Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Сопряженный транспорт ионов Са2+, К+ и Н+ в лимфоцитах и эритроцитах человека

л ^ШиМЭЦП яьгизпь шСЦшй ьпьаиьь 'пьэи^иъ V I рас^иь чииишириь

ъи^и^ьэзиь иипььь ялг-гяььь

Са3^, К'-Ь и Н'-Ь ЬПЪЪЬРЬ ЗШДИПЬО БРиЪи'ППРЗС ииртль |_ьиз>пзьзъьрпш ь ьрмэрпзьзъьрпш

14.00.36 _ Ш-ЬР0Л1-П0М1 и ЬШ1ЮП1_П0М1

ЦЬйишршйшЦшй ч[илтр)П10йЬр[1 рЫ^йшдпф дГилш^шй шиифбшСф ИицЬдйшй штЬОш|шипф)шС

ШтОДШОФР

ЬРЬ"4иЪ -1996

ЕРЕВАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. МХИТАРА ГЕРАЦИ

НАХАПЕТЯН КАРИНЕ ГУРГЕНОВНА

СОПРЯЖЕННЫЙ ТРАНСПОРТ ИОНОВ Саг+, К+ и Н+ В ЛИМФОЦИТАХ И ЭРИТРОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА

14.00.36 _ АЛЛЕРГОЛОГИЯ И ИММУНОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН - 1996

И2^1Ш1лшй£с ^шшшрЦЬ^ I: Зш]иштшй[1 ЧшйршщЬтш^шО 11ппг12ш1чш111нр]шй Ош^шршрт^шй 111. 1Г|п£Ш|ЬишйЬ шйЦ. 4[1Пшрп1.0гир)шй Ьйиифтпилшй

^Ьтш^шО г^шЦшрОЬр

- р^ш^шй <}1илп1р]шййЬр[1 г>п1)1лпр, щрпфЬипр и.и. ОшйршрпЦ

- ЦЬйишршйшЦшй сф1ппф)ш.ййЬр[1 гупЦшпр и.<4. 0}т[[ишйг}шИ;шй 'ПшгтпйшЦшО дйцг^йш^пиОЬр

- рс^ш^шй 4Ьшпф]шОйЬр|1 Г)п1]1ппр, щрпфЬипр 4.и. СЬЦп/тй

- ЦЬйишршйшЦшО с^тт^тйОЬрЬ Г)п1{1лпр и.и. Рше^шй

ипшдшшшр ^и^йшЦЬрщш^тО' ЯЗ иппвдшщшЬш^шй Ош[ишршршр1шй 11ппг\2ша|шЬп1р]1иО иодшДО [гёиифтпил:

"ЛшгтщшОп^тОо ЦицшСицш. к "___"_______ 1996р. д.14.00

и|фршр ЗЬршдт шйЦ. ЬрЬшйЬ щЬтшЦшй р^шЦшй Ншйицишршй^й Щпд (375025, Ьр1ииО-25, Чпр]шй[1 2) 026 бшиОшс^'пшдЦшй [ипрИр^ йЬитгий:

ШлЬОш^пипф^йо ЦшрЬ|.Ь I 6шйпршйш[ ЬОиифттиф чршгциршйтй: иЬфЗи^рв шпшрЦшд I "_"_ 1996р.

ишийшсгЬшшЦшй ^прИрг^ йш[ишс^шЬ

д[11ппФ1п<'ййЬр|| гу^тпр, щрпфЬипр и.Р. rlшqшpjшO

Работа выполнена в Институте хирургии им. А.Л. Микаеляна Министерства здравоохранения Республики Армения

Научные руководители

- доктор медицинских наук, профессор С.С. Гамбаров

- доктор биологических наук АЛ. Гюльханданян Официальные оппоненты

- доктор медицинских наук, профессор ВЛ. Шекоян • доктор биологических наук СЛ. Баджинян

Ведущее учреждение - Национальный институт здравоохранения Министерства здравоохранения Республики Армения.

»V

Защита диссертации состоится - х/ 1996г. в 14.00

часов на заседаннии специального Ученого совета 026 при Ереванском Государственном медицинском университете им. Мхитара Гераци (375025, г. Ереван, Корюна 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета. Автореферат разослан " -77" X 1996г.

"V

Ученый секретарь специализированного совета,

доктор медицинских наук, профессор Назарян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из актуальных задач современной биологии и физиологии является изучение механизмов движения ионов и регуляция их транспорта через мембраны. Неорганические ионы играют важную роль во многих физиологических процессах, регулируя активность многих мембранных (Liu S.-G.J. et al., 1995) и внутриклеточных ферментов (Alkon D.L., Russmusen Н., 1986). Содержание ионов в клетке регулируется с помощью ионтранспортных систем.

В последнее время большое внимание привлекает Са2+-за-висимый К+-канал клеток. Существует ряд данных, указывающих на присутствие в лимфоцитах Са2+-зависимого К+-ка-нала, активируемого увеличением концентрации Са2+ внутри клеток (MacDougall S.L. et al., 1988; Schlichter L.C., Mahaut-Smith M.P., 1989). Однако в доступной нам литературе нет данных относительно прямой регистрации Са2+-зависимого выхода К+ из лимфоцитов.

Известно, что ß - блокатор пропранолол, увеличивая содержание Са2+ в клетке активирует Са2+-зависимый К+-канал в эритроцитах (Szasz I. et al., 1977). До сих пор неизвестно, оказывает ли влияние пропранолол на ионные потоки лимфоцитов.

