Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Состояние сурфактантной системы легких при неблагоприятных воздействиях окружающей среды и способы ее коррекции

На правах рукописи

оаздь

НИЗАМУТДИНОВА РАМЗИЯ Р АШИДОВНА

СОСТОЯНИЕ СУРФАКТАНТНОЙ СИСТЕМЫ ЛЕГКИХ ПРИ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ И СПОСОБЫ ЕЕ КОРРЕКЦИИ

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2008

003455982

Работа выполнена на кафедре общей патологии ГОУ ВПО «Сургутский государственный университет Ханты-Мансийского автономного округа - Югры»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

доктор медицинских наук профессор

Коваленко Людмила Васильевна

Тараканов Игорь Анатольевич

Войнов Владимир Антипович

Ведущая организация: Российский университет дружбы народов

Защита состоится « 1% » ИгАМ 200^_ г. в часов

на заседании Диссертационного боветаД001. 003. 01 при ГУ Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН

(125315, Москва, ул. Балтийская, д. 8).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Автореферат разослан « » _200& г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат медицинских наук

Л.Н. Скуратовская

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. Сурфактантная система легких -это многокомпонентная, сложно организованная система с большим набором обратных связей, играющих большую роль в регуляции ее функции (Ерохин В.В., Романова Л.К., 2000). Легочный сурфактант (ЛС) является быстро обновляемым секретом альвеолярных клеток, который имеет многообразные функции (Нестеров Е.Н, 2006; Тагано-вич А.Д., 2007).

ЛС очень часто рассматривают как статичный структурный компонент, влияющий на механические свойства альвеол и не участвующий в механизме развития основных легочных болезней. Причина, по которой не учитывали возможности его участия во многих легочных заболеваниях, заключается в том, что процессы синтеза, секреции и клиренса сурфактанта необратимо поражаются относительно нечасто. В то же время известно, что недостаточность сурфактанта является главным механизмом синдрома дыхательных расстройств новорожденных (Евсюкова И.И., 2006). Многие пульмонологи считают, что и патогенез острого легочного поражения у взрослых в качестве важного звена включает массивную потерю сурфактанта (Брындина И.Г, 2004; Тапеуа Б. е1. а1., 2002). Полагают, что сурфактант подвержен патогенному влиянию инфекции и токсинов и что при нарушении сурфактантной системы ослабевают определенные защитные процессы в легких.

Изучение сурфактантной системы легких (ССЛ) в здоровом организме и при патогенных воздействиях стоит в ряду важных задач современной пульмонологии. Поскольку методы изучения легочного сурфактанта непрерывно совершенствуются, следует ожидать, что участие патологии сурфактантной системы в легочных заболеваниях будет раскрыто значительно полнее. Доказательство нарушений альвеолярного сурфактанта в связи с ограничением его синтеза с последующим дефицитом в альвеолярной выстилке, а также вследствие повышенного разрушения или инактивации при воздействии конкретных поражающих факторов и при определенных заболеваниях важно для теоретической и практической пульмонологии.

Особый интерес представляет действие на сурфактантную систему легких неблагоприятных факторов, с которыми нередко приходится встречаться человеку, в частности гипотермии, голодания, обезвоживания, ионизирующего излучения. Выяснение этих вопросов имеет не только чисто медицинский интерес, но и определенную социально-экономическую значимость.

Существенный практический интерес для клиники представляет задача использования эффективных и лишенных ксеногенности препаратов, способствующих пополнению легочного сурфактанта при его дефиците или инактивации, особенно в тех случаях, когда механизмы самовосстановления сурфактантной системы легких после ее повреждения уже исчерпаны. Столь важные для клиники вопросы пока нельзя считать достаточно разработанными.

Целью настоящего исследования явились изучение в эксперименте состояния сурфактантной системы легких при патогенных для человека экспериментальных воздействиях и участие в патогенезе возникающих нарушений систем перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты (АОЗ) и возможности восстановления функционального состояния сурфактантной системы легких. Задачи исследования

Для достижения цели были поставлены задачи:

1. Изучить функциональное состояние сурфактантной системы легких при общей гипотермии.

2. Исследовать влияние голодания на состояние сурфактантной системы легких и процессы перекисного окисления липидов.

3. Определить характер воздействия сухоядения на функциональную активность легочных сурфактантов, процессы перекисного окисления липидов и состояние антиоксидантной защиты.

4. Изучить влияние гамма-облучения грудной клетки на изменение состояния сурфактантной системы легких, процессы пероксидации и антиоксидантной защиты.

5. Выяснить возможности восстановления сурфактантной системы легких после повреждающих воздействий и исследовать влияние на этот процесс альфа-токоферола, метионина, эссенциале и микро-гидрина.

Научная новизна исследования

В работе подробно изучены патофизиологические аспекты повреждения клеточного и неклеточного компонентов сурфактантной системы легких при патогенных экспериментальных воздействиях (переохлаждение, голодание, обезвоживание, воздействие ионизирующего излучения). Впервые развернутая характеристика сурфактантной системы легких при этих видах ее экспериментальной патологии и при корригирующих воздействиях на них представлена параллельно с многокомпонентным, информативным комплексом критериев активности процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты. Экспериментально доказано, что действенным путем восстановления

нарушенного функционального состояния ССЛ при патогенных воздействиях является применение альфа-токоферола, метионина, эссенциале. Впервые показано благоприятное воздействие на ССЛ микрогидрина.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты выполненной работы позволили полунить ряд данных, раскрывающих роль сурфактантной системы легких в патогенезе и саногенезе легочной патологии. Полученные результаты могут явиться теоретической базой для последующих работ.

Для клиники практически важным является доказательство патогенного влияния переохлаждения, голодания, сухоядения и других неблагоприятных факторов на клеточный и неклеточный компоненты сурфактантной системы легких и изменения в ней процессов переокисления и антирадикальной защиты. Использование доступных и безопасных соединений позволяет надеяться на широкое их применение в практике.

