Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Совершенствование фармацевтического анализа лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов с помощью гальваностатической кулонометрии

у

На правах рукописи

АГАПОВА НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

И ФИТОПРЕПАРАТОВ С ПОМОЩЬЮ ГАЛЬВАНОСТАТИЧЕСКОЙ КУЛОНОМЕТРИИ

14.04.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

- 3 КОЯ 2011

Москва-2011

4858943

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации на кафедре фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии и кафедре фармакологии фармацевтического факультета с курсами фармакогнозии и ботаники

Научные руководители: кандидат химических наук, доцент

Абдуллина Светлана Геннадиевна

кандидат биологических наук, доцент Хазиев Рамиль Шамилевич

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Боковикова Татьяна Николаевна

доктор химических наук, профессор Звонкова Елена Николаевна

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится «14» ноября 2011 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН (117216, г. Москва, ул. Грина, 7) по адресу: 123056, г. Москва, ул. Красина, д.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7.

Автореферат разослан: « /Оу.ШУсЯд^2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.070.01,

доктор фармацевтических наук

А. И. Громакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди большого ассортимента лекарственных средств, производимых в нашей стране, доля препаратов растительного происхождения составляет 25-30%, а в некоторых фармакотерапевтических группах достигает почти 70%. Повышенное внимание к лекарственному растительному сырью (ЛРС) со стороны населения и медицинских работников отражает мировую тенденцию к увеличению числа лекарственных препаратов на растительной основе. Действительно, ЛРС обладает меньшей токсичностью, мягкостью и широтой терапевтического действия, возможностью более длительного применения, особенно для лечения хронических заболеваний, минимальным проявлением побочных эффектов и аллергических реакций. Обеспечение надлежащего качества ЛРС во многом зависит от правильной организации контроля, его действенности и эффективности, а также от уровня требований, заложенных в нормативную документацию (НД), и используемых методов анализа. Стандартизация и совершенствование методов контроля качества ЛРС являются одной из актуальных задач фармакогнозии. Учитывая, что основным показателем качества ЛРС служит содержание в нем биологически активных веществ, одной из важных задач стандартизации является разработка и внедрение современных методов их количественного определения. В связи с этим всё шире внедряются в практику фармакогностического анализа хроматографические, оптические и электрохимические методы.

Весьма перспективным и доступным для широкого применения методом является гальваностатическая кулонометрия, в котором основными контролируемыми параметрами являются время и сила тока. Имеющиеся в настоящее время приборы и устройства позволяют автоматически измерять эти параметры с очень высокой точностью. На одной и той же установке можно проводить как кислотно-основное, так и окислительно-восстановительное титрование, меняя лишь состав фонового электролита в кулонометрической ячейке. Все это создает предпосылки для разработки высокочувствительных методик кулонометрического определения различных биологически активных соединений. Метод гальваностатической кулонометрии отличается высокой точностью, экспрессностью, простотой проведения эксперимента, не требует предварительной стандартизации титранта, применения стандартных образцов и построения градуировочных графиков и актуален для стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов.

Цель исследования. Совершенствование стандартизации ЛРС и фитопрепаратов по содержанию органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ методом гальваностатической кулонометрии.

Задачи исследования'. 1. Провести сравнительный анализ методов, рекомендуемых отечественной и зарубежной НД, для определения содержания органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ в лекарственном растительном сырье.

2. Разработать кулонометрические методики определения содержания органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в шиповника плодах, рябины плодах, малины плодах, смородины черной плодах, фитопрепаратах «Холосас», «Сироп из плодов шиповника» и «Сок каланхое» с помощью электрогенерированных гидроксид-ионов с рН-метрической индикацией конечной точки титрования (к.т.т.) для включения в НД.

3. Разработать кулонометрические методики определения содержания аскорбиновой кислоты в шиповника плодах, первоцвета весеннего листьях и фитопрепарате «Сироп из плодов шиповника» с помощью электрогенерированного йода с биамперометрической индикацией к.т.т. для включения в НД.

4. Разработать кулонометрические методики определения содержания арбутина в бадана листьях, толокнянки листьях, брусники листьях с помощью электрогенерированного брома с биамперометрической индикацией к.т.т. для включения в НД.

5. Разработать кулонометрические методики определения содержания дубильных веществ в пересчете на танин в дуба коре, лапчатки корневищах, ольхи соплодиях, кровохлебки корнях и корневищах, бадана корневищах, черники плодах с помощью гипоиодит-ионов с биамперометрической индикацией к.т.т. для включения в НД.

Научная новизна. Предложены усовершенствованные методики кулонометрического определения содержания органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в шиповника плодах, рябины плодах, в лекарственных средствах «Сироп из плодов шиповника» и «Сок каланхое»; схемы методик кулонометрического определения содержания органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в малины плодах, смородины черной плодах, в лекарственном средстве «Холосас». Предложены усовершенствованные методики кулонометрического определения содержания аскорбиновой кислоты в шиповника плодах, первоцвета весеннего листьях и лекарственном средстве «Сироп из плодов шиповника». Определены стехиометрические коэффициенты в реакции арбутина с электрогенерированным бромом в кислой среде и предложена схема реакции. Предложены усовершенствованные методики кулонометрического определения содержания арбутина в бадана листьях, брусники листьях и толокнянки листьях. Предложены усовершенствованные методики кулонометрического определения содержания дубильных веществ в пересчете на танин в дуба коре, лапчатки корневищах, ольхи соплодиях, кровохлебки корнях и корневищах, бадана корневищах, черники плодах. Найдены стандартные условия получения электрогенерированного йода и предложено проверять эффективность кулонометрического титрования по стандарт-титру «Натрий серноватистокислый 5-водный».

По материалам исследования получено положительное решение о выдаче патента по заявке № 2010113440 «Способ кулонометрического определения дубильных веществ в ЛРС», получен приоритет по заявкам №2010113430 «Способ кулонометрического определения органических кислот в ЛРС и препаратах из растительного сырья» (от 6.04.2010 г.) и №2010137455 «Способ

кулонометрического определения аскорбиновой кислоты в JIPC и препаратах из растительного сырья» (от 8.09.2010 г.)

Практическая значимость. Разработаны усовершенствованные методики и схемы методик количественного определения органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в шиповника плодах, рябины плодах, малины плодах, смородины черной плодах, в лекарственных средствах «Холосас», «Сироп из плодов шиповника» и «Сок каланхое»; аскорбиновой кислоты в шиповника плодах, первоцвета весеннего листьях и лекарственном средстве «Сироп из плодов шиповника», арбутина в бадана листьях, брусники листьях и толокнянки листьях и дубильных веществ в пересчете на танин в дуба коре, лапчатки корневищах, ольхи соплодиях, кровохлебки корнях и корневищах, бадана корневищах, черники плодах методом гальваностатической кулонометрии, в том числе и в сочетании с методом ионообменной хроматографии (при определении суммы свободных и связанных органических кислот), на кулонометре «Эксперт-006» («Эконикс-эксперт»,).

Предложенные методики позволяют исключить расход дорогостоящих реагентов, не требуют применения стандартных образцов, построения градуировочных графиков, отличаются простотой проведения эксперимента, точностью и экспрессностью.

Внедрение в практику. Материалы о практической значимости подтверждены актами о внедрении в учебный процесс Казанского ГМУ на кафедре фармакологии фармацевтического факультета с курсами фармакогнозии и ботаники в виде учебно-методической разработки для студентов фармацевтического факультета «Применение гальваностатической кулонометрии для стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов» («Казанский государственный медицинский университет», -2011 г. - 46 е.); актами о внедрении в практику работы ОАО «Татхимфармпрепараты» и ГУ «Центр контроля качества и сертификации лекарственных средств Республики Татарстан».

Апробация. 1-ой Всероссийской конференции «Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции» (Москва,

2009), X и XI международный конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2009, 2010), 65-ой межрегиональной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск,

2010), 3-й ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2010), III Всероссийской конференции «Биотехнология и биомедицинская инженерия» (Курск, 2010), Республиканской конференции «Актуальные вопросы повышения качества последипломной подготовки фармацевтических кадров» (Казань, 2010), 15-й Всероссийской конференции «Молодые учёные в медицине» (Казань,2010), Всероссийская конференция «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты» (Самара, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК и 11 тезисов на международных и всероссийских конференциях, издано методическое пособие.