Не изучен в лимфоцитах также трансмембранный К+/Н+-обмен. Обмен внутриклеточных ионов К+ на внеклеточные ионы Н+ может играть важную роль в регуляции объема и pH клеток (Cala P.M. et al., 1985; Lee S.C. et al.; 1988; Stobo J.D., 1988) и, таким образом, влиять на многие функции лимфоцитов.

В связи с этим большой интерес представляет изучение сопряженного транспорта Са2+, К+ и Н+ в лимфоцитах периферической крови и миндалин человека с помощью ион-сёлективных электродов, реагирующих непосредственно на изменение концентрации ионов.

Одним из проявлений патологического состояния организма может являться повреждение, мембран клеток и клеточных органелл и нарушения в транспорте ионов.

Нарушения функции лимфоцитов после оперативных вмеша-

тельств, вероятно, во многом определяются изменением ион транспортных систем. Эти изменения могут являться ранними предопределяющими нарушение функции иммунокомпетент ных клеток. Поэтому приобретает особую важность изученш влияния оперативного вмешательства на транспорт ионов I лимфоцитах.

Учитывая ведущую.роль ионтрансдортных систем в функцио нировании клеток различного происхождения чрезвычайно ак туальным является изучение влияния физиологически актив ных веществ и препаратов, используемых в практической меди цине, на мембранные процессы. Очень важной характеристи кой цитотоксических препаратов, применяемых в онкологи ческой практике, является их влияние на мембраны клеток В этом аспекте большой интерес представляет изучени! действия широко используемого препарата адриамицина (АДР и бромистого этидия (БЭ) на мембранные процессы.

Таким актуальным вопросам, как сопряженный транспор1 ионов Са2+, К+ и Н+ в лимфоцитах и эритроцитах человека 1 влиянию на него некоторых физиологически активных вещест и посвящено настоящее исследование.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей рабой явилось изучение механизмов функционирования сопряженны: систем транспорта ионов Са2+, К+ и Н+ в лимфоцитах и эритро цитах человека и выявление новых эффектов и механизмо влияния физиологически активных веществ на ионтранс портные процессы.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи

1. Изучить влияние увеличения протонной проницаемост: и трансмембранного градиента рН на выход К+ из лимфоцито человека.

2. С помощью ионселективных электродов выявить Са2+-3£ висимый выход К+ из лимфоцитов, выделенных из периферк ческой крови и из миндалин человека и выяснить влияние прс пранолола на вход Са2+ в лимфоциты.

3. Исследовать влияние оперативного вмешательства на ио! транспортные процессы в лимфоцитах.

4. Подобрать условия влияния цитотоксических соединени АДР и БЭ на активность Са2+-зависимого К+-канала в эритрс

цитах человека и раскрыть механизм действия этих соединений на ионтранспортные процессы в эритроцитах.

Научная новизна. Впервые с помощью ионселективных электродов зафиксирован Са2+-зависимый выход К+ из лимфоцитов, выделенных из периферической крови и из миндалин человека, индуцированный Са2+-ионофором А23187. Впервые показано, что блокатор р-рецепторов пропранолол также индуцирует Са2+-зависимый выход К+ из лимфоцитов.

Впервые выявлено, что увеличение протонофором С1ССР протонной проницаемости лимфоцитов, выделенных из периферической крови и из миндалин, приводит к выходу К+ из клеток, причем при наличии отрицательного трансмембранного рН идет К*/Н+ -обмен.

Показано, что оперативное вмешательство изменяет транспорт ионов К+ и Са2+, а также угнетает сопряженный транспорт К+ и Н* в лимфоцитах.

Подобраны условия, при которых АДР действует на активируемый Р-блокатором пропранололом Са2+-зависимый К+-канал эритроцитов.

Практическая значимость работы. Наши исследования по влиянию оперативного вмешательства на ионтранспортные процессы в лимфоцитах дают возможность выявить биохимические механизмы повреждения лимфоцитов.

Выявление изменения ионтранспортных процессов клеток после оперативных вмешательств и изучение мембранных механизмов действия физиологически активных соединений и лекарственных препаратов позволит наметить пути целенаправленной коррекции состояния клеток.

Внедрение результатов исследований в практику здравоохранения. Результаты работы внедрены в научную практику Института хирургии им. А.Л. Микаеляна МЗ Республики Армения и могут быть использованы в Ереванском Государственном Медицинском Университете на кафедре Иммунологии.

Апробация работы. Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании Ученого совета Института хирургии им. А.Л. Микаеляна МЗ РА 23 июня 1995г. Материалы диссертации доложены на международном конгрессе по иммуно-

реабилитации (Дагомыс, июль, 1994), на международной научной конференции, посвященной 20-летию основания института им. A.JI. Микаеляна (Ереван, сентябрь, 1994 г.), на международном симпозиуме "Heart surgery" (Рим, 1995г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения и выводов. Указатель литературы включает работы отечественных и иностранных авторов. Диссертация изложена на страницах машинописи; иллюстрирована рисунками и таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Объектом исследования служили лимфоциты периферической крови и миндалин человека, а также эритроциты человека.

Метод выделения лимфоцитов из крови человека. Для выделения лимфоцитов из периферической крови человека мы пользовались методом Воуиш-метод седиментации клеток в одноступенчатом градиенте фиколл-верографина, в основу которого положено свойство клеточных элементов крови разделяться, благодаря различной плотности.

Выделение лимфоцитов из миндалин человека. Миндалины, полученные сразу после тонзиллэктомии, на холоду в 0,9% растворе NaCl размельчаются, гомогенизируются н пропускаются через капроновый фильтр. Далее лимфоциты выделяются в одноступенчатом градиенте фиколл-верографина.