Данные диссертационного исследования могут быть использованы в учебном процессе при чтении лекций на кафедрах общей патологии, патофизиологии и физиологии медицинских высших учебных заведений.

Положения, выносимые на защиту

1. Разной степени изменения сурфактантной системы легких, процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты определяются видом и выраженностью патогенного экспериментального воздействия.

2. Клеточные и неклеточные компоненты сурфактантной системы легких после экспериментального патогенного воздействия способны к самовосстановлению. Альфа-токоферол, метионин, эссенциале и микрогидрин ускоряют этот процесс.

Апробация работы. Основные положения и результаты исследования были представлены в виде публикаций и докладов на научно-практических конференциях «Медико-биологические и экологические проблемы на Севере» (Сургут 2004, 2005 гг.), на Всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука, медицина: эколо-го-экономический аспект» (Пенза, 2005 г.), на I Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Сочи, Дагомыс, 2005 г.), Открытой окружной конференции молодых ученых «Наука и инновации XXI века» (Сургут, 2005, 2006, 2007 гг.), на И Международной научно-практи-

ческой конференции «Проблемы демографии, медицины и здоровья населения России: история и современность» (Пенза, 2006 г.), на научно-практической конференции молодых ученых (Казань, 2006 г.).

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 137 листах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных собственных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 117 источников (отечественных - 100, зарубежных - 17). Работа иллюстрирована 14 рисунками и содержит 22 таблицы.

Материал и методы исследования

Опыты выполнены на 557 беспородных белых крысах - самцах массой 220-300 г., из которых 380 были подвергнуты воздействию различных неблагоприятных факторов, а 177 интактных животных служили контролем. Животных содержали в виварии на стандартном лабораторном рационе при температуре окружающей среды -18-20°С.

Особенности состояния сурфактантной системы легких изучали после воздействия на организм низкой температуры, голодания, длительного обезвоживания, ионизирующего излучения.

Терапевтическое или профилактическое воздействие на нарушения легочного сурфактанта осуществляли с помощью масляного раствора альфа - токоферола ацетата (0,1 мг/сут). Витамин Е вводили с помощью микропипетки в ротовую полость. Препарат эссенциале, главным действующим веществом которого является дилинолеил-фосфатидилхолин, вводили по 0,2 мл внутримышечно и 0,1 мл в рот с помощью микропипетки. Таким же образом вводили раствор метиони-на (1,4 мг/сут).

Дизайн проведенного исследования представлен на рис. 1.

Рис. 1. Дизайн исследования

Моделирование экспериментальной патологии

I. Для получения острой гипотермии крыс сажали в клетку, резко ограничивающую их движения. Измерив ректальную температуру, их помещали в холодильную камеру с температурой -18-20°С на 4-5 часов. При этом возможность местного обморожения вследствие контакта со стенками камеры была исключена. Выбор временной экспозиции был основан на выживаемости крыс, которая при данном сроке составила 90%.

II. Сухоядение вызывали у крыс, лишая их питьевой воды и влажного корма на 20 суток. Однако известно, что при таком рационе крысы погибают через 5-6 дней, а потому животным на 4, 8, 12, 16-й дни опыта предоставляли на 2 мин питьевую воду. При этом крысы выпивали не более 8-12 мл, но таким путем удавалось продлить им жизнь при сухоядении до 20 дней.

III. В опытах с голоданием крыс в течение 4-5 суток лишали пищи без ограничения воды. Исследование состояния CCJI проводили сразу же после этого срока или после двух недель откармливания.

IV. Однократное гамма-облучение грудной клетки зафиксированных на спине крыс при экранировании остальных частей тела проводили на установке «Луч-1» из расчета поглощенной дозы - 10 Гр.

Методы исследования клеточного и неклеточного компонентов сурфактантной системы легких

Для характеристики состояния сурфактантной системы легких использовали биофизические, биохимические и морфологические методы. Исследовали: 1) поверхностное натяжение (ПН) бронхо-альвео-лярных смывов и экстрактов ткани легких; 2) коэффициент стабильности (КС) пузырьков, выжатых из легочной паренхимы в каплю физиологического раствора по методу Pattie; 3) количественный показатель поляризационной микроскопии в замороженных неокрашенных срезах фиксированных легких; 4) морфологическую картину легких методом световой и электронной микроскопии.

Биофизические методы. Определение ПН смывов и экстрактов легких на поверхностных весах Вильгельми.

Вычисление коэффициента стабильности (КС) пузырьков воздуха, выжатых из легких в жидкость, определяли по методу Pattie.

Биохимические методы.

Для исследования значения в процессе функционального нарушения сурфактантной системы легких при воздействии ряда изученных

нами патогенных факторов активации перекисного окисления липидов сурфактанта был избран ряд показателей активности ПОЛ в легочных смывах, а также показателей ферментативной активности антиокси-дантной системы в том же субстрате.

О напряженности процессов перекисного окисления липидов судили по концентрации в смыве:

- Диеновых конъюгатов, определяли в эритроцитах по методике 3. Плацер. Принцип метода основан на измерении интенсивности поглощения в области 232-234 нм, обусловленной конъюгированными диеновыми структурами, возникающими при образовании гидроперекисей полиненасыщенных жирных кислот.

- Гидроперекисей липидов. Устанавливали два ряда пробирок. В первый ряд добавляли по 0,2 мл БАС и 0,02 мл 50% трихлоруксусной кислоты и центрифугировали. Извлекли надосадочную жидкость, добавляли к ней 2,5 мл этилового спирта и 0,02 мл концентрированной НС1, затем 0,002 мл 5% соли Мора. Через 30 сек добавляли 0,1 мл 20% тиоцианата аммония. Спектрофотометрировали при 480 нм. Контроль проводили аналогично, только вместо смыва добавляли дистиллированную воду (Романова А.И., Стальная И.Д., 1977). Единицы измерения -усл. ед.

