

В отличие от БС, воздействие продуктов хлорирования БС вызывало стойкое ингибирование активности каталазы (рисунок 3), которое, по мнению Л.Д.Лукьяновой и соавт. (1982), свидетельствует о срыве антиперекисной системы защиты организма. На повреждение мембран под действием продуктов хлорирования БС указывало выявленное у животных 1 группы на 5 и 30 сутки эксперимента снижение активности И-ацетил-Р-О-глюкозаминидазы в ткани печени и почек (рисунок 4А), сопровождаемое активацией фермента в сыворотке крови на 20 и 30 сутки опыта (рисунок 4Б). В те же сроки у животных отмечалось увеличение активности ХЭ и ЩФ в сыворотке крови, свидетельствующее о гепатотоксическом действии продуктов хлорирования БС.

Рисунок 3. Динамика изменения активности каталазы в сыворотке крови белых крыс, получавших продукты хлорирования БС

0,01

0,008

0,006

0,004

0,002

[р<0.01 ]

_ . - [р<0.01 ] - *---г- -

— - , _д^(р<0.05

время, сутки 20

30

-Контроль

■20 мг/кг

. - 5 мг/кг

-1 мг/кг

5

Токсическое действие хлорированных продуктов на гепатоциты сопровождалось и снижением детоксицирующей функции печени, что подтверждается активацией Р-глюкуронидазы в ткани печени и почек.

Воздействие продуктов хлорирования БС приводило к изменению морфофункционального состояния ткани печени, оказывало неблагоприятное

Рисунок 4. Динамика изменения активности N-ацетил-бета-1>глкжозаминидазы в гомогенатах органов (А) и сыворотке крови (Б) белых крыс, получавших продукты хлорирования БС

время, сутки Б

13 20

время, сутки

□ Контроль 020 мг/кг Р5 мг/кг Р1 мг/кг

влияние на почки, надпочечники животных; вызывало усиление дегрануляции тучных клеток подкожной соединительной ткани.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в основе токсического эффекта БС и продуктов хлорирования БС лежат разные механизмы действия.

Данные субхронического эксперимента по изучению влияния продуктов хлорирования на организм свидетельствуют о выраженном общетоксическом действии смеси хлорпроизводных БС и их способности к функциональной кумуляции. При минимальной из изученных доз (1 мг/кг) изменения были менее выражены, чем при 5,0 и 20,0 мг/кг и охватывали меньшее количество показателей. Таким образом, доза 1,0 мг/кг могла бы рассматриваться как пороговая, однако в эксперименте не было выявлено недействующей дозы. Поэтому нельзя с уверенностью утверждать, что доза 1,0 мг/кг является пороговой.

Таким образом, диагностический анализ зависимостей «доза-время-эффект» при учете реакций в градированной форме не позволил четко определить пороговые дозы БС и продуктов его хлорирования, а также установить максимальную недействующую дозу смеси продуктов хлорирования БС. В связи с этим, был осуществлен поиск математических критериев, которые дали бы возможность сопоставить общетоксическое действие БС и продуктов его хлорирования по изоэффекту или по изоответу. Для этого доза хлорпроизводных была пересчитана на реальное содержание продуктов трансформации в реакционной смеси.

При вычислении изоэффективных доз методом вероятностной оценки по Б.М.Штабскому и соавт. (1979) графическим и расчетным методом были получены парадоксально низкие значения ОЕ50т1п и ОЕ°т;п. В связи с этим результаты расчетов не могли служить основой для оценки сравнительной токсичности БС и продуктов его хлорирования.

Для вероятностной оценки зависимости «доза-ответ» и определения доз, близких к пороговым, за рубежом в настоящее время наиболее

разработанным считается метод, получивший название «Установление реперной (опорной) дозы» (Benchmark Dose, BMD) (K.S.Crump, 1984), то есть эффективной дозы (BMD) или ее нижнего 95%-ного доверительного интервала (BMDL), которая вызывает определенное увеличение частоты возникновения данного эффекта по сравнению с контролем или естественным фоном. Принято считать, что реперная доза является приближением к истинному биологическому порогу (Environmental Health Criteria, 1999).

Установление величин реперных доз и их доверительных границ был осуществлен с использованием статистической программы BMDs (US.EPA). Для расчета реперных доз были выбраны наиболее чувствительные показатели - частота увеличения активности каталазы в крови животных на 5-е, 20-е и 30-е сутки эксперимента (БС); частота ингибирования ß-глюкуронидазы в печени и почках животных, индукция холинэстеразы и N-ацетил-Р-0-глюкозаминидазы в сыворотке крови (продукты хлорирования БС).

