Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Сравнительная фармакологическая активность препаратов эссенциальных фосфолипидов, солодки и их комбинации при экспериментальном поражении печени

ТАУКИ Ахмед Набил

^ СРАВНИТЕЛЬНАЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ ЭССЕНЦИАЛЬНЫХ

ФОСФОЛИПИДОВ, СОЛОДКИ И ИХ КОМБИНАЦИИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПОРАЖЕНИИ ПЕЧЕНИ

14.03.06- фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 МАЙ 2011

4848047

На правах рукописи

ТАУКИ Ахмед Набил

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ ЭССЕНЦИАЛЬНЫХ

ФОСФОЛИПИДОВ, СОЛОДКИ И ИХ КОМБИНАЦИИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПОРАЖЕНИИ ПЕЧЕНИ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации».

Научный руководитель доктор медицинских наук,

профессор Раков Андрей Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Боровская Татьяна Геннадьевна

доктор биологических наук Новожеева Татьяна Петровна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится "_"_2011 г. в_часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при УчрежденшА^оссийской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Роо сийской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан"____" мая 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Согласно данным ВОЗ за последние 20 лет во всем мире наметилась отчетливая тенденция к росту числа заболеваний печени, обусловливающих высокую смертность населения. Сегодня в мире количество больных с различной гепатобшшарной патологией превышает 2 млрд. человек. Только в странах СНГ ежегодно регистрируется от 500 тыс. до 1 млн. человек, страдающих тем или иным заболеванием печени. Резкому увеличению числа больных с хроническими заболеваниями печени способствовал рост заболеваемости токсическими (алкогольными и медикаментозными) гепатитами, а также существенный рост числа больных с ожирением и сахарным диабетом, которые являются основной причиной развития сравнительно новой нозологической формы - неалкогольной жировой болезни печени [Винницкая Е.В., 2007].

Широкая распространенность токсических гепатитов, значительное омоложение основных групп больных, рост хронических форм болезни, приводящих к снижению трудоспособности, определяют многогранность проблемы и актуальность ее исследования специалистами разных областей [Блюм Х.Е., 2005; Павлов Ч.С. и др., 2007; Custer В, 2004; Stckel F; Droz S, 2009].

Морфологические и клинические проявления патологических изменений в печени под действием повреждающих факторов подробно изучены и описаны [Syntichaki Р, 2004], но биохимические механизмы реализации этих процессов в клетках печени выяснены еще не до конца [Чиркни А.В, 2008]. Важность изучения этих механизмов не вызывает сомнений, в том числе и из-за частого использования гепатотоксичных препаратов, химических веществ и связанной с этим возрастающей смертности [Lee W.M., 2003].

О повреждении гормональных и медиаторных механизмов регулирования гомео стаза при гепатитах известно немного, данные о роли кате-холаминов и других биогенных аминов в формировании осложнений, возникающих на фоне гепатитов, являются противоречивыми [Политова В.П. и др., 1989; Мухаметзянов М.А., 1999]. Между тем, эти вещества оказывают как общее влияние, регулируя тонус сосудов, в том числе печени [Крыжановский Г.Н., 2002], так и локальное, взаимодействуя со специфическими рецепторами мембран гепатоцитов и участвуя в биохимических клеточных реакциях [Imbert-Bismut F., 2001]. Поэтом}' детальное исследование состояния симпатоздреналовой системы и ее связь с биохимическими звеньями функционирования гепатоцитов при острых гепатитах позволит дополнить имеющиеся сведения о патогенезе заболевания и выявить значение этой системы в защитно-адаптационных механизмах гомеостаза [Can S., 2008].

Одним из наиболее перспективных путей решения проблемы лечения гепатитов является рациональное использование наиболее эффективных гепатопротективных средств и их комбинаций. Однако, несмотря на длительный клинический опыт использования гепатопротекторов, границы их применения в гепатологии до сих пор не очерчены [Дударь Л.В., Чернявский В.В., 2009; Колганова К.А., 2009]. Кроме того, конкретный вклад в терапию тех или иных средств выяснить, как правило, невозможно, поскольку лечение в клинике осуществляется комплексно. Индивидуальную активность препаратов можно проверить только в эксперименте. Это в полной мере относится и к такой относительно «молодой» группе гепатопротекторов, как препараты солодки [Ткач С.М., 2009; Каиг Р , Каиг Б, 2009]. До сих пор остается неясным вклад в «защиту» печени от патологического воздействия разных действующих начал корня солодки: терпенов, флаваноидов и полисахаридов.

Одними из наиболее эффективных гепатопротекторов являются препараты эссенциальных фосфолипидов [Рябоконь Е.В., 2009]. На российском фармацевтическом рынке представлены препараты эссенциальных фосфолипидов различных производителей, отличающихся друг от друга по составу фосфолипидов и/или по источнику их получения [Поливанов В.А., 2009]. Это может обусловить неодинаковую их фармакотерапевти-ческую эффективность, что делает целесообразным проведение исследований по сравнительной активности препаратов эссенциальных фосфолипидов различных производителей на модели экспериментального токсического гепатита.

Цель исследования

Сравнить гепатопротекгавную активность и особенности механизма действия препаратов эссенциальных фосфолипидов, солодки и комбинированного средства «Фосфоглив» на модели токсического гепатита у белых крыс.

Задачи исследования

Изучить гепатопротекгавную активность различных препаратов солодки, используя методику двухэтапного скрининга.

Сравнить гепатопротекгавную активность различных препаратов эссенциальных фосфолипидов, используя методику двухэтапного скрининга.

Исследовать патохимические закономерности развития патологического процесса в печени: динамику изменения содержания в крови и печени катехоламинов (адреналин, норадреналин и дофамин), 11-оксикор-тикостероидов, серотонина, гистамина, аскорбиновой кислоты, токоферола, триглицеридов, общего холестерина и холестерина липопротеидов

низкой, очень низкой и высокой плотности, а также скорости аскорбат- и НАДФ-зависимого ПОЛ, активности фрукгозо-1,6-дифосфатальдолазы и кислой фосфатазы на модели несмертельного тетрахлорметанового гепатита у белых крыс.

Изучить влияние препаратов эссенциальных фосфолипидов, солодки и комбинированного средства «Фосфоглив» на динамику изменения содержания в крови и печени катехоламинов (адреналин, норадреналин и дофамин), 11-оксикортсшэстероидов, серотонина, гистамина, аскорбиновой кислоты, токоферола, триглицеридов, общего холестерина и холестерина липопротеидов низкой, очень низкой и высокой плотности, а также скорости аскорбат- и НАДФ-зависимого ПОЛ, активности фрукгозо-1,6-дифосфатальдолазы и кислой фосфатазы на модели несмертельного тетрахлорметанового гепатита у белых крыс.

Определить наиболее эффективный гепатопротектор из изученных препаратов солодки, эссенциальных фосфолипидов и комбинированного средства «Фосфоглив» при тетрахлорметановом гепатите у белых крыс.

Научная новизна

В эксперименте по методике двухэтапного фармакологического скрининга были установлены наиболее эффективные лекарственные средства из групп препаратов солодки и эссенциальных фосфолипидов и их комбинации и определен их спектр защитного действия. При сравнительном исследовании терпеновых и биофлавоноидных препаратов из корня солодки был определен практически равный коэффициент их гепатопро-текгивной активности. Из трех исследуемых препаратов эссенциальных фосфолипидов наибольшей гепатопротективной активностью обладал эссенциале.

В работе определены особенности механизма действия гепагопротек-торов различной химической природы; найдено сходство и различие в развитии их гепатопротективного эффекта. Показано, что единым звеном в механизме действия гепато протекторов является предупреящение медиаторно-гормонального дисбаланса в центральных и периферических структурах, а также прямая (более характерна для эссенциальных фосфолипидов) и/или"косвенная (более характерна для препаратов солодки) регуляция активности ПОЛ и мембранотропная активность. Различия в регулирующем влиянии препаратов на обмен медиаторов и функции мембран определяют специфику их метаболических эффектов.

Практическая значимость

Предложена и экспериментально обоснована модифицированная методика скрининга для поиска соединений с гепатопротективной активностью.

На модели экспериментального гепатита у крыс ранжирована гепа-тоггротективная эффективность трех препаратов эссенциальных фосфо-липидов, использующихся в клинике; выявлена и ранжирована гепа-топротекгивная эффективность различных препаратов солодки. Было показано, что наиболее полным спектром гепатопротективного действия обладает комбинированный препарат «Фосфоглив», чем отдельные препараты эссенциальных фосфолипидов или солодки.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При помощи модифицированного двухэтапного фармакологического скрининга был проведен анализ гепатопротективной активности 8 препаратов эссенциальных фосфолипидов и солодки; наибольшую эффективность показал комбинированный препарат «Фосфоглив».

2. Из препаратов солодки наибольшую активность проявили отвар (содержащий сумму действующих начал) и глицирризиновая кислота (тритерпеновая фракция), менее активен был ликвиригон (флавоноид-ную фракция). Препараты эссенциальных фосфолипидов (производящиеся на разных предприятиях и имеющие различные торговые названия) обладают далеко не равнозначной эффективностью: наибольшей гепатопротективной активностью обладал эссенциале, затем по нисходящей следовали эслидин и эссливер форте.

3. В развитии острого токсического гепатита можно выделить единое патогенетическое звено - гормонально-медиаторный дисбаланс и активацию свободно-радикального перекисного окисления липидов на фоне падения активности компонентов эндогенной антиокислительной системы. Это вызывает лабилизацшо клеточных мембранных структур (повышение в печени активности кислой фосфатазы) и цитолиз гепато-цитов (повышение в крови активности АЛТ и альдолазы). Вторичным по отношению к этому является падение активности синтетических процессов и, в частности, нарушение белкового, углеводного и лили дно го обменов.

4. Эссенциальные фосфолипиды (эссенциале) и препараты солодки (глицирризиновая кислота), применяемые для терапии токсического гепатита по отдельности, не способны полностью восстановить нарушенный биохимический баланс организма животных, в то же время комбинированный препарат «Фосфоглив» (содержит эссенциальные фосфолипиды и глицирициновую кислоту) препятствует развитию гормонально-медиаторного дисбаланса (происходит нормализация содержания в организме животных катехоламинов, гистамина, серотонина, 11-окси-кортикостероидов), нарастанию активности аскорбат-зависимого ПОЛ и предотвращает падение активности НАДФ-зависимого ПОЛ и истощение компонентов эндогенной антиокислительной системы, препятствуя, б

таким образом, нарушению функций щггоплазматических мембран, цитолизу и нарушению обменных процессов в печени.

Внедрение результатов исследования в практику

Основные научные положения и выводы работы применены в научной, педагогической и практической работе кафедры фармакологии и кафедры клинической фармакологии Ярославской государственной медицинской академии.

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 65-летию Ярославской государственной медицинской академии (Ярославль, 2009), 66-летию Ярославской государственной медицинской академии (Ярославль, 2010), Х1-м Международном конгрессе, «ЗДОРОВЬЕ И ОБРАЗОВАНИЕ В XXI ВЕКЕ» (МОСКВА 2010), 66-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объема и методов исследования, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 15 таблицами, 11 рисунками. Библиография содержит 300 литературных источников: 175 российских и 125 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментальной части работы использовались беспородные половозрелые животные: 455 белых крыс-самцов массой 180-220 г. Колебания веса животных одной экспериментальной группы (не менее 10 животных) составляли 10-20 г. Исследование проводилось в соответствии с действующими «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» и «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных». Все животные находились в одинаковых условиях обитания и кормления (стандартный брикетированный корм).