Выделение эритроцитов. Эритроциты человека, используемые в опытах, выделяли из гепаринизированной крови доноров, хранившейся в холодильнике не более 24 часов. Центрифугирование проводили на центрифуге Т-23 (Германия).

Определение транспорта Сав лимфоциты. Для определения транспорта ионов Са2+ в лимфоциты последние распределяли по лункам планшеты для последующего культивирования. В каждую лунку вносили 100 мкл суспензии

шмфоцитов (10®/мл в среде RPMI 1640), по 100 мкл среды i^PMI 1640 ("Serva", USA). Во все лунки добавляли по 10 мкл шотопа 45Са2+ с радиоактивностью 2мкКю. Планшету инкубировали при 37°С в течение 45 минут. После окончания срока шкубации содержимое лунок отсасывали, переносили на фильтры и промывали. Для подсчета вошедших в клетки меченых тонов <5Ca2t использовали ß-счетчик, настроенный на 45Ca2t.

Измерение концентрации ионов Н.у и Кf. Транспорт зовов К+ и Н+ через мембраны эритроцитов и лимфоцитов изучали с помощью ионселективных электродов потенцио-угетрическим методом, основанным на измерении электродвижущей силы гальванического элемента.

Измерение концентрации ионов II1" определяли стеклянным водородным электродом. Концентрацию К+ регистрировали с помощью стеклянного К+-селективного электрода, изготовлен-яого из стекла марки NAS 2704.

Определение калиевой и Саг*-зависимой калиевой проводимости в лимфоцитах и эритроцитах. Плотный эсадок лимфоцитов или эритроцитов осторожно ресуспен-цировали и добавляли в инкубационную ячейку. Инкубация клеток проводилась в ячейке объемом 1 или 2 мл при размешивании на магнитной мешалке ММ-3. При определении Са2+-зависимого выхода К+ в среде присутствовал СаС12.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. К*/Ну-обмен в лимфоцитах периферической крови и миндалин человека

В доступной нам литературе мы не обнаружили данных,* касающихся прямой регистрации и сопряжения потоков ионов К+ и Н1" через мембрану лимфоцитов человека. В связи с этим нами было изучено влияние увеличения протонной проницаемости и трансмембранного градиента рН на выход К+ из лимфоцитов периферической крови и миндалин человека.

При инкубации лимфоцитов из периферической крови чело-

века в ячейке с холинхлоридной безбуферной средой в теч< нии 3-4 минут происходит заметное увеличение рН среды, 3£ тем этот процесс замедляется. рН среды устанавливается пределах 6,3-6,8. Можно предположить, что это изменение р1 связано с выходом ОН" (входом Н^) из клеток. С целью опр« деления рН внутри лимфоцитов периферической крови ячейку добавляли сапонин (конечная концентрация 0,01%] вызывающий лизис клеток и выравнивающий внутри (рШ) внеклеточные (рНе) рН суспензии лимфоцитов. Поскольк лимфоциты инкубировались в бербуферной среде, то в данно! случае рН в среде становится равным рН внутри клетки. Вну триклеточная рН по результатам пяти экспериментов соста вила 7,0+0,05. Таким образом, после 3-4 минут инкубаци клеток трансмембранная ДрН(ДрН=рНе-рШ) была отрицо тельна и варьировала в пределах 0,2-0,7 единиц рН.

Нами было обнаружено, что протонофор С1ССР вызывав увеличение калиевой проницаемости лимфоцитов. На рис. показан типичный опыт по влиянию С1ССР на перераспреде ление ионов К+ и Н+ через мембрану лимфоцитов перифери ческой крови в безбуферной среде. Из рисунка видно, что поел добавления С1ССР происходит резкий вход Н+ и выход К+ и клеток. Скорость выхода К* в данном опыте составлял 1,1 нмоль К+/мин.х10® клеток (величина скорости подсчитывс лась как среднее количество вышедшего в течение 15 минут К+' Добавление переносчика К+ валиномицина после 15 минут ин кубации с протонофором вызывало дополнительно небольшо; выход К+ и вход Н*. По результатам опытов стехиометри. К+/Н+-обмена составляла 1,35-1,45 (п=5).

Отметим, что добавление сапонина в конце опыта показы вает, что рШ становится равным 6,7-6,9. Это говорит о том что вход ионов Н+ в клетки изменяет внутриклеточное рН.

С целью выяснения роли рН в индукции выхода К+ был* проведено промывание и инкубация лимфоцитов в слабобу ферной среде с рН 7,5 и 7,9. При этом после внесения лим фоцитов в инкубационную ячейку происходило не подще лачивание среды, а небольшое подкисление. Опыты показали что и в случаях, когда внутриклеточная концентрация ионо Н+ превышала внеклеточную, протонофор индуцировал вы

:од К+. Однако в этом случае скорость выхода К+ существенно яеныпе. Изменения рН среды практически не наблюдается. )чевидно, в этом случае ионы выходят совместно с каким-шбо анионом. Добавление сапонина после завершения опыта юказало, что рШ составляло 7,2-7,3 и 7,3-7,5 соответственно.

Нами было проверено также действие С1ССР на пере->аспределение ионов в лимфоцитах, выделенных из миндалин геловека. При добавлении С1ССР в суспензию лимфоцитов согда ДрН<0, происходит вход Н+ и выход К+. И в случае шмфоцитов, выделенных из миндалин, в условиях, когда вне-слеточное рН превышало внутриклеточную, т.е. ДрН>0, выход С+ под действием протонофора имел место, однако движения не наблюдалось.

