Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Состояние эритрона у больных хронической почечной недостаточностью на перитонеальном диализе

Актуальность проблемы

Проблема хронической почечной недостаточности (ХПН) в настоящее время остается одной из наиболее актуальных в здравоохранении. Благодаря прогрессу в области заместительной почечной терапии, одним из методов которой является постоянный амбулаторный перитонеальный диализ (ПАПД), продолжительность и качество жизни больных терминальной ХПН, существенно повысились. Тем не менее, анемия является одним из постоянных симптомов, сопровождающих течение хронической почечной недостаточности. Патогенетические механизмы развития анемии при ХПН достаточно сложны и до сих пор полностью не изучены. Развитию анемии способствуют кровопотери, связанные с геморрагическими проявлениями при ХПН, укорочение продолжительности жизни эритроцитов, токсические продукты азотистого обмена, способствующие мембранолитическим процессам. Однако основным этиопатогенетическим фактором анемии при ХПН является абсолютный или относительный дефицит продукции эндогенного эритропоэтина (ЭПО) (12,28,32).

Качественные и количественные изменения периферического звена эритрона закономерно сопровождают эндотоксемию. Они являются следствием как нарушенного кроветворения при ХПН, так и воздействия токсинов на зрелые клетки, циркулирующие в кровотоке. При всем многообразии лабораторных тестов, определяющих степень интоксикации и эффективность экстракорпорального лечения ХПН, они далеко не всегда позволяют убедительно ориентироваться в конкретной клинической ситуации. В качестве стабильного и, в то же время, достаточно объективного параметра оценки эндогенной интоксикации могут служить морфофункциональные показатели периферического звена эритрона. Комплексное изучение структуры и основных функциональных показателей эритроцитов при эндотоксемии и программном диализе имеют не только практическое, но и теоретическое значение, поскольку изменение морфологии эритроцитов, их мембранного электрического потенциала играют существенную роль в нарушении реологических свойств крови и развитии микроциркуляторных и тканевых расстройств.

Ведущую роль в патогенезе нефрогенной анемии играет дефицит эндогенного эритропоэтина. Коррекция его препаратами рекомбинантного эритропоэтина (рЭПО) приводит к стимуляции эритропоэза и усиленному потреблению железа в организме. В соответствии с этим актуальным является изучение морфологии эритроцитов, состояния эритроцитарной мембраны, метаболизма железа на фоне лечения рЭПО, что позволит получить важную информацию о характере анемии и морфофункциональных особенностях периферического звена эритрона. Подобные сведения об эритроцитах больных ХПН, находящихся на ПАПД, весьма немногочисленны и фрагментарны. В данной ситуации клиническая практика создает уникальные условия для оценки реагирования эритроцитов на эндогенную интоксинацию в процессе проведения перитонеального диализа и терапии рЭПО. Все вышеизложенное определяет актуальность проблемы и позволяет обозначить цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования: проанализировать состояние периферического звена эритрона и оценить значение морфофункциональных показателей эритроцитов у больных терминальной почечной недостаточностью, находящихся на постоянном амбулаторном перитонеальном диализе.

Задачи исследования:

1. Изучить эритроцитарные параметры крови больных ХПН на ГТАПД до и в динамике лечения препаратами рЭПО

2. Исследовать морфологию эритроцитов крови с помощью компьютерной цитофотоморфометрии в процессе проведения ПАПД и терапии рЭПО

3. Охарактеризовать метаболизм железа у больных ХПН, находи щихся на ПАПД, в динамике лечения рЭПО

4. Оценить функциональное состояние мембраны эритроцитов в динамике заместительной почечной терапии (ПАПД)

Научная новизна

Научная новизна настоящего исследования заключается в характеристике морфологических изменений эритроцитов при хронической почечной недостаточности в процессе проведения перитонеального диализа и терапии рЭПО. Впервые были установлены значительные морфологические изменения периферического звена эритрона, которые приобретают клетки в условиях эндогенной интоксикации на фоне проведения ПАПД. Данные компьютерной цитофотоморфометрии эритроцитов указывают на морфологическую неоднородность эритроцитарного пула при ХПН. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что развитие пойкилоцитоза у больных ХПН на ПАПД может усугублять течение анемии.