Дозы препаратов для в ну тр иже дудочного введения рассчитывались на основании данных литературы и результатов предварительных исследований. При этом для крыс учитывался коэффициент пересчета 5,9, предложенный проф. Т.А, Гуськовой (1990). Исследуемые препараты и их дозы представлены в таблице 1.

Таблица 1

Лекарственные препараты, использованные в эксперименте

Группа препаратов Препараты Доза

Препараты эссенциальных фосфолипидов Фосфолипиды (Эссенциале Н A.nattemiaxm and Cie,Germany, эссливер форте Нижфарм, Россия, эслидин Нижфарм, Россия) 50 мг/кг по количеству фосфолипидов

Препараты солодки Отвар солодки, сироп солодки (Ярославская фармацевтическая фабрика, Россия), гаицирризиновая кислота (SNMC301НРС, Switzerland), Солодки голой корней экстракт + Солодки уральской экстракт (Ликвиригон, Здоровье УКР, Украина) Отвар и сироп -1 мл/кг; SNMC301 и ликвиритон - 20 мг/кг

Эссенциальные фосфолипиды + гаицирризиновая кислота Фосфолипиды + Глицирризиновая кислота (Фосфогаив, Фармстандарт, Россия) 50 мг/кг фосфолипидов и 20 мг/кг шицирризиновой кислоты

Моделирование экспериментального острого гепатита состояло из двух этапов и было предназначено для скрининга БАВ на гепатопротек-тивную активность.

Основной задачей первого этапа моделирования было быстрое, объективное и относительно нетрудоемкое выявление гепатопротективной активности препаратов с возможностью ее количественного расчета [Беленький M.JI., 1963]. Для этого воспроизводилась жесткая модель токсического гепатита, сопровождающаяся выраженным некрозом печеночных клеток и массовой гибелью лабораторных животных.

В начале исследования у белых крыс была определена токсичность четыреххлористого углерода (СС14). При внутрижелудочном введении установлены дозы минимальной токсичности (ДМТ), 16%, 50%, 84% и 100% летальности (DL16, DL}g, DLS4, и DLW0), которые оказались равны 6,2; 7,5; 10,1; 12,6 и 15,8 мл/кг.

Для проведения I этапа скрининга была выбрана доза DLJ0 - 10,1 мл/ кг. Введение исследуемых препаратов осуществлялось внутрижелудочно через 60 минут после введения токсиканта. Гепатопротективные средства вводили ежедневно всем выжившим животным на протяжении двух недель эксперимента. Анализируемыми критериями являлись процент выживаемости, продолжительность жизни погибших животных, весовой коэффициент печени.

На II этапе моделирования экспериментального острого гепатита проводилось уточнение характера гепатопротективной активности отобранных на I этапе средств и выявление препаратов, обладающих наиболее стабильным и универсальным действием. Для этого у лабораторных животных создавали классическую модель не смертельного токсического гепатита путем однократного внутрижелудочного введения 5 мл/кг 50% раствора СС14 на подсолнечном масле. Ежедневное недельное введение препаратов осуществлялось внутрижелудочно через сутки после применения токсиканта. На 7 сутки эксперимента выполняли биохимические исследования, на основании которых можно было сделать вывод о характере влияния гепатопротекторов на различные стороны функциональной активности.

Для оценки фармакологической эффективности изучаемых лекарственных средств использовался коэффициент гепатопротективной активности - КГА [Ситников, И. Г., 2005].

КГА рассчитывался на основании сравнения результатов 3 групп животных (1 - здоровые интакгные животные, 2 - контрольные животные, 3 - животные, получающие препараты, по следующей формуле:

где И - результат интакгных животных, О - результат животных, получивших препараты, К - результат контрольных животных.

Изучение биохимических показателей осуществлялось при помощи спектрофлюориметрических (спекгрофлюориметр «Hitachi» MPF-4) и колориметрических (фотоэлектроколориметр КФК-2-УХЛ4,2) методов. Для исследования у крыс брали кровь и печень.

Определение в крови активности АлТ осуществлялось стандартизированными методиками с использованием реактивов фирмы «Лахема». Концентрацию общего холестерина, липопротеидов, триглицеридов в плазме крови определяли ферментативным колориметрическим методом с помощью стандартных наборов фирмы «Human» ( Германия). Содержание холестерина (ХС) ЛПНП рассчитывали по формуле Фридвальда как разницу между концентрацией общего холестерина, ХС ЛПВП и ХС ЛПОНП. Концентрацию ХС ЛПОНП вычисляли как ТГ/2,2 (содержание триглицеридов, деленное на 2,2) [Камышников B.C., 2003].

Совместное определение показателей гистамина (ГТ) и серотонина (СТ) в крови проводилось методом, основанном на измерении флюоресценции продуктов конденсации гистамина с ортофталевым альдегидом, а серотонина - с нингидрином по методике Л.Я. Проплатой (1981). Ориентируясь на интенсивность свечения стандартных проб, производится расчет показателей в мкг/мл и мкг/г. Уровень адреналина (АД), норадреналина (НА), дофамина (ДА) определялся дифференциально-флюориметрическим методом В.О. Осинской (1977), основанном на окислении йодом адреналина, норадреналина и дофамина с образованием флюоресцирующих продуктов - адренолютина, норадренолютина и дофалюгана. Концентрация катехоламинов в крови выражалась в мкг/мл, в печени - мкг/г. Определение 11 -оксикортикостероидов (11-ОКС) проводилось по методике Ю.А. Панкова и И .Я. Усватовой [Камышников B.C., 2003], которая основана на том, что экстрагированные из плазмы крови 11-ОКС обнаруживают флюоресценцию после обработки проб смесью концентрированной серной кислоты и этилового спирта. Вычисляли коэффициенты АД/НА; ДА/(АД+НА); 11-ОКС/АД.

Определение активности кислой фосфатазы (КФ) проводили колориметрическим методом, который основан на измерении количества паранитрофенола, образующегося при ферментном гидролизе парани-трофенилфосфата [Камышников B.C., 2003]. Активность КФ рассчитывали в мМоль паранитрофенола/г. Определение активности щелочной фосфатазы (ЩФ) проводили колориметрическим методом, который основан на измерении количества паранитрофенола, образующегося при ферментном гидролизе паранитрофенилфосфата при рН>7. Активность ЩФ рассчитывали в мМоль паранитрофенола/г. Определение концентрации альбумина в крови: колориметрия с бромкрезолом зеленым. Единицы измерения мг%. Определение количества тканевого гликогена проводили колориметрическим методом после этанольно-10

щелочной экстракции и обработки концентрированной серной кислотой [Прохорова М.И., 1982; Kemp A, Rits A.S, 1954]. Концентрацию гликогена выражали в мг%. Определение активности фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы проводили колориметрическим методом с применением 2,4-динитрофенилгидразина. Активность фермента измерялась в условных единицах (B.C. Камышников, 2003). Активность систем ферментативного (НАДФ-зависимого) и неферментативного (аскорбат-зависимого) ПОЛ определяли по скорости накопления МДА. В качестве прооксидантов использовали НАДФ, аскорбат и пирофосфат железа. Скорость ПОЛ выражали в мкМ МДА/мин х мл. [Рябков А.Н и др., 1991]. Малоновьш диальдегид (МДА) определяли спектрофотометрически; концентрацию МДА выражали в мкМ/мл [Арутюнян A.B., 2000]. Определение токоферола проводили флюорометрическим методом. Концентрацию витамина Е выражали в мг% [Черняускене Р.И и др., 1984]. Количественное определение аскорбиновой кислоты (АК) проводили дихлорфенолиндофеноловым методом. Концентрацию витамина выражали в мг% [Покровский A.A., 1969]. Осмотическая резистентность эритроцитов (ОРЭ) изучалась стандартизированным методом [Меньшиков В.В., 1987].

Статистическая обработка полученных данных проводилась на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ Statistica for Windows версия 6.0. В экспериментальной части исследования количество определений каждого показателя в различных опытах составляло от 8-22. Рассчитывали средние, их ошибки, среднее квадратичное отклонение, дисперсию. Для межгрупповых сравнений использовался критерий t Стьюдента (при наличии нормального распределения) и непараметрический критерий Уилкоксона (при его отсутствии), для множественных сравнений использовался критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони. Различия считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе работы проводило сь сравнительное исследование гепа-топротективной активности лекарственных препаратов солодки и эссенци-альных фосфолипидов. Анализ гепатопротекгивных свойств исследуемых соединений проводился с использованием методики двухэтапного фармакологического скрининга. Всего было изучено 8 препаратов.

Как показали результаты I этапа скрининга (суммация данных по всем трём показателям изучаемым показателям: выживаемость, продолжительность жизни и весовой коэффициент печени), исследуемые препараты можно подразделить на 3 группы: 1 - лекарственные средства, показавшие

высокую степень гепатопротекгавной активности (КГА не менее 0,70): «Фосфоглив» (0,99) и эссендиале (0,70); 2 группа - лекарственные вещества со средней степенью активности (КГА 0,40 - 0,69): глицирризиновая кислота (0,55), отвар корня солодки (0,47), эслидин (0,42), ликвиритон (0.43); к препаратам 3 группы относятся лекарственные средства с низкой степенью активности (КГА менее 0,40): эссливер (0,22) и сироп солодки (0,15) (рисJ).

Рис. 1. Гепатопротекгорная активность препаратов по КГА (1-й этап скрининга)

Данное исследование показало также и то, что так называемые «препараты-аналоги» эссенциальных фосфолипидов (производящиеся на разных предприятиях и имеющие различные торговые названия) обладают далеко не равнозначной активностью. Так, наибольшей гепато-протективной активностью обладал эссендиале (0,70), затем по нисходящей следовали эслидин (0,42) и эссливер (0,22). Из четырех препаратов солодки три (глицирризиновая кислота, отвар корня солодки и ликвиритон) показали сходную эффективность (КГА 0,42-0,55), а сироп солодки статистически значимой гепатопротективной активностью не обладал. Это показывает, что вклад тритерпеновых и флаваноидных гликозидов в гепатопротективную активность корня солодки был примерно равным.

Следует также отметить, что наибольшую эффективность показал комбинированный препарат «Фосфогив». По гепатопротективной активности он почти в 1,5 раза превосходил эссендиале и в 2 раза глицирри-зиновую кислоту.

По результатам I этапа скрининга для дальнейших исследований были отобраны 5 препаратов из 8: из препаратов эссенциальных фосфолипидов 12

- эссенциале, имеющий наибольшую активность; из препаратов солодки -лекарственные средства, содержащие комплекс действующих начал (отвар корня) или отдельные их компоненты (ликвиритон и глицирризиновая кислота), также комбинированное лекарственное средство - «Фосфогив».

II этап скрининга позволил выяснить, что исследуемые препараты существенно различаются по влиянию на динамику изменения значений маркеров патологического процесса. Так, цитолиз гепатоцитов предупреждает «Фосфогив», а эссенциале достоверно ограничивал активность этого процесса. Холестазу препятствуют «Фосфогив» и отвар корня солодки. Значимое нарушение белюовосинтетической функции печени предупреждали эсснциале и отвар корня солодки, но максимально активным был «Фосфогив». Гликогенсинтезирующую функцию наиболее полно восстанавливали «Фосфогив» и далее по мере убывания эффективности следовали глицирризиновая кислота, отвар корня солодки, ликвиритон и эссенциале (рис.2).

