Автореферат и диссертация по медицине (14.00.13) на тему:Состояние системы антиоксидантной защиты при диабетических поражениях нервной системы (клинико-экспериментальное исследование)

На правах рукописи

ГРИГОРЕНКО ГРИГОРИЙ АНАТОЛЬЕВИЧ

СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ ПРИ ДИАБЕТИЧЕСКИХ ПОРАЖЕНИЯХ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

(КЛИНИКО-ЭКСНЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.00.13- нервные болезни 14.00.16- патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена на кафедре неврологии и нейрохирургии и кафедре

патофизиологии Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета имени академика И.П.Павлова

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Тарас Александрович Скоромец доктор медицинских наук, профессор Светлана Алексеевна Шестакова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Мария Лазаревна Чухловина доктор медицинских наук, профессор Валентин Иванович Николаев

Ведущее учреждение : Российская Военно-медицинская академия

Защита состоится "_/р " декабря 2004 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 208.080.06 при СПбГМУ им.акад И.П.Павлова (197022,Санкт-Петербург улица Льва Толстого, 6/8)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Санкт-Петербургского Государственного медицинского Университета им. акад. И.П.Павлова.

Автореферат разослан " " ноября 2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Михаил Дмитриевич Дидур

POO 6 -ч 3/9

Актуальность проблемы

Прогрессирующий рост заболеваемости сахарным диабетом (количество больных достигает по данным ВОЗ 1-4% от всей популяции) и его осложнений ставит исследование последних в центр внимания специалистов различного профиля. Поражение нервной системы (периферических нервов, автономной нервной системы, центральной нервной системы) является частым осложнением сахарного диабета(СД), приводящим к ранней инвалидизации. В связи с этим исследование механизмов неврологических осложнений при СД и разработка новых способов их лечения и профилактики приобретают особую актуальность.

Одним из ключевых звеньев в патогенезе СД и его неврологических осложнений является окислительный стресс, формирующийся на основе прооксидантно - антиоксидантного дисбаланса в клетках и тканях организма. При СД гипергликемия индуцирует образование свободных радикалов за счет ускорения аутоокисления глюкозы, неферментативного гликозилирования белков и T.fl.(Williamson J.R. et. al., 1993;Sima A.F. et al.1999 и др.). Образующиеся в этих процессах высокореактогенные кислородсодержащие свободные радикалы вызывают интенсификацию процессов пероксидации лилидов и белков с образованием токсичных продуктов.

В клинических и экспериментальных исследованиях отечественных (Скоромец А. А. и соавт.,1993; Балаболкин М.И.,1994; Корчин В.И. 1994; Бобырева JI.E.1996, Баранцевич Е.Р. 2000 и др.) и зарубежных авторов (Cameron N.E.,1996; Fuller C.J. 1996; A.Vinick, 2003 и др.) показано важное патогенетическое значение повышения уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ) и снижения некоторых компонентов системы антиоксидантной защиты (САЗ) нервной ткани в развитии ее поражений при С Д. Однако структура системы САЗ, роль огдельных ее компонентов и последовательность их нарушений при формировании окислительных повреждений нервной ткани остаются неясными.

В связи с концепцией окислительного стресса наряду с лечебными средствами, направленными на достижение эугликемии при сахарном диабете, является логичным использование препаратов, воздействующих на патогенетические процессы в нервной ткани с целью их коррекции и профилактики. Протективный эффект наблюдается у некоторых препаратов антиоксидантного, метаболического действия (а-токоферол, никотинамид, а- липоевая кислота). Отмечены в разной степени выраженное улучшение невральной проводимости, уменьшение явлений внутриневральной гипоксии, уменьшение интенсивности ПОЛ (Дедов И.И и соавт. 1992; Балаболкин М.И. 1998; Packer L.et al. 1995; Cameron N.E.,1996) Представляется, что в условиях необходимости проведения длительной (практически в течение всей жизни) терапии диабетических поражений

нервной системы перспективным является

лечения и профилактики с включением в комплексную терапию препаратов антиоксидантного действия.

Научная новизна

Проведено параллельное комплексное исследование функциональных, метаболических и ультраструктурных показателей периферического и центральной^ головнйй мозг) отделов нервной системы в динамике развития и течения экспериментального сахарного диабета(СД).

Выявлены нарушения нервной ткани в обоих отделах нервной системы уже в ранние сроки (30 сут) заболевания и их прогрессирование в соответствии с продолжительностью СД.

Установлена последовательность развивающегося при СД дефицита ферментативных и неферментативных компонентов САЗ и их роль в формировании антиоксидантной недостаточности в ткани головного мозга.

Показано, что уменьшение буферной емкости САЗ, особенно в более поздние сроки СД(90сут), обусловливает прогрессирующую интенсификацию ПОЛ и формирование окислительного стресса в нервной ткани. У больных с диабетической невропатией в тромбоцитах, исследованных в качестве модели нейрона, выявлены значительное снижение антиоксидантной защиты и интенсификация ПОЛ.

Показано положительное влияние введения препарата а- липоевой кислоты (эспа-липон) на ферментативное и неферментативное звенья САЗ на уровне нервной ткани и тромбоцитов в эксперименте и клинике.

Цель исследования

Улучшить эффективность лечения больных с неврологическими проявлениями сахарного диабета типа 1, воздействуя на патогенетические механизмы, связанные состоянием системы антиоксидантной защиты и процессами перекисного окисления липидов в нервной ткани с помощью а--липоевой кислоты (а-Ж).

Задачи исследования

1.Изучить состояние ферментативных компонентов(активность супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы), неферментативных компонентов (антирадикальная активность) системы антиоксидантной защиты и интенсивность перекисного окисления липидов в ткани головного мозга крыс с аллоксановым диабетом длительностью 30,60 и 90 сут.

2. Исследовать функциональную активность периферических нервов(по электрофизиологическим показателям) и поведенческие реакции крыс в динамике течения СД.

3.Выявить влияние а-ЛК на состояние компонентов САЗ и интенсивность ПОЛ в гомогенатах головного мозга, функциональную активность периферических нервов и поведенческие реакции крыс в динамике течения СД.

4.0пределить состояние компонентов САЗ и интенсивность процессов ПОЛ в тромбоцитах у больных диабетической невропатией.

5.Оценить влияние а-ЛК на состояние вибрационной чувствительности и электрофизиологические показатели функции периферических нервов у больных с неврологическими проявлениями СД.

б.Выявить влияние а-ЛК на состояние компонентов САЗ и интенсивность ПОЛ в тромбоцтах больных с диабетической невропатией.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Полученные результаты уточняют представления о патогенезе неврологических расстройств при СД , в частности о роли снижения САЗ в формировании

На экспериментальной модели СД и в клинических исследованиях показано, что снижение резерва САЗ и интенсификация ПОЛ возникают на ранних сроках развития сахарного диабета и сочетаются с нарушениями периферических нервов и ЦНС.

Это является обоснованием раннего начала лечения препаратом а-ЛК с целью профилактики прогрессировать неврологических осложнений, как на доклинической стадии, так и при выраженных диабетических неврологических синдромах.

Данные об изменении антиоксидантного статуса тромбоцитов у больных диабетической полиневропатией позволяет использовать определения САЗ в тромбоцитах для контроля за эффективностью проводимой терапии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1.При экспериментальном аллоксановом сахарном диабете параллельно с увеличением срока заболевания происходит прогрессирующее снижение антиоксидантного резерва в нервной ткани в основном за счет развивающегося дефицита активности супероксидисмутазы, глутатионяероксидазы и неферментативных компонентов САЗ. Это обусловливает прогрессирующую интенсификацию процессов ПОЛ в нервной ткани.

2.Введение а-ЛК (эспа-липон) животным с СД (100 мг/кг в течение 30 сут) оказывает положительный эффект, повышая антиоксидантный резерв и снижая интенсивность ПОЛ в ткани головного мозга.