Применение рЭПО и препаратов железа способствовало положительной динамике со стороны количественных эритроцитарных показателей, однако "эритроцитарная формула" крови полностью не восстанавливалась. Повышенное количество переходных и необратимо измененных форм эритроцитов позволяет предположить, что терапия рЭПО не защищает мембрану эритроцитов от воздействия эндотоксинов.

На основании показателей компьютерной цитофотоморфометрии и обмена железа выявлен разный характер анемии до и в динамике лечения рЭПО.

Впервые проведена оценка поверхностного заряда эритроцитов в сочетании с морфологической формулой эритроцитов на основании компьютерного анализа изображения у больных ХПН, находящихся на перитоне-альном диализе.

Изменения морфологии эритроцитов у больных ХПН на ПАПД сопровождаются снижением их электрофоретической подвижности, что свидесвидетельствует о физико-химических изменениях поверхностной мембраны эритроцитов.

Практическая значимость работы

Результаты настоящего исследования способствуют углублению имеющихся представлений о состоянии периферического звена эритрона при ХПН на фоне проведения ПАПД. Полученные сведения о морфофункциональных особенностях эритроцитов при ХПН представляются важными, поскольку дают дополнительную ценную информацию о структурных изменениях клеток в условиях эндогенной интоксикации, которые могут играть существенную роль в патогенезе микроциркуляторных расстройств.

Установлено, что у больных ХПН в условиях проведения перитонеального диализа наблюдается относительный (функциональный) дефицит железа, диагностика которого должна основываться на комплексном исследовании показателей гемограммы, метаболизма железа и данных компьютерной цитофотоморфометрии. Показано, что подсчет количества гипохромных эритроцитов, содержания гемоглобина в каждом эритроците являются информативными лабораторными показателями в оценке функционального дефицита железа.

Изучение электрофоретической подвижности эритроцитов может быть использовано в качестве дополнительного критерия, оценивающего адекватность применения ПАПД.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Хроническая почечная недостаточность характеризуется мор-фофункциональными изменениями периферического звена эритрона.

2. Перитонеальный диализ и заместительная терапия рЭПО вызывают положительные сдвиги со стороны эритроцитарных показателей, однако полностью "формула эритроцитов" периферической крови не восстанавливается.

3. Терапия рЭПО должна контролироваться комплексом лабораторных тестов, включающих показатели гемограммы, обмена железа и компьютерной цитофотоморфометрии.

4. Изменения морфологии эритроцитов больных ХПН, находящихся на ПАПД, сопровождаются снижением их отрицательного поверхностного заряда.

Внедрение результатов исследования в практику. Основные положения диссертационной работы нашли практическое применение в работе кафедры клинической лабораторной диагностики РМАПО (зав. кафедрой профессор Долгов В.В.), клинико-диагностической лаборатории городской клинической больницы им. С.П.Боткина (зав. Коровина В.И.).

Апробация диссертации. Материалы диссертации доложены на конференции «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 2001 г), 1 Всероссийском съезде гематологов (2002 г.), Всероссийской научной конференции специалистов клинической лабораторной диагностаки (Санкт-Петербург, 2002 г.), на конференции «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 2002г.), съезде Республиканского научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики Беларуси (Брест, 2002 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Выводы

1. Выявлена морфологическая неоднородность эритроцитов периферической крови больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на пери гонеальном диализе до проведения заместительной терапии рекомбинантным эритропоэтином (рЭПО): увеличение дис-коцитов без пэллора, эхиноцитов, стоматоцитов, необратимо измененных эритроцитов.

2. Установлена положительная динамика со стороны эритроцитарных показателей на фоне перитонеального диализа и терапии рЭПО, однако полностью "формула эритроцитов" не восстанавливается (доля переходных и необратимо измененных форм эритроцитов повышена).

3. Заместительная терапия рЭПО может способствовать развитию относительного дефицита железа у больных хронической почечной недостаточностью, что требует контроля со стороны показателей метаболизма железа и оценки процента гипохромных эритроцитов.