Результаты расчета показали, что при всех статистических уровнях увеличения частоты вредных реакций реперные дозы БС превышают на 1-2 порядка соответствующие дозы продуктов трансформации БС (таблица 3). Эти данные свидетельствуют о том, что продукты трансформации существенно токсичнее и кумулятивнее самого БС.

Таблица 3

Реперная доза (ВМБ) и ее нижняя доверительная граница (ВМЮЬ) БС и продуктов хлорирования БС (мкг/кг) при реперном ответе 10%.

Сроки наблюдения (сутки) BMD BMDL

БС Хлор-БС БС Хлор-БС

5 210 1,8 110 0,93

20 150 8,2 70 3,7

30 265 8,2 110 3,7

В целом, субхронический эксперимент позволил заключить, что продукты хлорирования БС обладают более выраженной токсичностью, опасностью и способностью к кумуляции по сравнению с БС, а также вызывают токсические эффекты, характерные для хлорорганических соединений (Л.А.Томашевская, З.И.Жолдакова, 1979). Следует подчеркнуть, что 30-дневный субхронический эксперимент с ежедневным введением веществ не менее чем в 3-5 дозах, дает возможность получить репрезентативную информацию по сравнительной токсичности веществ и продуктов их хлорирования; количественным критерием оценки могут служить реперные дозы. При выборе доз продуктов трансформации целесообразно принять, что их доза эквивалентна дозе исходного вещества, а при оценке результатов - учитывать реальное содержание продуктов в реакционной смеси, вводимой животным.

Опасность хлорорганических соединений определяется в основном мутагенными и канцерогенными свойствами, поэтому была изучена мутагенная активность двух модельных веществ (ЦГ и БС) и продуктов их хлорирования в тесте Эймса и микроядерном тесте на млекопитающих.

В наших исследованиях мутагенную активность в тесте Эймса проявила только смесь производных ЦГ на штамме ТА 100 в варианте без метаболической активации (СМ-) при внесении максимальной дозы, эквивалентной 610 мкг ЦГ на чашку. Эти результаты свидетельствуют о том, что среди продуктов трансформации ЦГ есть прямые мутагены, вызывающие мутации типа замены пар оснований и/или сдвига считывания генетического кода (Методические указания по изучению мутагенной активности химических веществ при обосновании их ПДК в воде, 1986). Продукты трансформации БС, а также сами модельные соединения не вызвали мутагенного ответа.

С помощью микроядерного теста мутагенное действие смеси производных ЦГ было обнаружено в эпителиальных клетках толстой кишки и мочевого пузыря, а смеси производных БС - в ПХЭ костного мозга и

эпителиальных клетках толстой кишки. При действии продуктов хлорирования ЦГ эффект более выражен в мочевом пузыре по сравнению с толстой кишкой, а производных БС - в толстой кишке по сравнению с ПХЭ. Эффект различался по минимально действующим дозам (16,4; 32,8 мг/кг для ЦГ и 5; 20 мг/кг для БС соответственно), а также по частоте клеток с микроядрами при сравнении одинаковых доз. Следует отметить, что мутагенный эффект продуктов хлорирования БС проявился на дозе (5 мг/кг), соизмеримой с пороговой. Тот факт, что мутагенная активность продуктов трансформации БС выявлена только в микроядерном тесте, свидетельствует о повреждении генетического аппарата клетки данной смесью на хромосомном уровне.

Для теоретического обоснования возможных путей трансформации веществ был использован метод прогноза. Сопоставление степени конверсии и структуры молекулы послужило основанием для выделения структурных детерминант, определяющих возможность прохождения реакции хлорирования. К ним относятся: бензольное кольцо, активированное электронодонорными заместителями, система конденсированных ароматических колец, двойные связи (ненасыщенный характер соединения), наличие амино-, и гидроксильной групп, а также метильной группы в соположении к кето-группе.

Сравнительный анализ методов гигиенической оценки продуктов трансформации веществ при хлорировании воды показал, что каждый из них имеет свои достоинства и ограничения. Поэтому для получения наиболее полной и объективной информации о токсичности веществ целесообразно рекомендовать следующую последовательность экспериментов:

• Химический анализ продуктов трансформации, гигиеническая оценка исходного вещества и продуктов его трансформации на основе данных из информационно-поисковых систем. Вычленение самого

опасного вещества среди продуктов трансформации для текущего контроля за загрязнением воды.