3.Повышение антиоксидантного резерва и снижение ПОЛ в нервной ткани под влиянием а-ЛК (эспа-липон) животным с СД улучшает функциональное состояние периферического отдела (увеличивается скорость распространения возбуждения по периферическим нервам, возрастает длительность и амплитуда потенциала двигательных единиц мышц) и центрального отдела нервной системы (улучшение поведенческие реакции у животных).

4.У больных с диабетической невропатией снижается буферная емкость системы антиоксидантной защиты в тромбоцитах как за счет ферментативных, так и неферментативных компонентов, что сопровождается активизацией процессов ПОЛ.

5. а-ЛК (эспа-липон) в дозе бООмг/сут оказывает положительное влияние на состояние ферментативного и неферментативного звеньев САЗ и снижает интенсивность ПОЛ в тромбоцитах больных с диабетической невропатией.

6.Проведение курса лечения а-ЛК (эспа-липон) у больных с диабетической невропатией увеличивает скорость распространения возбуждения по периферическим нервам (преимущественно по чувствительным) и улучшает вибрационную чувствительность

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ Результаты исследования внедрены в практическую работу городской многопрофильной больницы N 2 Санкт-Петербурга, клинике нервных болезней СПбГМУ имени академика И. П. Павлова. Данные о патогенезе неврологических расстройств и их коррекции а-ЛК при сахарном диабете внедрены в учебный процесс кафедры неврологии и нейрохирургии, кафедры патофизиологии СПбГМУ имени академика И. П. Павлова.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ Материалы выполненного исследования представлены в виде докладов и обсуждены на. Международной конференции

«Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 1999), Российской конференции «Актуальные вопросы эндокринологии» (Санкт-Петербург, 2000), Четвертом всероссийского конгресса эндокринологов, (Санкт-Петербург 2001), Третьем Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем» (экспериментальная и клиническая патофизиология) (Москва,2004).

По теме диссертации опубликовано 14 работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на /26 страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков и 11 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований (5 глав), общего заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 98 отечественных и /Гриностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Работа содержит экспериментальный и клинический разделы. Экспериментальные исследования выполнены на 120 белых половозрелых нелинейных крысах-самцах массой 180-240г (питомник «Рапполово», Ленинградская обл.). Крысы содержались в виварии в стандартных условиях с соблюдением всех гигиенических нормативов. Эксперименты ставили в течение всего года в первую половину дня.

Аллоксановый диабет (АД) воспроизводили путем однократного подкожного введения крысам 5% водного раствора аллоксана в диабетогенной дозе 150-180 мг/кг. В работе исследовали животных с хронической формой СД продолжительностью 30, 60 и 90 сут от момента

введения аллоксана. Также изучали серию животных с сахарным диабетом сроком 60 сут, которым вводили а- ЛК (эспа-липон) внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг в течение 30 сут.

Уровень гликемии контролировали еженедельно с помощью глюкометра (Глюкотренд®, Рош Диагностика, Швейцария). Одновременно определяли массу тела животных, оценивали их внешний вид, опрятность. Перед опытом дополнительно определяли содержание в моче глюкозы с помощью стандартных полосок-тестов фирмы «Lachema» (Чехия).

Электрофизиологические_исследования проводили у

анестезированных эфирным наркозом животных. Для оценки тяжести поражения структур периферической нервной системы проводили элекгронейромиографию (ЭНМГ) периферических нервов, игольчатую электромиографию мышц (ЭМГ) конечностей. Исследование осуществляли с помощью 4-х канального электромиографа фирмы « Медикор » (Венгрия). Для проведения стимуляционной ЭНМГ периферических нервов в m.extensor digitorum на задней лапе и на передней лапе - в ш. abductor digitiorum вводили биполярные концентрические игольчатые электроды. Проводили супрамаксимальную стимуляцию электрическим током с прямоугольными импульсами длительностью 1 мс и частотой 2 Гц. Максимальная амплитуда М-ответа достигалась стимуляцией с интенсивностью 130 % от максимальной силы раздражения. Максимальной считается такая интенсивность возбуждения, при которой возбуждается 100% волокон исследуемого периферического нерва и при последующем увеличении интенсивности стимуляции не происходит увеличения амплитуды М-ответа. На уровне olecranon и на уровне os pisiforme в передние лапы крыс вводили игольчатый регистрирующий электрод для исследования скорости распространения возбуждения (СРВ) по локтевому нерву. При исследовании СРВ по малоберцовому нерву игольчатый регистрирующий электрод вводили снаружи в области incisura poplítea и в области проекции malleolus lateralis. Регистрировали М-ответы мышц передних и задних лап.

Для проведения ЭМГ использовали игольчатые биполярные электроды в виде полой иглы диаметром 0,5 мм. Электроды помещали в область двигательных точек исследуемых мышц. С помощью этого обследования оценивали в покое параметры потенциалов двигательных единиц (ПДЕ) m. gluteus, т. bieeps femoris, m.tibialis anterior, ш. delloideus, m.biceps brachii.

Поведенческие реакции у крыс с аллоксановым диабетом изучали по двигательной реакции на болевое воздействие (ДРБВ) в тесте "горячая пластина" (t° = 57° С) по величине латентного периода первой двигательной реакции (отдергивание лапы или ее облизывание).

Общую двигательную активность (ОДА) и ориентировочно-познавательную активность (ОПА) крыс, находившихся в свободном поведении в замкнутом отсеке (в камерах размерами 25x35 см), регистрировали с помощью актометра соответственно по количеству

горизонтальных движений и вертикальных стоек животных. Определение проводили в течение пяти дней подряд.

Биохимические методы исследования

Извлеченный после декапитации крыс головной мозг помещали в охлажденную (+4° С) чашку Петри и выделяли передние участки коры головного мозга (фронтопариетальные отделы). Выделенные участки помещали в охлажденный гомогенизатор, в котором приготовляли 10% гомогенат (в качестве растворителя использовали охлажденный фосфатный буфер рН=7,4),

В гомогенатах фронтопариетальных отделов мозга определяли содержание малонового диальдегида (МДА) - вторичного продукта ПОЛ. Измерение осуществляли спектрофотометрически в тесте с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Гаврилов В.Б., Гаврилова А.Р.,1987)и выражали в нмоль МДА/мг липидов. Для определения уровня МДА в тромбоцитах производили следующие манипуляции: цитратную кровь (1:9), взятую из кубитальной вены в силиконированную пробирку, центрифугировали при 1000 об/мин 10 мин, получая таким образом обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП). Далее для определения МДА производили центрифугирование ОТП при 3000 об/мин в течение 10 мин, полученный осадок ресуспензировали в трис-НС1-буфере (рН 7.47). Измерение МДА проводили описанным способом.

Общие липиды определяли фосфорно-ванилиновым методом с использованием стандартного набора реактивов (Bio-latest, Chemapol, Чехия).

Измерение активности супероксидцисмутазы осуществляли в СФ-46 по угнетению реакции окисления кверцетина (В.А. Костюк и соавт.,1990)и выражали в условных единицах активности измерения (за единицу активности принимали угнетение реакции на 50%)за 1мин на 1 мг белка . Для определения активности СОД в тромбоцитах ОТП центрифугировали трижды при 2000 об/мин, по 10 минут отмывая в трис-НС1-буфере с глюкозой, ЭДТА и NaCl, затем осадок ресуспензировали в трис-НС1-буфере, трижды замораживали пробу при - 20°С и оттаивали при 37 °С. После этого производили измерение активности СОД описанным методом.