4. Эритроциты периферической крови больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на перитонеальном диализе, характеризуются снижением электрофоретической подвижности, что свидетельствует о физико-химических изменениях поверхностной мембраны эритроцитов на фоне уремической интоксикации.

5. Предложен комплекс информативных лабораторных тестов для оценки состояния периферического звена эритрона в условиях проведения перитонеального диализа и заместительной терапии рЭПО: исследование «формулы эритроцитов» и процента гипохромных эритроцитов с использованием цитофотоморфометрии, изучение поверхностного мембранного потенциала эритроцитов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анемия является одним из серьезных осложнений, определяющих качество жизни и выживаемость больных хроническими заболеваниями почек на стадии хронической почечной недостаточности (ХПН). Патогенез развития анемического синдрома при ХПН достаточно сложен. К факторам, способствующим анемии, относят снижение продолжительности жизни эритроцитов, действие уремических токсинов на кроветворение (средние молекулы, креатинин, паратгормон, фуранкарбоксиловая кислота и др.), снижение уровня железа, фолиевой кислоты из-за гемодиализных кровопотерь и многие другие (12,13,79). Однако наиболее важной причиной развития анемии при ХПН является дефицит продукции эндогенного эритропоэтина (ЭПО) перитубулярными клетками интерстициальной ткани почек (67). При развитии почечной недостаточности нарушается свойственная здоровым людям линейная зависимость между уровнем ЭПО и концентрацией гемоглобина. В результате снижается ответ кислородных тканевых сенсоров на гипоксическую стимуляцию и синтез ЭПО не увеличивается пропорционально тяжести анемии (11,29,32). Костномозговое кроветворение в условиях дефицита эндогенного ЭПО характеризуется снижением пролиферативной активности эритроидных клеток-предшественников и усилением неэффективного эритропоэза (34,37). Коррекция анемического синдрома препаратами рекомбинантного эритропоэтина (рЭПО) приводит к стимуляции эритропоэза и усиленному потреблению железа в организме. В соответствии с этим актуальным является изучение морфологии эритроцитов, состояния эритроцитарной мембраны, метаболизма железа на фоне лечения рЭПО, что позволяет получить важную информацию о характере анемии и морфофункциональных особенностях периферического звена эритрона. Подобные сведения об эритроцитах больных ХПН, находящихся на ПАПД, весьма немногочисленны и фрагментарны.

Качественные и количественные изменения периферического звена эритрона закономерно сопровождают эндотоксемию. Они являются следствием как нарушенного кроветворения при ХПН, так и воздействия токсинов на зрелые клетки, циркулирующие в кровотоке. При всем многообразии лабораторных тестов, определяющих степень интоксикации и эффективность экстракорпорального лечения ХПН, они далеко не всегда позволяют убедительно ориентироваться в конкретной клинической ситуации. В качестве стабильного и, в то же время, достаточно объективного параметра оценки эндогенной интоксикации могут служить морфофункциональные показатели периферического звена эритрона. Комплексное изучение структуры и основных функциональных показателей эритроцитов при эндотоксемии и программном диализе имеют не только практическое , но и теоретическое значение, поскольку такие параметры, как морфология эритроцитов, их мембранный электрический потенциал играют существенную роль в патогенезе микроциркуляторных и тканевых расстройств.

В соответствии с вышеизложенным, целью настоящего исследования явилось изучение состояния периферического звена эритрона и оценка значения морфофункциональных показателей эритроцитов у больных терминальной почечной недостаточностью, находящихся на постоянном амбулаторном перитонеальном диализе.

В настоящую работу вошли результаты исследования 25 больных ХПН в возрасте от 29 до 68 лет (6 мужчины и 19 женщин). Хроническая почечная недостаточность развилась на фоне хронического гломерулонефрита и пиелонефрита, диабетической нефропатии, гипертонического нефроскле-роза, поликистоза почек и других заболеваний. Диагноз терминальной стадии хронической почечной недостаточности установлен на основании кли-нико-лабораторных данных, результатов функциональных и ультразвукового исследований почек. В качестве заместительной почечной терапии всем больным проводился постоянный амбулаторный перитонеальный диализ (ПАПД). Контрольную группу составили 20 здоровых лиц. Исследования выполнялись до и в динамике лечения препаратами рЭПО и железа.