Автор благодарит профессора кафедры аналитической химии Химического института им. Бутлерова Казанского (Приволжского) федерального университета, академика РАЕН Будникова Г.К. за научные консультации и ценные советы на различных этапах выполнения данного исследования.

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России «Применение кулонометрического титрования в фармацевтическом анализе лекарственных средств и лекарственного растительного сырья» (№ гос. регистрации 0120.0 805877).

Основные положения, выносимые на защиту. Методики стандартизации ЛРС и фитопрепаратов по содержанию органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ методом гальваностатической кулонометрии с помощью электрогенерированных титрантов. Результаты изучения взаимодействия электрогенерированного брома с арбутином.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 132 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав экспериментальных исследований и выводов, содержит 29 таблиц, 22 рисунка. Список литературы включает 183 источника, в том числе 76 иностранных авторов.

ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Определение содержания органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и фитопрепаратах проводили на кулонометре «Эксперт-006» («Эконикс-Эксперт», Россия) при силе тока 5 мА. Генераторный и вспомогательный электроды представляли собой платиновые спирали. рН-метр, встроенный в кулонометр, калибровали по буферным растворам с рН 4 и 9 («Метром», Швейцария). Электрогенерацию гидроксид-ионов осуществляли из насыщенного водного раствора КгБОд, смешанного с водой очищенной в соотношении 1:7, конечную точку титрования определяли рН-метрически с помощью лабораторного комбинированного «полумикро»-рН-электрода ЭСК-10614 («Измерительная техника», Россия). Генерацию брома проводили из водного 0,2 М раствора КВг в 0,1 М растворе НгБО^ Электрогенерированный йод получали из 0,1 М раствора К1 в хлористоводородном буферном растворе (рН 1,2). Гипоиодит-ионы получали из 0,1 М раствора К1 в фосфатном буферном растворе (рН 9,5). Конечную точку титрования определяли биамперометрически с помощью платиновых электродов (ДЕ=300 мВ).

Используемые реактивы имели квалификацию х.ч. или ч.д.а. Для проведения ионного обмена использовали катионит КУ-2-8. В качестве растворителя использовали воду очищенную.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Сравнительный анализ определения содержания действующих веществ в ЛРС и фитопрепаратах.

Отечественная и зарубежная НД рекомендуют для определения содержания органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ титриметрические методы с визуальной и инструментальной фиксацией к.т.т., спектрофотометрию и ВЭЖХ. Недостатком титриметрических методов является трудность определения к.т.т. ввиду наличия собственной окраски вытяжки из ЛРС и необходимость предварительной стандартизации титранта, что увеличивает время анализа. Спектрофотометрия и ВЭЖХ являются ведущими физико-химическими методами анализа, но необходимость наличия стандартных образцов и дорогостоящего оборудования делают эти методы не всегда доступными. В связи с этим для определения содержания органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ перспективна разработка экспресс-методик методом гальваностатической кулонометрии. Отсутствие необходимости предварительной стандартизации титранта, использования стандартных образцов, невысокая стоимость оборудования и реактивов дают этому методу явные преимущества для проведения рутинных измерений на фармацевтических предприятиях. В связи с этим был сделан вывод о необходимости совершенствования методик определения содержания органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ в ЛРС и фитопрепаратах с помощью гальваностатической кулонометрии.

Определение содержания органических кислот в ЛРС и фитопрепаратах титрованием электрогенерированными гидроксид-ионами

Гидроксид-ионы образуются при электролизе воды на катоде по схеме: 2Н20 + 2ё -» 20Н~ + НгТ, в присутствии сульфата калия, как переносчика электронов. Эффективность кулонометрического титрования проверяли по стандарт-титру «Кислота соляная 0,1 моль/л», которая составила 99,9+0,2%.

Определение содержания органических кислот в шиповника плодах и рябины плодах. НД предлагает проводить стандартизацию по содержанию свободных органических кислот в пересчете на яблочную кислоту методом прямой алкалиметрии по фенолфталеину в смеси с метиленовым синим. В связи с этим было изучено взаимодействие яблочной кислоты с электрогенерированными гидроксид-ионами. Установлено, что реакция протекает быстро и количественно в стехиометрическом отношении 1:2.

Таблица 1

Результаты кулонометрического определения яблочной кислоты

по реакции с электрогенерированными гидроксид-ионами (п=5, Р=95%)

Введено яблочной Найдено яблочной с

кислоты, мкг кислоты, мкг

148 149±2 0,013

207 208±2 0,007

256 257±3 0,009

Отсутствие систематической ошибки показано методом «введено-найдено» (табл. 1). Опыты с добавками яблочной кислоты к водному извлечению из шиповника плодов и рябины плодов также свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки предлагаемой методики (табл. 2).

Таблица 2

Определение содержания органических кислот с добавками яблочной кислоты

к вытяжке из шиповника плодов и рябины плодов (п = 5, Р- 95%)

Найдено Добавлено Рассчитано Найдено

ЛРС органических яблочной органических органических S

кислот, мкг кислоты, мкг кислот, мкг кислот, мкг

Шиповника плоды 182 182 182 46 91 139 228 273 321 230 ± 3 272 ±3 320 ±4 0,020 0,018 0,019

Рябины плоды 81 55 136 135±1 0,014

81 81 77 99 158 180 157±1 180±1 0,011 0,009

Рн

/ \

/ \ / V у

рН

г 1

А Б

Рис.1. Кривые кулонометрического титрования яблочной кислоты (А) и водного извлечения из шиповника плодов (Б).

Количественное определение органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в шиповника плодах и рябины обыкновенной плодах проведено методом, рекомендуемым НД и по разработанной методике (табл. 3, 4). Кривые кулонометрического титрования представлены на рис. 1. Содержание органических кислот в исследованных образцах шиповника плодов составляет от 1,6 до 2,8%, в рябины плодах от 3,4 до 4,1%. Относительная ошибка кулонометрического титрования не превышает 2%, что значительно ниже ошибки алкалиметрического титрования. При расчете критерия Фишера для всех исследуемых образцов шиповника оказалось, что Ррас„>Рта6_,=4,85 при Р=99%, т.е. различие между дисперсиями статистически значимо и выборки неоднородны. Однако, размах варьирования значений выборки кулонометрического титрования входит в размах варьирования значений выборки алкалиметрического титрования. Больший интервал значений, найденных алкалиметрически, связан, по видимому, с трудностью визуальной фиксации к.т.т. ввиду интенсивной окраски водного извлечения из шиповника плодов. Для плодов рябины различие между дисперсиями (Р,,аот<Рта6,=4,85 при

Р=99%) и между средними (1р1ССЧ < 1тж5:т =2,85 при Р=99% и f=20) статистически не значимо. Выборки однородны. Следует отметить, что интенсивность окраски водного извлечения из плодов рябины значительно меньше интенсивности окраски водного извлечения из плодов шиповника.

Таблица 3

Определение содержания органических кислот

в плодах шиповника (п = 11, Р= 95%)_

ЛРС Найдено Найдено

кулонометрически, % алкалиметрически, %

Шиповника коричного плоды, Республика 2,71±0,04 еср= 1,5% еед= 5,0% 2,8±0,1 sCD= 4,2% £ед= 13,9%

Марий-Эл, 2007 г. ^"рассч — 7,55

Шиповника морщинистого 2,56+0,03 2,66±0,08

плоды, е„=1,0% z„= 3,3% £Ср=3,0% £ед= 9,9%

Бот. сад КГМУ, 2007 г 9,80

Шиповника плоды ЗАО АПФ «Фито ЭМ» 1,65±0,02 есс= 1,1% £„=3,7% 1,73±0,08 еСр= 4,6% £ед= 15,3%

^"оассч — 18,25

Таблица 4

Определение содержания органических кислот в рябины обыкновенной плодах (п = 11, Р= 95%)

ЛРС Найдено Найдено

кулонометрически, % алкалиметрически, %

Рябины плоды 3,41±0,04 3,46±0,07

ОАО еср= 0,94% сел= 3,1% £с„= 1,9% Еед=6,3%

«Красногорсклексредства» F =422 ' рассч ^рассч 1

Рябины плоды 3,90±0,06 3,95±0,09

Республика Марий-Эл ecd= 1,6% еед= 5,3% есп= 2,3% Еед=8,6%

2008 г ^рассч — 2,26 ^рассч — 1,01

Рябины плоды 4,04+0,06 4,02±0,09

Республика Чувашия ЕС1,= 1,6% еед= 5,3% £ср= 2,2% 8ед= 7,3%

2008 г. Fpacc4 1,84 ^рассч "" 0,41

Определение содержания органических кислот в свежих и высушенных плодах. Содержание органических кислот колеблется от 1,45% до 13,22% в высушенных плодах и от 6,32% до 22,1% в свежих плодах, относительная ошибка среднего кулонометрического определения не превышает 2% (табл. 5).