*)- достоверная разница (р<0,05) при сравнении с группой ишжгных животных **}- достоверная разница (р<0,05) при сравнении с контрольной 1руппой Рис. 2. Влияние исследуемых препаратов на концентрацию гликогена в печени крыс с экспериментальным токсическим гепатитом (мг%)

Подводя итог II этапа скрининга, можно отметить, что наиболее активным, стабильным, разноплановым и универсальным гепатопротекгив-ным действием обладал «Фосфогив», далее следовали эссенциале, отвар корня солодки, глизирризиновая кислота и ликвиритон.

Проведенное исследование также показало, что использование комбинированных препаратов более эффективно, чем монотерапия. «Фосфогив» был более активен, чем взятые по отдельности эссенциале и глицирризиновая кислота.

Анализируя данные, полученные в ходе двухэтапного скрининга на белых крысах по поводу гепатопротективной активности, следует отметить, что в результате спецйалышх нетрудоемких исследований можно получить объективную оценку терапевтической эффективности гепато-протекгивных средств.

По результатам скрининга для дальнейшего исследования были выбраны комбинированный препарат «Фосфогив» и его компоненты -эссенциале и глицирризиновая кислота.

На следующем этапе работы на модели несмертельного тетрахлормета-нового гепатита у белых крыс исследовались патохимические закономерности развития патологического процесса в печени: динамика изменения содержания в крови и печени катехоламинов (АД НА и ДА), 11-ОКС, СТ, ГТ, аскорбиновой кислоты, токоферола, триглицеридов, общего холестерина и холестерина липопротеидов низкой, очень низкой и высокой плотности, а также скорости аскорбат- и НАДФ-зависимого ПОЛ, активности фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы и кислой фосфагазы, а также влияние на них препаратов эссенциальных фосфолипидов (эссенциале), солодки (гаицирризиновнй кислоты) и комбинированного средства «Фосфоглив».

* - достоверная разница (р<0,05) с интактаой группой ** - достоверная разница (р<0,05) с группой острого гепатита Рис. 3. Содержание АД в крови крыс с экспериментальным токсическим гепатитом (мкг/мл).

На фоне острого экспериментального гепатита у животных наблюдалась (рис.3 и 4) выраженная дисфункция симпатоадреналовой системы, которая характеризовалась повышением в крови и печени концентрации АД и НА (на 82% и 31%, 21% и 19% соответственно; р<0,05) и падением содержания дофамина на 38% и 34% (р<0,05). По-видимому, при развитии ОГ повышение уровня АД и НА в плазме связано не только (или не столько) с увеличением их синтеза, сколько с угнетением активности ферментов,

□ штатные ■ контрольные

■ фосфоглив О эссенциале

а глицирризиновая кислота

ответственных за метаболизм КА. Уменьшение количества ДА можно связать с угнетением синтеза ДОФА из тирозина вследствие нарастания ацидоза и угнетения активности тирозингидроксилазы [Меерсон Ф.З., 1986]. Повышение значений коэффициента АД/НА в крови на 56% свидетельствует о том, что, несмотря на одновременность повышения концентрации АД и НА в крови и печени этот процесс шел нераномерно: уровень АД повысился в более значительной степени, чем НА. Концентрация АД на периферии полностью зависит от его синтеза в мозговом слое надпочечников, а в основе увеличения концентрации НА лежит его повышенная продукция адренергическими нервами. Это позволяет сделать вывод, что при остром гепатите происходит преимущественная активация гормональной компоненты САС, а не медиаторной [Карсанов Н.В.и др., 2002].

Падение значений «дофаминового» коэффициента в исследуемых тканях (в 2,1 раза в крови и в 1,8 раза в печени) свидетельствует о превалировании активности вазоконстрикторных КА над вазодилятирующими и, в итоге, указывает на выраженное нарушение периферической гемодинамики (повышение периферического сопротивления сосудистой стенки и объема циркулирующей крови), микроциркуляции и трофики тканей. Рецепторное поле сосудов печени представлено в основном сосудосуживающими с^- и а,-адренорецепторами при минимальном представительстве вазодилятирующих Р2-адренорецепторов. В этом случае значительная роль в регуляции периферического кровотока принадлежит ДА, который через постсиналтические Д,-дофаминовые рецепторы способствует прямому' расслаблению сосудистой стенки артерий, а посредством возбуждения пресинаптических Д,- дофаминовых рецепторов препятствует выбросу НА в синаптическую щель [Карсанов Н.В.и др., 2002].

* - достоверная разница (р<0,05) с интактной группой

** - достоверная разница (р<0,05) с группой острого гепатита

# - достоверная разница (р<0,05) групп эссенциаде и глицирризиновой кислоты с группой «Фосфогива»

Рис. 4. Влияние исследуемых препаратов на содержание ДА (мкг/мл) в крови крыс с экспериментальным токсическим гепатитом

Введение исследуемых препаратов препятствовало грубым изменениям показателей САС на фоне токсического гепатита. Так, использование «Фосфогива» и эссенциале полностью предупреждало нарастание уровня АД. как в крови, так и в печени. При введении глицирризиновой кислоты, хотя и имело место достоверное возрастание концентрации данного кате-холамина в крови и печени, но в меньшей степени (на 16 и 9% соответственно), чем в контроле. Однако необходимо отметить, что при использовании глицирризиновой кислоты концентрация АД в исследуемых тканях была достоверно выше, чем при введении «Фосфогива» (на 36% для крови и 23% для печени). Исследуемые препараты снижали концентрацию НА на 8-21%, однако достоверная разница по содержанию НА в сравнении с контрольной группой крыс наблюдалась только при введении «Фосфогива».

Введение исследуемых препаратов животным с моделируемым ОГ препятствовало падению уровня ДА, как в крови, так и в печени. Наиболее эффективным препаратом был «Фосфогив»: его применение приводило к полной нормализации исследуемого показателя. Также, следует отметить, что при введении глицирризиновой кислоты уровень ДА крови и печени оставался достоверно ниже на 24% и 26%, чем при использовании «Фосфогива».

Все исследуемые препараты (рис.5) в той или иной степени нормализовали значения «адреналинового» и «дофаминового» коэффициентов в крови и печени. Наиболее эффективными препаратами были «Фосфогив» и эссенциале. Его применение приводило к полной нормализации исследуемого показателя. Следует отметить, что при введении глицирризиновой кислоты значения коэффициента ДА/(АД+НА) крови и печени был достоверно ниже на 36% и 38%, чем при использовании «Фосфогива».

Кровь Печень

* - достоверная разница (р<0,05) с ингактной группой ** - достоверная разница (р<0,05) с группой острого гепатита

# - достоверная разница (р<0,05) групп эссенциаде и глицирризиновой кислоты с группой «Фосфогива»

Рис. 5. Влияние исследуемых препаратов на значение коэффициента ДА/ (АД+НА) в крови и печени крыс с экспериментальным токсическим гепатитом

На фоне развития ОГ (рис.6) у белых крыс имело место, выраженное повышение глюкокортикоидной активности: концентрации 11-ОКС крови возросла в 2,1 раза, значение же коэффициента 11-ОКС/АД практически не изменилось, т.е. изменение функциональной активности коркового и мозгового слоя надпочечников происходило практически параллельно.

* - достоверная разница (р<0,05) с интактной группой

**- достоверная разница (р<0,05) с группой острого гепатита

# - достоверная разница (р<0,05) групп эссенциаде и глицирризиновой кислоты с группой «Фосфогива»

Рис. 6. Влияние исследуемых препаратов на содержание И-ОКС (мкг/мл) в крови крыс с экспериментальным токсическим гепатитом

Применение «Фосфогива» и эссенциаде, но не глицирризиновой кислоты, способствовало нормализации содержания глюкокортикоидов в крови. «Надпочечниковый» коэффициент под воздействием препаратов изменений не претерпевал.

На фоне острого гепатита у экспериментальных животных (рис.7) наблюдался параллельный рост концентрации ГТ в крови и печени в 2,7 и 2,3 раза. Повышение активности гистаминергической системы в печени, по-видимому, является положительным фактором, так как гистамин считается функциональным антагонистом СТ и НА в отношении органного кровотока и обладает антиоксидантной активностью [Вайсфельд И.Л.; Г.Н.Кассиль, 1981; Ching T.L.; Koelemij J.G.; Bast А., 1995].

* - достоверная разница (р<0,05) с интактной группой

** - достоверная разница (р<0,05) с группой острого гепатита

# - достоверная разница (р<0,05) групп эссенциаде и глицирризиновой кислоты с группой «Фосфогива»

Рис. 7. Влияние исследуемых препаратов на содержание гистамина (мкг/мя) в I крови крыс с экспериментальным токсическим гепатитом

i Все исследуемые препараты приводили к снижению уровня ГТ в

j крови и печени. Наиболее эффективным препаратом был «Фосфогив»:

его применение способствовало полной нормализации исследуемого показателя. Эссенциале также нормализовал содержание ГТ в печени, а в крови препятствовал его повышению на 40% (р<0,05). Глицирризино-вая кислота достоверно препятствовала повышению уровня ГТ только в крови на 28%.

Уровень СТ при введении тетрахлорметана в крови и печени экспериментальных животных возрастал в 2 и 1,5 раза соответственно (рис, 8). Имеется мнение, что сдвиги обмена СТ, происходящие в печени при формировании гепатита, связаны, прежде всего, с угнетением ферментативного дезаминирования и, в меньшей степени, с увеличением синтеза СТ клетками хроматофинной ткани кишечника [Vanhoutte P.M.; Luscher Т.М., 1986].

Введение «Фосфогива» приводило к нормализации показателей СТ как в крови, так и в печени. Эссенциале нормализовало уровень СТ в крови и способствовало значимому (на 25%) его снижению в печени. Глицирризиновая кислота у больных животных достоверно препятствовала повышению уровня СТ на 34% только в крови. Следует также отметить, что при введении глицирризиновой кислоты содержание ГТ в крови I и печени, а СТ в печени, было достоверно выше, чем при использовании

«Фосфогива».

* - достоверная разница (р<0,05) с интактной группой ** - достоверная разница (р<0,05) с группой острого гепатита Рис. 8. Влияние исследуемых препаратов на содержание серотонина (мкг/мл) в крови крыс с экспериментальным токсическим гепатитом.

При развитии токсического гепатита имеет место поражение печеночной паренхимы, некроз ряда клеток и их цитолиз. В качестве маркеров некротических процессов, происходящих в печени при ведении четырех-хлористого углерода, были выбраны два фермента - цитоплазматический гликолигический фермент Фр-1,6-ДФА и лизосомалъный фермент - КФ. По данным литературы повышение активности Фр-1,6-ДФА в крови и КФ в печени коррелирует с тяжестью поражения печеночной ткани патологическими агентами [Калинин A.B., 2005; Sherlock S, 1995],

При развитии ОГ уровень плазменной активности одного из ведущих ферментов гликолиза Фр-1,6-ДФА, локализованного в цитоплазме гепа-тоцитов и диффундирующего в кровь после гибели клетки повышался в 1,8 раза (р<0,05). Полученные данные сопоставимы с результатами по исследованию плазменной активности другого цитоплазматического фермента АлАТ. Активность лизосомального фермента кислой фосфатазы, являющегося маркером клеточной деструкции, при экспериментальном ОГ повышалась на 41%.