- Малонового диальдегида, определяли по реакции с тиобарбшу-ровой кислотой по методу И. Д. Стальной и Т.Г. Гаришвили.

- Средних молекул. К 0,5 мл БАС добавляли 0,5 мл 0,5 N раствора хлорной кислоты, центрифугировали, в чистую пробирку сливали надосадочную жидкость и доводили рН до 7,4 - 7,6 одномолярным раствором К2С03. Готовили пробирки с 5 мл дистиллированной воды, добавляли по 0,2 мл обработанного указанным образом БАС и измеряли на спектрофотометре при 280 нм против воды (Осипович В.И. и др., 1988). Единицы измерения - усл. ед/мл.

Критериями состояния антиоксидантной системы послужили показатели ферментативной активности.

- Активность супероксиддисмутазы в эритроцитах изучали методом В.Н. Чумакова и Л.Ф. Осинской, основанным на определении степени задержки этим энзимом восстановления нитротетразолия синего супероксидными радикалами, генерируемыми системой рибофлавин-тетраметилендиам ин.

Церулоплазмин. К 0,1 мл БАС добавляли 1 мл ацетатного буфера и 0,5 мл 1% парафенилендиамина. Помещали на 10 мин в термостат при 60°С, затем добавляли 1 мл буфера, 3,5 мл NaOH и 0,5 мл парафенилендиамина. Спектрофотометрировали при длине волны 440 нм против

контроля (Тен Э.А., 1981, в модификации Муравлевой Л.Е. и др.) Единицы измерения - ед.акт/мл/мин.

Активность катал азы сыворотки крови определяли по методу М.А. Королюк, Л.И. Иванова и соавт., 1988 и выражали в мкмоль/мин на 1 грамм гемоглобина. Принцип метода основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс.

Пероксидаза. Готовили два ряда пробирок (опыт и контроль). В оба ряда пробирок с налитым в каждую по 0,1 мл БАС добавляли по 0,2 мл бензидина. В контрольные пробы добавляли по 0,2 дистиллированной воды, а в пробы опытной серии - по 0,2 мл 3% перекиси водорода. Через 3 мин добавляли по 1 мл 30% №ОН и по 2 мл этилового спирта, перемешивали и приливали по 1,5 мл дистиллированной воды. Спектрофотометрировали на волне 440 нм против контроля (Архипова О.Г. и др., 1987). Единицы измерения - ед.опт.пл/мл.

Глутатионредуктаза. В среду, содержащую 0,1 мл смыва, добавляли 2,4 мл буфера (рН 8,0-8,2). 0,1 мл ЭДТА и 0,5 мл окисленного глу-татиона. После установления нуля на спектрофотометре при длине волны 360 нм быстро вносили 0,1 НАДФН2, записывали экстинцию сразу после его внесения и через 5 мин. При расчете активности фермента учитывали коэффициент полярной экстинкции НАДФН2 - 6,22 х 103 м"1 см"1. Расчет производили по формуле: А = Ех 1607/5, где Е - разница оптической плотности за 5 мин, а 1607 - коэффициент пересчета.

Морфологические методы

Общеморфологическую картину цитоархитектоники легких исследовали при окрашивании депарафинированных срезов гематоксилином и эозином.

Для электронно-микроскопического исследования фиксацию легких проводили в 2,5%-ном растворе глютаральдегида на 0,1 м фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) с постфиксацией 1%-ным раствором четы-рехокиси осмия. Ткань заключали в аралдит. Ультратонкие срезы толщиной 20-30 нм получали на ультратоме ЛКБ-3, контрастировали ура-нил-ацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу.

Внутриклеточные запасы сурфактанта определяли методом поляризационной микроскопии.

Сущность метода заключается в том, что альвеолоциты II типа становятся оптически выявляемыми при исследовании в поляризационном свете криостатных срезов, приготовленных из фиксированных в формалине легких. При этом липвдные включения цитоплазмы альвео-лоцитов II типа дают интенсивное двойное лучепреломление. Количе-

ственное определение двоякопреломляющих структур сурфактанта проведено при 520 нм на цнтофотометре, смонтированном на основе ФЭУ-31 на микроскопе NU-2E («Zeiss», Германия) с фотометрической насадкой ФМЭЛ-Н. В каждом из 10 срезов легких животных каждой серии фото-метрировали по 10 полей зрения, выбранных по методу случайного отбора.

Статистическую обработки полученного материала осуществляли с помощью пакета прикладных программ «STATISTICAL» (Боровиков В.В, 2001; Реброва О.Ю., 2001) и EXSEL согласно современным требованиям к проведению анализа медицинских и биологических данных (ГланцС., 1998).

Результаты исследования и их обсуждение

Применение избранных нами патогенных факторов (гипотермия, голодание, сухоядение, ионизирующее излучение) сопровождалось реакцией сурфактантной системы далеко не одинаковой интенсивности и даже направленности.

Сурфактантная система легких и гипотермия

Воздействие в течение 4-5 часов низких температур на организм животных вызывало значимое снижение основных показателей ПА только внеклеточной фракции сурфактанта. ПН мин легочных смывов достоверно возросло (р < 0,05) с 16,8 ± 0,44 мН/м до 19,0 ± 0,69 мН/м. При этом КС снизился до 0,91 ± 0,009 (р < 0,01). Отсутствие признаков нарушения внутриклеточного звена сурфактанта соответствует данным другого исследования (Куликов В.Ю. с соавт., 2003), в котором уже в первые часы действия холода находили достоверное возрастание концентрации фосфатидилэтаноламина (ФЭА) в фосфоллпидах легких. Эти изменения, несомненно, отражают специфический стрессовый характер реакции ССЛ на холодовое воздействие, поскольку ФЭА является основным субстратом, подвергающимся процессам перекисного окисления липидов. Его увеличение в первые часы действия холода может потенцировать, с одной стороны, реакцию ПОЛ, с другой, активировать тканевые макрофаги, «убирающие» избыток сурфактанта и разрушенные клетки. Такая последовательность процессов позволяет связывать в единую функциональную систему клетки, секретирующие сурфактант, и системы, утилизирующие его с помощью перекисного механизма и элементов макрофагальной системы.