Определение содержания органических кислот в фитопрепаратах. Разработана методика кулонометрического определения содержания органических кислот в холосасе и сиропе из плодов шиповника титрованием электрогенерированными гидроксид-ионами с рН-метрической индикацией к.т.т. В холосасе разных производителей содержание органических кислот

варьирует от 1,1 до 1,7%. В сиропах из плодов шиповника, приобретенных в розничной сети, содержится от 0,24 до 0,42% органических кислот (табл. 6).

Таблица 5

Определение содержания органических кислот в растительном сырье (п = 11, Р= 95%)

Растительное сырье Найдено кулонометрически, %

Рябины черноплодной плоды Республика Татарстан, 2008 г 3,37+0,03 Е„= 0,99% s„= 3,3%

Земляники плоды Республика Татарстан, 2009 г 4,43±0,06 sco =1,4% s„=4,6%

Смородины черной плоды Республика Татарстан, 2008 г 13,2±0,1 £Ср= 0,89% Е„= 3,0%

Облепихи плоды Республика Татарстан, 2008 г 10,26+0,08 еср= 0,80% £ед= 2,7%

Малины плоды Республика Татарстан, 2008 г 5,51 ±0,03 Еср=0,61% £„=2,0%

Боярышника плоды Республика Татарстан, 2008 г 1,45±0,12 £„= 0,74% £ед= 2,5%

Барбариса плоды Республика Татарстан, 2008 г 10,8±0,1 £ср= 0,97% Е„= 3,2%

Облепихи плоды свежие, Республика Татарстан, 2009 г 7,17±0,03 £Ср= 0,46% £„=1,5%

Клюквы плоды свежие, Республика Татарстан, 2009 г 22,1 ±0,3 £ср=1,3% £ед= 4,3%

Малины плоды свежие, Республика Татарстан, 2009 г 6,32±0,08 £ср=1,3% £ед= 4,3%

Таблица 6

Определение содержания органических кислот в сиропе из плодов шиповника и холосасе (п = 5, Р= 95%)_

ЛРС Найдено кулонометрически, % Найдено алкалиметрически, %

Холосас ЗАО «Алтайвитамины» г. Бийск 1,15±0,02 s„= 1,8% еед= 4,0% 1,13±0,05 £„=4,0% £„=8,9%

F =4 7*5 t =1 11 1 оассч "t, í vJ 1рассч 1 - 1 1

Холосас ООО «Генос» г.Краснообск 1,70±0,02 £„= 0,95% £ед= 2,1% 1,69±0,06 £„=3,6% £„= 8,0%

^рассч "" 13,71 tpacc4 0,45

Сироп из плодов шиповника «Астромар», БАД 0,282±0,006 £„=2,0% Бед= 4,5% 0,27±0,02 £„=6,3% £„=14,1%

^оассч 9,00 tPacc4 —1 »90

Сироп из плодов шиповника ОАО «Фарм-стандарт-Уфавита» 0,396±0,007 £„=1,7% еед= 3,8% 0,42±0,03 Е„=5,9% Е„=13,2%

^"рассч 13,33 ^рассч 2,16

Относительная ошибка среднего кулонометрического определения не превышает 2%. Правильность и воспроизводимость предложенных методик оценивали путем сравнения с методикой, рекомендуемой НД, с помощью критерия Стьюдента и критерия Фишера, соответственно. Результаты статистической обработки показали, что различие между дисперсиями (Ррассч<РТабл= 15,98 при Р=99%) и между средними (1рассч < 1табл = 3,50 при Р=99% и f=8) статистически не значимо.

Лекарственный препарат «Сок каланхое» стандартизуется по количественному определению суммы свободных и связанных органических кислот методом прямой алкалиметрии с визуальной индикацией к.т.т. после ионообменной хроматографии. В связи с этим кулонометрическое определение содержания органических кислот в соке каланхое в пересчете на яблочную кислоту проводили после пропускания через колонку с катионитом КУ-2. Содержание органических кислот сравнивали с данными, полученными по методике, рекомендуемой НД (табл. 7). Заниженное содержание органических кислот, найденное по методике НД, связано, по-видимому, с индикаторной ошибкой титриметрического метода анализа. Часть органических кислот остается недотитрованой, так как рН перехода окраски у индикатора 6,0-7,6, а рН точки эквивалентности при титровании слабых кислот сильным основанием смещена в щелочную сторону. Кулонометрическое титрование позволяет определить содержание органических кислот как после, так и до пропускания через колонку с катионитом. Таким образом, содержание органических кислот в соке каланхое в виде солей составляет около 1,0%. Относительная ошибка среднего кулонометрического определения органических кислот в соке каланхое не превышает 2%.

Таблица 7

Определение содержания суммы органических кислот в препарате

«Сок каланхое» (п = 5, Р= 95%)

Сок каланхое Найдено кулоно- Найдено кулоно- Найдено алкали-

ЗАО метрически, %, метрически, % метрически, %

«Вифитех» до ионного обмена после ионного обмена

серия 100909 0,414±0,007 1,57±0,01 1,42±0,05

£сР=1,6% Еср=0,91% еср= 3,7%

8СД= 3,6% Еед=2,0% еед= 8,3%

серия 110909 0,404±0,007 1,41±0,01 1,33±0,05

вср=1,7% гср=0,79% гср=4,1%

8ед= 3,8% 8ед= 1,8% £сд= 9,2%

Валидационную оценку методики определения органических кислот в лекарственном средстве «Холосас» проводили по показателям: специфичность, линейность и аналитическая область методики, правильность, воспроизводимостью. Специфичность оценивалась нами по методу добавок яблочной кислоты к водному раствору холосаса (табл. 8). Линейность и аналитическая область методики подтверждается анализом 7 проб на 7 уровнях

концентрации в диапазоне от 70 до 130% от уровня концентрации принятой за 100%. Сравнение зависимости массы кислоты от количества электричества показало, что она имеет линейный характер и рассчитанное значение коэффициента линейной корреляции равно 0,9999; у=(0±9)-10г4 + (14,40±0,03) Ю"4х (рис. 2).

Таблица 8

Определение содержания органических кислот с добавками _ яблочной кислоты в холосасе (п = 5,Р= 95%) _

Определено органических кислот, мкг Добавлено яблочной кислоты, мкг Рассчитано органических кислот, мкг Найдено органических кислот, мкг 5

336 75 411 415 ±5 0,016

336 125 461 459 ±3 0,009

336 174 510 512 ±4 0,010

0,65 -0,600,550,50-О 0,450,400,35250 300 350 400 450

ш, мкг

Рис. 2. Зависимость между содержанием (ш, мкг) кислот и количеством электричества (Q, Кл).

Таблица 9

Количественное определение органических кислот в лекарственном средстве

«Холосас» на трех уровнях концентрации (п = 9, Р~ 95%)

Уровень Прямая алкалиметрия Кулонометрическое титрование

диапазона Навеска, г Найдено, % Навеска, г Найдено, %

1,6034 1,75 1,5991 1,59

Нижний 1,6589 1,71 1,6983 1,68

1,6875 1,62 1,6985 1,66

2,0575 1,69 2,0838 1,60

Средний 2,0944 1,56 2,0363 1,63

2,1407 1,72 2,1515 1,63

2,4405 1,71 2,3885 1,63

Верхний 2,4094 1,58 2,4392 1,63

2,5078 1,65 2,5139 1,64

Правильность и воспроизводимость оценивалась на примере 3 проб на 3 уровнях концентрации (табл. 9,10).