Введение «Фосфогива» и эссенциале оказывало значимое влияние на процессы цитолиза гепатоцитов; активность Фр-1,6-ДФА в крови нормализовалась, а активность КФ в печени перестала достоверно отличаться от таковой группы интакгного контроля и снизилась по отношению к больным животным на 19 и 20%. Нормализация активности лизосомального фермента КФ на фоне применения гепатопротекторов прежде всего связана с ограничением ими повреждающего действия свободных радикалов на мембранные образования клеток (в частности лизосом), что и снижает уровень их лабилизации.

Печень является основным органом, осуществляющим обмен и синтез липидов в организме, поэтому гепатит, ведущий к нарушению функции

19

печени, сказывается на обмене липидов [Бунатян Т.Г. и др., 1999].

В условиях экспериментального ОГ в крови крыс происходило существенное нарушение липидного обмена (рис.9): имело место снижение содержания общего холестерина на 18% (р>0,05) при одновременном возрастании концентрации тригяицеридов (ТГ) на 81% (р<0,05). Одновременно в крови больных животных изменялся и липопротеидный спектр: возрастал по отношению к интакгным животным удельный вес холестерина в наиболее атерогенной фракции липопротеидов крови - ЛПНП и достоверно снижался в их антиатерогенной фракции - ЛПВП, что закономерно увеличивает степень атерогенности плазмы крови. Так, коэффициент ЛПНП/ЛПВП достоверно повышался в 1,8 раза. Уровень ЛПОНП снижался на 17% (р>0,05), но это явление носило характер тенденции.

В целом действие исследуемых гепатопротекгоров на липидный обмен можно охарактеризовать следующим образом: они способствовали снижению в крови содержания ТГ, не влияли на уровень ЛПНП и повышали синтез холестерина и его включение в антиатерогенные ЛПВП. Все это вместе взятое способствовало снижению атерогенности плазмы. Наиболее активен в этом отношении был «Фосфогив», затем следовал эссенциале, а минимальной эффективностью обладала глицирризиновая кислота.

интактаые контрольные Фосфоглив Эссенциале Глицирризиновая

кислота

* - достоверная разница (р<0,05) с интактной группой ** - достоверная разница (р<0,05) с группой острого гепатита Рис. 9. Влияние исследуемых препаратов на обмен липидов (мкг/мл) крыс с экспериментальным токсическим гепатитом.

Для обеспечения жизнедеятельности клетки требуется постоянное обновление липидного слоя клеточных мембран, что осуществляется при

помощи перекисного окисления липидов, который при резкой активации является универсальным механизмом повреждения клеток [Мирзоян С. А. и др., 1993]. ПОЛ мембран может осуществляться по ферментативному и неферментативному механизму. Ферментативный ПОЛ способствует модификации мембранных фосфолипидов, выполняет функции синтеза биологически активных веществ, детоксикации, метаболизма ксенобиотиков и эндогенных субстратов. Он локализован на ограниченных участках мембран и осуществляется НАДФ-зависимыми оксигеназами эндо-плазматического ретикулума со смешанной функцией [Владимиров Ю.А., 1998; Скворцов В.В., 2003]. Неферментативный (аскорбат-зависимый) ПОЛ обладает выраженным разрушительным характером, что приводит к структурным нарушениям клеточных элементов и гибели самих клеток. Он не имеет специфической организации и развивается в любых структурах клеток [Крыжановский Г.Н., 2000].

Повышение содержания продуктов пероксидации липидов в печени и эритроцитах пораженных животных происходило только за счет свободно-радикального (аскорбат-зависимого) пути ПОЛ, активность которого при ОГ достоверно возрастала в 2,5 и 3 раза соответственно. Активность ферментативного (НАДФ-зависимого) ПОЛ, наоборот, снижалась соответственно на 24 и 38% по отношению к контролю. Происходило нарушение соотношения активности ферментативного, и неферментативного ПОЛ в гепатоцитах (рис.10): коэффициент АЗ/НЗ ПОЛ увеличивался при ОГ в 3,6 раза в печени и в 5 раз в эритроцитах.

Ограничение реакций ПОЛ в клетках до физиологического уровня достигается за счет согласованного функционирования специфических защитных антиокислительных ферментативных систем и биоантиокислителей, компартментализацией субстратов и катализаторов ПОЛ [На1-1гае11 В.; Сийепс^е 1,1990]. К основным параметрам неферментативной АОС относятся токоферол, БН-группы, аскорбиновая кислота [Легонь-коваЛ.Фидр., 1997; .ГаеБсЫсе Н., 1995].

При моделировании токсического гепатита повышение активности пероксидации липидов происходило на фоне истощения возможностей антиокис лительной системы организма: так, концентрация аскорбиновой кислоты в печени снижалась на 30%. Процессы, происходящие в печени, находили зеркальное отражение в показателях крови. Дополнительно к выше перечисленным параметрам АОС в крови исследовали также концентрацию токоферола, которая падала на 28%.

Поскольку имеет место тесная связь между изменением проницаемости эритроцитарных мембран и мембран клеток, пораженных патологическим процессом органов [Захарова Н.Б и др., 1991], исследовалась осмотическая резистентность эритроцитов при их инкубации в 0,5% растворе ИаС1. При моделировании токсического гепатита процент гемолиза эритроцитов достоверно нарастал в 1,4 раза (рис. 11).

Таким образом, при развитии токсического гепатита в организме пораженных животных происходили существенные изменения в системе ПОЛ: на фоне истощения запасов эндогенных антиоксидантов имело место резкое повышение скорости пероксидадии мембранных липидов, происходившее только за счет неферментативного аскорбат-зависимого пути. Именно, активация неферментативного ПОЛ, приводящая к патологической модификации мембранных фосфолипидов, и лежит в основе патогенеза разрушения печеночной клетки при гепатитах любой этиологии.

интактные контрольные Фосфоглив Эссенциале Глицирризиновая

кислота

* - достоверная разница (р<0,05) с интактной группой ** - достоверная разница (р<0,05) с группой острого гепатита Рис. 10. Влияние исследуемых препаратов на отношение АЗ ПОЛ/НЗ ПОЛ в печени крыс с экспериментальным токсическим гепатитом

Все три исследуемые препарата в той или иной степени обладали антиоксидантной активностью, которая играла немаловажную роль в их гепатопротективном действии. Наиболее значимо активность ПОЛ и АОС модулировал «Фосфогив». Он препятствовал у подопытных животных нарастанию активности аскорбат-зависимого ПОЛ и предотвращал падение активности НАДФ-зависимого ПОЛ. Одновременно с этим предупреждалось истощение компонентов антиокислительной системы. Таким образом, «Фосфогив»приводил к гармонизации активностей систем ПОЛ и АОС, предотвращая нарушение функций цитоплазмати-ческих мембран и, в частности, предупреждая снижения ОРЭ. Далее по эффективности следовало эссенциале. Его введение больным животным также препятствовало нарастанию активности аскорбат-зависимого ПОЛ в крови и в печени и снижению здесь же скорости НАДФ-зависимого ПОЛ; предупреждало существенное падение изучаемых показателей 22

□ иктагтые

■ контрольные в фэсфоглив

□ эссенциале

Дглицирризиновая кислота

АОС и приводило к восстановлению значений такого интегрального показателя, как ОРЭ. Замыкала ряд глицирризиновая кислота. Ее влияние на параметры ПОЛ и АОС было минимально. На фоне введения данного препарата наблюдалось лишь тенденция к снижению активности асшрбат-зависимого ПОЛ в эритроцитах и в гепатоцитах. Необходимо также отмстить, что «Фосфогив» по своему положительному влиянию на системы ПОЛ и АОС достоверно превосходил глицирризиновую кислоту в отношении аскорбат-зависимого ПОЛ почти в 2 раза, а коэффициента АЗ/НЗ ПОЛ в 2, 6 раза в крови и в 1,8 раза в печени.

* - достоверная разница (р<0,05) с интактной группой ** - достоверная разница (р<0,05) с группой острого гепатита Рис. 11. Влияние исследуемых препаратов на ОРЭ (% гемолиза) при остром токсическом гепатите

Таким образом, гепатопротекторы значимо ограничивали активность цитолиза гепатоцитов в процессе формирования острого токсического гепатита. Судя по данным эксперимента, механизм их терапевтической активности двоякий и заключается, прежде всего, в предупреждении развития гормонально-медиаторного дисбаланса и ограничении свободно-радикальных процессов. Это способствует сохранению структурной и функциональной активности цитоплазматических мембран клетки и препятствует активации ферментов клеточного повреждения, локализованных в лизосомах.

выводы

1. Препараты солодки, содержащие сумму действующих начал (отвар) и тритерпеновую фракцию (глицирризиновая кислота) более эффективны, чем флавоноидсодержащий ликвиритон. Перечисленные препараты проявили умеренную гепагопротективную активность. Сироп солодки гепа-топротективной активностью практически не обладал.

2. Препараты, содержащие эссенциальные фосфолипиды обладали далеко не равнозначной эффективностью: наибольшую гепагопротективную активность проявил эссенциале, затем по нисходящей следуют эслидин и эссливер форте.

3. В развитии острого токсического гепатита можно выделить единое патогенетическое звено - гормонально-медиаторный дисбаланс и активацию свободно-радикального перекисного окисления лшшдов на фоне падения активности компонентов эндогенной антиокислительной системы. Это вызывает лабилизацию клеточных мембранных структур и цитолиз гепатоцитов. Вторичным по отношению к этому является падение активности синтетических процессов и, в частности, нарушение белкового, углеводного и липидного обменов.

4. Эссенциальные фосфолипиды и, в меньшей степени, глицирризиновая кислота препятствовали развитию гормоналыю-медиаторного дисбаланса (происходила нормализация содержания в организме животных катехоламинов, гистамина, серотонина, 11-оксикортикостероидов), нарастанию активности аскорбат-зависимого ПОЛ, предотвращали падение активности НАДФ-зависимопз ПОЛ и истощение компонентов эндогенной антиокислительной системы, препятствуя, таким образом, нарушению функций цитоплазматсгческих мембран, цитолизу и нарушению обменных процессов в печени.

5. Наибольшую эффективность в терапии экспериментального токсического гепатита показал комбинированный препарат фосфоглив, который по гепатопротективной активности почти в 1,5 раза превосходил эссенциале и в 2 раза глицирризиновую кислоту.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Тауки А.Н. Фармакотерапевтическая активность «Фосфогива» при экспериментальном токсическом гепатите / А.Н. Тауки // Сборник научных работ сотрудников ЯПМА, Ярославль 2009. - С. 273-274.

2. Таукн А.Н. Сравнительная эффективность лекарственных средств разных фармакотерапевгических групп при экспериментальном токсическом гепатите / А.Н. Тауки, В.Н. Федоров, З.А Куница, H.A. Смирнов, Н.В. Кочнева П Российский медико-биологический вестник им. академии И.П.Павлова. -2010. -№1. - С.66-73.

3. Тауки А.Н. Влияние «Фосфоглива» на уровень катехоламинов при экспериментальном токсическом гепатите / А.Н. Тауки // Сборник XI Международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке», Москва,2010. - С.419-420.