• Субхронический эксперимент с изучением мутагенного действия микроядерным методом в дозах, близких к пороговым.

• Расчет реперных доз, дающий возможность сделать вывод о сравнительной токсичности и кумулятивности исходных веществ и продуктов их трансформации.

Таким образом, по всем гигиеническим критериям продукты трансформации изученных веществ, образующиеся при хлорировании воды, более опасны, чем исходные соединения.

ВЫВОДЫ

1. В экспериментальных исследованиях с применением метода хроматомасс-спектрометрии показано, что при хлорировании воды, содержащей органические химические соединения разной структурной природы, образуется большое число продуктов трансформации. Полученные продукты свидетельствуют о том, что трансформация веществ может происходить, по крайней мере, по следующим основным механизмам: реакции, идущие с разрывом и без разрыва связей в молекуле (в том числе окисление и присоединение хлора), а также реакции димеризации.

2. Качественный и количественный состав продуктов хлорирования зависит от структуры исходного соединения, природы хлорирующего агента и концентрации активного хлора. Повышение дозы активного хлора приводит к значительному увеличению качественного и количественного состава продуктов в результате реализации глубоких стадий хлорирования. Результаты хлорирования веществ хлорной водой и гипохлоритом натрия пока не позволяют сделать однозначного вывода в пользу того или другого реагента.

3. При обработке ультрафиолетовым излучением воды, содержащей химические вещества, обнаружены только производные БС и ФКЭ.

Сравнение процессов трансформации под влиянием активного хлора и УФО свидетельствует о том, что УФО действует на вещества гораздо мягче, не вызывая трансформации или приводя к появлению весьма незначительного тасла продуктов.

4. Сравнение ЛК50 в экспериментах на Daphnia magna в течение 96 засов показало, что продукты хлорирования обладают, как правило, меньшей эстрой токсичностью, чем исходные модельные вещества. Кривые изменения динамики ЛК50 модельных веществ и соответствующих им смесей продуктов хлорирования указывают на некоторое повышение способности последних к кумуляции.

5. Результаты исследований, полученные в тесте Эймса, свидетельствуют о том, что среди продуктов трансформации ЦГ есть прямые мутагены, вызывающие мутации типа замены пар оснований и/или сдвига считывания генетического кода, а продукты трансформации БС и сами модельные соединения мутагенной активностью не обладают.

6. В субхронических экспериментах на лабораторных животных при внутрижелудочном введении смесь производных ЦГ проявила цитогенетическую активность, более выраженную в эпителиальных клетках мочевого пузыря по сравнению с толстой кишкой, а смесь производных БС -в эпителиальных клетках толстой кишки по сравнению с ПХЭ костного мозга. Наличие мутагенной активности позволяет говорить о канцерогенной эпасности продуктов трансформации ЦГ и БС.

7. В субхроническом эксперименте на белых крысах токсический эффект БС и продуктов хлорирования БС различался по механизму действия. Расчет зависимости «доза-ответ» показал, что реперные дозы БС на 1-2 порядка выше соответствующих реперных доз продуктов трансформации БС, г.е. последние существенно более опасны, чем БС.

8. Методом прогноза показано, что большинство промышленных химических веществ при обеззараживании воды хлором могут подвергаться трансформации с образованием ГСС. Способность легко

трансформироваться определяется наличием одиночных илк конденсированнх бензольных колец с различными электроннодонорнымк заместителями или наличием двойной связи. Для ароматических полиароматических и гетероароматических соединений интенсивносп трансформации зависит от энергетической характеристики образованш интермедиатов реакции электрофильного замещения, которая может бьт определена на основании расчетов.

9. Количественным критерием относительной опасности продукте! трансформации может служить отношение пороговых или реперных доз (с учетом всех видов эффектов) исходного вещества и смеси продукте! трансформации, установленное в эксперименте на теплокровных животных.

10. Каждый метод сравнительной оценки опасности веществ i продуктов их трансформации имеет свои достоинства и ограничения поэтому наиболее полная информация может быть получена лишь npi использовании комплекса методов. При этом наличие современны; информационных технологий на первое место выводит детальньп химический анализ с последующей гигиенической оценкой полученны: соединений по литературе и базам данных.