Таблица 10

Параметр Кулонометрия Алкалиметрия

Среднее выборки, Хср±АХ 1,63±0,02 1,67±0,05

Относительное стандартное отклонение, § 0,017 0,040

Стандартное отклонение среднего результата, 0,009 0,022

Относительная ошибка среднего, е , ср % 1,3 3,1

Относительная ошибка единичного определения, е , % ед 3,9 9,3

РРас„=5,901<Ртабл=6,03 при Р = 99%; 1рассч=1,29<1та6л=2,93 при Р = 99% и 1 = 16

Используя критерий Фишера сравнивали воспроизводимость и выяснили, что различия между дисперсиями статистически не значимо, причем воспроизводимость метода кулонометрического титрования лучше, чем у титриметрического метода. Значения рассчитанного критерия Стьюдента меньше табличных, следовательно, метод кулонометрического титрования валиден по показателям правильность и воспроизводимость.

Изучение динамики накопления органических кислот в алое древовидного листьях, каланхое перистого и каланхое Дегремона листьях при биостимуляции по методу Филатова показало, что содержание кислот, в целом, увеличивается незначительно, максимум приходится на 6" — 9й день, однако значительное увеличение наблюдается в листьях каланхое Дегремона (рис. 3).

Содержали« 30

Каяаягое Дмремояа АповМЗ

Алое Ш

■АлоеКа2

Каланхое перистое №2 -Каланхое перистое МЗ

3 6 9 12 Дни биостимушфовшия

Рис. 3. Динамика накопления органических кислот в алое, каланхое Дегремона и каланхое перистого листьях.

Определение содержания аскорбиновой кислоты в ЛРС и фитопрепаратах титрованием электрогенерированным йодом При электролизе калия иодида в кислой среде йод образуется на аноде по схеме: 2Г - 2ё —> 1г. Эффективность кулонометрического титрования предложено проверять по стандарт-титру «Натрий серноватистокислый 5-водный 0,1 моль/л», которая составила 100,0±0,2%.

Согласно НД стандартизация шиповника плодов и первоцвета весеннего листьев по содержанию аскорбиновой кислоты проводится титрованием 2,6-дихлорфенол-индофенолятом натрия с визуальной индикацией к.т.т. Недостатком данной методики является длительность и трудность визуальной фиксации к.т.т. К тому же методика усложняется необходимостью предварительной стандартизации титранта и его ограниченным сроком годности. Проведено кулонометрическое определение аскорбиновой кислоты в ЛРС. Установлено, что электрогенерированный йод взаимодействуют с аскорбиновой кислотой быстро и в стехиометрическом отношении 1:1. Кривая кулонометрического титрования представлена на рис. 19.

/ / /

/ /

/ /

- /

/ 1 А Б

Рис. 4. Кривые кулонометрического титрования аскорбиновой кислоты (А) и водного извлечения из шиповника плодов (Б).

Методом «введено-найдено» показано отсутствие систематической ошибки, относительное стандартное отклонение не превышает 0,02 (табл. 11). Опыты с добавками аскорбиновой кислоты к водному извлечению из шиповника плодов также свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки предлагаемой методики (табл. 12, рис. 4).

Таблица 11

Кулонометрическое определение аскорбиновой кислоты по реакции

с электрогенерированным йодом (п = 5, Р= 95%)

Введено аскорбиновой Найдено аскорбиновой а

кмслоты, мкг кислоты, мкг

149 149±2 0,013

193 192±2 0,009

261 261,6+0,8 0,003

Разработана методика кулонометрического определения аскорбиновой кислоты в водных извлечениях из шиповника плодов и первоцвета весеннего листьях (табл. 13).

Таблица 12

Определение содержания аскорбиновой кислоты в извлечении из шиповника плодов с добавками аскорбиновой кислоты (п = 5, Р- 95%)

Определено аскорбиновой кислоты, мкг Добавлено аскорбиновой кислоты, мкг Рассчитано аскорбиновой кислоты, мкг Найдено аскорбиновой кислоты, мкг 5

52 168 166±3 0,015

116 101 217 217±2 0,007

146 262 263 ±2 0,007

Содержание аскорбиновой кислоты в исследованных образцах шиповника плодов колеблется от 0,24 до 2,36%, в первоцвета весеннего листьях составляет 1,05%. Содержание аскорбиновой кислоты, найденное кулонометрически, меньше найденного по НД, что, по-видимому, связано с меньшей окислительной способностью йода по сравнению с 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия. Относительная ошибка среднего куло-нометрического определения аскорбиновой кислоты в ЛРС не превышает 2%.

Таблица 13

Определение содержания аскорбиновой кислоты в ЛРС (п = 7, Р= 95%)

ЛРС Найдено кулонометрически, % Найдено алкалиметрически, %

Шиповника коричного плоды, Мордовия, 2008 г. 2,36±0,02 £„=1,0% еед= 2,6% 2,4±0,1 есо=5,2% гсд= 13,8%

Шиповника морщинистого плоды, Бот. сад КГМУ, 2009 г. 0,539+0,006 £„=1,2% Еед=3,2% 0,54±0,02 £„=3,5% еел= 9,3%

Шиповника плоды, ООО «Биоком», г. Ульяновск 0,287+0,005 еср=1,6% есд= 4,2% 0,31±0,02 Есо=4,9% £„= 13,0%

Шиповника плоды, ЗАО АПФ «Фито-Эм», пос. Мамонтовка 0,77+0,01 Еср=1,3% Еед=3,4% 0,914+0,03 £„=2,7% £ед=7,1%

Первоцвета листья, Бот. сад КГМУ, 2010 г. 1,05±0,02 £„=1,4% еед= 3,7% 1,10±0,05 £„=4,3% Есд= 11,4%

Одним из показателей качества сиропа из плодов шиповника является содержание аскорбиновой кислоты. Опыты с добавками аскорбиновой кислоты к раствору сиропа из плодов шиповника свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки предлагаемой методики кулонометрического определения аскорбиновой кислоты (табл. 14)

Таблица 14

Определение содержания аскорбиновой кислоты в «Сиропе из плодов

шиповника» с добавками аскорбиновой кислоты (п = 5, Р= 95%)

Определено органических кислот, мкг Добавлено яблочной кислоты, мкг Рассчитано органических кислот, мкг Найдено органических кислот, мкг §

115 68 183 183± 3 0,014

115 99 214 214 ±3 0,010

115 148 263 261+3 0,008

Содержание аскорбиновой кислоты в сиропе из плодов шиповника колеблется от 2,83 до 3,32 мг (табл. 15). Относительная ошибка среднего кулонометрического определения не превышает 2%, что значительно меньше ошибки титриметрического определения.

Таблица 15

Определение содержания аскорбиновой кислоты в препарате «Сироп из плодов шиповника» (п = 5, Р= 95%)_

Лекарственное средство Найдено кулонометрически, % Найдено алкалиметрически, %

Сироп из плодов шиповника витаминизированный ОАО «Фармстандарт-Уфавита» 2,88±0,03 £ср=1,0% еед= 2,2% 3,6+0,5 £ср= 13,0% £ед= 29,1%

Сироп из плодов шиповника ООО «Астромар», БАД 3,32±0,04 Еср=1,2% £ед= 2,7% 4,2+0,6 еср=14,3% е„= 32,0%

Сироп из плодов шиповника с витамином С ООО «Марбиофарм», БАД 2,83±0,04 £ср=1,4% еед= 3,1% 3,9±0,4 еср=11,0% Еед= 24,6%

Определение содержания аскорбиновой кислоты в смородины черной и рябины плодах показало, что содержание аскорбиновой кислоты небольшое и составляет около 0,01% (табл. 16).

Таблица 16

Содержание аскорбиновой кислоты в сырье (п = 7, Р- 95%)_

Растительное сырье Найдено кулонометрически, %.