4. Таукн А.Н. Сравнительная гепатопротективная активность препаратов эссенциальных фосфолипидов на модели экспериментального гепатита / А.Н. Тауки // Сборник XI Международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке», Москва,2010. - С.420-421.

5. Тауки А.Н. Сравнительная аштюксидантная активность препаратов эссенциальных фосфолипидов и солодки при экспериментальном токсическом гепатите / А.Н. Таукн // Сборник 66-й региональной конференции по фармации и фармакологии, Пятигорск,2011. - С.602.

6. Тауки А.Н. Сравнительная гепатопротективная активность препаратов солодки, на модели экспериментального токсического гепатита / А.Н. Тауки // Сборник 66-й региональной конференции по фармации и фармакологии, Пятигорск,2011. - С.603.

7. Тауки А.Н. Влияние препаратов эссенциальных фосфолипидов и солодки на динамику показателей цитолиза гепатоцитов у крыс с экспериментальным острым тетрахлорметановым гепатитом / А.Н. Тауки // Сборник научных работ студентов и молодых учёных Всероссийской научно-практической конференции, Ярославль, 2011. - С. 286.

8. Тауки А.Н. Влияние препаратов эссенциальных фосфолипидов и солодки на лшшдный обмен у крыс с экспериментальным токсическим гепатитом / А.Н. Тауки // Сборник научных работ студентов и молодых учёных Всероссийской научно-практической конференции, Ярославль, 2011. - С. 287.

9. Боброва Т.И. Экспериментальная фармакотерапия острого токсического гепатита /Т.И. Боброва, А.Н. Тауки, H.A. Смирнов, A.B. Смирнов, С.В. Чупрунова, A.B. Саприцкий // Сборник материалов XVIII Российского национального конгресса «ЧЕЛОВЕК И ЛЕКАРСТВО», Москва,

2011,-С. 418-419.

10. Тауки Л.H. Сравнительная гепагопротекгивная активность препаратов, содержащих эссенциальные фосфолипиды / А.Н. Тауки, Т.И. Боброва, A.B. Смирнов, C.B. Чупрунова, А.О. Щербаков, A.B. Саприц-кий // Сборник материалов XVIII Российского национального конгресса «ЧЕЛОВЕК И ЛЕКАРСТВО», Москва, 2011, - С. 486.

11. Тауки А.Н. Влияние эссенциальных фосфолшщцов на течение острого экспериментального гепатита / А.Н. Тауки // Сборник материалов XIV Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина-человек и его здоровье» С.-Петербург, 2011, - С. 320.

12. Тауки А.Н. Сравнение гепатозащитных свойств фосфоглива и эссенциале на модели токсического гепатита/ А.Н. Тауки// Сборник материалов XIV Всероссийской медиюо-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина-человек и его здоровье» С.-Петербург, 2011, - С. 321.

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АД - адреналин

АК - аскорбиновая кислота

АЗ ПОЛ - аскорбатзависимый путь ПОЛ

АлАТ - аланиновая аминотрансфераза

АОС - антиоксидантная система

АФК - активные формы кислорода

ВНС - вегетативная нервная система

ГК - глюкокортиконды

ГТ - гистамин

ДА - дофамин

ДМТ - доза минимальной токсичности ЖКТ - желудочно-кишечный тракт КА - катехоламины

КГА - коэффициент гепатопротективной активности КФ - кислая фосфатаза ЛПВП- липопротеиды высокой плотности ЛПНП - липопротеиды низкой плотности ЛПОНП - липопротеиды очень низкой плотности МДА - малоновый диальдегид

НА - норадреналин ,

НАДФ - никотинашщ-динуклеотид-фосфат БЗ ПОЛ - НАДФ-зависимый ПОЛ ОГ - острый гепатит

ОРЭ - осмотическая резистентность эритроцитов

ОХ - общий холестерин

11-ОКС - 11-оксикортикостероиды

ПОЛ - перекисное окисление липидов

САС - симпатоадреналовая система

СДГ - сукцинагдегидрогеназа

СЖК - свободные жирные кислоты

СОД - супероксид-дисмутаза

СР - свободные радикалы

СРО - свободнорадикальное окисление

СТ - серотонин

ТГ - триглицериды

Фр-1,6-ДФА - фрукгозо-1,6-дифосфат-адьдолаза ХС - холестерин

ДНС - центральная нервная система ЩФ - щелочная фосфатаза ЭФЛ - эссенциальные фосфолипиды ЬБ - летальная доза вН -сульфгидрильные группы

Издательство «Ремдер» ЛР ИД № 06151 от 26.10.2001. г. Ярославль, ул. Полушкина роща, 1. Тел.: (4852) 58-80-28, факс 58-80-29. E-mail: remder@mail.ru

Сдано в набор 3.05.2011. Подписано в печать .2011. Формат 60x90/16. Объем 2,25 усл. печ. л. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме Нью Роман» Тираж 100. Заказ.

Отпечатано в типографии «Деловая полиграфия» г. Ярославль, ул. Полушкина роща, 1

Актуальность проблемы Согласно данным ВОЗ за последние 20 лет во всем мире наметилась отчетливая тенденция к росту числа заболеваний печени, обусловливающих высокую смертность населения. Сегодня в мире количество больных с различной гепатобилиарной патологией превышает 2 млрд человек. Только в странах СНГ ежегодно регистрируется от 500 тыс. до 1 млн человек, страдающих тем или иным заболеванием печени. Резкому увеличению числа больных с острыми и хроническими заболеваниями печени способствовали увеличение уровня заболеваемости вирусными и токсическими (алкогольными и медикаментозными) гепатитами, а также существенный рост числа больных с ожирением и сахарным диабетом, которые являются основной причиной развития сравнительно новой нозологической формы — неалкогольной жировой болезни печени [27].

Широкая распространенность токсических гепатитов и неалкогольного стеатогепатита, значительное омоложение основных групп больных, рост хронических форм болезни, приводящих к снижению трудоспособности, определяют многогранность проблемы и актуальность ее исследования специалистами разных областей [57,90, 147,151,281].

Известно, что эти медленно прогрессирующие заболевания (особенно алкогольное поражение печени) протекают с неуклонным фиброзиро-ванием ткани печени, степень и темпы которого определяются'патобиохи-мическими изменениями: избыточной активацией перекисного окисления липидов на фоне истощения системы антиоксидантной защиты, нарушением липидного, углеводного, белкового и энергетического обменов [31, 32, 44, 75, 127, 133,212].

Морфологические и клинические проявления патологических изменений в печени под действием повреждающих факторов подробно изучены и описаны [283], но биохимические механизмы реализации этих процессов в клетках печени, выяснены еще не до конца [161]. Важность изучения этих механизмов не вызывает сомнений и в связи с возрастающим уровнем заболеваемости вирусными гепатитами в мире, и с гепатотоксичностью лекарственных средств и связанной с ней возрастающей смертностью [10, 17, 48,81, 168, 198, 246, 288].

О повреждении гормональных и медиаторных механизмов регулирования гомеостаза при гепатитах известно немного, данные о роли катехо-ламинов и биогенных аминов в патогенезе и формировании осложнений, возникающих на фоне вирусных и токсических гепатитов, являются противоречивыми [94, 110, 151, 166]. Между тем, эти вещества оказывают как общее влияние, регулируя тонус сосудов, в том числе и печени [75, 255, 292], так и локальное, взаимодействуя с открытыми в последние годы специфическими рецепторами мембран гепатоцитов и участвуя в биохимических клеточных реакциях [134, 232]. Поэтому детальное исследование состояния симпатоадреналовой системы, систем гистамина и серотонина и их связь с биохимическими звеньями функционирования гепатоцитов при острых гепатитах позволит дополнить имеющиеся сведения о патогенезе заболевания и выявить значение этих систем в защитно-адаптационных механизмах гомеостаза при поражении печени [193, 194].

Следует заметить, что на современном этапе терапия острых гепатитов является, в основном, симптоматической, а лечение такого заболевания, как вирусный гепатит С, в соответствии со стандартами «Европейской ассоциации по изучению болезней печени», - выжидательным и пассивным, при котором спонтанное выздоровление прогнозируется через 3 месяца и происходит лишь у 20% больных [120, 145, 202]. С другой стороны, даже избавив больного от присутствия вируса или токсина в организме, нельзя гарантировать полного излечения - остаются дистрофия клеток и фиброз [56, 131, 199, 235]. Это свидетельствует о необходимости проведения уже в остром периоде заболевания терапии, направленной на восстановление функционального состояния печени и предотвращение ее структурных изменений, в частности формирования и прогрессирования фиброза [129].

Одним из наиболее перспективных путей решения данной проблемы, является рациональное использование наиболее эффективных гепатопро-тективных средств и их комбинаций. Несмотря на большой клинический опыт, границы применения гепатопротекторов до сих пор не очерчены. Отношение к ним в медицинской среде варьирует от полного неприятия до I использования в качестве базисных препаратов [46, 59, 70, 96, 104, 106, 139]. Кроме того, вклад в терапию отдельных средств выяснить, как правило, невозможно, поскольку лечение в клинике осуществляется комплексно. Индивидуальную активность препаратов можно проверить только в эксперименте. Это в полной мере относится и к такой относительно «молодой» группе гепатопротекторов, как препараты солодки [144, 149, 150, 239, 286, 296]. До сих пор остается неясным вклад в «защиту» печени .от патологического воздействия разных действующих начал корня солодки: терпенов, флавоноидов и полисахаридов.

Одними из наиболее эффективных гепатопротекторов являются препараты эссенциальных фосфолипидов [129, 118]. На российском фармацевтическом рынке представлены препараты эссенциальных фосфолипидов различных производителей, отличающихся друг от друга по составу фосфолипидов и/или по источнику их получения [118]. Это может обусловить неодинаковую фармакотерапевтическую эффективность. Поэтому для повышения качества фармакотерапии гепатитов, целесообразно проведение исследования сравнительной активности препаратов эссенциальных фосфолипидов различных производителей на модели экспериментального токсического гепатита.

Цель исследования: сравнить гепатопротективную активность и особенности механизма действия препаратов эссенциальных фосфолипидов, солодки и комбинированного средства «Фосфоглив» на модели токсического гепатита у белых крыс.

Задачи исследования:

Изучить гепатопротективную активность у различных препаратов солодки, используя методику двухэтапного скрининга.

2.Сравнить гепатопротективную активность различных препаратов эссенциальных фосфолипидов, используя методику двухэтапного скрининга.

3.Исследовать патохимические закономерности развития патологического процесса в печени: динамику изменения содержания в крови и печени катехол аминов (адреналин, норадреналин и дофамин), 11-оксикортикостероидов, серотонина, гистамина, аскорбиновой кислоты, токоферола, триглицеридов, общего холестерина и холестерина липопротеи-дов низкой, очень низкой и высокой плотности, а также скорости аскорбат-и НАДФ-зависимого ПОЛ, активности фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы и кислой фосфатазы на модели несмертельного тетрахлорметанового гепатита у белых крыс.

4.Изучить влияние препаратов эссенциальных фосфолипидов, солодки и комбинированного средства «Фосфоглив» на динамику изменения содержания в крови и печени катехоламинов (адреналин, норадреналин и дофамин), 11-оксикортикостероидов, серотонина, гистамина, аскорбиновой кислоты, токоферола, триглицеридов, общего холестерина и холестерина липопротеидов низкой, очень низкой и высокой плотности, а также скорости аскорбат- и НАДФ-зависимого ПОЛ, активности фруктозо-1,6дифосфатальдолазы и кислой фосфатазы на модели несмертельного тетра-хлорметанового гепатита у белых крыс.