Результаты серии опытов с кратковременным действием низкой температуры указывают на лабильность процессов функционирования

CCJI, сдвиги в которых достигают выявляемой интенсивности уже в течение 4 часов. С другой стороны, они свидетельствуют о возможности значимого снижения секреции сурфактанта на альвеолярную поверхность без существенного нарушения внутриклеточного его синтеза.

Сурфактантная система легких и голодание

После четырехсуточного лишения пищи в легочной ткани животных мы отметили не только все признаки снижения внутриклеточного синтеза сурфактанта, но и значительный дефицит его на поверхности альвеол в результате нарушения процессов секреции (табл. 1).

У голодавших животных достоверно возросли величины Г1Нстат и ПНмакс экстракта. Повысились также ПНмакс и ПНЫИ„ смыва. Достоверно уменьшился коэффициент стабильности по Pattle. Откармливание животных в течение двух недель после голодания в значительной мере восстанавливало показатели состояния CCJI.

При электронно-микроскопической исследовании была видна картина угнетения выработки поверхностно-активного вещества альве-олоцитами II типа. Просветы альвеол находились в спавшемся состоянии. В альвеолоцитах И типа выявлялись единичные осмиофильные тельца. Капилляры аэрогематического барьера были спавшимися и обескровленными. В них выявлялись единичные микропиноцитозные везикулы.

При поляризационной микроскопии находили заметное уменьшение количества и размеров двоякопреломляющих гранул сурфактанта.

Вполне вероятно, что такие изменения возникают иногда после тяжелых операций на пищеводе, желудке и в других случаях голодания больных, осложняя их состояние нарушениями дыхательной функции.

На это указывает, в частности, и тот факт, что не только полное голодание, но даже недокармливание животных (контрольная серия)

Таблица 1

Показатели состояния ССЛ крыс после голодания в течение 4 сут

(М ± т)

Серия Контроль п = 7 Голодание 4 сут. п = 22 Голодание 4 сут + 2 нея Откармливания п = 22 Р 1 и 2 р 2 иЗ Р 1 иЗ

Коэффициент легочной массы 0,65 ± 0,04 0,71 ±0,04 0,60 ±0,03 <0,05

Поверхностное натяжение (мН/м) Статическое с 46,3 ±0,51 47,6 ±0,91 47,5 ± 0,27

э 37,9 ±0,51 41,2 ±0,91 36,1 ±0,20 <0,01 <0,001 <0,01

Максимальное с 53,1 ±0,57 55,3 ± 0,72 53,3 ± 0,28 <0,05 <0,05

э 44,0 ±0,75 48,0 ±0,69 41,0 ±0,38 <0,01 <0,001 <0,01

Минимальное с 18,4 ±0,25 20,1 ±0,43 19,4 ±0,25 <0,01 <0,02

э 16,6 ±0,45 17,7 ±0,47 15,2 ±0,58 <0,01

Индекс стабильности с 0,95 ±0,001 0,92 ±0,01 0,92 ±0,01

э 0,91 ±0,001 0,93 ±0,03 0,89 ±0,03

Коэффициент стабильности 0,97 ± 0,01 0,93 ±0,01 0,94 ± 0,02 <0,001

ППМ 22,8 ± 0,26 15,3 ±0,27 19,0 ± 0,22 <0,001 <0,001 <0,001

Примечание: ППМ - показатель поляризационной микроскопии; С -смыв; Э - экстракт опыта , менее сильно, но достоверно

снижало активность обеих фракций ССЛ.

Сурфактантная система легких и обезвоживание

Обезвоживание животных в течение 20 суток путем сухоядения явилось еще более сильным стрессовым фактором, чем голодание, и повело к еще более выраженным изменениям всех перечисленных показателей состояния ССЛ (табл. 2).

При электронной микроскопии отмечена картина резкого снижения активности альвеолоцитов II типа. Апикальная поверхность клетки была сглажена, лишь изредка выявлялись группы микроворсинок. Цитоплазма альвеолоцитов выглядела резко отечной или тотально, или в виде крупных светлых вакуолей. Митохондрии и осмиофильные тельца обнаруживались в очень малом количестве.

Несмотря на разноречивость и недостаточность сведений в данной области, мы считаем, что длительная гипогидрия вызывает значительное обеднение как внутри-, так и внеклеточных запасов сурфактан-

та. В механизме нарушения синтеза ПАВ вероятно участие снижения активности стимулирующих его ферментов, изменение и ограничение состава липидов и повышенное использование их в ходе нарушения энергетических процессов.

Таблица 2

Показатели состояния сурфактантной системы легких крыс после сухоядения в течение 20 сут (М ± ш)

Серия Контроль п = 7 Контроль п= 11 Сухоядение п= 10

Коэффициент легочной массы 0,65 ± 0,04 0,64 ±0,03** 0,83 ±0,009**

Поверхностное натяжение (мН/м) Статическое с 46,3 ±0,51 47,6± 0,61 49,9 ±0,54***

э 37,2 ±0,51 37,7 ±0,33** 42,7± 1,12***

Максимальное с 53,1 ±0,51 56,0 ±0,75* 58,0 ±0,84***

э 44,1 ±0,75 44,0 ± 0,86** 49,3 ±0,70***

Минимальное с 18,4 ± 0,25* 20,2 ± 0,40 24,1 ±1,38***

э 16,6 ± 0,45 17,0 ±0,31** 19,3 ±0,22***

Индекс стабильности с 0,94 ± 0,01 0,94 ±0,02** 0,83 ±0,03***

э 0,91 ±0,01 0,89 ±0,01 0,87 ±0,02

Коэффициент стабильности 0,96 ±0,01* 0,98 ± 0,002** 0,97± 0,02

Показатель поляризационной микроскопии 22,8 ± 0,26* 17,3 ±0,22** 11,0 ± 0,15***

Примечание: С - смыв; Э - экстракт

*- различия между 1 и 2 группой статически достоверны (р < 0,001); **- различия между 2 и 3 группой статически достоверны (р < 0,001); ***- различия между 1 и 3 группой статически достоверны (р < 0,001).