Смородины черной плоды Спасский район, Татарстан, 2009 г. 0,010±0,001 ес„ = 9,2 % £ед= 24,3%

Смородины черной плоды Ботанический сад КГМУ, 2009 г. 0,011±0,001 £«,= 11,7% ем= 31,0%

Рябины обыкновенной плоды Марий-Эл, 2008 г. 0,0088+0,0003 еср= 3,7% еед= 9,8%

Таким образом, предложены методики для определения содержания аскорбиновой кислоты в шиповника плодах, первоцвета листьях, а также в лекарственном препарате «Сироп из плодов шиповника» отличающиеся простотой проведения эксперимента, чувствительностью и экспрессностью. Относительная ошибка среднего кулонометрического определения аскорбиновой кислоты не превышает 2%.

Определение содержания арбутина в лекарственном растительном сырье титрованием электрогенерированным бромом

Электрогенерированный бром образуется на аноде при электролизе калия бромида по схеме: 2ВГ -2ё -» Вг2. Эффективность кулонометрического титрования проверяли по стандарт-титру «Натрий серноватистокислый 5-водный 0,1 моль/л», которая составила 99,9±0,2%.

Определение содержания арбутина в бадана листьях, толокнянки листьях и брусники листьях предложено проводить с помощью электрогенерированного брома. Установлено, что электрогенерированный бром взаимодействуют с арбутином быстро и количественно в стехиометрическом отношении 1:1. Учитывая, что гидроксильная группа, относящаяся к ориентантам I рода, будет направлять электрофильный заместитель региоселективно в орто-положения, можно предположить, что бромирование протекает только в одном о-положении, в то время как электрофильное замещение во втором о-положении

пространственно затруднено: он

( но-

Ьн ОН

Следует отметить, что гликозидная часть молекулы арбутина электрогенерированным бромом не окисляется. Кривая кулонометрического титрования арбутина представлена на рис. 5.

А Б

Рис. 5. Кривые кулонометрического титрования арбутина (А) и водного извлечения из бадана листьев (Б).

Методом «введено-найдено» показано отсутствие систематической ошибки, относительное стандартное отклонение не превышает 0,02 (табл. 17).

Таблица 17

Кулонометрическое определение арбутина по реакции

=5, Р=

Введено арбутина, мкг Найдено арбутина, мкг

138 136+3 0,018

193 191+4 0,019

275 274+7 0,020

НД рекомендует проводить стандартизацию листьев бадана, брусники и толокнянки по количественному содержанию арбутина. Недостатками методики являются длительность и трудоемкость, определению предшествуют стадия очистки от дубильных веществ методом осаждения и получение гидрохинона путем гидролиза арбутина, визуальная фиксации к.т.т. К тому же методика усложняется необходимостью предварительной стандартизации титранта. Поэтому за основу методики количественного определения была

взята методика спектрофотометрического определения арбутина в бадана толстолистного листьях с предварительной хроматографической очисткой извлечения. Учитывая, что наряду с арбутином водно-спиртовое извлечение может содержать гидрохинон, который также будет взаимодействовать с электрогенерированным бромом, полученные извлечения из исследуемого сырья проверяли на наличие гидрохинона методом тонкослойной хроматографии. В качестве стандартов использовали PCO арбутина и гидрохинона.

Бр1 Бр2 51 62 T1 Т2 <"

А - спиртовый (40 %) раствор PCO арбутина Бр1 - спиртовое (40 %) извлечение из листьев брусники до очистки Бр2 - спиртовое (40 %) извлечение из листьев брусники после очистки Б1 - спиртовое (40 %) извлечение из бадана листьев до очистки Б2 - спиртовое (40 %) извлечение из бадана листьев после очистки Т1 - спиртовое (40%) извлечение из листьев толокнянки до очистки Т2 - спиртовое (40%) извлечение из листьев толокнянки после очистки Г - спиртовый (40 %) раствор гидрохинона

Рис. 6. Хроматограмма спиртового (40 %) извлечения бадана толстолистного листьев до и после очистки.,

Как видно из рис. 6 на хроматограмме обнаружились красно-оранжевые пятна Rf (0,80), соответствующие арбутину в извлечение до и после очистки; желтое пятно Rf (0) предположительно дубильных веществ в извлечение до очистки и в извлечении брусники до и после очистки обнаружены бледно-розовые быстроисчезающие не идентифицированные пятна Rf (0,91). Пятен гидрохинона в извлечениях нет. Следовательно, водно-спиртовые извлечения из бадана толстолистного листьев, толокнянки листьев и брусники листьев не содержат гидрохинона.

Опыты с добавками арбутина к водному извлечению из бадана листьев свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки предлагаемой методики (табл. 18).

Таблица 18

Определение содержания арбутина в извлечении из бадана листьев _ с добавками арбутина (п =5, Р= 95%)__

Найдено Добавлено Рассчитано Найдено с

арбутина, мкг арбутина, мкг арбутина, мкг арбутина, мкг м-

249 71 320 318+2 0,011

249 126 375 377+3 0,010

249 190 439 440±3 0,003

Правильность и воспроизводимость предложенной методики оценивали путем сравнения с методикой, рекомендуемой в литературе, с помощью критерия Стьюдента и критерия Фишера, соответственно. Результаты статистической обработки показали, что различие между дисперсиями (РРаси<Ртабя= 15,98 при Р= 99%) и между средними (1рассч < 1та6л = 3,50 при Р-99% и (=8) статистически не значимо (табл. 19).

Таблица 19

Определение содержания арбутина в ЛРС (п =5, Р= 95%)_

ЛРС Найдено кулонометрически, % Найдено спектрофотометрически, %

Бадана толстолистного листья, Бот. сад КГМУ, 2009 г. 16,640,4 есв=2,4% еед= 5,4% 17,0+0,6 £Ср=3,7% £ед= 8,3%

F =2 48 t =162 1 раесч 1рассч 1

Брусники листья г. Волжск, 2008 г. 11,0±0,3 £cd=2,5% £ед=5,6% 10,9+0,4 £сс=3,3% £ед= 7,4%

^расся "" 1 >69 tDaccq ~' 0,67

Толокнянки листья Республика Марий-Эл 2010 г. 10,3±0,2 £„,=2,4% Есд= 5,4% 10,4+0,5 £с„=4,8% £ел= 10,7%

F = 4 94 t = fl 4fi 1 рассч ' 1рассч

Таким образом, разработаны простые и чувствительные методики определения содержания арбутина в бадане листьях, толокнянки листьях, брусники листьях. Относительная ошибка среднего кулонометрического определения арбутина не превышает 3%.

Определение содержания дубильных веществ в ЛРС титрованием гипоиодит-ионами

Гипоиодит-ионы образуются при электролизе калия иодида в щелочной среде, вследствие диспропорционирования образующегося йода: 1г + 20Н~ —» Г + Ю" + Н20. Учитывая, что определение дубильных веществ по НД основано на реакции окисления, можно предложить в качестве окислителя галогены или гипогалогенит-ионы, чья окислительная способность будет определяться ОВ потенциалами пар На^НаГ и НаЮ~|НаГ, соответственно.

1

I

< <

А Б

Рис.7. Кривые кулонометрического титрования танина (А) и водного извлечения из дуба коры (Б).

Таблица 20

_Величины окислительно-восстановительных потенциалов титрантов_

ОВ пара Условия генерации ОВ потенциал, В отн. х.с.э. ОВ потенциал, В отн. н.в.э.