5.Определить наиболее эффективный гепатопротектор из изученных препаратов солодки, эссенциальных фосфолипидов и комбинированного средства «Фосфоглив» при тетрахлорметановом гепатите у белых крыс.

Научная новизна исследования

В эксперименте по методике двухэтапного фармакологического скрининга с учетом коэффициента гепатопротективной активности и суммарной гепатопротективной активности были установлены наиболее эффективные лекарственные средства из групп препаратов солодки и эссенциальных фосфолипидов и их комбинации и определен их спектр защитного действия. При сравнительном исследовании терпеновых и биофлаво-ноидных препаратов из корня солодки был определен практически равный коэффициент их гепатопротективной активности. Из трех исследуемых препаратов эссенциальных фосфолипидов (эссенциале, эссливер форте и эслидин) наибольшей гепатопротективной активностью обладал эссенциале.

В работе определены закономерности механизма действия гепато-протекторов различной химической природы; найдено сходство и различие в развитии их гепатопротективного эффекта. Показано, что единым звеном в механизме действия гепатопротекторов является предупреждение медиа-торно-гормонального дисбаланса в центральных и периферических структурах, а также прямая (более характерна для эссенциальных фосфолипидов) и/или косвенная (более характерна для препаратов солодки) регуляция активности ПОЛ, мембранотропная активность. Различия в регулирующем влиянии препаратов на обмен медиаторов и функции мембран определяют специфику их метаболических эффектов.

Практическая значимость

Предложена и экспериментально обоснована модифицированная методика скрининга для поиска соединений с гепатопротективной активностью.

На модели экспериментального гепатита у крыс ранжирована гепа-топротективная эффективность трех препаратов эссенциальных фосфоли-пидов, использующихся в клинике; выявлена и ранжирована гепатопро-тективная эффективность различных препаратов солодки. Было показано, что наиболее полным спектром гепатопротективного действия обладает комбинированный препарат «Фосфоглив», чем отдельные препараты эссенциальных фосфолипидов или солодки.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При помощи модифицированного двухэтапного фармакологического скрининга был проведен анализ гепатопротективной активности 8 препаратов эссенциальных фосфолипидов и солодки; наибольшую эффективность показал комбинированный препарат «Фосфоглив».

2. Из препаратов солодки наибольшую активность проявили отвар (содержащий сумму действующих начал) и глицирризиновая кислота (тритерпеновая фракция), менее активен был ликвиритон (флавоно-идную фракция). Препараты эссенциальных фосфолипидов (производящиеся на разных предприятиях и имеющие различные торговые названия) обладают далеко не равнозначной эффективностью: наибольшей гепатопротективной активностью обладал эссенциале, затем по нисходящей следовали эслидин и эссливер форте.

3. В развитии острого токсического гепатита можно выделить единое патогенетическое звено - гормонально-медиаторный дисбаланс и активацию свободно-радикального перекисного окисления липидов на фоне падения активности компонентов эндогенной антиокислительной системы. Это вызывает лабилизацию клеточных мембранных структур (повышение в печени активности кислой фосфатазы) и цитолиз гепатоцитов (повышение в крови активности АЛТ и альдолазы). Вторичным по отношению к этому является падение активности синтетических процессов и, в частности, нарушение белкового, углеводного и липидного обменов.

4. Эссенциальные фосфолипиды (эссенциале) и препараты солодки (глицирризиновая кислота), применяемые для терапии токсического гепатита по отдельности, не способны полностью восстановить нарушенный биохимический баланс организма животных, в то же время комбинированный препарат «Фосфоглив» (содержит эссенциальные фосфолипиды и глицирициновую кислоту) препятствует развитию гормонально-медиаторного дисбаланса (происходит нормализация содержания в организме животных катехоламинов, гистамина, серо-тонина, 11-оксикортикостероидов), нарастанию активности аскорбат-зависимого ПОЛ и предотвращает падение активности НАДФ-зависимого ПОЛ и истощение компонентов эндогенной антиокислительной системы, препятствуя, таким образом, нарушению функций цитоплазматических мембран, цитолизу и нарушению обменных процессов в печени.

Внедрение результатов исследования в практику

Основные научные положения и выводы работы применены в научной, педагогической и практической работе кафедры фармакологии и кафедры клинической фармакологии Ярославской государственной медицинской академии.

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 65-летию Ярославской государственной медицинской академии (Ярославль, 2009), 66- летию Ярославской государственной медицинской академии (Ярославль, 2010), Х1-й Международный конгрессе, «ЗДОРОВЬЕ И ОБРАЗОВАНИЕ В XXI ВЕКЕ» (МОСКВА 2010), 66-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объема и методов исследования, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 15 таблицами, 11 рисунками. Библиография содержит 300 литературных источников: 175 российских и 125 зарубежных.

ВЫВОДЫ

1. Препараты солодки, содержащие сумму действующих начал (отвар) и тритерпеновую фракцию (глицирризиновая кислота) более эффективны, чем флавоноидсодержащий ликвиритон. Перечисленные препараты проявили умеренную гепатопротективную активность. Сироп солодки гепато-протективной активностью практически не обладал.

2. Препараты, содержащие эссенциальные фосфолипиды обладали далеко не равнозначной эффективностью: наибольшую гепатопротективную активность проявил эссенциале, затем по нисходящей следуют эслидин и эсс-ливер форте.

3. В развитии острого токсического гепатита можно выделить единое патогенетическое звено - гормонально-медиаторный дисбаланс и активацию свободно-радикального перекисного окисления липидов на фоне падёния активности компонентов эндогенной антиокислительной системы. Это вызывает лабилизацию клеточных мембранных структур и цитолиз гепатоци-тов. Вторичным по отношению к этому является падение активности синтетических процессов и, в частности, нарушение белкового, углеводного и липидного обменов.

4. Эссенциальные фосфолипиды и, в меньшей степени, глицирризиновая кислота препятствовали развитию гормонально-медиаторного дисбаланса (происходила нормализация содержания в организме животных катехола-минов, гистамина, серотонина, 11-оксикортикостероидов), нарастанию активности аскорбат-зависимого ПОЛ, предотвращали падение активности НАДФ-зависимого ПОЛ и истощение компонентов эндогенной антиокислительной системы, препятствуя, таким образом, нарушению функций ци-топлазматических мембран, цитолизу и нарушению обменных процессов в печени.

5. Наибольшую эффективность в терапии экспериментального токсического гепатита показал комбинированный препарат фосфоглив, который по гепатопротективной активности почти в 1,5 раза превосходил эссенциале и в 2 раза глицирризиновую кислоту.

ГЛАВА V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Широкая распространенность токсических гепатитов и неалкогольного стеатогепатита, значительное омоложение основных групп больных, рост хронических форм болезни, приводящих к снижению трудоспособности и дальнейшему распространению инфекции среди населения, определяют многогранность проблемы терапии поражений печени и актуальность ее исследования специалистами разных областей [10, 17, 19, 39, 48, 57, '81, 90, 168, 198, 203].

К факторам, повреждающими печеночную ткань, относят вирусные, токсикологические (в том числе и лекарственные) и иммунологические [96, 151]. Основными же причинами разрушения печеночной клетки называются избыточная активация перекисного окисления липидов, истощение системы антиоксидантной защиты, нарушение липидного, углеводного и энергетического обменов. Значимую роль в патогенезе гепатитов играет нарушение гормонально-медиаторного баланса. Нейромедиаторы участвуют во всех патофизиологических процессах в организме, оказывая как общее, так и местное действие. Первое обусловлено влиянием медиаторов на тонус сосудов и кровоснабжение органа. Второе связано с взаимодействием со специфическими рецепторами мембран гепатоцитов.

Современная программа комплексного лечения патологии печени включает два основных направления: этиотропную и патогенетическую терапию. Этиотропная терапия, как правило, применяется при вирусных гепатитах с парентеральным механизмом заражения и направлена на подавление репликации возбудителя заболевания и его элиминацию. Для усиления этиотропной терапии используют иммуномодулирующие средства с различным механизмом действия (чаще всего интерфероногены).

Основу патогенетической терапии составляют препараты, влияющие на структуру и функцию гепатоцитов. Именно средства патогенетической терапии принято обозначать термином «гепатопротекторы» [52, 82, 106, 140, 163, 201, 219]. К ним относятся представители различных групп лекарственных средств, повышающие устойчивость гепатоцитов к патологическим воздействиям; усиливающие их обезвреживающую функцию и способствующие восстановлению нарушенных функций печеночных клеток. Действие гепатопротекторов направлено на восстановление гомеоста-за в печени, повышению ее устойчивости к действию патогенных факторов, нормализацию функциональной активности и стимуляцию в печени процессов регенерации.

На первом этапе настоящей работы проводилось сравнительное исследование гепатопротективной активности лекарственных препаратов солодки и эссенциальных фосфолипидов и препарата фосфоглив. Анализ гепатопротективных свойств исследуемых соединений проводился с использованием методики двухэтапного фармакологического скрининга. Всего было изучено 8 препаратов.

Основной задачей первого этапа моделирования было быстрое, объективное и относительно нетрудоемкое выявление гепатопротективной активности препаратов с возможностью ее количественного расчета. Для этого воспроизводилась жесткая модель токсического гепатита, сопровождающаяся выраженным некрозом печеночных клеток и массовой гибелью лабораторных животных.

В начале исследования у белых крыс была определена токсичность четыреххлористого углерода при внутрижелудочном введении: установлены дозы минимальной токсичности (ДМТ), 16%, 50%, 84% и 100% летальности (ОЬ16, ВЬ50, ОЬ84, и ОЬ10о), которые оказались равны 6,2; 7,5; 10,1; 12,6 и 15,8 мл/кг. Для проведения I этапа скрининга была выбрана доза ОЬ50 — 10,1 мл/кг. Анализируемыми критериями являлись процент выживаемости, продолжительность жизни погибших животных, весовой коэффициент печени у выживших крыс.

На II этапе моделирования экспериментального острого гепатита проводилось уточнение характера гепатопротективной активности отобранных на I этапе средств и выявление препаратов, обладающих наиболее стабильным и универсальным действием. Для этого у лабораторных животных создавали классическую модель несмертельного токсического гепатита путем однократного внутрижелудочного введения 5 мл/кг 50% раствора СО4 на подсолнечном масле. На 7-е сутки эксперимента выполняли биохимические (активность АлТ и щелочной фосфатазы крови, содержание в крови альбуминов, а в печени - гликогена) исследования, на основании которых можно было сделать вывод о характере влияния гепатопротекторов на различные стороны функциональной активности.

Для оценки фармакологической эффективности изучаемых лекарственных средств нами введен коэффициент гепатопротективной активности - КГ А [138, 170]. 1

0,5 0

Рис.5.1 . Гепатопротекторная активность препаратов по КГА (1-й зтап скрининга)

Как показали результаты I этапа скрининга (суммация данных по всем трём показателям изучаемым показателям: выживаемость, продолжительность жизни и весовой коэффициент печени), исследуемые препараты можно подразделить на 3 группы: 1 - лекарственные средства, показавшие высокую степень гепатопротективной активности ( КГА не менее 0,70): I фосфоглив (0,99) и эссенциале (0,70); 2 группа — лекарственные вещества со средней степенью активности (КГА 0,40 — 0,69): глицирризиновая кислота (0,55), отвар корня солодки (0,47), эслидин (0,42), ликвиритон (0,41); к препаратам 3 группы относятся лекарственные средства с низкой степенью активности (КГА менее 0,40): эссливер (0,22) и сироп солодки (0,15) (рис.5.1).