СПИСОК

работ, опубликованных по теме диссертации

1. Соотношение структура-мутагенная активность на штамме ТА 10' Salmonella typhimurium в ряду галогенированных углеводородов и спиртов короткой цепью // Генетика, 1997, том 33, №5, С. 710-713 (соавторь: Н.В.Харчевникова, В.С.Журков, З.И.Жолдакова, С.М.Новиков).

2. Трансформация циклогексена при хлорировании воды // Гигиена санитария, 1998, №5, С. 8-11 (соавторы: З.И.Жолдаков, А.Т.Лебедев).

3. Оценка мутагенной активности циклогексена и продуктов ег хлорирования // Бюллетень эксп. биологии и медицины, 2000, №6, С. 682 685 (соавторы: Л.П.Сычева, З.И.Жолдакова, Н.Е.Лукманова, Л.В.Ахальцев; В.С.Журков)

4. Опасность хлорорганических соединений, образующихся пр хлорировании циклогексена // Тезисы докладов 4-го Международног конгресса «Вода»: экология и технология ЭКВАТЕК-2000», Москва, 3

мая - 2 июня 2000 г. - М., 2000. - С. 769 (соавторы: З.И.Жолдакова, <\.Т.Лебедев, Л.П.Сычева, В.С.Журков).

5. Гигиенические аспекты применения УФ излучения для обеззараживания воды // Там же, С. 763 (соавторы: Ю.В.Новиков, А.В. Тулакин, Г.В.Цыплакова, Г.П.Амплеева, И.С.Тюленева, О.Г.Семенова, З.И.Жолдакова, Н.А.Зайцев и др.).

6. Особенности биотестирования хлорорганических соединений на гидробионтах // Тезисы докладов научной конференции «Водные экосистемы и организмы-2», Москва, 23-24 Июня 2000 г. - М., 2000. - С. 40 (соавторы: З.И.Жолдакова).

7. Экспериментальная оценка и прогноз образования хлорорганических соединений при хлорировании веществ в воде // Гигиеническая Наука и практика на рубеже XXI века: Материалы IX Всероссийского съезда гигиенистов и санитарных врачей. - Том 1. - М., 2001. - С. 428-431 (соавторы: З.И.Жолдакова, Н.В.Харчевникова, Н.А.Синикова, А.Т.Лебедев).

8. Стабильность и трансформация химических веществ при гигиенической оценке их опасности // Там же, С. 236-239 (соавторы: З.И.Жолдакова, О.О.Синицына).

9. Трансформация химических веществ как критерий риска и возможности прогноза образования опасных продуктов трансформации // "Оценка риска влияния факторов окружающей среды на здоровье: проблемы и пути их решения". Материалы Пленума Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды Российской Федерации, 20-21 декабря 2001 г., М., 2001, С. 55-57 (соавторы: З.И.Жолдакова, О.О.Синицына, Н.В.Харчевникова).

10. GS-MS Study of the Aquatic Chlorination of Cyclohexene. Comparison of Chlorinating Agents Proc. 46th ASMS Conference on Mass Spectrometry. -Orlando, Florida, 1998, p. 727 (co-autors: Z.I.Zholdakova, A.T.Lebedev)

11. Estimation of mutagenicity of the chlorination products of cyclohexene // Satellite Meeting to 29thAnnual Meeting of EEMS and 16th Annual Meeting of NordEMS Environ-mental Genotox-icology. Field and Human Studies in the Nordic/Baltic Region", Vilnius University, Vilnius, Lithuania. - 30 June - 3 July 1999, P. 54-55 (co-autors: L.P.Sycheva, Z.I.Zholdakova, N.E.Lukmanova, L.V.Akhaltseva, V.S.Zhurkov).

12. Formation of organochlorine by-products during chlorination of wastewaters containing cyclohexene and butanol // Water Pollution VI. Modeling, Measuring and Prediction. Edited by C.A.Brebbia, WIT Press, 2001, P. 367-374 (co-autors: Z.I.Zholdakova, К. K. Khamidoulina, A.T.Lebedev).