ВгО"|Вг" Фосфатный буфер рН=8,0 1,65 1,88

ю-|г 1,05 1,28

С12|СГ 0,1 М НС1 1,44 1,67

Вг2|ВГ 0,81 1,04

У" 0,52 0,75

Таблица 21

Определение танина по реакции с гипоиодит-ионами (п = 5, Р= 95%)

Введено танина, мкг Найдено танина, мкг 5

84 84+1 0,012

125 126+2 0,015

190 189+2 0,013

Таблица 22

Определение содержания дубильных веществ с добавками танина к водному _извлечению из коры дуба в пересчете на танин (п = 5, Р- 95%)_

Найдено дубильных веществ, мкг Добавлено танина, мкг Рассчитано дубильных веществ, мкг Найдено дубильных веществ, мкг $

125 56 181 182±3 0,024

125 84 209 208+3 0,023

125 102 227 227+1 0,014

Для выбора титранта и условий титрования были измерены вольтамперометрически ОВ потенциалы пар На^НаГ и На1СГ|НаГ на платиновом электроде (табл. 20) относительно хлорсеребряного электрода с последующим пересчетом относительно насыщенного водородного электрода. В связи с тем, что ОВ потенциал пары М п04~|М п2+ при окислении дубильных веществ перманганатом калия в условиях, регламентируемых НД, составляет 1,39 В относительно н.в.э., можно предложить в качестве титранта 1СГ. При титровании танина гипоиодит-ионами, оказалось, что при рН 8,0 танин окисляется только на 80%. Учитывая, что потенциал пары зависит от концентрации ионов водорода, было найдено, что танин окисляется полностью

при рН 9,5, что подтверждается методом «введено-найдено» (табл.21) и методом добавок (табл.22). Измеренный вольтамперометрически, ОВ потенциал пары Ю~|Г в данных условиях составил 1,33 В (в пересчете относительно н.в.э.). Кривые титрования представлены на рис. 7.

Таблица 23

Определение содержания дубильных веществ в ЛРС _в пересчете на танин (п = 11, Р= 95%)_

Лекарственное средство Найдено кулоно-метрически, % Найдено перманга-натометрически, %

Дуба кора , ОАО «Красногор-склексредство», г.Красногорск 5,17±0,04 еСр= 0,76% £„= 2,5% 6,4±0,2 8Ср= 2,4% е„= 8,0%

Лапчатки корневища ООО «Камелия-ЛТ», г. Пенза 18,5±0,2 £сп= 1,1% Е„= 3,6% 21,8±0,7 ес„= 3,2% Е„= 10,6%

Ольхи соплодия, ЗАО АПФ «Фито-Эм», п.Мамонтовка 6,49±0,09 сср= 1,3% 8ед= 4,3% 10,5±0,3 8С„= 3,2% £„= 10,6%

Кровохлебки корни и корневища, ЗАО «Иван-чай», г. Москва 16,91±0,08 ес„=0,47%Ё„= 1,6% 21,6±0,7 £сс= 3,2% 8ед= 10,6%

Бадана корневища ЗАО «Иван-чай», г. Москва 14,9±0,2 еср= 1,2% еед= 4,0% 18,2±0,5 сс„= 2,6% Е„= 8,6%

Черники плоды, ООО «Геммавит», г. Санкт-Петербург 2,56±0,02 £со= 0,58% Еед= 1,9% 2,91±0,08 Есо= 2,8% Еел= 9,3%

Таблица 24

Определение содержания дубильных веществ

в растительном сырье (п = 9, Р- 95%)_

Лекарственное средство Найдено кулоно-метрически, % Найдено перманга-натометрически, %

Черемухи обыкновенной листья, Бот. сад КГМУ, 2009 г. 6,30±0,04 Есо=0,71% Е„=2,1% 8,4+0,2 £„=2,8% £„=8,4%

Березы обыкновенной листья г. Мамадыш, 2009 г. 5,02±0,05 ёсо= 0,91% £„=2,7% 6,1 ±0,2 ЕСр= 3,1% £ед= 9,3%

Ольхи клейкой листья г. Мамадыш, 2009 г. 3,89±0,04 £„=1,0% £ед=3,0% 6,9+0,1 Есо= 1,6% Еед= 4,8%

Лапчатки гусиной трава г. Мамадыш, 2009 г. 4,70±0,05 Есо=0,96% Е„= 2,9% 7,7±0,3 Еср=4,0% £„=12,0%

Шиповника майского листья г. Балтаси, 2009 г. 10,99±0,08 е№= 0,75% Есд=2,3% 14,6±0,2 Еср=1,7% Есд=5,1%

Боярышника кроваво-красного листья, Бот. сад КГМУ, 2009 г. 5,37±0,03 £Ср= 0,55% £„= 1,7% 6,9+0,1 £ср=2,1% £„= 6,3%

Таволги вязолистной листья Бот сад КГМУ, 2009 г. 13,9+0,1 £со= 0,75% £„=2,3% 18,4+0,3 Еср=1,4% £„=4,2%

Земляники лесной листья, Боровые Матюши, 2009 г. 8,96+0,06 £со= 0,68% £„= 2,0% 11,03±0,23 £ср=2,1% £ед= 6,3%

Вишни обыкновенной листья п. Константиновка, 2009 г 3,50±0,04 £ср= 1,2% £„=3,6% 4,6±0,2 еср=3,8% Еед=11,4%

Содержание дубильных веществ в ЛРС в пересчете на танин определяли кулонометрическим титрованием гипоиодит-ионами при рН 9,5 и по НД (табл. 23). Относительная ошибка кулонометрического титрования не превышает 2%. Содержание дубильных веществ, найденное кулонометрически, несколько меньше найденного по НД, что связано, вероятно, с меньшим значением ОВ потенциала пары Ю~|Г по сравнению с потенциалом пары Мп04~|Мп2+. Следует отметить, что перманганат-ион является жестким окислителем, а это, в свою очередь, значительно расширяет круг органических соединений, подвергающихся окислению под его действием, в том числе и не являющихся дубильными веществами. Поэтому использование перманганат-ионов может приводить к завышенным результатам.

Определено содержание дубильных веществ в растительном сырье, которое используется в научной и народной медицине (табл. 24). Содержание дубильных веществ, найденное кулонометрически, колеблется от 3,50% в вишни обыкновенной листьях до 13,9% в таволги вязолистной листьях.

Таким образом, разработаны методики определения содержания дубильных веществ в дуба коре, лапчатки корневищах, ольхи соплодиях, кровохлебки корнях и корневищах, бадана корневищах, черники плодах, отличающиеся экспрессностью и простотой проведения эксперимента. Относительная ошибка среднего кулонометрического определения дубильных веществ не превышает 2%.

ВЫВОДЫ

1. Проведен сравнительный анализ методов, рекомендуемых отечественной и зарубежной НД, для определения содержания органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ в ЛРС и фитопрепаратах. Определена необходимость совершенствования методик с помощью гальваностатической кулонометрии.

2. Разработанные усовершенствованные методики определения содержания органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в шиповника плодах, рябины плодах, малины плодах, смородины черной плодах, препаратах «Холосас», «Сироп из плодов шиповника» и «Сок каланхое» с помощью электрогенерированных из насыщенного раствора КгБО^НгО (1:7) гидроксид-ионов предложены для включения в раздел нормативной документации «Количественное определение». Относительная ошибка среднего не превышает 2%. Относительная ошибка единичного определения не превышает 5,5%.

3. Процедура валидации методики определения органических кислот методом гальваностатической кулонометрии в препарате «Холосас» показала обоснованность предложенной методики.

4. Разработанные усовершенствованные методики определения содержания аскорбиновой кислоты в шиповника плодах, первоцвета весеннего листьях и препарате «Сироп из плодов шиповника» с помощью электрогенерированного из 0,1 М раствора К1 в хлороводородном буферном растворе (рН 1,2) йода предложены для включения в раздел нормативной документации «Количественное определение». Относительная ошибка

среднего не превышает 2%. Относительная ошибка единичного определения не превышает 4,5%.

5. Показано, что арбутин взаимодействует с электрогенерированным из 0,2 М раствора КВг в 0,1 М растворе серной кислоты бромом быстро и количественно, в соотношении 1:1. Усовершенствованные методики определения содержания арбутина в бадана листьях, толокнянки листьях, брусники листьях предложены для использования в разделе нормативной документации «Количественное определение». Относительная ошибка среднего не превышает 3%. Относительная ошибка единичного определения не превышает 6%.

6. Предложенные усовершенствованные методики определения содержания дубильных веществ в пересчете на танин в дуба коре, лапчатки корневищах, ольхи соплодиях, кровохлебки корнях и корневищах, бадана корневищах, черники плодах с помощью гипоиодит-ионов, образующихся при генерации в фосфатном буферном растворе (рН 9,5) йода, могут быть использованы в разделе нормативной документации «Количественное определение». Относительная ошибка среднего не превышает 2%. Относительная ошибка единичного определения не превышает 4,5%. Методики кулонометрического титрования отличаются точностью, экспрессностью, простотой проведения эксперимента, не требуют предварительной стандартизации титранта, использования стандартных образцов или построения градуировочных графиков.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Валидация методики определения содержания органических кислот в препарате «Холосас»/ С.Г. Абдуллина, Н.М. Агапова, Р.Ш. Хазиев, С.А. Сидуллина// Фармация. - 2009. - №.8 - С. 28 - 30.