С целью изучения соотношения морфологических типов эритроцитов, анализа геометрических их параметров, а также определения содержания гемоглобина в каждом эритроците нами использована компьютерная цито-фотоморфометрия эритроцитов у лиц контрольной группы (п=20). В каждом препарате анализировали 500 эритроцитов.

Морфометрическое исследование эритроцитов позволило получить нормальную «формулу эритроцитов», в которой дискоциты составили 93,2%, эхиноциты - 5,3%, стоматоциты - 0,43%, на долю других необратимо измененных форм приходилось около 1,05%. В общей популяции эритроцитов процент гипохромных и гиперхромных эритроцитов составил 4,6% и 2,1% соответственно. Полученные результаты согласуются с данными других авторов (19,21,39).

С целью изучения морфофункциональных особенностей периферического звена эритрона на фоне лечения рЭПО нами проведено изучение изменений эритроцитарных параметров до в динамике лечения препаратами рЭПО «EPREX» и железа у больных ХПН на ПАПД. Исследования проводили до и через 1, 2 и 3 месяца после начала лечения рЭПО. Оценивали следующие показатели:

• эритроцитарные параметры, определяемые на гематологическом анализаторе "Sysmex SE-9000";

• количество ретикулоцитов;

• эритроцитарные показатели, получаемые при компьютерной цитофотоморфометрии

Исследование количественных показателей эритроцитов больных ХПН на ПАПД в условиях эндотоксемии выявило наличие нормохромной нормоцитарной анемии, ретикулоцитоз, свидетельствующий об активности костномозгового эритропоэза. Применение рЭПО и препаратов железа способствовало увеличению в крови количества эритроцитов, ретикулоцитов, содержания гемоглобина и уровня гематокрита и, следовательно, являлось эффективным в коррекции анемического синдрома при ХПН. Однако, исследование периферического звена эритрона больных ХПН, находящихся на ПАПД, с помощью цитофотоморфометрии показало выраженные морфологические изменения эритроцитов в условиях токсемии. Наиболее характерными из них являлись:

• снижение количества дискоцитов;

• увеличение дискоцитов без пэллора;

• увеличение числа переходных форм эритроцитов (эхиноциты, сто-матоциты);

• увеличение доли необратимо измененных форм -ритроцитов

Появление в циркуляции дискоцитов без пэллора свидетельствует об их морфологической и функциональной неполноценности (19,21,22). Выраженный пойкилоцитоз эритроцитов периферической крови, проявлявшийся в увеличении содержания переходных и необратимо измененных эритроцитов, по-видимому, может быть связан с изменениями эритроци-тарной мембраны, возможно цитоскелета, на фоне эндогенной интоксикации (72,81,87,92). По данным ряда авторов эхиноцитоз при уремии связан с повышением концентрации внутриклеточного Са . Исследование числа эхиноцитов и содержания Са 2+ в динамике проведения гемодиализа установило зависимость увеличения процента эхиноцитов параллельно с транзиторным повышением внутриклеточного Са (55,89). Таким образом, данные компьютерной цитофотоморфометрии эритроцитов указывают на морфологическую неоднородность эритроцитарного пула при ХПН.

Заместительная терапия рЭПО вызывала положительные сдвиги со стороны морфологии эритроцитов. Они проявлялись в увеличении общего количества дискоцитов за счет клеток с пэллором, число которых соответствовало нормальным значениям к концу 3 месяца введения рЭПО. Этот факт, по-видимому, можно объяснить появлением в циркуляции нормальных эритроцитов на фоне активации эритропоэза рЭПО. Однако спустя 3 месяца после начала лечения рЭПО формула эритроцитов периферической крови полностью не восстанавливалась и количество переходных (клеток, способных восстанавливаться в дискоциты) и необратимо измененных форм эритроцитов оставалось практически неизменным (рис. 19). г#

Рис.19. Эхиноциты периферической крови при ХПН Логично предположить, что терапия рЭПО не защищает мембрану эритроцитов от воздействия эндотоксинов, что согласуется с данными ряда авторов, указывающих на сниженную деформабельность эритроцитов при ХПН на фоне терапии рЭПО (22,38,75,82,83,84 ).