Таким образом, увеличение протонной проницаемости лимфоцитов из периферической крови и миндалин человека при-юдит к активации также и калиевой проницаемости и выходу С4" по градиенту концентрации. При наличии трансмем-¡ранного отрицательного ДрН выход К+ происходит преимущественно в обмен на Н+, при увеличении же рН среды выше шутриклеточного рН, идет симпорт К+ и анионов, скорее всего Л", основного аниона цитоплазмы.

При низких рН среды, по нашему мнению, в основе индук-цш С1ССР выхода из лимфоцитов могут лежать два механизма. Первый механизм связан с выходом К+ вследствие юсредованного С1ССР резкого входа Н+ внутрь и активации юледствие этого К*-каналов. Второй возможный механизм вы-сода К+ может быть обусловлен, по-видимому, тем, что С1ССР тзобщает митохондрии и понижает мембранный потенциал литохондрий. Ионы Саг+ выходят из митохондрий и увели-швают внутриклеточное содержание Са2+, вследствие чего 1ктивируется Са2+ -зависимый К+-канал. Однако Гуковская А.С. I Зинченко В.П. (1986) показали, что обработка протонофором ■имоцитов не приводит к увеличению внутриклеточной сонцентрации Са2+. На основании вышеизложенного можно федположить, что имеет место первый механизм выхода К+.

Более высокая скорость выхода К+ при низких рН среды :корее всего объясняется тем, что обмен К4" на Н+ является юлее предпочтительным, чем симпорт К+ и анионов. Очевид-

но, что скорость выхода К+ при высоких pH среды лимити руется скоростью выхода анионов.

2. Са*+ -зависимый К*-канал в лимфоцитах человека

Используя Са2+-ионофор А23187, с помощью ионселектив-ных электродов нами был зафиксирован Са2+-зависимый выход К+ из лимфоцитов, выделенных из периферической кро ви и миндалин человека.

На рис.2 представлено действие А23187 на перераспределение ионов в лимфоцитах крови при pH суспензии, равной 6,8. Из рисунка видно, что А23187 вызывает выход К+ из клеток, Ионы Н+ при этом также выходили из лимфоцитов. Выхо/i протонов вместе с ионами К+, наблюдаемый при инкубаци» лимфоцитов крови в безбуферной среде, по-видимому, бьи обусловлен входящим потоком Са2+. Кроме того, известно, чтс ионофор А23187 является Са2+/Н+-обменником (Pfeiffer D.R, et al., 1978).

При повышении pH среды до 7,2-7,4 выход Н+ становится менее выраженным, хотя выход К+ такой же, как и при pH 6,8. Уменьшение выхода протонов в лимфоцитах, промытых и инкубированных в среде, где присутствует 1мМ Трис, может объясняться тем, что наличие буфера препятствует изменению pH внешней среды.

При pH суспензии равной 6,3 добавление ионофора A2318'i не вызывает выхода К+ из лимфоцитов как крови, так и миндалин.

Чем объяснить тот факт, что при сдвиге pH в кислую об ласть, Са2+-зависимый выход К+ не наблюдается? Pfeiffer D.R. et al. (1978) была получена S-образная зависимость концентрации ионов Са2+, экстрагируемых из водной в органическую фазу, от pH водной среды. С понижением pH водное фазы в интервале от 7,5 до 5,5 экстракция резко уменьшалась, Это объяснялось авторами тем, что ионофор А23187 обме нивает Са2+ на протоны, и поэтому при уменьшении pH водной фазы (увеличением количества Н+) обмен будет затруднен. Поток Са2+ внутрь понизится, и, соответственно, уменьшится Са2+-зависимый выход К+.

Рис. 1 Индуцированный протонофором выход К+ и вход Н+ в тимфоцитах периферической крови человека при ДрН<0. Преда инкубации содержит 150мМ холинхлорида и ОДмМ КС1. Начальное рН суспензии 6,7. Добавлено 18мкМ С1ССР и

1.,2мкМ валиномицина. В 1мл среды 40x10® лимфоцитов.

+

5 мин ■ х

Рис. 2 Синхронный выход К+ и Н+ под действием А23187 в лимфоцитах крови. В безбуферной среде присутствует 1мМ СаС12. Добавлено 5мкМ А23187. Начальное рН суспензии 6,8. В 1мл среды 40x10е лимфоцитов.

Эксперименты, проведенные на тонзиллярных лимфоцитах, показали, что А23187 не приводит к заметному выходу К+ иг клеток, даже при рН суспензии порядка 6,8-7,3 (рис.3).

Известно, что в популяции тонзиллярных лимфоцитов количество активированных клеток гораздо больше, чем в лимфоцитах крови (Brandtzaed Р.,1988). В активированных же клет ках количество Са2+ выше, чем в покоящихся. Возможно, чтс Са2+-зависимый К+-канал в тонзиллярных лимфоцитах исходно в какой-то степени активирован, поэтому внесение Са2+ внутр! с помощью ионофора А23187 приводит лишь к небольшой дополнительной активации канала.

Было выявлено, что в лимфоцитах крови и миндалик добавление А23187 после внесения С1ССР вызывает заметный выход К+ и Н+, причем скорости обмена гораздо выше, чек только в присутствии С1ССР. Это' также свидетельствует о том что йонофор А23187 вызывает увеличение калиевой проницае мости, вследствие чего и усиливается индуцированный С1СС1 обмен К+ на Н+.

Известно,' что пропранолол активирует Са2+-зависимьп К^-канал в эритроцитах, однако механизм повышения внутри клеточной концентрации Са2+ в клетке под действием пропра нолола в настоящее время недостаточно выяснен.

В связи с этим мы решили провести изучение действи: пропранолола на Са2+-зависимый К+-канал в лимфоцитах.