Активность глутатионпероксидазы в гомогенатах мозга определяли с использованием глутатионредуктазы по убыли НАДФН в ходе кинетической реакции разложения перекиси водорода по изменению оптической плотности за 5 минут при длине волны 340 нм. Активность глутатионредуктазы определяли по уменьшению содержания НАДФН в реакции восстановления окисленного глутатиона, регистрируя оптическую плотность проб при длине волны 340нм (Beutler ,1975). Результаты выражали в мкмоль/мин/мг белка Белок определяли по Lowry et al. (1951).

Антирадикальную активность в гомогенатах мозга и тромбоцшах определяли (Glavind,1963)no изменению оптической плотности раствора устойчивого свободного радикала дифенилпикрилгидразила(ДФПГ) после

добавления к нему антиоксиданта при длине волны 517 нм (Glavind,1963). Результаты выражали в мкэкв/г ткани и мкэкв/мг белка соответственно.

Определение уровня окисленного и восстановленного глутатиона в тромбоцитах проводили по цветной реакции с хлорпромазином в присутствии ионов палладия (Lee Kum-Tatt,Tat It-Koon,! 974).Результат выражали в мкмоль/мг белка.

Для электронной микроскопии кусочки ткани бедренного нерва помещали в фиксатор Карновского (смесь 2,5% глютаральдегида и 1,6% формальдегида свежеприготовленного из параформа, на 0,2 М фосфатном буфере, pH = 7,4).Через 2-3 мин после декапитации животного кусочки измельчали до размеров 1-2 куб.мм и перемещали в свежую порцию фиксирующего раствора, в котором выдерживали 2 часа при комнатной температуре. Затем материал промывали в нескольких сменах 0,2 М фосфатного буфера pH 7,4. Проводили дополнительную фиксацию 1,0% раствором тетроксида осмия на том же буфере и, после обезвоживания в этаноле заливали в аралдит. Ультратонкие срезы после двойного контрастирования 3,0% уранилацетатом в 70% этаноле, и цитратом свинца по Рейнольдсу просматривали и фотографировали на электронном микроскопе "Jem - 100В".

В клинических исследованиях использовали материал, полученный у 56 больных сахарным диабетом 1 типа с дисталыюй симметричной сенсорно-моторной полиневропатией, находящихся на стационарном лечении в отделении эндокринологии городской больницы№2, эндокринологическом отделении клиники факультетской терапии СПбГМУ им. акад.И.П.Павлова и 20 практически здоровых доноров(контрольная группа). Всем больным проводилось с гандартное неврологическое обследование, биохимические исследования (определение уровня гликемии, глюкозурии, гликированного гемоглобина). Определение вибрационной чувствительности проводили с помощью градуированного камертона Riedel Seifert (128 Гц). Снижением вибрационной чувствительности считали порог вибрационной чувствительности менее 6 условных единиц.. Для количественной характеристики проявлений диабетической полиневропатии использовали специальные шкалы. Субъективные жалобы пациентов оценивали по шкале TSS (Total Symptoms Score) (Ziegler D. et. al.,1995), оценку объективных признаков проводили по шкале NDS (Neuropathy Disability Score) (Young M.J.,1986)).

Объективная оценка состояния соматической нервной системы проводилась на приборе для электронейромиографии "Viking-IV" фирмы "Nicolet" (USA). В основе метода лежит применение электрической стимуляции нервного ствола с последующей регистрацией и анализом вызванных потенциалов, отводимых с иннервируемых мышц или непосредственно с самого нервного ствола. Нейромиография проводилась в

горизонтальном положении больного, в помещении с постоянной температурой 25±2° С.

Для исследования скоростей распространения возбуждения по чувствительным волокнам и двигательным (проксимальным и дистальным отделам) периферических нервов проводилась стимуляция п. peroneus superficialis, п. suralis, п. peroneus, п. medianus.

Также изучали состояние ферментативного и неферментативного звена САЗ и интенсивность ПОЛ в тромбоцитах по описанным выше методам. Наряду с инсулинотерапией больные получали курс лечения а- ЛК (эспа-липон) внутривенно капельно в дозе 600 мг/сут в течение 14 сут,а затем per os в той же дозе в течение 60 сут.

Результаты исследования обработаны на персональном компьютере IBM PC с использованием пакета прикладных программ Windows ХР

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

При проведении игольчатой ЭМГ перечисленных в методике мышц было выявлено снижение амплитуды и уменьшение длительности потенциалов двигательных единиц (ПДЕ) относительно контрольных значений. В контроле амплитуда ПДЕ была 0,63±0,14 мВ, длительность ПДЕ 7,2±0,67 мсек (рис.1). Снижение амплитуд ПДЕ и уменьшение длительности ПДЕ было тем значительнее, чем дольше был сахарный диабет. Патологической мышечной активности в исследованных мышцах не наблюдалось. При проведении стимуляционных проб правого и левого n.peroneus и п. ulnaris выявлено значительное снижение амплитуды М-ответа до 0,2±0,08 мВ при длительном сахарном диабете, до 0,6± 0, 27 мВ - на ранних сроках сахарного диабета (рис.2) (при нормальных показателях амплитуды М-ответа = 1,5±0,23 мВ).

Скорость распространения возбуждения по периферическим нервам при экспериментальном СД также значительно снижалась. При СД сроком 30 сут этот показатель снижался до 20,0±3,4 м/с, при СД сроком 90 сут -до 18,5±2,9 м/с (контрольные показатели скорости проведения для крыс составляли 28,4±3,1м/с).

Таким образом, скорость распространения возбуждения по периферическим нервам снизилась на 35% на позднем сроке экспериментального СД. В целом можно было говорить о развитии у крыс уже на ранних сроках экспериментального СД признаков хронической аксонально-демиелинизирующей полиневропатии с преобладанием аксональной полиневропатии. В мышцах развивались изменения миопатического характера. На более поздних сроках развития СД возникающие изменения становились еще более выраженными.

□Амплитуда ПДЕ (мВ) ■Длительность ПДЕ (мсек)

Контроль СД 30 сут СД 90 сут СД

+альфа-лилоевая к-та

Рис. 1 Амплитуда и длительность потенциалов двигательных единиц мышц крыс с экспериментальным сахарным диабетом на разных сроках развития

* - р < 0,05 " - р< 0,001

л- р < 0,05 по сравнению с группой животных с СД 90 сут

Рис.2 Скорость распространения возбуждения по периферическим нервам и амплитуда М-ответа у крыс в динамике течения экспериментального сахарного диабета.

* - р < 0,05 •*-р< 0,01 Л- р < 0,05

лл -р< 0,01 по сравнению с 1-руппой животных с СД 90 сут

Данные определения двигательной реакции на болевое раздражение в тесте «горячая пластина» у крыс в динамике течения СД выявили увеличение латентного периода реакции на болевое раздражение. У контрольных животных величина латентного периода болевой реакции в среднем составила 5,86+ 0,55 с. Латентный период у крыс с СД продолжительностью 60 сут был достоверно большим, чем в контрольной группе (р<0,01). У животнных с СД продолжительностью 90 сут также отмечалось увеличение латентного периода по сравнению с его величиной в группе одновозрастного контроля (р<0,01). При этом определяемый показатель увеличивался пропорционально длительности течения диабета (р<0,05). При электронной микроскопии в ткани периферической нервной системы (бедренный нерв) крыс при развитии экспериментального СД уже в ранние сроки (через 14 сут после его возникновения) были обнаружены патологические изменения миелиновых оболочек аксонов нервных клеток, усиливающиеся на более поздних сроках существования СД. В самих аксонах обнаруживались признаки их частичного повреждения и только в более отдаленные сроки развития СД. В сосудах периневрия через 60 сут после развития СД были обнаружены выраженные изменения, что совпадает с представлениями о возникновении при экспериментальном СД уплотнения базальных мембран сосудов периневрия, наличия спавшихся капилляров, возникновения внутрисосудистых микротромбов.