Сурфактантная система легких и ионизирующее излучение

В наших экспериментах однократное гамма-облучение дозой 10 Гр грудной клетки крыс вызвало снижение их поверхностной активности бронхоальвеолярных смывов и экстрактов легких.

Наши исследования через 21 сут с момента облучения выявили признак уменьшения функциональной активности внеклеточного звена ССЛ - снижение КС пузырьков по Рай1е при больших его различиях между отдельными пузырьками. В то же время снижение ПНстат и ПНмин смыва указывало на некоторое суммарное усиление процесса секреции

ПАВ на поверхность альвеол. Внутриклеточный резерв сурфактанта был снижен и выявлялись ультраструктурные нарушения клеток II типа. Однако можно было наблюдать и некоторую активизацию секреторных структур, выражавшуюся в появлении групп из 3-4 альвеолоци-тов с явными признаками усиления их активности. Начальный фиброз септальной ткани характеризовался скоплением в межклеточных пространствах коллагеновых волокон.

У животных, проживающих после облучения 90 суток, остались все выявленные к концу третьей недели признаки морфофункциональ-ных нарушений ССЛ, исчезли некоторые проявления адаптивной реакции секретирующих клеток и, напротив, более четкими стали нарушения ультраструктуры.

Перекисное окисление липидов и состояние сурфактантной системы легких при повреждающих воздействиях

Одной из задач патофизиологического исследования, естественно, явилось выяснение некоторых существенных механизмов выявленных нарушений ССЛ. Неудивительно, что, прежде всего, наше внимание было обращено на систему фундаментальных общеклеточных процессов, которые закономерно изменяются при стрессовых воздействиях, свободнорадикальных процессов и сопряженной с ними антиокси-дантной защиты. Получение сведений в этой области важно для разработки патогенетических средств восстановительного воздействия на поврежденную ССЛ.

В то же время работ, посвященных систематизированному изучению состояния процессов пероксидации и ферментов антиоксидант-ной защиты при поражениях ССЛ, относительно небольшое число, причем большая часть из них несет черты методической односторонности. То есть исследований, в которых бы последовательно была выявлена активность процессов ПОЛ от первичных продуктов пероксидации до конечных с учетом ферментативной системы АОЗ, нам не встретилось. Мы надеемся, что проведенные нами исследования на моделях поражения ССЛ при голодании, обезвоживании и радиационном воздействии в определенной мере восполняют этот пробел. Выбор названных трех моделей обусловлен тем, что при них наблюдались наиболее четко выраженные морфо-функциональные сдвиги в системе сурфактантов легких.

При голодании, наряду со сдвигами в ССЛ, повышение активности перекисного окисления проявилось в снижении показателя ИХЛ, а также в возрастании концентрации первичных (ДК, р < 0,001)) и вто-

ричных (МДА, р < 0,05) продуктов ПОЛ и протеолиза (СМ, р < 0,01). Одновременно отмечалось возрастание количества некоторых ферментов АОЗ (каталазы и СОД, р < 0.001).

Изменения ПОЛ и АОЗ в легких при обезвоживании организма были еще более значительными, чем при голодании. Произошло увеличение в несколько раз первичных, промежуточных и вторичных продуктов пероксидации. Значительно возросло количество продуктов протеолиза. Это свидетельствовало о нарушении тканевого метаболизма в легких, высокой степени интоксикации. Параллельно отмечена явная активация некоторых ферментов системы АОЗ (церулоплазмина, р < 0,05; каталазы, р < 0,001 и пероксидазы, р < 0,01), не компенсировавшая выявленных нарушений ССЛ. Активность же СОД была значимо (р < 0,05) снижена (как и глютатионредуктазы, р < 0,02).

В наших исследованиях через 21 сут и спустя 90 сут после гамма-облучения отмечено значительное увеличение в бронхоальвеоляр-ном смыве (БАС) концентрации первичных продуктов пероксидации и протеолиза (ДК, р < 0,001 и СМ, р < 0,05). Следует подчеркнуть, что по прошествии трех месяцев после однократного облучения ожидаемого снижения активности процесса пероксидации не происходило, скорее, напротив, проявлялась обратная тенденция. Этому способствовало происходившее с удлинением срока жизни после облучения существенное нарастание концентрации ферментов АОЗ (церулоплазмина, каталазы, пероксидазы, р < 0,001). Увеличение активности СОД на 21 сут свидетельствовало о препятствии избыточному образованию промежуточных продуктов перекисного окисления, в том числе и супероксидного аниона. Видимо, это способствовало удержанию в альвеолах не превосходящей норму концентрации ГПЛ. Итак, с 21 по 90 сут с момента гамма-облучения констатировано поддержание повышенной активности процессов пероксидации в легких с соответственным реактивным усилием функций системы АОЗ.

При сравнении этих трех моделей повреждения ССЛ по всем исследованным критериям состояния легочной ткани, прежде всего, следует отметить, что наиболее выраженные сдвиги показателей морфо-функционального статуса ее сурфактантной системы происходят в случае обезвоживания, несколько меньше - после полного голодания и наименее четкие - вследствие гамма-облучения. Соответственно этому степень активации ПОЛ была наиболее высока также при обезвоживании, менее значимо - после облучения и еще немного ниже - после голодания. Активность системы АОЗ была по большинству ее показателей наиболее высока после гамма-облучения и нарастала в течение трех месяцев. Вероятно, это и обусловливало наибольшую защищенность ССЛ от поражающего действия пероксидации.