Мы показали, что пропранолол в концентрации 0,4 мМ ак тивирует Са2+-зависимый выход К+ из лимфоцитов перифери ческой крови й миндалин. На рис.4 показано, что при рН сус пензии лимфоцитов крови, равной 7,9, в присутствии 1 мЛ Са2+ пропранолол вызывает выход К+ из клеток. Отметим, чк при рН суспензии лимфоцитов крови, равной 7,3-7,4 эффек1 пропранолола был менее выражен. Аналогичная зависимост: действия пропранолола на Са2+-зависимый К+-канал от р! среды наблюдалась и в лимфоцитах миндалин. Эта рН-зави симость действия пропранолола может объясняться тем, чт при щелочных рН количество, недиссоциированной формы про пранолола, а эта форма лучцщ диффундирует через мембрану выше. При этом должен увеличиваться вход Са2+ в клетку.

При рН около 7,1-7,3 С1ССР индуцировал умеренный выход К

Рис. 3 Влияние А23187 и С1ССР на перераспределение ионов в тонзиллярных лимфоцитах. В безбуферной среде инкубации присутствует 1мМ СаС12. Добавлено 5мкМ А23187 и 18мкМ С1ССР. Штриховой линией показано действие протонофора в отсутствие А23187. Начальное рН суспензии 6,8. В 1мл среды 50x10е лимфоцитов.

ЦК:

0,2

рН

7,8 Г 7.9

. 5 мин

Рис. 4 Выход К+ под действием пропранолола в лимфоцитах периферической крови, при рН равной 7,9. Добавлено 0,4мМ пропранолола. В 1мл среды 40x10е лимфоцитов.

и сравнительно небольшой вход Н+ в лимфоциты, выделенные из миндалин. Последующее добавление пропранолола заметно усиливало выход К+. При этом Н+ резко входил внутрь (рис.5).

При изменении последовательности внесения препаратов про-пранолол весьма слабо индуцировал К+-проницаемость, добавление же С1ССР приводило к резкому выходу К* и входу Н+.

Аналогичные результаты были получены и на лимфоцитах периферической крови человека.

Необходимо отметить, что совместное действие пропранолола и С1ССР (или в обратной последовательности) гораздо сильнее, чем простое суммирование эффектов этих соединений.

Чем же можно объяснить совместные эффекты пропранолола и С1ССР? Вероятно пропранолол, способствуя входу внеклеточного Са2+ может активировать Са2+-зависимый К+-канал. Скорость выхода К+, очевидно, лимитирована скоростью выхода анионов. С1ССР, увеличивая протонную проницаемость, облегчает выход К+ в обмен на Н+, тем самым усиливая выходящий поток К+. Отметим, что последовательные внесения А23187 и С1ССР (или наоборот) также дают такой же эффект, хотя и в меньшёй степени выраженный.

3. Влияние оперативного вмешательства на ион-транспортные системы лимфоцитов

Изучалось влияние оперативных вмешательств на ионтранс-портные системы (ИТС) лимфоцитов (К+/Н+- обмен, транспорт ионов кальция и калиевую проницаемость) в динамике при поступлении в стационар, непосредственно после операции и через сутки после опреации.

Мы провели изучение влияния оперативного вмешательства у 34 больных, распределенных по 3 группам. Поскольку сама хирургическая патология могла привести к изменению ИТС лимфоцитов, мы изучали также характеристики ИТС лимфоцитов у здоровых лиц.

Проведенный нами анализ показателей ИТС лимфоцитов не выявил существенной разницы в обследуемых группах больных в день поступления и в группе здоровых.

Нами был исследован индуцируемый протонофором С1ССР

К+/Н+-обмен в лимфоцитах периферической крови больных с абдоминальной патологией (п=17), сосудистой патологией (п=18) и в лимфоцитах больных, которые подверглись кардиохирурги-ческому вмешательству на сердце с применением искусственного кровообращения (п=9).

Исследования показали, что через день после операции имело место угнетение К+/Н+-обмена в лимфоцитах у больных с изучаемыми нами хирургическими патологиями. У больных с абдоминальной патологией (п=17) угнетение К+/Н+-обмена составляло 36,5±2,1%, а у больных с сосудистой (п=18) и сердечной патологиями угнетение составляло соответственно 34,2±3,2% и 39,1±2,9%.

Нами также исследовался транспорт ионов кальция и калиевая проницаемость у больных с абдоминальной патологией (п=17) и сосудистой патологией (п=18).

Показатели транспорта ионов кальция и калиевой проницаемости при поступлении и непосредственно после операции существенно не отличались. Уменьшение входа ионов кальция и выхода ионов калия у больных с абдоминальной и сосудистой патологией выявлялось лишь через сутки после оперативного вмешательства. Процент угнетения калиевой проницаемости у больных с абдоминальной патологией составил 44,46±3,6%, а у сосудистых больных - 46,07±3,2%.

Таким образом, можно сделать заключение, что оперативное вмешательство является мощным фактором, угнетающим ион-транспортные системы лимфоцитов.

4. Влияние адриамицина на активность Са"-зависимого К*-канала в эритроцитах человека

Вызывает большой интерес выявление новых эффектов и механизмов влияния физиологически активных веществ и используемых в медицине лекарственных препаратов на мембранные процессы, в частности на системы транспорта ионов. При изучении влияния АДР на Са2+-зависимый К+-канал эритроцитов было выявлено, что АДР в концентрации 35мкМ усиливает Са2+-зависимый выход К+ в присутствии низких концентраций пропранолола (0,04мМ), не действуя на скорость

выхода К+ при использовании более высокой концентрации /9-блокатора (0,2мМ) (рис.6). Следует отметить, что АДР в используемых концентрациях сам по себе не влияет на калиевую проницаемость эритроцитов.