Результаты исследования общей двигательной активности и ориентировочно-познавательной активности выявили у крыс с СД различной продолжительности (60 и 90 сут) статистически достоверное снижено по сравнению с контрольной группой (р<0,01). Сопоставление данных, полученных у крыс с СД 60 сут и 90 сут, свидетельствовало о том, что с увеличением продолжительности заболевания уменьшалось количество вертикальных стоек у крыс (р<0,01). При анализе горизонтальных движений в те же сроки СД (60 и 90 сут) различия оказались статистически недостоверными (р>0,05). Следовательно, продолжительность СД оказывала влияние на изменение (снижение) ориентировочно-познавательной активности.

Результаты исследования состояния компонентов САЗ и ПОЛ в ткани головного мозга крыс в динамике течения экспериментального СД представлены в таблице 1.

Через месяц после введения аллоксана у крыс с выраженной гипергликемией уровень МДА в ткани головного мозга был значительно выше, чем у контрольных животных, прогрессирующе повышался в более поздние сроки заболевания и составил на 90 сут (1,72 + 0,09 нмоль/мг липидов, р<0,001). Через 30 сут после введения аллоксана у крыс с выраженной гипергликемией активность СОД несколько повышалась, что, вероятно, отражает компенсаторный ответ. У крыс с СД 60 сут отмечалось падение активности СОД (р<0,01), которое было еще более выражено на 90 сут СД (5,9 ± 0,67 усл.ед./мг белка, р<0,001).

Активность глутатионредуктазы (ГР) у крыс с СД длительностью 30 сут значимо снижалась по сравнению с контрольной группой (7,69±0,45, в контроле —11,55±1,13 мкмоль НАДФН/мин/мг белка; р< 0,05). Снижение прогрессировало к 90-м суткам течения СД(7,48±0,54 мкмоль НАДФН/мин/мг белка; р< 0,05).

Активность глутатионпероксидазы (ГП) у крыс с СД длительностью 30 сут статистически достоверно не отличались от таковой в контроле. Однако через 90 сут после введения аллоксана активность фермента значимо снижалась( 0,83±0,07, в контроле -1,41 ±0,18 мкмоль НАДН/мин/мг белка ; р< 0,05).

Исследования неферментативного звена САЗ нервной ткани оценивали по состоянию антирадикальной активности. У животных с СД 30 сут отмечалась тенденция к повышению атирадикальной активности, которая затем снижалось до уровня контрольных величин и только на сроке 90 сут была достоверно ниже ( 0,28±0,06;р<0,01) по сравнению с контролем.

Для изучения возможности коррекции выявленных нарушений в системе антиоксидантной защиты и проявлений диабетической невропатии нами был проведен курс введения крысам с СД сроком 60 сут а- ЛК в течение 1 месяца. Группу сравнения составили животные с длительностью сахарного диабета 90 сут, не получавшие а- ЛК.

Введение а- ЛК оказало выраженное положительное действие на динамику осложнений со стороны нервной системы у животных, проявившееся в улучшении электрофизиологических показателей, по сравнению с животными, не получавшими лечения. Амплитуда ПДЕ возросла почти в 2 раза, также выросла длительность ПДЕ (рис.1). Скорость распространения возбуждения достоверно увеличилась на 30% по сравнению с нелеченными животными, а амплитуда М-ответа увеличилась примерно в 2,5 раза, (рис.2). У крыс, леченных а- ЛК статистически достоверных отличий в величине латентного периода двигательной реакции на болевое раздражение не обнаружено. Однако а- ЛК оказала статистически значимое влияние на ОПА животных, о чем свидетельствовало изменение числа вертикальных стоек (р<0,01).

Введение крысам с СД 60 сут а- Ж оказало положительное действие на активность и состояние компонентов САЗ нервной ткани (табл.1 ).

Так, отмечалась положительная динамика в виде значимого уменьшения интенсивности ПОЛ - снижение уровня МДА в 2 раза по сравнению с контролем.

Изменение ферментативного звена системы антиоксидантной защиты было наиболее заметно в отношении роста активности СОД у леченных альфа-липоевой кислотой крыс по сравнению с нелечеными и в меньшей степени в активности ГП.

Таблица 1

Показатели состояния компонентов системы антиоксидантной защиты и перекисного окисления липидов в ткани мозга у крыс в динамике экспериментального

"•«^Группы животных Показатели Контроль (n-lS) Сахарный диабет, 30 суток (1Г-24) Сахарный диабет 60 суток (л-22> Сахарный диабс], 90 суток (п-20) Введение альфа-лнпосвой кислотой (л—IS)

МДА.нмоль/мг липидов 0,89 ±0,05 1,12*0 07" ! 31*0,07*** 1 72±009*** 0 63*0,06* АА

СОД, уел ел/мин/ мг 12,1+081 13 9±0,38 11 65*0,67« 6,3*0,42"* 11 06*0,73АА

АРА, чюкв/r ткани 0,74*0,22 0.95*0,18 0 75±0,П 0Д»*0,06»* 1,02*0,28 АА

ГПмкмоль/мин/мг белка 1,41*0,18 1,40*0,13 1,15*0,16 1 0,83*0,07* 1,1*0,12л

ГР мкмоль/мин/мг белка 11,55*1,13 7 69*0,45* 7,58*0,67* 7,48*0,54* 7,65*0,82

* - р < 0,05

**-р<0,01 ***-р<0,001

л- р < 0,05 лл -р< 0,01

ААЛ-р< 0,001 по сравнению с группой животных с СД 90 сут

Так, отмечалась положительная динамика в виде значимого уменьшения интенсивности ПОЛ ( снижение уровня МДА - в 2 раза по сравнению с контролем.

Изменение ферментативного звена системы антиоксидантной защиты было наиболее заметно в отношении роста активности СОД у леченных альфа-липоевой кислотой крыс по сравнению с нелечеными и в меньшей степени в активности ГП.

Одновременно выявлена у леченных альфа-липоевой кислотой живошых активация неферментного звена САЗ - значимо возросла АРА в ткани головного мозга по сравнению с нелечеными животными(табл. 1). Окислительный стресс является одним из ключевых патогенетических звеньев в развитии осложнений сахарного диабета, в частности со стороны нервной системы. Выявленная нами динамика изменения активности ферментативного и неферментного звена САЗ ткани головного мозга при экспериментальном СД отражает различные их адаптационные возможности в ответ на активацию окислительного стресса в условиях хронической гипергликемии.

Таким образом, исследования на животных с экспериментальным аллоксановым диабетом демонстрируют поражение периферического и центрального отделов нервной системы. Поражение периферических нервов,

верифицированное электрофизиологическим исследованием их функции (снижение скорости распространения возбуждения, амплитуды и длительности ПДЕ) и ультраструктурными изменениями в них, в целом эквивалентными описанным у больных с диабетической невропатией. Поражение центрального отдела нервной системы-головного мозга, проявлялась прогрессирующим снижением антиоксидантного резерва и параллельным усилением интенсификации ПОЛ в ткани головного мозга, приводящими к формированию окислительного стресса в значительной степени обусловливающими нарушение паттернов поведения животных (снижение ориентировочно-познавательной деятельности, повышения порога болевой чувствительности к повышенной температуре). Длительное введение животным а- ЛК оказало значительный положительный эффект на исследуемые параметры в обоих отделах нервной системы, хотя они и не достигли контрольных значений.

Клинические исследования

Характеристика обследованных групп больных СД 1 типа с диабетической невропатией

В группу обследованных больных пациентов вошли 56 больных СД 1 типа в возрасте от 18 до 51 года, женщин - 32, мужчин - 24; Средний возраст больных 36,5 * 4,8 лет, контрольную группу составили 20 практически здоровых доноров в возрасте от 19 до 32(средний возраст25,3±3,7 лет).