Динамика показателей, отражающих геометрические характеристики эритроцитов больных ХПН на ПАПД, выявила увеличение среднего диаметра эритроцитов и доли макроцитов, которые оставались практически без изменений при приеме рЭПО.

Изучение показателей распределения эритроцитов по содержанию гемоглобина позволило определить характер анемии у исследованных больных до и в течение 3 месяцев лечения рЭПО. Как по данным гематологического анализатора, так и по показателям компьютерной цитофотомор-фометрии до лечения рЭПО у всех пациентов ХПН регистрировалась нор-мохромная анемия. Однако, несмотря на прием препаратов железа, спустя 2-3 месяца после назначения рЭПО имело место снижение концентрации гемоглобина в эритроцитах, что свидетельствовало о развитии гипохромной анемии. Динамика изменения процента гипохромных эритроцитов (ГЭР) у больных ХПН на ПАПД на фоне терапии рЭПО представлена на рис.20. ГЭР,%

04

Долвч

2 мес ■ контроль

Рис. 20. Динамика изменения ГЭР на фоне приема рЭПО.

Многие исследователи рекомендуют использовать процент ГЭР в качестве одного из информативных критериев насыщенности железом эрит-рокариоцитов. При этом оптимальный уровень, отражающий достаточное насыщение тканей железом, соответствует концентрации сывороточного ферритина 200-500 нг/мл и ГЭР <2,5% (12,28). Таким образом, эффективность терапии рЭПО можно оценить по содержанию ГЭР в периферической крови.

Выявленное нами значительное увеличение процента ГЭГ, снижение концентрации гемоглобина в эритроцитах на 2-3 месяце лечения рЭПО и препаратов железа свидетельствовало о трансформации нормохромной анемии в гипохромную анемию. Подобные изменения могут свидетельствовать либо о развитии резистентности к рЭПО, либо о железодефицитной анемии. По данным ряда авторов снижение эффективности рЭПО отмечено у больных ХПН на ПАПД с явлениями перитонита, что может быть обусловлено повышенным содержанием в крови провоспалительных цитоки-нов (ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6), ингибирующих эритропоэз (48,57,93). У всех исследованных нами больных отмечался синдром хронического воспаления, закономерно сопровождающий перитонеальный диализ. Однако абсолютной резистентности к рЭПО у них не наблюдалось.

Следует отметить, что, получаемые на гематологическом анализаторе, эритроцитарные индексы (MCV, МСН, МСНС), являющиеся усредненными показателями, практически не изменялись в динамике терапии и, следовательно, не могут быть ориентиром в оценке эффективности терапии рЭПО.

Анизохромия, повышение количества макроцитов и гиперхромных эритроцитов у больных ХПН на фоне терапии рЭПО, регистрируемые компьютерной цитофотоморфомстрией, могут свидетельствовать о повышенном неэффективном эритропоэзе в костном мозге, что подтверждается данными ряда авторов (19,37).

Заместительная терапия рЭПО, проводимая у больных ХПН, вызывает стимуляцию эритропоэза, следствием которой является усиление потребления железа эритрокариоцитами. По данным ряда авторов на фоне приема рЭПО синтез гемоглобина повышается в 1,5 раза, а потребность в железе возрастает с 16 до 22 мг/сутки (12,28,54,62). Поэтому у больных ХПН коррекция анемии рЭПО часто вызывает функциональный и абсолютный дефицит железа, усугубляющий течение нефрогенной анемии.

Нами проведено изучение изменений параметров обмена железа в процессе лечения рЭПО у больных ХПН на ПАПД. Исследования проводили до и через 1, 2 и 3 месяца после начала лечения рЭПО. Оценивали следующие показатели: концентрацию сывороточного железа (СЖ), транс-феррина и ферритина сыворотки, индекс насыщения трансферрина железом (НТЖ).