2. Агапова Н.М. Определение содержания свободных органических кислот в плодах шиповника/ Н.М. Агапова// Материалы 83-й Всерос. студ. науч. конф. - Казань, 2009. - С. 253.

3. Абдуллина, С.Г. Определение содержания органических кислот в плодах аронии черноплодной/ С.Г. Абдуллина, Н.М. Агапова, Р.Ш. Хазиев// Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции: Материалы первой Всеросс. конф. - М., 2009. - С.5-6.

4. Абдуллина, С.Г. Кулонометрическое определение содержания органических кислот в листьях каланхое/ С.Г. Абдуллина, Н.М. Агапова, Р.Ш. Хазиев II Здоровье и образование в XXI веке: Инновационные технологии в биологии и медицине: Сб. научн. трудов X междунар. конгресса. -М., 2009. - С.84-85.

5. Агапова Н.М. Кулонометрическое титрование в анализе препарата «Сок каланхоэ»/Н.М. Агапова, С.Г.Абдуллина, Р.Ш. Хазиев// Биотехнология и биомедицинская инженерия: Сб. тр. Ill Всероссийской научн.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск, 2010. - С.253-255.

6. Кулонометрическое определение дубильных веществ в лекарственном растительном сырье /С.Г. Абдуллина, Н.М. Агапова, Г.К. Зиятдинова, Р.Ш. Хазиев, С.А. Сидуллина, Г.К. Будников// Фармация -2010. -№.4 - С. 13-15.

7. Агапова Н.М. Кулонометрическое определение содержания органических кислот в свежих и сухих плодах / Н.М. Агапова, С.Г. Абдуллина, Р.Ш. Хазиев II Актуальные вопросы повышения качества последипломной подготовки фармацевтических кадров: Материалы Респ. научн.-практ. Конф. -Казань, 2010.-С.9- 11.

8. Агапова Н.М. Стандартизация растительного сырья по содержанию дубильных веществ/ Н.М. Агапова// Молодые ученые в медицине: Материалы XV Всероссийской научн.-практ. конф. - Казань, 2010. - С. 243.

9. Абдуллина, С.Г. Определение свободных органических кислот в растительном сырье/ С.Г. Абдуллина, Н.М. Агапова, Р.Ш. Хазиев// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Сб. науч. тр. - Пятигорск, 2010. - С.6-7.

Ю.Агапова Н.М. Определение содержания дубильных веществ в растительном сырье методом гальваностатической кулонометрии/ Н.М. Агапова, С.Г. Абдуллина, Р.Ш. Хазиев // Фармация и общественное здоровье: Материалы ежег. конф. - Екатеринбург, 2010. - С. 203-206. 11.Агапова Н.М. Кулонометрическое определение содержания аскорбиновой кислоты в плодах шиповника/ Н.М. Агапова, С.Г. Абдуллина, Р.Ш. Хазиев/Ддоровье и образование в XXI веке. Материалы XI международного конгресса. -М., 2010. - С. 44. 12,Определение содержания органических кислот в плодах рябины обыкновенной / С.Г. Абдуллина, Н.М. Агапова, Р.Ш. Хазиев, С.А. Сидуллина// Фармация. -2011,- №.2 - С. 17 - 19.

13.Агапова Н.М. Определение содержания арбутина в листьях бадана толстолистного/ Н.М. Агапова, С.Г. Абдуллина, Р.Ш. Хазиев//Здоровье и образование в XXI веке: Материалы XI международного конгресса. - М.,

2010. -С.540-541.

14.Кулонометрическое определение содержания свободных органических кислот в плодах шиповника/ С.Г. Абдуллина, Н.М. Агапова, O.A. Лира, Р.Ш. Хазиев, Н.П. Кодряну // Хим. -фарм. журн. - 2011. -Т.45-№5. - С. 25 - 27.

15.Агапова Н.М. Применение кулонометрического титрования для анализа «Сиропа из плодов шиповника» / Н.М. Агапова, С.Г. Абдуллина, Р.Ш. Хазиев// Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты. Материалы Всерос. научн.-практ. конф. - Самара,

2011.-С.93 - 94.

16.Абдуллина, С.Г. Применение гальваностатической кулонометрии для стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов. Учебно-методическое пособие для студентов фармацевтического факультета/С.Г. Абдуллина, Р.Ш. Хазиев, Н.М. Агапова / Казань: КГМУ, 2011-46 с.

Отпечатано с готовых оригинал-макетов в ООО «Типографии «Икспресс» г. Иваново, пр. Ленина, 31А, тел. (4932) 41-71-17. Тираж 100 экз., формат А5, печаль лазерная.

Актуальность темы. Среди большого ассортимента лекарственных средств, производимых в нашей стране, доля препаратов растительного происхождения составляет 25-30%, а в некоторых фармакотерапевтических группах достигает почти 70%. Повышенное внимание к ЛРС со стороны населения и медицинских работников отражает мировую тенденцию к увеличению числа лекарственных препаратов на растительной основе. Действительно, ЛРС обладает меньшей токсичностью, мягкостью и широтой терапевтического действия, возможностью более длительного применения, особенно для лечения хронических заболеваний, минимальным проявлением побочных эффектов, и аллергических реакций. Обеспечение надлежащего качества ЛРС во многом зависит от правильной организации контроля, его действенности и эффективности, а также от уровня требований, заложенных в нормативную документацию (НД), и используемых методов анализа. Стандартизация и совершенствование методов контроля качества ЛРС являются одной из актуальных задач фармакогнозии. Учитывая, что основным * показателем качества ЛРС служит содержание в нем биологически активных веществ, одной из важных задач стандартизации является разработка и внедрение современных методов их количественного определения. В связи с этим всё шире внедряются в практику фармакогностического анализа хроматогра-фические, оптические и электрохимические методы.

Весьма перспективным и доступным для широкого применения методом является гальваностатическая кулонометрия, в котором основными контролируемыми параметрами являются время и сила тока. Имеющиеся в настоящее время приборы и устройства позволяют автоматически измерять эти параметры с очень высокой точностью. На одной и той же установке можно проводить как кислотно-основное, так и окислительно-восстановительное титрование, меняя лишь состав фонового электролита в кулонометрической ячейке. Все это создает предпосылки для разработки высокочувствительных методик кулонометрического определения различных биологически активных соединений. Метод гальваностатической кулонометрии отличается высокой точностью, экспрессностью, простотой проведения эксперимента, не требует предварительной стандартизации титранта, применения стандартных образцов и построения градуировочных графиков и актуален для стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов.

Цель исследования. Совершенствование стандартизации ЛРС и фитопрепаратов по содержанию органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ методом гальваностатической кулонометрии.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ методов, рекомендуемых отечественной и зарубежной НД, для определения содержания органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ в лекарственном растительном сырье.

2. Разработать кулонометрические методики определения содержания органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в шиповника плодах, рябины плодах, малины плодах, смородины.черной плодах, фитопрепаратах «Холосас», «Сироп из плодов шиповника» и «Сок каланхое» с помощью электрогенерированных гидроксид-ионов с рП-метрической индикацией к.т.т. для включения в НД.

3. Разработать кулонометрические методики определения содержания аскорбиновой кислоты в шиповника плодах, первоцвета весеннего листьях и фитопрепарате «Сироп из плодов шиповника» с помощью электрогенери-рованного йода с биамперометрической индикацией к.т.т. для включения вНД.

4. Разработать кулонометрические методики определения содержания арбутина в бадана листьях, толокнянки листьях, брусники листьях с помощью электрогенерированного брома с биамперометрической индикацией к.т.т. для включения в НД.

5. Разработать кулонометрические методики определения содержания дубильных веществ в пересчете на танин в дуба коре, лапчатки корневищах, ольхи соплодиях, кровохлебки корнях и корневищах, бадана корневищах, черники плодах с помощью гипоиодит-ионов с биамперометрической индикацией к.т.т. для включения в НД.