Больные были скомпенсированы по схеме интенсивной инсулинотерапии -среднесутоточная доза инсулина 31,7± 7,4 МЕ. Давшхмь заболевания больных СД колебалась от 2-х до 24-х лет( в среднем 16,1 ± 5,8 лет). Высокая степень гипергликемии отмечалась у 14 больных, 33 человека имели среднюю степень гипергликемии, 9 человек - невысокую (по показателям гликозилированного гемоглобина и с учетом суточных колебаний гликемии во время курса лечения). Склонность к эпизодам гипогликемии отмечалась у 8 пациентов.

У 46(81% от общего числа обследованных) пациентов были характерные жалобы на боли в кистях и стопах, чувство «жжения» рук и/или ног 21 (37,5%), чувство «онемения» ног-31(55,4%) ощущение "ползания мурашек" в кистях и/или стопах 21(37,5%), усталость в голенях и стопах при продолжительной физической нагрузке -36(57,1%).

При неврологическом осмотре различные нарушения трофики кожи имелись у 33-х пациентов(58,9%), умеренная слабость и атрофия мышц дистальных отделов нижних конечностей - у 4 (7,1%), понижение рефлексов с двуглавой мышцы плеча - у 5 (8,9%), с трехглавой мышцы плеча - у 6 (10,7%), карпорадиальных - у 7 (12,5%), коленных - у 27 (48,2%), ахилловых - у 36 (64,2%). Снижение болевой чувствительности в дистальных отделах конечностей было выявлено у 40 (71,4%) человек. Вибрационная чувствительность на уровне лучезапястного сустава была снижена в 12

(21,4%) случаях, на уровне лодыжки в 46 (85,7%). Выявленные симптомы позволяли говорить о наличии у больных симметричной дистальной сенсорно-моторной полиневропатии. (Табл. 2)

Больные наблюдались в течение 3-х месяцев с момента назначения препарата. Для количественной оценки субъективных проявлений диабетической полиневропатии использовали шкалу TSS (Total Symptoms Score), оценку объективных признаков проводили по шкале NDS (Neuropathy Disability Score)

Таблица 2

Динамика числа пациентов, предъявляющих жалобы и объективные проявления ДПН на фоне лечения а-липоевой кислотой

(эспа-липон)

До После После

Показатель начала внутривенного перорального

лечения курса а-ЛК курса а-ЛК

(эспа-липон). (эспа-липон).

Жалобы ,(■■)

боли 46 17 8

парестезии 36 18 8

онемение 31 18 6

жжение 21 14 5

Чувствительность, (п)

1 болевая 40 26 9

| температурная 14 8 3

1 вибрационная 46 27 14

1 тактильная 4 3 2

|мышечно-суставное чувство 5 4 2

Рефлексы -(и)

| карпорадиальиый 7 6 4

1 бицепс 5 4 2

|трицепс 6 5 3

, коленные 24 19 12

1 ахилловы 40 31 24

Мышечная слабость, (п) 5 2 1

Вибрационная чувствительность,

усл.ед 3,7±0,82 4,8±0,58* 5Д±0,61»

Правая нога 3,9=0,64 4,0X0,70* 5,1 +0,78*

Левая нога

Т55, баллы 8,83 ±0,52 6 19=Н>,27* 4,21±0,35**

N05,баллы 12,34±0Д5 Ю,29±0,51* 8,05±0.44"

n-количество пациентов **-р<0,01* - р<0,05

Результаты тестирования компонентов САЗ и ПОЛ представлены в табл.3 Как видно из табл.3 .выявлено достоверное увеличение более чем в 3 раза уровня МДА в тромбоцитах у больных с диабетической невропатией, свидетельствующее о повышении интенсивности ПОЛ. Одновременно обнаружено статистически достоверное снижение в 1,6 раза активности СОД, в 1,5 раза уровня восстановленного глутатиона ив 1,8 раза антирадикальной активности

Таблица 3

Состояние системы антиоксидантной зашиты и перекисного окисления липидов у больных с диабетической невропатией и у

Здоровые доноры (контроль) (п-20) Больные с диабетической иевропатией(п=45)

СОД,усл.ед/мг белка 0,92±0,07 0,56±0,11**

АРА,мкэкв/мг белка 90,57±8,6 50,46±6,56**

Глутатион вост., мкмоль/ мг белка 2,73±0,38 1,79±0,67**

Глутатион окисл, мкмоль/ мг белка 0,35±0,09 0,49±0,02

МДА,нмоль/мг белка 0,37±0,05 1,28*0,22***

**р<0,01 *** -р<0.001

Большинство пациентов (45 человек) отмечали улучшение состояния уже после внутривенных инфузий а- ЛК. Субъективное улучшение продолжалось в течение всего курса внутривенного введения препарага, при переходе на прием эспа-липона per os больные отмечали некоторое ослабление эффекта и постепенное возвращение прежних жалоб, затем эти явления проходили. После курса лечения уменьшились ощущения болей в кистях и стопах у 38 больных (82,6%), онемения у 25 пациентов (80,6%), жжения у 16 (76,2%),парестезий у 28 (77,8%). Больные отмечали улучшение настроения, памяти и внимания. Только восемь пациентов не отметили никакого улучшения после применения препарата.

Но данным оценки неврологического статуса было выявлено уменьшение проявлений полиневропатии: восстановление глубоких рефлексов у 16 пациентов, регресс расстройств болевой чувствительности по полиневритическому типу у 31 пациента, увеличение мышечной силы у 4 пациентов, восстановление или значительное улучшение вибрационной чувствительности у 42 больных. Как показано в таблице 2 в ходе лечения средний балл субъективных проявлений по шкале TSS и объективных неврологических симптомов по шкале NDS достоверно снизились.

Также выявлена тенденция к снижению уровня гликированного гемоглобина (10,8 ± 0.54% до лечения и 9,8±0.89 % после всего курса лечения.) Выявлено достоверное улучшение электрофизиологических

показателей под влиянием лечения а-Ж. Уже после окончания курса внутривенного введения препарата достигалось значительное улучшение электронейромиографических данных. Эта динамика сохранялась после окончания всего курса лечения (табл.4).

Таблица 4

Влияние лечения а -липоевой кислотой на скорость распространения возбуждения по чувствительным нервным волокнам у больных с диабетической полиневропатией, м/с

Чувствительны е нервы Контроль. здоровые п=15 До лечения п=32 Через 14 сут п=32 Через 60 сут п=32

n.peroneus superficialis 50,4 ± 1,1 14,8+0,95ААА 17,03+0,99 22,3 ±0,86***

п. medianus 65,8 ± 5,7 35,0+1,2ААЛ 39,7+1,03** 42,0±1,56***

п. suralis 52,5 ±5,6 32.3±1,56ААА 33,3+1,4 36,2+1,8

*** -р<0,001 ** - р<0.01-но сравнению с нелечеными больными

ААА р<0,001- по сравнению со здоровыми п-число пациентов

Таблица 5

Влияние лечения а -липоевой кислотой на скорость распространения возбуждения по двигательным нервным волокнам у больных с диабетической полиневропатией, м/с

Двигательные нервы Контроль, здоровые п=15 До лечения п=32 Через 14 сут п=32 Через 60 су г п-32

п. medianus (дистальные отделы) 55,9 ± 2,6 53,2+1,4*** 50,1±1,05 54.1±0,81

п medianus (проксимальный участок) 65,1 ± 4.2 64,6+2,1 62,8±2,06 65,1±2.8

п. peroneus (дистальный участок) 49,5 ± 5,4 51,4±13,0* 72.9±23.1 65.9±25,3

п peroneus (проксимальный участок) 56,9 ±5.1 65,7+3,2 58,81*3,2 56,4±3,7

*** -р<0.001 * - р<0,05 по сравнению со здоровыми

п-число пациентов

Эффект а- Ж был наиболее отчетлив в отношении состояния чувствительных нервов верхних и нижних конечностей, что проявлялось увеличением СРВ по чувствительным нервам. После лечения а- Ж имелась также тенденция к ускорению проведения по дистальным (наиболее тонким) участкам двигательных нервов (табл.5).