Данное исследование показало также и то, что так называемые «препараты-аналоги» эссенциальных фосфолипидов (производящиеся на разных предприятиях и имеющие различные торговые названия) обладают далеко не равнозначной активностью. Так, наибольшей гепатопротективной активностью обладал эссенциале (0,70), затем по нисходящей следовали эслидин (0,42) и эссливер (0,22).

Из четырех препаратов солодки три (глицирризиновая кислота, отвар корня солодки и ликвиритон) показали сходную эффективность (КГА 0,420,55), а сироп солодки гепатопротективной активностью не обладал. Это показывает, что вклад тритерпеновых и флавоноидных гликозидов в гепа-топротективную активность корня солодки был примерно равным.

Следует также отметить, что наибольшую эффективность показал комбинированный препарат фосфоглив. По гепатопротективной активности он почти в 1,5 раза превосходил эссенциале и в 2 раза глицирризино-вую кислоту. По результатам I этапа скрининга для дальнейших исследований были отобраны 5 препаратов из 8: из препаратов эссенциальных фосфолипидов - эссенциале; из препаратов солодки - лекарственные средства, содержащие комплекс действующих начал (отвар корня) или отдельные их компоненты (ликвиритон и глицирризиновая кислота), также комбинированное лекарственное средство - фосфоглив.

II этап скрининга позволил выяснить, что исследуемые препараты существенно различаются по влиянию на динамику изменения значений маркеров патологического процесса. Так, цитолиз гепатоцитов предупреждает фосфоглив, а эссенциале достоверно ограничивал активность этого процесса. Холестазу препятствуют фосфоглив и отвар корня солодки. Значимое нарушение белковосинтетической функции печени предупреждали эссенциале и отвар корня солодки, но максимально активным был фосфоглив. Гликогенсинтезирующую функцию наиболее полно восстанавливали фосфоглив и далее по мере убывания эффективности следовали глицирризиновая кислота, отвар корня солодки, ликвиритон и эссенциале (рис.5.2).

3000

2000

1000

Интактные

Контрольные

Фосфоглив

Эссенциале В Глицирризиновая кислота 0 Отвар корня солодки ¡^ Ликвиритон

- достоверная разница (р<0,05) при сравнении с группой интактных животных **)- достоверная разница (р<0,05) при сравнении с контрольной группой

Рис.5.2 Влияние исследуемых препаратов на концентрацию гликогена в печени крыс с экспериментальным токсическим гепатитом (мг%).

Подводя итог II этапа скрининга, можно отметить, что наиболее активным, стабильным, разноплановым и универсальным гепатопротективным действием обладал фосфоглив, далее следовали эссенциале, отвар корня солодки, глизирризиновая кислота и ликвиритон.

Проведенное исследование также показало, что использование комбинированных препаратов более эффективно, чем монотерапия. Фосфоглив был более активен, чем взятые по отдельности эссенциале и глицирри-зиновая кислота.

Анализируя данные, полученные в ходе двухэтапного скрининга на белых крысах по поводу гепатопротективной активности, следует отметить, что в результате нетрудоемких исследований можно получить объективную оценку терапевтической эффективности гепатопротективных средств.

По результатам скрининга для дальнейшего исследования были выбраны комбинированный препарат фосфоглив и его компоненты - эссенциале и глизирризиновая кислота.

На следующем этапе работы на модели несмертельного тетрахлор-метанового гепатита у белых крыс исследовались патохимические закономерности развития патологического процесса в печени: динамика изменения содержания в крови и печени катехоламинов (адреналин, норадрена-лин и дофамин), 11-оксикортикостероидов, серотонина, гистамина, аскорбиновой кислоты, токоферола, триглицеридов, общего холестерина и холестерина липопротеидов низкой, очень низкой и высокой плотности, а также скорости аскорбат- и НАДФ-зависимого ПОЛ, активности фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы и кислой фосфатазы, а также влияние на них препаратов эссенциальных фосфолипидов (эссенциале), солодки (глицирризи-новнй кислоты) и комбинированного средства фосфоглив.

На фоне острого экспериментального гепатита у животных наблюдалась выраженная дисфункция симпатоадреналовой системы, которая характеризовалась повышением в крови и печени концентрации АД и НА (на 82% и 31%, 21% и 19% соответственно; р<0,05) и падением содержания дофамина на 38% и 34% (р<0,05) (рис.5.3 и 5.4). По-видимому, при развитии острого токсического гепатита повышение уровня АД и НА в плазме связано не только (или не столько) с увеличением их синтеза, сколько с угнетением ферментов, ответственных за оксиметилирование, окислительное дезаминирование, "хиноидное" окисление катехоламинов. Уменьшение количества ДА можно связать с угнетением синтеза ДОФА из тирозина вследствие нарастания ацидоза и угнетения активности тирозингидрок-силазы [91, 92]. - достоверная разница (р<0,05) с интактной группой - достоверная разница (р<0,05) с группой острого гепатита

Рис.5.3 содержание АД в крови крыс с экспериментальным токсическим гепатитом (мкг/мл).

Повышение значений коэффициента АД/НА в крови на 56% свидетельствует о том, что несмотря на одновременность повышения концентрации АД и НА в крови и печени, этот процесс шел неравномерно: уровень АД повысился в более значительной степени, чем НА. Таким образом, у животных с экспериментальным острым гепатитом в периферической крови и печени наблюдалось превышение активности гуморального адреналового) звена САС над медиаторным и снижалась роль дофаминер-гических влияний.

Концентрация адреналина на периферии полностью зависит от его синтеза в мозговом слое надпочечников, а в основе увеличения концентрации норадреналина лежит его повышенная продукция окончаниями адре-нергических нервов. По данным литературы при острых и хронических гепатитах также имеет место снижение клиренса НА из крови [43].

- достоверная разница (р<0,05) с интактной группой ** - достоверная разница (р<0,05) с группой острого гепатита

- достоверная разница (р<0,05) групп эссенциаде и глицирризиновой кислоты с группой фосфоглива

Рис.5.4 Влияние исследуемых препаратов на содержание ДА в крови крыс с экспериментальным токсическим гепатитом(мкг/мл).

Падение значений «дофаминового» коэффициента в исследуемых тканях (в 2,1 раза в крови и в 1,8 раза в печени) свидетельствует о превалировании здесь активности вазоконстрикторных катехоламинов над вазо-дилятирующими и, в итоге, о снижении периферического кровотока. Это касается, прежде всего, паренхиматозных органов и указывает на выраженное нарушение в них периферической гемодинамики (повышение периферического сопротивления сосудистой стенки и объема циркулирующей крови), микроциркуляции и трофики тканей [11, 12, 43, 107]. Рецеп глицирризиновая кислота фосфоглив ез эссенциале интактные ■ контрольные торное поле сосудов печени представлено в основном сосудосуживающими ар и а2-адренорецепторами при минимальном представительстве вазо-дилятирующих (32-адренорецепторов. В этом случае значительная роль в регуляции периферического кровотока принадлежит дофамину, который через постсинаптические Д]-дофаминовые рецепторы способствует прямому расслаблению сосудистой стенки артерий, а посредством возбуждения пресинаптических Д2- дофаминовых рецепторов препятствует выбросу НА в синаптическую щель.

Кровь Печень - достоверная разница (р<0,05) с интактной группой ** - достоверная разница (р<0,05) с группой острого гепатита # - достоверная разница (р<0,05) групп эссенциаде и глицирризиновой кислоты с группой фосфоглива

Рис.5.5 Влияние исследуемых препаратов на значение коэффициента ДА/(АД+НА) в крови и печени крыс с экспериментальным токсическим гепатитом

Введение исследуемых препаратов препятствовало грубым изменениям показателей САС на фоне токсического гепатита. Так, использование фосфоглива и эссенциале полностью предупреждало нарастание уровня АД, как в крови, так и в печени. При введении глицирризиновой кислоты, хотя и имело место достоверное возрастание концентрации данного кате-холамина в крови и печени, но в меньшей степени (на 16 и 9% соответственно), чем в контроле. Однако необходимо отметить, что при использовании глицирризиновой кислоты концентрация АД в исследуемых тканях была достоверно выше, чем при введении фосфоглива (на 36% для крови и 23% для печени).

Введение исследуемых препаратов животным с моделируемым острым токсическим гепатитом препятствовало падению у них уровня ДА, как в крови, так и в печени. Наиболее эффективным препаратом был фос-фоглив: его применение приводило к полной нормализации исследуемого показателя. Также, следует отметить, что при введении глицирризиновой кислоты уровень ДА крови и печени оставался достоверно ниже на 24% и 26% соответственно, чем при использовании фосфоглива.

Все исследуемые препараты степени препятствовали изменению значений «адреналинового» и «дофаминового» коэффициентов в крови и печени (рис.5.5). Наиболее эффективными препаратами были фосфоглив и эссенциале. Их применение приводило к полной нормализации исследуемых показателей. Следует отметить, что при введении глицирризиновой кислоты значения коэффициента ДА/(АД+НА) крови и печени было достоверно ниже на 36% и 38%, чем при использовании фосфоглива.

На фоне развития острого токсического гепатита у белых крыс имело место выраженное повышение глюкокортикоидной активности крови: концентрации 11-ОКС здесь возросла в 2,1 раза, значение же коэффициента 11-ОКС/АД практически не изменилось (рис.5.6). Последнее указывает на то, что изменение функциональной активности коркового и мозгового слоя надпочечников происходило практически параллельно.

Применение фосфоглива и эссенциале, но не глицирризиновой кислоты, способствовало нормализации содержания глюкокортикоидов в крови. «Надпочечииковый» коэффициент под воздействием препаратов изменений не претерпевал.

- достоверная разница (р<0,05) с интактной группой - достоверная разница (р<0,05) с группой острого гепатита

- достоверная разница (р<0,05) групп эссенциаде и глицирризиновой кислоты с группой фосфоглива

Рис. 5.6 Влияние исследуемых препаратов на содержание 11-ОКС в крови крыс с экспериментальным токсическим гепатитом (мкг/мл).

На фоне острого гепатита у экспериментальных животных наблюдался параллельный рост концентрации ГТ в крови и печени в 2,7 и 2,3 раза (рис.5.7). Основной причиной этого является, прежде всего, снижение активности диаминооксидазы - фермента, метаболизирующего ГТ. Повышение активности гистаминергической системы в печени, по-видимому, является положительным фактором, так как гистамин считается функциональным антагонистом серотонина и норадреналина в отношении органного кровотока [23] и обладает антиоксидантной активностью [197].