Научная новизна. Предложены усовершенствованные методики куло-нометрического определения содержания органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в шиповника плодах, рябины плодах, в лекарственных средствах «Сироп из плодов шиповника» и «Сок каланхое»; схемы методик кулонометрического определения содержания органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в малины плодах, смородины черной плодах, в лекарственном средстве «Холосас». Предложены усовершенствованные методики кулонометрического определения содержания аскорбиновой кислоты в шиповника плодах, первоцвета весеннего листьях и лекарственном средстве «Сироп из плодов шиповника». Определены стехиометрические коэффициенты в реакции арбутина с электрогенерированным бромом в кислой среде и предложена схема реакции. Предложены усовершенствованные методики кулонометрического определения содержания арбутина в бадана листьях, брусники листьях и толокнянки листьях. Предложены усовершенствованные методики кулонометрического определения содержания дубильных веществ в пересчете на танин в дуба коре, лапчатки корневищах, ольхи соплодиях, кровохлебки корнях и корневищах, бадана корневищах, черники плодах. Найдены стандартные условия получения электрогенерированного йода и предложено проверять эффективность кулонометрического титрования по стандарт-титру «Натрий серноватистокислый 5-водный».

По материалам исследования получено положительное решение о выдаче патента по заявке № 2010113440 «Способ1 кулонометрического определения дубильных веществ в ЛРС», получен приоритет по заявкам №2010113430 «Способ кулонометрического определения органических кислот в ЛРС и препаратах из растительного сырья» (от 6.04.2010 г.) и №2010137455 «Способ кулонометрического определения аскорбиновой кислоты в ЛРС и препаратах из растительного сырья» (от 8.09.2010 г.)

Практическая значимость работы. Разработаны усовершенствованные методики и схемы методик количественного определения органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в шиповника плодах, рябины плодах, малины плодах, смородины черной плодах, в лекарственных средствах «Холосас», «Сироп из плодов шиповника» и «Сок каланхое»; аскорбиновой, кислоты в шиповника плодах, первоцвета весеннего листьях и лекарственном средстве «Сироп из плодов .шиповника», арбутина в бадана листьях, брусники листьях и толокнянки листьях и дубильных веществ в пересчете на танин, в; дуба коре; лапчатки корневищах, ольхи: соплодиях,, кровохлебки; корнях: и корневищах, бадана корневищах, черники плодах методом гальваностатической кулонометрии, в том: числе и в сочетании: с методом- ионообменной; хроматографии: (при определении суммы свободных и связанных органических кислот), на кулонометре «Эксиерт-006» («Эконикс-эксперт»,).

Предложенные методики позволяют исключить расход дорогостоящих реагентов, не требуют применения стандартных образцов;, построения' грат дуировочных графиков, отличаются простотой?.проведения? эксперимента,, точностью и экспрессностыо. . . !

Внедрение в практику. Материалы о практической- значимости; подтверждены актами: о внедрении, в учебный процесс Казанского ГМУ на ка-. федре: фармакологии фармацевтического факультета с курсами фармакогнозии и ботаники в виде учебно-методической разработки для студентов фармацевтического факультета «Применение гальваностатической кулонометрии для стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов» («Казанский государственный медицинский университет», - 2011 г. — 46 е.); актами: о внедрении; в практику работы ОАО «Татхимфармпрепараты» и ГУ «Центр контроля качества и; сертификации лекарственных средств Республики Татарстан».

Апробация. Основные положения работы доложены и обобщены: на 83-й Всероссийской студенческой научной конференции (Казань, 2009), 1-ой Всероссийской конференции «Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции» (Москва, 2009), X международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке: Инновационные технологии в биологии и медицине» (Москва, 2009), 65-ой ежегодной межрегиональной; конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукций» (Пятигорск, 2010); 3-й ежегодной конференции; «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2010), III Всероссийской научно-практической конференции: «Биотехнология; и биомедицинская; инженерия» (Курск, 2010), Республиканской научно-практической конференции «Актуальные вопросы повышения качества последипломной*г подготовки фармацевтических кадров» (Казань, 2010),: 15-й Всероссийской: научно-практической конференции: «Молодые учёные: в медицине» (Казань,2010), XI международный: конгресс «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2010), Всероссийская научно-практическая» конференция «Современная фармацевтическая • наука* и.практика:традиции, инновации, приоритеты» (Самара; 2011). • . V . ■

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том: числе 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК иП тезисов на мелсду-народных и всероссийских конференцияху издано методическое пособие.

Автор благодарит, д.х.н., профессора кафедры аналитической химии Химического института им. Бутлерова Казанского (Приволжского) федерального университета, академика РАЕН Будникова Г.К. за научные консультации и ценные советы на различных этапах, выполненияданного исследования.

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук: Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии ГБОУ П1Ю «Казанский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России «Применение кулонометрического титрования в фармацевтическом анализе лекарственных средств и лекарственного растительного сырья» (№ гос. регистрации 0120.0 805877).

Основные положения, выносимые на защиту; Методики стандартизации ЛРС и фитопрепаратов по содержанию органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ методом гальваностатической кулонометрии с помощью электрогенерированных титрантов. Результаты изучения взаимодействия электрогенерированного брома с арбутином.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 133 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав экспериментальных исследований и выводов, содержит 29 таблиц, 22 рисунка. Список литературы включает 183 источника, в том числе 76 иностранных авторов.

выводы

1. Проведен сравнительный анализ методов, рекомендуемых отечесзг-веннои И' зарубежной НД, для определения содержания органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ в ЛРС hv$ht<z>препаратах. Определена необходимость. совершенствования методик о помощью гальваностатической кулонометрии.

2. Разработанные усовершенствованные методики определения, соде^=>:экания органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в шиповни^са. пло- • дах, рябины плодах, малины плодах, смородины черной плодах, rrf=>enapa-тах «Холосас», «Сироп из плодов шиповника» и «Сок каланхое» о помо-щыо элекгрогенерированных из насыщенного раствора K2S04:H;2<33> (I -?) гидроксид-ионов предложены для: включения-в раздел нормативной документации «Количественное определение». Относительная ошибка; о^реднего не превышает, 2%. Относительная^ ошибка единичного, определе^ззш не

• превышает 5,5%.

3. Процедура валидации методики г определения- органических- кислот методом гальваностатической кулонометрии: в препарате «Холосас» по-зсазала обоснованность предложенной методики.

4. Разработанные* усовершенствованные методики определения: содер>^жаниял аскорбиновой кислоты в шиповника плодах, первоцвета весеннего листьях: и препарате «Сироп из плодов шиповника» с помощью: электрог^ыери-рованного из 0,1 М раствора KI в хлороводородном буферном рас^ггворе (рН. 1,2) йода: предложены для включения в раздел нормативной док^утмен-гации «Количественное.определение». Относительная ошибка средине превышает 2%. Относительная« ошибка единичного определения пре-В1.1шает 4,5%).

5. Показано, что арбутин взаимодействует с электрогенерированным Е23 0,2 М раствopa КВг в 0,1 М растворе серной кислоты бромом быстро и эсоличественно, в соотношении 1:1. Усовершенствованные методики опре=^о;еления^содержания арбутина в бадана листьях, толокнянки листьях, брус^ники листьях предложены для использования в разделе нормативной документации «Количественное определение». Относительная ошибка среднего не превышает 3%. Относительная ошибка единичного определения не превышает 6%.

6. Предложенные усовершенствованные методики определения содержания дубильных веществ в пересчете на танин в дуба коре, лапчатки корневищах, ольхи соплодиях, кровохлебки корнях и корневищах, бадана корневищах, черники плодах с помощью гипоиодит-ионов, образующихся при генерации в фосфатном буферном растворе (рН 9,5) йода, могут быть использованы в разделе нормативной документации «Количественное определение». Относительная ошибка среднего не превышает 2%. Относительная ошибка единичного определения не превышает 4,5%. Методики кулонометрического титрования отличаются точностью, экспрессностью, простотой проведения эксперимента, не требуют предварительной стандартизации титранта, использования стандартных образцов или построения градуировочных графиков.

115