* - р<0,05

Рис. 3 Влияние а-лнпоевой кислоты на показатели вибрационной чувствительности больных с диабетической невропатией, усл. ед.

Положительный эффект а- Ж на расстройство вибрационной чувствительности был отмечен у большинства 42 человека (75%) обследованных больных. Показатели вибрационной чувствительности с обеих ног значимо возросли после курса внутривенной терапии (р <0,05), эта положительная динамика продолжилась и в течение перорального курса лечения (рис.3).

Таблица 6.

Влияние лечения альфа-липоепой кислотой на состояние ПОЛ и ГАЗ в тромбоцитах у больных диабетической невропатией

Показатели

После лечения а- липоевой кислотой

До лечения п=45

Внутривенный

курс (14 сут) п-36

Пероральный курс (60 сут) п=36

СОД,уел ед/мг белка

0,56*0,11

0,74*0,14Л

0,79*0,09"

АРА,мкэкв/мг белка

50,46*6,56

57,4*9,92"

67,1±5,41л

Глутатион восст., мкмоль/мг белка

1,79*0,67

2.21*0,68"

2,23*0,44"

Глутатион окисл., мкмоль/мг белк

0,49*0,02

0,14*0,03"

0,2*0.05"

МДА,нмоль/мг белка

1,28*0,22

1,09*0,18"

0,74*0,13"

^<0,01 лр<0,05

Под влиянием лечения а- ЛК отмечена положительная динамика в виде уменьшения интенсивности процессов ПОЛ (по снижению уровня МДА) как после внутривенного курса, так и после окончания курса перорального приема а- ЛК(табл.б).

Антирадикальная активность в тромбоцитах, характеризующая неферментное звено САЗ повышалась на протяжения всего курса терапии а-Ж. Активность СОД, характеризующая состояние ферментативного звена САЗ. наиболее выражено увеличилась после внутривенного курса терапии а-Ж и незначительно повысилась после всего курса терапии. Уровень глутатиона наиболее выражение изменялся после в/в курса, особенно глутатионовый индекс, который увеличился в 4 раза характеризующий баланс восстановленного и окисленного глутатиона. Надо отметить, что положительная динамика наблюдаемая у больных в ходе курса лечения а-Ж приводила к улучшению показателей САЗ тромбоцитов, однако они не достигали уровня соответствующих показателей у здоровых доноров. Таким образом, результаты исследования компонентов САЗ в тромбоцитах больных диабетической невропатией по своей направленности соответствуют изменениям САЗ, обнаруженным в ткани головного мозга животных с экспериментальным СД ,чю подгверждает правомерность представления о тромбоците как модели нейрона (Бе ОшНо, 1982; Ма1гг^геп, На55е1тагк, 1988). Нарушение функции периферических нервов у больных с диабетической невропагаей тесно связано с развивающейся недостаточностью САЗ, обусловливающей прогрессирование ПОЛ. Это приводит к формированию состояния окислительного стресса в нервной ткани, следствием которого является повреждение клеточных элементов. При этом необходимо учитывать также роль сосудистого звена в патогенезе диабетической невропатии.

В клинике, как и в эксперименте, получен положительный эффект а- ЛК на исследуемые показатели. Действие а- Ж обусловлено ее множественными эффектами, в первую очередь антиоксидантным действием (кроме замещающего эффекта, а- ЛК участвует в регенерации других естественных антиоксидантов —аскорбиновой кислоты и а-токоферола), метаболическим действием (улучшение функции ферментов цикла трикарбоновых кислот,утилизацией глюкозы) и другими.

ВЫВОДЫ

1.У крыс с хроническим аллоксановом сахарном диабетом нарушается функциональное состояние периферических нервов, характеризующееся снижением электрофизиологических показателей и центрального отдела нервной системы, проявляющееся в изменении поведения животных в специальных тестах. Эти изменения выявляются на 60 сут течения сахарного диабета и усиливаются в более поздние сроки сахарного диабета.

2.При экспериментальном (аллоксановом) сахарном диабете параллельно с увеличением срока заболевания происходит пргрессирутощее снижение буферной емкости системы антиоксидантной защиты в ткани головного мозга за счет истощения ферментативных компонентов-супероксиддисмутазы, глутатиоредуктазы, глутатионпероксидазы, и неферментных компонентов(антирадикальной активности) и параллельная активизация процессов пероксидашга липидов.

3.Длительное введение альфз-липоевой кислоты(100 мг/кг,30 сут) животным с сахарным диабетом приводит к повышению антиокислительного резерва и снижению уровня липопероксидации в ткани головного мозга.

4. У крыс с сахарным диабетом ,получавших альфа-липоевую кислоту(100 мг/кг,30 сут) улучшаются электрофизиологические показатели функции периферических нервов(увеличивается скорость распространения возбуждения, возрастает длительность и амплитуда потенциала двигательных единиц мышц) и поведение крыс в специальных тестах.

5.У больных с диабетической невропатией снижается антиоксидантньтй резерв тромбоцитов причем, как за счет ферментативного (активность супероксиддисмутазы), так и неферментного (антирадикальная активность, уровень глутатиона) звеньев системы антиоксидантной защиты.

6. Проведения курса лечения альфа-липоевой кислотой (600 мг/сут внутривенно-14 сут, перорально-60 сут) больным с диабетической невропатией приводит к увеличению скорости распространения возбуждения по периферическим нервам, преимущественно по чувствительным нервам и улучшению вибрационной чувствительности.

7. Лечение больных с диабетической невропатией альфа-липоевой кислотой (курс-600 мг/сут внутривенно-14 сут, перорально-60 сут) оказывает положительное влияние на состояние системы антиоксидантной защиты (повышает активность супероксиддисмутазы, антирадикальную активность, уровень восстановленного глутатиона) и параллельно снижает интенсивность перекисного окисления липидов в тромбоцитах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Для изучения особенностей патогенеза диабетических поражений нервной системы целесообразно использовать модель аллоксанового диабета у крыс, позволяющую изучать механизмы патогенеза и эффективности различных методов лечения.

2. Для лечения и профилактики прогрессировапия диабетической невропатии целесообразно использовать альфа-липоевую кислоту в виде последовательного курса внутривенных инфузий и перорального приема в дозе 600 мг/сут в течение 3-х месяцев.

3. Определение состояния системы антиоксидантной защиты и уровня ПОЛ в тромбоцитах у пациентов с диабетической невропатией позволяет оценить эффективность препаратов антиоксидантного действия на нервную систему.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Григоренко Г.А. Нейрометаболические препараты в терапии диабетических поражений нервной системы. / Баранцевич Е.Р., Александрова Л.А., Григоренко Г.А., Мельникова Е.В., Скоромец A.A.// -«Метаболическая терапия в кардиологии, эндокринологии и неврологии» Материалы международного симпозиума-СПб 1998,с.12

2. Григоренко Г.А. Влияние супероксидисмутазы на поведенческие реакции крыс с сахарным диабетом. / Баранцевич Е.Р., Мельникова Е.В., Григоренко Г.А., Александрова Л.А., Шестакова С.А.//-Материалы конференции «Актуальные проблемы патофизиологии микроциркуляции».-СПб, 1998, с.21

3. Григоренко Г.А. Влияние бета-каротина на проявления оксидативного стресса в тканях головного мозга крыс с аллоксановым диабетом. /Григоренко Г.А.// -Актуальные проблемы патофизиологии-Материалы 3-й межвузовской научной конференции. -СПб 1998.,с. 11-13

4. G.A. Grigorenko.Protective effect of espa-lipon in brain tissue in experimental diabetes mellitus./ E.R. Barantsevitch, G.A. Grigorenko, E V. Melnikova, A.A. Skoromets ,R.P.Stepanov, S. A. Shestakova// -Pathophysiology Vol.5 (Sup. 1),1998- III International Congress of Pathoptisiology .-Abstract book.,p.345

5. Григоренко Г.А.Эффективность липоевой кислоты при диабетическом повреждении тканей головного мозга в эксперименте./ Баранцевич Е.Р., Мельникова Е.В., Махова O.A., Александрова Л.А., Григоренко Г.А., Шестакова С А//-Материалы Второй международной конференции «Микроциркуляция и гемореология», Ярославль 1999,с. 98-100.