Изучение метаболизма железа позволило установить функциональный (относительный) дефицит железа у больных ХПН на ПАПД до лечения рЭПО. Об этом свидетельствуют снижение концентрации сывороточного железа (9,45±1,6 мкмоль/л) и повышение количества гипохромных эритроцитов (7,4±0,8%). Выявленная нами гиперферритинемия может рассматриваться как результат активного синтеза ферритина в ответ на хроническое воспаление (перитонит), сопутствующее перитонеальному диализу. На фоне приема рЭПО и препаратов железа отмечалась положительная динамика со стороны показателей метаболизма железа (возрастание содержания сывороточного железа, коэффициента НТЖ). Компьютерный анализ гипохромных эритроцитов показал их нормализацию к концу 1 месяца (3,69±0,67%). Однако к концу 2 месяца заместительной терапии рЭПО, несмотря на положительную динамику показателей обмена железа, вновь отмечалось значительное возрастание ГЭР (13,55±3,44%), процент которых к 3 месяцу составил 17,7±2,5%. Полученные результаты свидетельствуют о г^Г 95 сохраняющемся, несмотря на прием препаратов железа, относительном дефиците железа.

Таким образом, наши данные согласуются с мнением ряда авторов, что количество циркулирующих гипохромных эритроцитов является наиболее чувствительным маркером функционального дефицита железа.

Значение мембранного потенциала для поддержания формы и обеспечения адекватных трансформаций эрифоцитов представляется важным, поскольку отражает активность ионного транспорта. Хроническая почечная недостаточность сопровождается значительным уменьшением поверхностного заряда эритроцитов и увеличением вязкости крови, что соответствует представлениям о заряде, как одном из факторов, обеспечивающих адекватные реологические свойства (47). Существенное снижение поверхностного потенциала может служить отражением измененных внутри- и внеклеточных ионных концентраций (35,64).

С целью оценки функционального состояния мембраны эритроцитов нами проведено исследование ЭФП эритроцитов периферической крови у 25 больных терминальной ХПН в разные сроки проведения перитонеально-го диализа. Контрольную группу составили 20 здоровых лиц в возрасте 1835 лиц.

У всех исследованных больных терминальной ХПН как до проведения перитонеального диализа, так и в его динамике отмечалось достоверное снижение отрицательного поверхностного заряда эритроцитов. Исследование мембранного потенциала эритроцитов в отдаленные сроки проведения ПАПД показало его стабильно низкие значения. Снижение поверхностного заряда эритроцитов может быть связано с воздействием уремических токсинов на мембрану клетки у больных ХПН на ПАПД (48). Согласно данным ряда авторов уменьшение поверхностного потенциала эритроцитов проявляет зависимость от степени выраженности уремии (7,36). В то же время после гемодиализного лечения больных ХПН отмечено повышение заряда эритроцитов, приближающегося к «норме» (35), что можно объяснить интенсивной и быстрой детоксикацией, закономерно приводящей к относительной нормализации поверхностного потенциала клеток.

Стабилизация мембранного потенциала эритроцитов исследованных нами больных на уровне 0,78-0,75 мкм • см • В"1-с"1 отражает достаточно мягкое воздействие перитонеального диализа на клетки периферической крови. В то же время отсутствие резкого падения поверхностного заряда эритроцитов у больных, находящихся в течение длительного времени (более 2 лет) на ПАПД, возможно свидетельствует об адаптации клеточной мембраны эритроцитов к условиям постоянной эндогенной интоксикации.

Результаты проведенного исследования позволяют констатировать наличие морфофункциональных изменений эритроцитов у больных ХПН (снижение количества дискоцитов, увеличение дискоцитов без пэллора, эхиноцитов, стоматоцитов, доли необратимо измененных форм эритроцитов). Перитонеальный диализ и заместительная терапия рЭПО вызывают положительные сдвиги со стороны эритроцитарных показателей, однако полностью формула эритроцитов периферической крови не восстанавливается. Нарушение морфологии эритроцитов больных ХПН на ПАПД сопровождаются физико-химическими изменениями их поверхностной мембраны. Отсутствие резкой положительной динамики поверхностного заряда эритроцитов на фоне проведения перитонеального диализа возможно свидетельствует о стабилизации клеточной мембраны в условиях уремии. Заместительная терапия рЭПО может способствовать развитию относительного дефицита железа и требует контроля со стороны измерения показателей метаболизма железа и процента ГЭР.