Нами было обнаружено, что различные препараты АДР по разному действуют на индуцированный пропранололом Са2+-за-висимый К+-канал эритроцитов. Результаты исследований препаратов АДР, подвергшихся кислотному гидролизу по остаткам аминосахара, показали, что агликоновая часть АДР способна активировать Са2+-зависимый К+-канал эритроцитов в присутствии низких концентраций пропранолола.

Как показали результаты проведенных нами экспериментов АДР в концентрации 35-70мкМ не влияет на Са2+-зависимый К+-канал индуцированный А23187 и на РЬ2+-зависимый выход К+ из эритроцитов.

Поскольку ионофор А23187 является экзогенно вносимым переносчиком Са2+, а РЬ2+-зависимый выход К+ не зависит от Са2+, то на основании проведенных экспериментов можно прийти к выводу, что АДР действует не на транспорт К+, а скорее всего, на эндогенную систему переноса Са2+.

Эксперименты, проведенные с использованием верапамила и трифторперазина подтвердили вышеприведенный механизм действия АДР.

Нами также было исследовано действие БЭ на функционирование Са2+-зависимого К^-канала эритроцитов, индуцируемого пропранололом. Результаты экспериментов показали, что БЭ ингибирует активность Са2+-зависимого К+-канала, индуцированного пропранололом. БЭ также ингибирует сопряженный вход Н+.

Из результатов экспериментов следует, что БЭ не влияет непосредственно на калиевый канал, скорее всего, эффект его опосредован ингибированием системы транспорта Са2+ в клетку.

Нами было также выявлено, что ингибирующий эффект БЭ на пропранолол-индуцированный Са2+-зависимый выход К+ отменяется при предварительном добавлении в систему АДР.

Таким образом, на основании полученных нами результатов можно предположить, что при низких концентрациях пропранолола, когда выход К+ незначителен, АДР активирует сис-

7.4

7.6

7.8

Рис. 5 Действие пропранолола при отсутствии С1ССР в лимфоцитах, выделенных из миндалин человека. Лимфоциты инкубировались в среде, содержащей 150мМ холинхлорида, ОДмМ КС1 и 1мМ СаС12. рН среды 7,1-7,3. В 1мл среды 50x10е лимфоцитов.

7.6

7.8

5 мин

Рис. 6 Усиление АДР выхода К+ и входа Н4" в присутствии низких концентрации пропранолола. Добавлено 40мкМ пропранолола и ЗомкМ АДР. Штриховой линией показан контроль в присутствии 0,2мМ пропранолола.

тему переноса Са2+ в клетки, причем этот эффект проявляется совместно с пропранололом.

Альтернативное объяснение может заключаться в усилении транспорта Ca2f в клетки вследствие увеличения степени вос-становленности мембранных белков эритроцитов. Известно, что электрондонорная система аскорбат + феназинметасульфат, взаимодействующая с редокс-компонентами мембран эритроцитов, открывает Са2+-зависимый К+-канал (Garcia-Sancho J. et al., 1979, Alvarez J. et al., 1984).

О способности же АДР реагировать с окислительно - восстановительными компонентами мембран свидетельствуют данные о том, что АДР является субстратом для многих оксиредуктаз (NADH: цитохром Ь5-редуктаза, ДТ-диафораза и т.д.) (Fisher G.R. et al., 1992), которые в последнее время рассматриваются как факторы, детерминирующие чувствительность клеток к АДР (Kasahara К. et al., 1994).

При этом первое объяснение не исключает второго, поскольку АДР в обоих случаях, очевидно, усиливает вход Са2+ в клетку совместно с пропранололом, вследствие чего и происходит утечка К+ из клетки.

Необходимо отметить также, что АДР, применяемый в клинике как противоопухолевый препарат, дает побочные эффекты, в частности имеет выраженное кардиотоксическое действие.

Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что дегликозилированная форма АДР характеризуется более сильным влиянием на мембраны клеток, чем интактная молекула. По-видимому, одним из механизмов кардиотоксич-ности может быть усиленное дегликозилирование АДР i организме с участием различных гликозидаз, что может приводить к увеличению К+ проницаемости кардиомиоцитов.

Таким образом, наши исследования молекулярных механиз мов действия физиологически активных соединений и лекарственных препаратов на мембранные процессы дали возможность выявить мембранные механизмы токсического действия противоопухолевого препарата адриамицина.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что я лимфоцитах человека, выделенных из периферической крови и из миндалин, имеет место К+/Н+-обмен.

Увеличение протонной проницаемости лимфоцитов прото-нофором С1ССР приводит к выходу К+ из. клеток. При рН суспензии лимфоцитов ниже внутриклеточного рН, происходит К^/Н^-обмен. При рН суспензии вышее внутриклеточного, наблюдается симпорт К+ и анионов.

2. В лимфоцитах человека обнаружен Са2+- зависимый К+ -канал.

Индукция Са2+-ионофором А23187 Са2+-зависимого К+-канала сопровождается одновременным выходом К+ и Н+.

В тонзиллярных лимфоцитах активность Са2+ -зависимого К+-канала, индуцируемого ионофором А23187, менее выражена по сравнению с лимфоцитами периферической крови.

3. Блокатор /?-рецепторов пропранолол активирует Са2+-за-висимый К^-канал в лимфоцитах человека.

4. При совместном действии протонофора С1ССР и пропранолола имеет место синергизм их действия на Са2+-зависимый выход К+ из лимфоцитов человека.