6. Григоренко Г.А. Влияние липоевой кислоты на проявление оксидативного стресса в центральной нервной системе при аллоксановом сахарном диабете ./ Баранцевич Е Р., , Григоренко Г.А., Мельникова Е.В., Махова O.A., Александрова Л.А., Шестакова СЛ.// - Цитология , 1999,т41,№9-с811-Тезисы докладов и сообщений международной конференции «Свободно-радикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» СПб. -1999.

7. Григоренко Г.А.Эффективность лишЛвой кислоты при неврологических осложнениях сахарного диабета./Мельникова Е.В.„ Григоренко Г.А., Махова O.A., Александрова Л.А., Баранцевич Е.Р., Скоромец A.A.// -Цитология,1999,т41,№9-с.822-Тезисы докладов и сообщений международной конференции «Свободно-радикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» СПб. -1999.

8. Григоренко Г.А. Влияние рекомбинантной супероксиддисмутазы на электрофизиологические показатели периферических нервов при экспериментальном диабете./ Григоренко Г.А., Баранцевич Е.Р., Мельникова Е.В,. Никитина В.В., Скоромец А.АИ - Актуальные проблемы современной эндокринологии. Материалы IV всероссийского конгресса эндокринологов, СПб-2001, -с.64

9. Григоренко Г.А.Ферментативное звено антиокидантной системы в тканях головного мозга крыс с аллоксановым диабетом. /Григоренко Г.А., Тишковская Ю.Н., Федорова HB.// Актуальные проблемы патофизиологии -Материалы межгородской конференции молодых ученых СПб, 2002,-с.83.

10.Григоренко Г.А. Влияние альфа-липоевой кислоты на антирадикальную активность в ткани головного мозга крыс с экспериментальным сахарным диабетом./ Григоренко Г.А., Зыбина H.H., Шестакова С.А., Скоромец A.A., Федорова Н.В., Тишковская Ю.Н// -Психофармакология и биологическая наркология 2002,№3-4-с.381-Материалы Всероссийской конференции «Нейрофармакология в XXI веке»,посвященная 100-летию академика С.В.Аничкова.

11 .Григоренко Г.А. Оксидативный стресс и антиксидантные системы защиты в ткани головного мозга животных с экспериментальным сахарным диабетом /Григоренко Г.А., Зыбина H.H., Федорова Н.В., Тишковская Ю.Н., Шестакова С.А., Скоромец А.А.//-Тезисы докладов Второго диабетологического конгресса «Сахарный диабет и сердечно-сосудистые осложнения».-Москва,-2002.-с.289.

12.Григоренко Г. А Состояние перекисного окисления липидоз и антиоксидантных систем нервной ткани при экспериментальной диабетической нейропатии и корригирующий эффект альфа-липоевой кислоты. /Григоренко Г.А.,С.А Шестакова// -Ученые записки СПбГМУ им. академика И.П.Павлова,2003,том Х,№3-с.57-62.

13.Григоренко Г А. Состояние антиоксидантной системы в нервной гкапи и его значение в формировании диабетической невропатии./Шестакова С.А., Степанов Р.П., Григоренко Г.А., Федорова Н.В., Тишковская Ю.Н //Тезисы докладов Третьего Российского конгресса по паюфизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем»(экспериментальная и клиническая патофизиология ) 9-12 ноября 2004,г. Москва 2004 -с. 109-110.

14. Григоренко Г.А. Эффект альфа-липоевой кислоты на уровень окислительного стресса и состояние антиоксидантных систем в тромбоцитах у больных с диабетической полиневропатией. /Григоренко Г.А., Шестакова С.А.//-Тезисы докладов II Санкт-Петербургской медицинской Ассамблеи 23-26 ноября 2004,СПб-2004, -с.94.

Список сокращений:

а-ЛК- а- липоевая кислота АД- аллоксановый диабет АРА- антирадикальная активность ГП-глутатионпероксидаза ГР-глутатионредуктаза

ДРБВ-двигательная реакция на болевое воздействие ДПН- диабетическая полиневропатия МДА-малоковый диальдегид ОДА-общая двигательная активность ОПА-ориентировочно-познавательная активность ОТП-обогащенная тромбоцитами плазма ПДЕ-потенциалы двигательных единиц ПОЛ- перекисное окисление липидов САЗ- система антиоксидантной защиты СД- сахарный диабет СОД-супероксиддисмутаза СРВ-скорость распространения возбуждения

Формат 60X84 1/16. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 120 экз. Заказ 03-11. Бесплатно. Подписано к печати 11.11.2004 г. Отпечатано с готового оригинал-макета. Издательство «Система».

■ ' 16 3 i

РНБ Русский фонд

2006-4 319

1.Актуальность темы.

Прогрессирующий рост заболеваемости сахарным диабетом (количество больных достигает по данным ВОЗ 14% от всей популяции) и его осложнений ставит исследование последних в центр внимания специалистов различного профиля. Поражение нервной системы (периферических нервов, автономной нервной системы, центральной нервной системы) является частым осложнением сахарного диабета (СД), приводящим к ранней инвалидизации. В связи с этим исследование механизмов неврологических осложнений при СД и разработка новых способов их лечения и профилактики приобретают особую актуальность .

Одним из ключевых звеньев в патогенезе СД и его неврологических осложнений является окислительный стресс, формирующийся на основе прооксидантно антиоксидантного дисбаланса в клетках и тканях организма. При СД гипергликемия индуцирует образование свободных радикалов за счет ускорения аутоокисления глюкозы, неферментативного гликозилирования белков и т .д. (Williamson J.R. et. al. , 1993;Sima A.F. et al.1999 и др.) . Образующиеся в этих процессах высокореактогенные кислородсодержащие свободные радикалы вызывают интенсификацию процессов пероксидации липидов и белков с образованием токсичных продуктов.

В клинических и экспериментальных исследованиях отечественных (Скоромец А. А. и соавт.,1993; Балаболкин М.И., 1994; Корчин В.И. 1994; Бобырева Л.Е.1996, Баранцевич Е.Р. 2000 и др.) и зарубежных авторов (Cameron N.E.,1996; Fuller С.J.1996; A.Vinick, 2003 и др.) показано важное патогенетическое значение повышения уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ) и снижения некоторых компонентов системы антиоксидантной защиты (САЗ) нервной ткани в развитии ее поражений при СД. Однако структура системы САЗ, роль отдельных ее компонентов и последовательность их нарушений при формировании окислительных повреждений нервной ткани остаются неясными.

В связи с концепцией окислительного стресса наряду с лечебными средствами, направленными на достижение эугликемии при сахарном диабете, является логичным использование препаратов, воздействующих на патогенетические процессы в нервной ткани с целью их коррекции и профилактики. Протективный эффект наблюдается у некоторых 'препаратов антиоксидантного, метаболического действия (а-токоферол, никотинамид, а- липоевая кислота). Отмечены в разной степени выраженное улучшение невральной проводимости, уменьшение явлений внутриневральной гипоксии, уменьшение интенсивности ПОЛ (Дедов И.И и соавт. 1992; Балаболкин М.И. 1998; Packer L.et al. 1995; Cameron N.E.,1996) Представляется, что в условиях необходимости проведения длительной (практически в течение всей жизни) терапии диабетических поражений нервной системы перспективным является разработка новых способов лечения и профилактики с включением в комплексную терапию препаратов антиоксидантного действия.