Таким образом, выявленная закономерная зависимость тяжести нарушения поверхностно-активных свойств легочной ткани от концентрации продуктов ПОЛ и ферментов системы АОЗ позволяет полагать, что одним из механизмов поражения ССЛ является чрезмерно напряжение свободнорадикальных процессов. Такое предположение подтверждается известными данными о том, что одним из характерных биохимических проявлений стресс-реакции служит усиление именно этих процессов. С другой стороны, все использованные способы поражения сурфактантной системы легких, несомненно, имеют стрессорное действие.

Восстанавливающие воздействия на сурфактаитную систему легких

Применение витамина Е на всем протяжении голодания произвело положительный сдвиг ослабленного внутриклеточного синтеза сур-фактанта. Об этом свидетельствовали показатели ПН и морфологические данные. Действие антиоксиданта на ССЛ было примерно таким же, как и после двухнедельного откармливания. Нормализующее влияние альфа-токоферола и на внеклеточную фракцию ССЛ проявилось только в существенном возрастании коэффициента стабильности по РаШе.

Несмотря на оставшуюся повышенной концентрацию всех продуктов пероксидации, наблюдалось явное уменьшение процессов про-теолиза (СМ, р< 0,001) и значимая активация пероксидазы (р < 0,001).

После введения витамина Е животным на протяжении всего срока обезвоживания особенно сильно возросла активность показателей, характеризующих внутриклеточные резервы сурфактанта, превзойдя даже соответствующие данные контрольных животных. Возрос ИС внеклеточного сурфактанта.

Значительное снижение концентрации всех основных продуктов ПОЛ говорило о торможении их избыточного образования и накопления. Этот процесс протекал с участием выраженной активации системы антирадикальной и антиперекисной защиты - в связи с накоплением ферментов, инактивирующих супероксидный анион, перекиси и гидро-ксильные радикалы.

Таким образом, введение альфа-токоферола оказало не только стабилизирующие действие на липидный бислой альвеолярной мембраны, но и способствовало усиленному синтезу внутриклеточного сурфактанта, а также, возможно, и реутилизации его с поверхности альвеол. Предохраняющее и восстанавливающее действие витамина Е на ССЛ закономерно и объяснимо, так как помимо собственного антиок-

сидантного действия, он способствовал накоплению в легочной ткани ферментов АОЗ.

Профилактическое введение метионина во время голодания способствовала не только восстановлению внеклеточного пула ПАВ, но и оказало выраженное стимулирующее воздействие на синтез сурфактан-та. Достоверных изменений количества продуктов пероксидации выявлено не было. Тем не менее, процессы протеолиза (р < 0,001) восстановились до уровня контрольных показателей. Значительно повысилась активность некоторых ферментов АОЗ. Можно полагать, что интенсивное защитное влияние метионина на ССЛ при голодании, помимо его прямого положительного вмешательства в синтез легочных фосфоли-пидов, в небольшой мере обусловлено и его противодействием усилению пероксидации.

При введении метионина животным во время сухоядения отмечалось усиление синтеза и секреции легочных ПАВ во внеклеточный сектор по сравнению с результатами опытов на крысах, не получавших его. Нормализация этих процессов происходила даже более четко, чем при использовании альфа-токоферола.

Биохимические исследования выявили достоверное снижение первичных и вторичных продуктов пероксидации липидов в БАС животных, получавших на всем протяжении сухоядения метионин. Кроме того, значимо уменьшилось количество токсически активных продуктов протеолиза. Одновременно повысился уровень усиленно расходуемой при обезвоживании СОД(р < 0,001) а также каталазы (р < 0,05) и пероксидазы (р < 0,01).

Таким образом, профилактическое применение метионина при обезвоживании тормозило нарушение ССЛ через многие механизмы, стимулирующие синтез и секрецию и предупреждающие разрушение сурфактанта.

Введение эссенциале при голодании способствовало наиболее убедительно выглядевшему усилению секреции ПАВ на поверхность альвеол за счет мобилизации внутриклеточных резервов сурфактанта. При этом их истощения не происходило, и, напротив того, по данным поляризационной и электронной микроскопии, усиливался внутриклеточный синтез сурфактанта. На изменение количества продуктов ПОЛ существенного влияния эссенциале не оказало, хотя значительно возросла активность таких ферментов АОЗ, как церулоплазмин (р <0,01) и каталаза (р < 0,001). Это в известной мере ограничивало возможность еще большего возрастания интенсивности пероксидации липидов при голодании. По-видимому, все-таки главным механизмом превентивного действия эссенциале на ССЛ в этом случае является его замещающий эффект.

Применение эссенциале на протяжении всего периода сухоядения оказало существенное положительное влияние на состояние активности внеклеточных ПАВ, а также вызвало явное усиление внутриклеточного синтеза сурфактанта. Биохимические показатели отразили значительное снижение первичных и промежуточных продуктов ПОЛ, а также концентрации промежуточных продуктов протеолиза. Очевидно, это связано с активацией ферментов (СОД, церулоплазмина, каталазы, р < 0,001), включающихся в процесс снижения избыточного образования продуктов ПОЛ на ранних стадиях, тормозя накопление супероксидного аниона. Многодневное потребление препарата должно было способствовать созданию резерва фосфолипидов, необходимых для синтеза ПАВ. Действие эссенциале на состояние процессов ПОЛ и АОЗ, как и на поверхностно-активные свойства ССЛ, при 20-суточным сухоядении было более выраженным, чем при четырехсуточном голодании. Очевидно, это связано со значительно большей длительностью его применения в первом случае.