Одной из наиболее серьезных проблем, возникающих в процессе водоподготовки, является образование продуктов трансформации веществ, находящихся в воде и являющихся более опасными, чем исходные соединения. В 70-е годы в литературе появились сообщения о том, что при обеззараживании хлором воды открытых водоисточников в ней образуются и накапливаются галогенсодержащие соединения (ГСС) - хлороформ, дихлорбромметан, трихлорэтилен и др. [86, 140]. В 1974 г. Рук выдвинул предположение о том, что они образуются из нетоксичных природных гуминовых и фульвокислот [133]. В дальнейшем было установлено, что некоторые ГСС обладают мутагенной и канцерогенной активностью [89]. В 1985 г. Г.Н.Красовский и соавт. впервые у нас в стране обобщили данные, касающиеся проблемы ГСС и сформулировали основные задачи по их изучению [34]. Особое внимание было уделено изучению опасности ГСС, образующихся в процессе хлорирования воды, содержащей пестициды и аминофенолы [59], бифенил, дибензофуран и дибензо-п-диоксин [38]. Однако реально дифференцированный норматив с учетом продуктов хлорирования разработан только для фенолов [21]. Возможно, что многие другие органические соединения, в том числе поступающие в окружающую среду со сточными водами предприятий, способны к галогенированию при обработке воды хлорсодержащими агентами. До сих пор не было проведено системного обобщения сравнительной опасности веществ промышленного происхождения и продуктов их трансформации, образующихся по действием активного хлора. Недостаточно изучен вопрос о том, насколько широк спектр соединений, способных давать опасные хлорпроизводные в результате хлорирования.

Для унификации условий изучения стабильности и трансформации веществ в водной среде были разработаны «Методические указания к экспериментальному изучению процессов трансформации химических веществ при их гигиеническом регламентировании в воде» [43]. Из-за отсутствия в этот период должной аналитической базы в гигиенических учреждениях в Методических указаниях рекомендовано производить идентификацию продуктов трансформации в исключительных случаях, а способность веществ реагировать с хлором оценивать лишь качественно. С развитием аналитической и информационной базы появилась возможность идентификации продуктов трансформации, однако до сих пор не определены условия и границы применимости биотестирования, роль методов токсикологической оценки и необходимый объем токсикологических исследований для получения информации об их реальной опасности. Поэтому необходимо усовершенствовать методику гигиенического нормирования веществ с учетом их трансформации при хлорировании.

В связи с вышесказанным сформулирована цель работы - сравнительная гигиеническая оценка химических веществ промышленного происхождения и продуктов их трансформации, образующихся при обеззараживании воды.

В соответствии с целью решались следующие задачи:

1. На примере веществ из разных структурных рядов установить состав продуктов трансформации при хлорировании воды и обработке ультрафиолетовым излучением (УФИ) в зависимости от условий эксперимента.

2. На основании экспериментальных данных, полученных в биологических экспериментах на клеточных культурах, зоогидробионтах и теплокровных животных, обосновать условия и границы применимости токсикологических и химико-аналитических методов для сравнительной оценки опасности исходных веществ и продуктов их трансформации.

3. На основе структурных особенностей молекулы исходного вещества и продуктов трансформации теоретически обосновать возможные пути трансформации (хлорирование, окисление и др.) и выбрать структурные параметры, характеризующие способность веществ к образованию продуктов трансформации.

4. Дать рекомендации к совершенствованию методов сравнительной гигиенической оценки опасности веществ и продуктов их хлорирования.

Научная новизна работы. Установлена зависимость состава продуктов трансформации циклогексена, бутилового спирта, дифенилметана, фенилксилилэтана, ацетофенона, анилина и метилнафталина от обеззараживающего агента (УФИ, хлорная вода, гипохлорит натрия) и молярного соотношения активный хлор/субстрат. Впервые предложены механизмы трансформации циклогексена и дифенилметана под влиянием активного хлора в воде.

Показано отсутствие закономерной связи результатов сравнительной гигиенической оценки опасности веществ и продуктов их хлорирования в субхроническом эксперименте с данными биотестирования на Daphnia magna.

На примере бутилового спирта и продуктов его хлорирования впервые доказана применимость метода расчета реперных доз на основе зависимости «доза-ответ» для сравнительной оценки опасности веществ

Выделены структурные фрагменты, наличие которых в молекуле определяет способность вещества подвергаться интенсивной трансформации с образованием ГСС.

Практическая значимость работы. Обоснованы возможности и ограничения методов сравнительной оценки опасности веществ и продуктов их хлорирования. Предложена система методов гигиенической оценки продуктов трансформации, образующихся при обеззараживании воды. Предлагаемая система позволит повысить надежность оценки опасности веществ, загрязняющих воду.