2.Научная новизна.

Проведено параллельное комплексное исследование функциональных, метаболических и ультраструктурных показателей периферического и центрального ( головной мозг) отделов нервной системы в динамике развития и течения экспериментального сахарного диабета(СД).

Выявлены нарушения нервной ткани в обоих отделах нервной системы уже в ранние сроки (30 сут) заболевания и их прогрессирование в соответствии с продолжительностью СД.

Установлена последовательность развивающегося при СД дефицита ферментативных и неферментативных компонентов САЗ и их роль в формировании показателям) и поведенческие реакции крыс в динамике течения СД.

3.Выявить влияние a-JIK на состояние компонентов САЗ и интенсивность ПОЛ в гомогенатах головного мозга, функциональную активность периферических нервов и поведенческие реакции крыс в динамике течения СД.

4.Определить состояние компонентов САЗ и интенсивность процессов ПОЛ в тромбоцитах у больных диабетической невропатией.

5.Оценить влияние а-ЛК на состояние вибрационной чувствительности и электрофизиологические показатели функции периферических нервов у больных с неврологическими проявлениями СД.

6.Выявить влияние а-ЛК на состояние компонентов САЗ и интенсивность ПОЛ в тромбоцитах больных с диабетической невропатией.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Полученные результаты уточняют представления о патогенезе неврологических расстройств при СД, в частности о роли снижения САЗ в формировании

На экспериментальной модели СД и в клинических исследованиях показано, что снижение резерва САЗ и интенсификация ПОЛ возникают на ранних сроках развития сахарного диабета и сочетаются с нарушениями периферических нервов и ЦНС.

Это является обоснованием раннего начала лечения препаратом а-ЛК с целью профилактики прогрессирования неврологических осложнений, как на доклинической стадии, так и при выраженных диабетических неврологических синдромах.

Данные об изменении антиоксидантного статуса тромбоцитов у больных диабетической полиневропатией позволяет использовать определения САЗ в тромбоцитах для контроля за эффективностью проводимой терапии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1.При экспериментальном аллоксановом сахарном диабете параллельно с увеличением срока заболевания происходит прогрессирующее снижение антиоксидантного резерва в нервной ткани в основном за счет развивающегося дефицита активности супероксидисмутазы, глутатионпероксидазы и неферментативных компонентов САЗ. Это обусловливает прогрессирующую интенсификацию процессов ПОЛ в нервной ткани.

2. Введение a-JIK (эспа-липон) животным с СД (100 мг/кг в течение 3 0 сут) оказывает положительный эффект, повышая антиоксидантный резерв и снижая интенсивность ПОЛ в ткани головного мозга.

3.Повышение антиоксидантного резерва и снижение ПОЛ в нервной ткани под влиянием а-ЛК (эспа-липон) животным с СД улучшает функциональное состояние периферического отдела (увеличивается скорость распространения возбуждения по периферическим нервам, возрастает длительность и амплитуда потенциала двигательных единиц мышц) и центрального отдела нервной системы (улучшение поведенческие реакции у животных).

4. У больных с диабетической невропатией снижается буферная емкость системы антиоксидантной защиты в тромбоцитах как за счет ферментативных, так и неферментативных компонентов, что сопровождается активизацией процессов ПОЛ.

5. а-ЛК (эспа-липон) в дозе бООмг/сут оказывает положительное влияние на состояние ферментативного и неферментативного звеньев САЗ и снижает интенсивность ПОЛ в тромбоцитах больных с диабетической невропатией.

6.Проведение курса лечения а-ЛК (эспа-липон) у больных с диабетической невропатией увеличивает скорость распространения возбуждения по периферическим нервам (преимущественно по чувствительным) и улучшает вибрационную чувствительность.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ

Результаты исследования внедрены в практическую работу городской многопрофильной больницы N 2 Санкт-Петербурга, клинике нервных болезней СПбГМУ имени академика И. П. Павлова. Данные о патогенезе неврологических расстройств и их коррекции а-ЛК при сахарном диабете внедрены в учебный процесс кафедры неврологии и нейрохирургии, кафедры патофизиологии СПбГМУ имени академика И. П. Павлова^

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ

Материалы выполненного исследования представлены в виде докладов и обсуждены на: Международной конференции «Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 1999), Российской конференции «Актуальные вопросы эндокринологии» (Санкт-Петербург,

2000), Четвертом всероссийского конгресса эндокринологов, (Санкт-Петербург 2001), Третьем Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегулядионная патология органов и систем» (экспериментальная и клиническая патофизиология) (Москва,2004) .

По теме диссертации опубликовано 14 работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕТАЦИИ Диссертация состоит из введения, б глав с обсуждением, общего заключения, выводов и практических рекомендаций. В работе содержится 12 6 листов машинописного текста, 21 рисунок и 11 таблиц. Список литературы содержит 214 названий работ, в том числе 170 иностранных авторов.

ВЫВОДЫ

1.У крыс с хроническим аллоксановом сахарном диабетом нарушается функциональное состояние периферических нервов, характеризующееся снижением злектрофизиологических показателей и центрального отдела нервной системы, проявляющееся в изменении поведения животных в специальных тестах. Эти изменения выявляются на 60 сут течения сахарного диабета и усиливаются в более поздние сроки сахарного диабета.

2. При экспериментальном (аллоксановом) сахарном диабете параллельно с увеличением срока заболевания происходит пргрессирующее снижение буферной емкости системы антиоксидантной защиты в ткани головного мозга за счет истощения ферментативных компонентов' i.i супероксиддисмутазы, глутатиоредуктазы, глутатионпероксидазы, и неферментных i 1 компонентов(антирадикальной активности) и параллельная активизация процессов пероксидации липидов.

3.Длительное введение альфа-липоевой кислоты(10 0 мг/кг,30 сут) животным с сахарным диабетом приводит к повышению антиокислительного резерва и снижению уровня липопероксидации в ткани головного мозга.

4. У крыс с сахарным диабетом ,получавших альфа-липоевую кислоту(100 мг/кг,30 сут) улучшаются I злектрофизиологические показатели функции периферических нервов(увеличивается скорость распространения возбуждения, возрастает длительность и амплитуда потенциала двигательных единиц мышц) и поведение крыс в специальных тестах.

5. У больных с диабетической невропатией снижается антиоксидантный резерв тромбоцитов причем, как за счет ферментативного (активность супероксиддисмутазы), так и неферментного (антирадикальная активность, уровень глутатиона) звеньев системы антиоксидантной защиты.

6. Проведения курса лечения альфа-липоевой кислотой (600 мг/сут внутривенно-14 сут, перорально-60 сут) больным с диабетической невропатией приводит к увеличению скорости распространения возбуждения по периферическим нервам, преимущественно по чувствительным нервам и улучшению вибрационной чувствительности.

7. Лечение больных с диабетической невропатией альфа-липоевой кислотой (курс-600 мг/сут внутривенно-14 сут, перорально-60 сут) оказывает положительное влияние на состояние системы антиоксидантной защиты (повышает активность супероксиддисмутазы, антирадикальную активность, уровень восстановленного глутатиона) и параллельно снижает интенсивность перекисного окисления липидов в тромбоцитах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Для изучения особенностей патогенеза диабетических поражений нервной системы целесообразно использовать модель аллоксанового диабета у крыс, позволяющую изучать механизмы патогенеза и эффективности различных методов лечения.

2. Для лечения и профилактики прогрессирования диабетической невропатии целесообразно использовать альфа-липоевую кислоту в виде последовательного курса внутривенных инфузий и перорального приема в дозе 600 мг/сут в течение 3-х месяцев.

3. Определение состояния системы антиоксидантной защиты и уровня ПОЛ в тромбоцитах у пациентов с диабетической невропатией позволяет оценить эффективность препаратов антиоксидантного действия на нервную систему.