Все исследуемые препараты приводили к снижению уровня ГТ в крови и печени. Наиболее эффективным препаратом был фосфоглив: его применение способствовало полной нормализации исследуемого показателя. Эссенциале также нормализовал содержание ГТ в печени, а в крови препятствовал его повышению на 40% (р<0,05). Глицирризиновая кислота достоверно препятствовала повышению уровня ГТ только в крови на 28%. - достоверная разница (р<0,05) с интактной группой ** - достоверная разница (р<0,05) с группой острого гепатита # - достоверная разница (р<0,05) групп эссенциаде и глицирризиновой кислоты с группой фосфоглива

Рис. 5.7 Влияние исследуемых препаратов на содержание гистамина в крови крыс с экспериментальным токсическим гепатитом (мкг/мл)

Уровень СТ при введении тетрахлорметана в крови и печени экспериментальных животных возрастал в 2 и 1,5 раза соответственно (рис.5.8). Сдвиги в обмене СТ, происходящие в печени при формировании гепатита, характеризовались нарастанием уровня биогенного амина, связанным, прежде всего, с угнетением его ферментативного дезаминирования (падение активности моноаминооксидазы класса А) и, в меньшей степени, с увеличением синтеза СТ клетками хроматофинной ткани кишечника [289].

Введение фосфоглива приводило к нормализации показателей СТ как в крови, так и в печени. Эссенциале нормализовал уровень СТ в крови и способствовал значимому (на 25%) его снижению в печени. Глицирризиновая кислота у больных животных достоверно препятствовала повышению уровня СТ на 34% только в крови. о интактные контрольные ■ фосфоглив эссенциале

Я глицирризиновая кислота

Следует также отметить, что при введении глицирризиновой кислоты содержание ГТ в крови и печени, а СТ в печени, было достоверно выше, чем при использовании фосфоглива. - достоверная разница (р<0,05) с интактной группой - достоверная разница (р<0,05) с группой острого гепатита

Рис. 5.8 Влияние исследуемых препаратов на содержание серотонина в крови крыс с экспериментальным токсическим гепатитом (мкг/мл) (

При развитии токсического гепатита имеет место поражение печеночной паренхимы, некроз ряда клеток и их цитолиз. В качестве маркеров некротических процессов, происходящих в печени при ведении четырех-хлористого углерода, были выбраны два фермента — цитоплазматический гликолитический фермент Фр-1,6-ДФА и лизосомальный фермент - КФ. По данным литературы повышение активности Фр-1,6-ДФА в крови и КФ в печени коррелирует с тяжестью поражения печеночной ткани патологическими агентами [46, 68, 277].

При развитии острого токсического гепатита уровень плазменной активности одного из ведущих ферментов гликолиза Фр-1,6-ДФА, локализованного в цитоплазме гепатоцитов и диффундирующего в кровь после гибели клетки, повышался в 1,8 раза (р<0,05). Полученные данные сопоставимы с результатами по исследованию плазменной активности другого ци

СП и нта ктн ые контрольные фосфогл и в m эссенциале гл i/i цирризиновая кислота топлазматических фермента АлАТ. Активность лизосомального фермента кислой фосфатазы, являющегося маркером клеточной деструкции, при экспериментальном остром токсическом гепатите повысилась на 41%. Таким образом, развитие острого экспериментального гепатита характеризовалось усилением процессов распада внутриклеточных структур и окисления образовавшихся субстратов на фоне падения возможностей выработки энергии и снижения, вследствие этого, возможностей клеточного транспорта.

Введение фосфоглива и эссенциале оказывало значимое влияние на процессы цитолиза гепатоцитов: активность Фр-1,6-ДФА в крови нормализовалась, а активность КФ в печени перестала достоверно отличаться от таковой группы интактного контроля и снизилась по отношению к больным животным на 19 и 20%. Нормализация активности лизосомального фермента КФ на фоне применения гепатопротекторов прежде всего связана с ограничением ими повреждающего действия свободных радикалов на мембранные образования клеток (в частности лизосом), что и снижает уровень их лабилизации.

Печень является основным органом, осуществляющим обмен и синтез липидов в организме, поэтому гепатит, ведущий к нарушению функции печени, сказывается на обмене липидов [117, 214]. В условиях экспериментального острого токсического гепатита в крови крыс происходило нарушение липидного обмена: возрастание концентрации триглицеридов (ТГ) на 81% (р<0,05), изменение липопротеидного спектра (достоверно снижался в уровень ЛПВП, что закономерно увеличивало степень атеро-генности плазмы крови). Так, коэффициент ЛПНП/ЛПВП достоверно повышался в 1,8 раза. Уровень ЛПОНП снижался на 17% (р>0,05), но это явление носило характер тенденции (рис.5.9).

В целом, действие исследуемых гепатопротекторов на липидный обмен можно охарактеризовать следующим образом: они способствовали снижению в крови содержания ТГ, не влияли на уровень ЛПНП и повышали синтез холестерина и его включение в антиатерогенные ЛПВП. Все это способствовало снижению атерогенности плазмы. Наиболее активным в этом отношении был фосфоглив, затем - эссенциале, а минимальной эффективностью обладала глицирризиновая кислота. - достоверная разница (р<0,05) с интактной группой - достоверная разница (р<0,05) с группой острого гепати та

Рис. 5.9 Влияние исследуемых препаратов на обмен липидов крыс с экспериментальным токсическим гепатитом (мкг/мл)

Для обеспечения жизнедеятельности клетки требуется постоянное обновление липидного слоя клеточных мембран, что осуществляется при помощи перекисного окисления липидов [87, 98], который, при резкой активации является универсальным механизмом повреждения клеток [132].

Перекисное окисление липидов мембран может осуществляться по ферментативному и неферментативному механизму. Ферментативный ПОЛ способствует модификации мембранных фосфолипидов, выполняет функции синтеза биологически активных веществ, детоксикации, метаболизма ксенобиотиков и эндогенных субстратов [18, 28, 29, 58, 181, 214]. Он локализован на ограниченных участках мембран и осуществляется НАДФ-зависимыми оксигеназами эндоплазматического ретикулума со смешанной функцией [80, 141]. Неферментативный (аскорбат-зависимый) ПОЛ обладает выраженным разрушительным характером, что приводит к структурным нарушениям клеточных элементов и гибели самих клеток. Он не имеет специфической организации и развивается в любых структурах клеток [74, 103, 159].

Повышение содержания продуктов пероксидации липидов в печени и эритроцитах пораженных животных происходило только за счёт свободно-радикального (аскорбат-зависимого) пути ПОЛ, активность которого при развитии острого токсического гепатита достоверно возрастала в 2,5 и 3 раза соответственно (рис.5.10). Активность ферментативного (НАДФ-зависимого) ПОЛ, наоборот, снижалась на 24 и 38% (соответственно) по отношению к контролю. Происходило нарушение соотношения активности ферментативного и неферментативного ПОЛ в гепатоцитах: коэффициент АЗ/НЗ ПОЛ увеличивался при остром гепатите в 3,6 раза в печени и в 5 раз в эритроцитах.

Чрезмерная активация ПОЛ в тканях ведет к затруднению связывания нейрорецепторов с медиаторами и нарушает их метаболизм [139]. Малоновый диальдегид оказывает центральное сосудосуживающее действие [127]. Снижение активности НАДФ-зависимого пути ПОЛ подтверждает мембранотоксичность стресс-индуцированного ПОЛ.

Ограничение реакций ПОЛ в клетках до физиологического уровня достигается за счет согласованного функционирования специфических защитных антиокислительных ферментативных систем и биоантиокислителей, компартментализацией субстратов и катализаторов ПОЛ [191, 224]. К основным параметрам АОС относятся токоферол, БН-группы, аскорбиновая кислота [31,115, 136, 139, 183, 234]. интак контр фосф эссенц ГК - достоверная разница (р<0,05) с интактной группой - достоверная разница (р<0,05) с группой острого гепатита

Рис. 5.10 Влияние исследуемых препаратов на отношение АЗ ПОЛ/НЗ ПОЛ в печени крыс с экспериментальным токсическим гепатитом

При моделировании токсического гепатита повышение активности пероксидации липидов происходило на фоне истощения возможностей антиокислительной системы организма: так концентрация аскорбиновой кислоты в печени снижалась на 30%. Процессы, происходящие в печени, находили зеркальное отражение в показателях крови. Дополнительно к выше перечисленным параметрам АОС в крови исследовали также концентрацию токоферола, которая падала на 28%.

Нарастание свободно-радикальных процессов приводит к снижению резистентности клеточных мембран, показателем чего является падение осмотической резистентности эритроцитов. Поскольку имеет место тесная связь между изменением проницаемости эритроцитарных мембран и мембран клеток, пораженных патологическим процессом органов [29], исследовалась осмотическая резистентность эритроцитов. При моделировании токсического гепатита процент гемолиза эритроцитов достоверно нарастал в 1,4 раза, что свидетельствует о снижении осмотической резистентности эритроцитов при формировании патологического процесса (рис.5.11). - достоверная разница (р<0,05) с интактной группой - достоверная разница (р<0,05) с группой острого гепатита

Рис. 5.11 Влияние исследуемых препаратов на ОРЭ при остром токсическом гепатите (% гемолиза)

Таким образом, при развитии токсического гепатита в организме пораженных животных происходили существенные изменения в системе ПОЛ: на фоне истощения запасов эндогенных антиоксидантов имело место резкое повышение скорости пероксидации мембранных липидов, происходившее только за счет неферментативного аскорбат-зависимого пути. Именно, активация неферментативного ПОЛ, приводящая к патологической модификации мембранных фосфолипидов, и лежит в основе патогенеза разрушения печеночной клетки при гепатитах любой этиологии.

Процессы, протекающие в печени, определяли изменения ПОЛ и АОС, наблюдаемые в крови. интаюные ■ контрольные фосфоглив о эссенциале глицирризиновая кислота

Все три исследуемые препарата в той или иной степени обладали ан-тиоксидантной активностью, которая играла немаловажную роль в их ге-патопротективном действии. Наиболее значимо активность ПОЛ и АОС модулировал фосфоглив. Он препятствовал у подопытных животных нарастанию активности аскорбат-зависимого ПОЛ и предотвращал падение активности НАДФ-зависимого ПОЛ. Одновременно с этим предупреждалось истощение компонентов антиокислительной системы. Таким образом, фосфоглив приводил к гармонизации активностей систем ПОЛ и АОС, предотвращая нарушение функций цитоплазматических мембран и, в частности, предупреждая снижения ОРЭ.

Далее по эффективности следовал эссенциале. Его введение больным животным также препятствовало нарастанию активности аскорбат-зависимого ПОЛ в крови и в печени и снижению здесь же скорости НАДФ-зависимого ПОЛ; предупреждало существенное падение изучаемых показателей АОС и приводило к восстановлению значений такого интегрального показателя, как ОРЭ.

Замыкала ряд глицирризиновая кислота. Ее влияние на параметры ПОЛ и АОС было минимально. На фоне введения данного препарата наблюдалась лишь тенденция к снижению активности аскорбат-зависимого ПОЛ в эритроцитах и в гепатоцитах.

Необходимо также отметить, что фосфоглив по своему положительному влиянию на системы ПОЛ и АОС достоверно превосходил глицирри-зиновую кислоту в отношении аскорбат-зависимого ПОЛ почти в 2 раза, а коэффициента АЗ/НЗ ПОЛ в 1,8 раза в печени.

Таким образом, гепатопротекторы значимо ограничивали активность цитолиза гепатоцитов в процессе формирования острого токсического гепатита. Судя по данным эксперимента, механизм их терапевтической активности двоякий и заключается прежде всего в предупреждении развития гормонально-медиаторного дисбаланса и ограничении свободно-радикальных процессов. Это способствует сохранению структурной и функциональной активности цитоплазматических мембран клетки и препятствует активации ферментов клеточного повреждения, локализованных в лизосомах.