Работа выполнена в рамках плановых тем 01.9.70002125 и 048. Материалы диссертации использованы при подготовке трех методических документов: Методических указаний по внедрению и применению Санитарных правил и норм СанПиН 2.1.4.559-96 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль 8 качества» МУ 2.1.4.682-97 (1998); Методических указаний "Санитарный надзор за обеззараживанием сточных вод ультрафиолетовым облучением 2.1.5.732-99" (1999); Методических указаний «Гигиеническая оценка материалов, реагентов, оборудования, технологий используемых в системах водоснабжения МУ 2.1.4.783-99» (1999).

ВЫВОДЫ.

1. В экспериментальных исследованиях с применением метода хроматомасс-спектрометрии показано, что при хлорировании воды, содержащей органические химические соединения разной структурной природы, образуется большое число продуктов трансформации. Полученные продукты свидетельствуют о том, что трансформация веществ может происходить, по крайней мере, по следующим основным механизмам: реакции, идущие с разрывом и без разрыва связей в молекуле (в том числе окисление и присоединение хлора), а также реакции димеризации.

2. Качественный и количественный состав продуктов хлорирования зависит от структуры исходного соединения, природы хлорирующего агента и концентрации активного хлора. Повышение дозы активного хлора приводит к значительному увеличению качественного и количественного состава продуктов в результате реализации глубоких стадий хлорирования. Результаты хлорирования веществ хлорной водой и гипохлоритом натрия пока не позволяют сделать однозначного вывода в пользу того или другого реагента.

3. При обработке ультрафиолетовым излучением воды, содержащей химические вещества, обнаружены только производные БС и ФКЭ. Сравнение процессов трансформации под влиянием активного хлора и УФИ свидетельствует о том, что УФИ действует на вещества гораздо мягче, не вызывая трансформации или приводя к появлению весьма незначительного числа продуктов.

4. Сравнение ЛК50 в экспериментах на Daphnia magna в течение 96 часов показало, что продукты хлорирования обладают, как правило, меньшей острой токсичностью, чем исходные модельные вещества. Кривые изменения динамики J1K50 модельных веществ и соответствующих им смесей продуктов хлорирования указывают на некоторое повышение способности последних к кумуляции.

5. Результаты исследований, полученные в тесте Эймса, свидетельствуют о том, что среди продуктов трансформации ЦГ есть прямые мутагены, вызывающие мутации типа замены пар оснований и/или сдвига считывания генетического кода, а продукты трансформации БС и сами модельные соединения мутагенной активностью не обладают.

6. В субхронических экспериментах на лабораторных животных при внутрижелудочном введении смесь производных ЦГ проявила цитогенетическую активность, более выраженную в эпителиальных клетках мочевого пузыря по сравнению с толстой кишкой, а смесь производных БС - в эпителиальных клетках толстой кишки по сравнению с ПХЭ костного мозга. Наличие мутагенной активности позволяет говорить о канцерогенной опасности продуктов трансформации ЦГ и БС.

7. В субхроническом эксперименте на белых крысах токсический эффект БС и продуктов хлорирования БС различался по механизму действия. Расчет зависимости «доза-ответ» показал, что реперные дозы БС на 1 -2 порядка выше соответствующих реперных доз продуктов трансформации БС, т.е. последние существенно более опасны, чем БС.

8. Методом прогноза показано, что большинство промышленных химических веществ при обеззараживании воды хлором могут подвергаться трансформации с образованием ГСС. Способность легко трансформироваться определяется наличием одиночных или конденсированнх бензольных колец с различными электроннодонорными заместителями или наличием двойной связи. Для ароматических, полиароматических и гетероароматических соединений интенсивность трансформации зависит от энергетической характеристики образования интермедиатов реакции электрофильного замещения, которая может быть определена на основании расчетов.

9. Количественным критерием относительной опасности продуктов трансформации может служить отношение пороговых или реперных доз (с учетом всех видов эффектов) исходного вещества и смеси продуктов

148 трансформации, установленное в эксперименте на теплокровных животных.

10. Каждый метод сравнительной оценки опасности веществ и продуктов их трансформации имеет свои достоинства и ограничения, поэтому наиболее полная информация может быть получена лишь при использовании комплекса методов. При этом наличие современных информационных технологий на первое место выводит детальный химический анализ с последующей гигиенической оценкой полученных соединений по литературе и базам данных.