5. Хирургическое вмешательство приводит к угнетению транспорта ионов Са2+ и К+, а также К+/Н+- обмена в лимфоцитах крови больных.

6. Агликоновая часть адриамицина (не содержащая остатков тиносахара) усиливает индуцированный низкими дозами пропранолола Са2+-зависимый выход К+.

7. Бромистый этидий угнетает, а адриамицин не оказывает злияние на активность Са2+-зависимого К+ -канала, индуциро-занного высокими дозами пропранолола.

8. Модулирующие эффекты адриамицина и бромистого )тидия на активность Са2+-зависимого К ^-канала обусловлены активацией адриамицином и ингибированием бромистым )тидием системы транспорта Са2+ в клетку, а не их действием непосредственно на К+-канал.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние психоэмоциональной сферы на процессы реаби литации ионтранспортирующих систем лимфоцитов в после операционном периоде. // В кн. "Современные аспекты рекон структивной хирургии" - Ереван, 1994.- с. 384-386. (Соавт С.С.Гамбаров, А.А.Мкртчян, Р.М.Танашян и др.).

2. Влияние оперативного вмешательства на ионтранспорти рующую систему лимфоцитов и его роль в возникновении пос леоперационных гнойно-септических осложнений. // В кн "Современные аспекты реконструктивной хирургии" - Ереван

1994.- с. 387-388. (Соавт. С.С.Гамбаров, А.А.Мкртчян А.В.Акопян; Р.М.Танашян и др.).

3. Influence of psychoeraotional sphere in rehabilitation pro cesses of the iontransporting system of lymphocytes in the post operative period. // In: International journal of immunoreha bilitation. ABSTRACTS of the I INTERNATIONAL CONGRESi of IMMUNOREHABILITATION. -1994. - Number 1 - Supple ment - p. 117 (Gambarov S.S., Melkonian D.L., Nahapetian K.G et. all).

4. Угнитающее влияние оперативных вмешательств на транс порт ионов в лимфоцитах. // Ж. Вестник хирургии. - Ереван

1995.- N1.- с. 24-29. (Соавт. Г.С.Тамазян, С.С.Гамбаров А.А.Мкртчян, Р.М.Танашян и др.).

5. Показатели транспорта ионов в лимфоцитах как критери] прогноза послеоперационных гнойно-септических осложнений // Ж. Вестник хирургии. - Ереван, 1995.- N1.- с.29-33. (Соавт С.С.Гамбаров, Р.М.Танашян, А.В.Гюльханданян и др.).

6. К+/Н+- обмен в Лимфоцитах периферической крови челе века и влияние на него оперативного вмешательства. //Ж Вестник хирургии. - Ереван, 1995.- N2.- с. 56-58. (Соавт С.С.Гамбаров, А.В.Гюльханданян, Р.М.Танашян и др.).

7. Modulation of Са2+ - dependent К+ channel of erythrocyte by cytotoxic compounds. // In: Ninth international conferenc on second messengers and phosphoproteins. - Nashville, Tennesse USA, 1995. - p.124 (A.V.Gyulkhandanyan, T.K.Davtyan S.S.Gambarov, K.G.Nahapetian).

8. The coupled-transport of Ca2+, K+ and H+ ions in human lymphocytes. // Medical Science of Armenia. - Yerevan, 1995. -V.35. - N 1-2. - P.66-74. (S.S.Gambarov, A.V.Gyulkhandanyan, K.M.Markosian, K.G.Nahapetian, S.S.Haroutyunian, A.V.Hakopian, R.M.Tanashian, T.K.Davtyan).

9. Сопряженный транспорт ионов Ca2+, K+ и H+ в лимфоцитах человека. // Ж. Иммунология. - Москва, 1996. N5. - с. 19-22 (Соавт, С.С.ГамбароЕ, А.В.Гюльханданян, Т.К.Давтян, А.В.Акопян).

10.Адаптивный ответ клеток на цитотоксические препараты. IV. Противоположные эффекты адриамицина и бромистого этидия на Са2+- зависимый канал эритроцитов человека. // Ж. Цитология. - Ленинград, 1996. - N2. - с.135-145 (Соавт. Т.К.Давтян, А.В.Гюльханданян, С.С.Гамбаров, Ю.Т.Алек-санян, Т.Н.Игнатова).

«Caj+-Ji, К+ф ЬЧ II+-ti MlVbbPI» ^ШЛНЛЫУ

spiTbu^inpse шхгапь и*1гл>пзь8ъьрпыг ьч. ЬРМ^РПЗМЪЬРПМГ»

IjuihiuiqUmjiiiG tiuippGb Q-mpqbGp

Ц 1Г Ф Я Ф ilh U"

■bbplpujujgiJmi ui2luuimuiGgnnl mumiluuiulipilui& bG ilmpqni 1[и1фа-g[iuiQlipmiI U tpftppngJiuiGbpnuI Ca2t-Ji, K+-}i li H*-li tinGGbpJi hunJui[ni& uipmGuiqnpmuijtiG hmi!iul|uipqh[i}i qnp&niGbmpjuiG ilhluuiGJiqiSGhpn, fiQ^iqbu Guib puigmhujjmi[ui& bG JmGinpuiGuuinpinuijliG uipngbuGbpli i|pm 3>liqlminqliuiu}hu mlpnjnl Gjnipbp}i Gnp ilhJuuiGliqilGbpG ni t^blpnGbpn: 4,mjinGmpbpiluid t, np iluipipu uibpti$>bplil| uipjniGlig ni G2Uiqbipibplig uiGjuiiniluid iliiL^ngfimGhpniiS щрптпйпфпр ClCCP-Ji iljijngnil ujpnrnn-GuijJiG pu^iuGgbilimpjuiG ilbduigniiip pbpniil t p2(i?Gbplig K+-Ji bipjifi: trpp iliiI3>nglimGbpfi Ijuilunijpli рП-р дш&р t GbppjjuijliG pH-}ig, mbq^i t niGbGnuI К*/Н+ i}inlumGmliniiI, fiulf bpp IpuJunijpli pH-p ршрйр t Gbp-P§2uij]iG pH-Jig, шцш ij|imL[ntiI t K+-Ji U uiGJinGGbpfi ujiilujnpm: Uuipipn iqbpfi.^bpjili uipjuiG ilnI^ngJnnGbpnuI пшпиЮипфрфий t