В физиологических условиях синтез фосфолипидов удовлетворяет нормальные потребности, и альвеолоциты II типа содержат их в достаточном количестве. При голодании и сухоядении ослабление биосинтеза фосфолипидов приводит к нарушению функции клеточной оболочки и еще более - митохондрий, которые содержат около 30% фосфолипидов, а также осмиофильных телец (цитофосфолипосом). Входящие в состав эссенциале так называется эссенциальные фосфолипиды (субстанция ЕРЬ) способствуют регенерации поврежденных митохондрий и реактивизируют нарушенные ферментные системы.

Применение микрогидрина при гипотермии привело к усилению секреции легочных сурфактантоа на поверхность альвеол, что отразилось в снижении максимального и минимального поверхностного натяжения (р < 0,001). В бронхо-альвеолярных смывах произошло снижение ДК (р < 0,01), гидроперекисей (р < 0,05), вдвое уменьшилось число средних молекул. Достоверно возросла активность СОД (р < 0,001), церулоплазмина (р < 0,02) и каталазы (р < 0,02).

Таким образом, следует считать доказанной возможность спонтанного восстановления ССЛ, даже после значительного ее повреждения голоданием. Учитывая, что все модели патологии ССЛ были получены путем применения стрессовых воздействий (о чем свидетельствовали, в частности, характерные для стресса сдвиги в системе ПОЛ и АОЗ), можно предполагать участие в механизмах естественного восстановления ССЛ свойственного стрессу начального усиления секреции глюкокортикоидов. Их стимулирующее влияние на секрецию сурфактанта хорошо известно. Возможно также, что секрецию стероидов активизируют и антиоксиданты.

Выводы

1. Общая гипотермия при температуре — 18-20°С в течение 4-5 часов вызывает у крыс снижение поверхностной активности внеклеточного альвеолярного сурфактанта, не изменяя показателей внутриклеточного компонента сурфактантной системы легких (ССЛ).

2. Лишение белых крыс пищи в течение 4 сут без ограничения воды приводит к резкому истощению внутриклеточного компонента сурфактантной системы и к выраженному снижению поверхностно-активных свойств внеклеточной альвеолярной выстилки. Одновременно в ней происходит активация процессов переокисления при напряжении некоторых из ферментативных механизмов антиоксидант-ной защиты. Возобновление нормального питания в течение 2 недель после голодания значительно нормализует состояние ССЛ, особенно ее внутриклеточного резерва, не восстанавливая его до исходных показателей.

3. Лишение крыс на 20 сут воды и влажного корма вызывает значительное снижение поверхностно-активных свойств внутри- и внеклеточных компонентов ССЛ. Одновременно происходит существенное накопление в альвеолах первичных и вторичных продуктов перекисного окисления липидов и протеолиза наряду с признаками усиления системы антиоксидантной защиты.

4. Через 20 сут гамма-облучения грудной клетки крыс дозой 10 Гр выявляются признаки снижения внутриклеточного синтеза сурфактанта при неоднозначных изменениях показателей активности внеклеточной выстилки альвеол. Одновременно нарастала концентрация первичных продуктов ПОЛ. Через 90 сут после облучения наряду с накоплением первичных продуктов ПОЛ и вторичных соединений повышалась активность ферментов антиоксидантной защиты.

5.1. Введение альфа-токоферола: а) при переохлаждении не вызывает изменений состояния ССЛ; б) во время 4-х суточного голодания способствует восстановительным процессам внутриклеточной фракции сурфактанта, ограничивает накопление токсичных продуктов протеолиза, значительно активируя пероксидазу; в) на протяжении 20 сут обезвоживания способствует восстановлению почти всех показателей активности внутриклеточного сурфактанта, мало влияя на его внеклеточную фракцию. Одновременно происходит значительное торможение избыточного накопления продуктов всех этапов ПОЛ на фоне выраженного усиления системы антиоксидантной защиты.

5.2. Введение крысам метионина на протяжении 4-х суточного голодания препятствует снижению активности внеклеточной фракции ССЛ и нарушению синтеза легочных ПАВ. Одновременно происходит уси-

ление системы антиоксидантной защиты и снижение активности про-теолиза. Введение метионина в течение 20 суток сухоядения способствует более выраженной нормализации процессов синтеза сурфак-танта и восстановлению его внеклеточной фракции, чем применение альфа-токоферола. Метионин существенно снижает чрезмерное образование многих продуктов ПОЛ, поддерживая активность антиоксидантной системы.

5.3. Введение эссенциале во время 4-х суточного голодания усиливает секрецию ПАВ во внеклеточную среду, стимулируя накопление некоторых антиоксидантных ферментов. Введение эссенциале на протяжении 20 сут обезвоживания оказывает четко выраженное восстановительное влияние на внутри- и внеклеточные резервы сурфактанта, тормозит образование первичных и промежуточных продуктов ПОЛ и протеолиза, стимулируя активность ферментов первой линии антиоксидантной защиты.

5.4. Введение микрогидрина при переохлаждении привело к усилению поверхностной активности внеклеточного компонента ССЛ и возрастанию активности ферментов антиоксидантной защиты.

Практические рекомендации

Полученные результаты позволяв рекомендовать для клинического испытания по новым показаниям в случаях поражения сурфак-тантной системы легких использование альфа-токоферола, метионина, эссенциале и микрогидрина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Низамутдинова P.P., Коваленко JI.B. Состояние сурфактантной системы легких при переохлаждении // Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере. Сб. материалов Всеросс. научно-практ. конф. Сургут, 2004. - С. 167-169.

2. Низамутдинова P.P. Состояние сурфактантной системы легких при голодании // Медико-биол. и экол. проблемы здоровья человека на Севере. Сб. научн. тр. Вып. 22. - Сургут, 2005. - С. 118-122.

3. Низамутдинова P.P., Коваленко JI.B. Влияние неблагоприятных факторов окружающей среды на сурфактантную систему легких // Научные труды I съезда физиологов СНГ. - Сочи, Дагомыс, 2005. -Т. 2.-С. 239.

4. Низамутдинова P.P. Состояние сурфактантной системы легких при голодании // Мат-лы Всеросс. научно-прак. конф. «Образование, наука, медицина: эколого-экономический аспект», Пенза, 2005. -С. 146-147.

5. Низамутдинова P.P. Состояние сурфактантной системы легких при экстремальных воздействиях на организм // Наука и инновации 21 века: Мат-лы VI откр. окр. конф. молодых ученых. - Сургут, 2006. -С. 166-167.

6. Низамутдинова P.P. Влияние ионизирующего излучения на поверхностно-активные свойства легких беременных крыс и плодов в эксперименте // Сб. материалов II международной науно-прак. конф. «Проблемы демографии, медицины и здоровья населения России: история и современность Пенза, 2006. - С. 104-107.

7. Низамутдинова P.P. Влияние сухоядения на сурфактантную систему легких в эксперименте // Мат-лы конференции «Молодые ученые в медицине». - Казань, 2006. - С. 217.

8. Низамутдинова P.P. Восстановление сурфактантной системы легких после применения повреждающих факторов и стимулирующее воздействие на этот процесс // Наука и инновации 21 века: Мат-лы VII откр. окр. конф. молодых ученых. - Сургут, 2007. - С. 154-156.

9. Низамутдинова P.P. Влияние неблагоприятных факторов окружающей среды на сурфактантную систему легких и возможности ее спонтанного восстановления // Вестник новых медицинских технологий.-2008. - Т. I, № 1. - С. 133-136.

10. Низамутдинова P.P. Состояние перекисного окисления липидов и антиоксидантной активности сурфактантной системы легких при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды // Наука и инновации 21 века: Мат-лы VIII откр. окр. конф. молодых ученых. - Сургут, 2008. - С. 215-217.

Список сокращений

АГБ - аэрогематический барьер

АОЗ - антиоксидантная защита

АССЛ - антисурфактантная система легких

АЦ - альвеолоциты

БАС - бронхоальвеолярный смыв

ДК - диеновые конъюгаты

ДПФХ - дипальмитоилфосфатидилхолина

ИС - индекс стабильности

ихл - индуцированная хемилюминесценция

КС - коэффициент стабильности

лк - коэффициент легочной массы

лс -легочный сурфактант

МДА - малоновый диалъдегид

ПА - поверхностная активность

ПАВ - поверхностно-активные вещества

ПАС - поверхностно-активные свойства

ПН - поверхностное натяжение

пн макс - поверхностное натяжение максимальное

пн мин - поверхностное натяжение минимальное

пн стат - поверхностное натяжение статическое

пол - перекисное окисление липидов

ппм - показатель поляризационной микроскопии

САК - сурфактантный альвеолярный комплекс

сод - супероксиддисмутаза

ссл - сурфактантная система легких

ФЛ - фосфолипиды

ФХ - фосфатидилхояин

Condition of lung's surfactant system under negative influences of environment and ways of its correction

Pulmonary's surfactant is the component of lungs influencing mechanical characteristics of alveoluses. It deficiency may cause a respiratory distress-syndrome of the newborns. As for adults the inactivation of surfactant is accompanied with development of a syndrome of sharp lung damage. Studying of surfactant system of lungs in a healthy organism and under pathogenic influences of an environment is very interesting. Evidences of disorders of surfactant system of lungs in causes of pulmonary diseases are important for theoretical and practical pulmonology.

The aim of the work was the investigating of a condition of surfactant system of lung's in pathogenic for people experimental influences and the analysis of peroxide oxidation of lipids system and antioxidation system taking part in pathogenesis of emergent disorders, and also possible restoration of a functional condition of surfactant system of lung's.

The general overcooling, starvation, dry food and influence of gamma irradiation were used as experimental models in rats. It is proved that the general hypothermia of rats led to decrease in superficial activity of extracellular surface of surfactant, and endocellular reserves didr t change. Starvation of rats during four days sharply depleted endo- and extracellular reserves of surfactant. Simultaneously an activation of peroxide oxidation of lipids and overstrain of the some mechanisms of antioxidation protection were determined in surfactant system of lungs. Renewal of a normal nutrition during two weeks after starvation normalized a condition of surfactant system of lungs. Deprivation of water and a damp forage during 20 days reduced endo- and extracellular reserves of surfactant of rats. At the same time an accumulation of primary and by-products of peroxide oxidation of lipids and proteolisis in alveoluses were caused. Gamma irradiation of a thorax of rats was accompanied with as intensification of antioxidation system of protection, as decreasing of endocellular generation of surfactant.

Opportunities of spontaneous regeneration of 1 surfactant system of lungs after experimental pathogenic influences were found during our investigation. Safe and unxenogetic drugs, such as vitamin E (a-tocopherol), mi-crogidrin, methionine, essenciale, accelerate the process of regeneration of surfactant system of lungs.

НИЗАМУТДИНОВА РАМЗИЯ РАШИДОВНА

СОСТОЯНИЕ СУРФАКТАНТНОЙ СИСТЕМЫ ЛЕГКИХ ПРИ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ И СПОСОБЫ ЕЕ КОРРЕКЦИИ

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 5.11.2008 г. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,4. Уч.-изд. л. 1,25. Тираж 100. Заказ № 144.

Оригинал-макет подготовлен в редакционно-издательском отделе издательского центра СурГУ. Тел. (3462) 23-25-75.

Отпечатано в полиграфическом отделе издательского центра СурГУ. г. Сургут, ул. Лермонтова, 5. Тел. (3462) 32-33-06.

ГОУ ВПО «Сургутский государственный университет ХМАО - Югры» 628400, Россия, Ханты-Мансийский автономный округ, г. Сургут, пр. Ленина, 1. Тел. (3462) 76-29-00, факс (3462) 76-29-29.