i}]ipuiphitfuiljuiG lîliguiiîuinipjuiû uiqqhgnipjmGp K+/H+ ilmluiuGiulpíuiG Ca:+-li U K*-}i JinGGbpli щршСтцприф Црш: иинптрфий hLuiuiqnmnip jniGGhpo gnijg milbgjiö, np lUipuipniduiljuiG lîJijuxiîumipjniGp 6Û2nr luqqbgnipjniG t qnp&nitf i]i^nglnnGbp[i ImGmpuiGuuinpinuijliC huitfuiliuipqbpti фш:

Uuipqni ilitl^ngtunGbpmil JinGGbpji йЦшшйшйр pGuipnquiliuiG tlbli inpnrjGbpli IiJipmnúmiíp тгрриЩтрЬй ЭДри^шй t Саг+фд Ipuluijuiö K*-J limGmip: Ca:+-li tmGn^np A23187-nil Caî+-bg liuiluijuiö К+ф IpuGuii] liGqniligtiuiG niqbljgijnuí t K+-fibH+-}i JmGGbpJi huiiiiuinbq Ьцэпф Г» шшр phpnipjniG iluipqni u|LpIi4>bplil¿ uipjuiG jliü$ngtnnGbpti, Ú2uiqbqñl¡plic mGjmmilmöilid^ngtiinGbpnii! A23187-nij jiGqniligi}uiö Ca:+-lig liuiliujuií K+"li lpuGui[]i mIim|iilnipjniGß ртд t uipuiuihuijuiiluiö:

•¿,mjuiGmpbpi|mô t, np ß-nhgbujinnpGbpli ррйциитр гщипцриШпрцС шЦтМшдбпи! t Ca:+-lig Ijuiluiluiö K+-Ji IpuGuiiji üuipqni ijnl^ngfiui-GbpnuS: Puiguihuijuuluiö t, np Ca:+-tig IjuiJuiluiö K+-li bipji iqpnmnGn^np ClCCP-Ji b uipnujpuxGninili hmiîmuibq mqqhgmpjniG[ (1|шй huiljumuili huignpqiulpuGnipjuiiîp) ¿шш uii|b[li nidbq t, puiG шJr úJimgnipjniGGbpli t^blfmGbpIi ujuipq qniüuipp:

-ibuiuiqnunluid bG ImGuipuiGuiqnpuiiujliG huiiîuiliuipqbpfi ijpuinumig-puijJiG lîJimgnipjniGGbp uiqpIiuiütigliGji b tmjiqlinuî ppnüjiqli uiqqb gnipjniGGbpp: Uripliuid|igliGli luqiJiljnGiujIiG lîuiup, npp jli uiuipniGuilini^ uiúliGi^uipuipli líGuignpqGbp, nidbquigGniiS t uipnuipuiGnjnili guiöj linGgbGuiprngJirnGbpni} JiGqntljgiliuö Ca:+-Jig liuilui]mö K+-lib[pQ, ii[iG¿i]br uipnujpmGn^n^i puipáp linGgliGinpuigliuiGUpli oquiuiqnpMuiG qbujpnui mqplimiíJigJiGp n¿ úji uiqqhgmpjniG ¿ji pnqGniiï Ca:+-Jig Ipujuiluiö K+-t IjuiGuiiJi i|pui: tuijiqlmuí ppnüjiqp öÜ2niii t uipnuipmGn^niJi b' puipáp. b' guiöp linGgbGinpmgJimGbpnil huipnigiluiö Ca:+-fig IjmJuilmô K+-J 1|ш0шщ: llqplimiîtigliGJi b tuijuilrntú ppniî|iriJi ilnqniiuigGiiq 1фЬ1цлСЬр[ tplippngtiuiGbpnitf Ca2+-Jig l[uiluijiuö K+-Ji IjiuGuiiji uiliinJnlnipjuiG 4pu ujuijüuiGuiilnpiluiö bG Ca:+-Ji mpuiGuiqnpmuijliG huiiîuiljuipqli uiq-pJimiîJigJiGli Ijnqiifig шЦифЦшдйшйр b tinJuilmiiS piiniSJuiti 6G2iïuuîp, iuj| n¿ pb пищшЩтрЬй K+-}i IjuiGuiili ijpui ntGbguiö uiqqbgnipjuiiíp:

UjuuiJiunil, YUipuipniduilpuG \lli2múmnipjniG|ig hbuin pgiigGUpîi juiG-inpuiGuiqnpuiuijliG uipngbuGbpli фпфп1шпр.зп100Ьр11 Ji huijui pbpnidp l 5>Iiqlinpq}immbu uil|mlii| Gjnipbpli ni qbquiGjnipbpIi uiqqbgnipjuiG lîbiîppuiGiujJiû übiumGJiqübpti hhmuiqnmnipjniGp p^lijGbpJi i|[iámliGbp[i limGnGmilnpúmG niqJiGbpli pGuipnipjuiG hQmpmijnpnipjniG bG uimj|iu: