Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Системный подход к оценке иммунного гомеостаза при остром инфаркте миокарда

На правах рукописи

оЩиа^б^/

Лимарева Лариса Владимировна

СИСТЕМНЫЙ ПОДХОД К ОЦЕНКЕ СОСТОЯНИЯ ИММУННОГО ГОМЕОСТАЗА ПРИ ОСТРОМ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА

14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Уфа - 2009

003481474

Работа выполнена в Институте экспериментальной медицины и биотехнологий Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты: доктор биологических наук доктор биологических наук доктор медицинских наук, профессор

Жестков Александр Викторович

Николаева Алевтина Максимовна Лютов Андрей Германович Ганцева Халида Ханафиевна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства

I ноябоя 2009 г. в

Защита состоится " 7у " ноября 2009 г. в '' часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3.

Автореферат разослан года

Ученый секретарь диссертационного совета , К.А. Лукманова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Инфаркт миокарда (ИМ) по-прежнему остаётся одной из главных причин смертности населения во всём мире [Шальнова С.А., 2008; Шахнович P.M., 2008; Young М.А., 2000]. Согласно прогнозам Всемирной Организации Здравоохранения, к 2020 году смертность от сердечно-сосудистых заболеваний может достигнуть 25 миллионов случаев в год, почти половину из них составит смертность от инфаркта миокарда. При этом в Российской Федерации показатель смертности от данного заболевания значительно выше, чем в развитых индустриальных странах. В связи с этим, в рамках Национального проекта «Здоровье» большое внимание уделяется формированию системы кардиологической помощи, направленной на повышение уровня здоровья населения за счёт раннего выявления заболеваний сердечно-сосудистой системы, прежде всего, ИМ, его адекватной диагностики, современного лечения и реабилитационных мероприятий [Беленков Ю.Н., Горохова С.Г., 2008].

В последнее десятилетие объём информации об особенностях клиники, патогенеза, возможностях ранней диагностики ИМ значительно возрос, однако, одной из важнейших медико-биологических проблем остаётся разработка комплекса клинико-лабораторных методов, позволяющих своевременно поставить диагноз и оценить характер течения инфаркта миокарда. Выявление групп пациентов с повышенным риском осложнений ИМ стало особенно важным после того, как появилась реальная возможность улучшить их состояние с помощью медикаментозных и хирургических методов лечения с использованием клеточных технологий [Бокерия JI.A. и др., 2008; Симбирцев A.C. и др., 2008; Темнов A.A., 2008].

Разработка новых терапевтических подходов к лечению ИМ с применением иммунокорректоров и клеточных технологий требует проведения экспериментальных исследований на крупных лабораторных животных. Наиболее удобной моделью для этих целей является воспроизведение экспериментального ИМ у собак. Однако данные об особенностях иммунной системы этих жи-

вотных в норме и при экспериментальном ИМ, полученные с помощью современных технологий, в том числе и методов лазерной проточной цитофлюори-метрии, крайне ограничены.

Бурное развитие иммунологии в последние годы позволило во многом пересмотреть и установить важную роль иммунологических механизмов, взаимодействия иммунной и нервной системы в формировании и течении инфаркта миокарда. Всё это требует комплексной оценки изменений отдельных компонентов системы иммунитета, нейро-иммунных взаимосвязей при данном заболевании. Однако анализ данных литературы выявил во многом недостаточно изученную, неполную и неадекватную трактовку результатов оценки состояния иммунной системы при ИМ в клинике и эксперименте, вследствие чего до сих пор отсутствует доказательная база эффективности проведения иммуно-корригирующей терапии при данном заболевании [Моисеев B.C. и др., 1998; Чукаева И.И., 2001; Логачева И.В. и др., 2002; Weismen I.H et al., 2002; Torre-Amione G. et al., 2008].

В настоящее время установлено, что ИМ характеризуется активацией каскада нейрогуморальных и иммуновоспалительных процессов, влияющих на некротическую и апоптотическую гибель кардиомиоцитов [Потапов И.В., Крашенинников М.Е., 2001; Маслов Л.Н. и др., 2003; GalangN. et al., 2000; Assmus В. et al., 2002]. Однако, исследования процессов апоптоза кардиомиоцитов в динамике ИМ, особенностей их реакций на сигналы со стороны нервной системы и апоптотические стимулы методически сложны, проводятся главным образом морфологическими методами, что может быть малоинформативным вследствие неадекватного забора биологического материала из очага поражения сердечной мышцы. В этой связи исследования аналогичных процессов в лимфоцитах крови, экспрессирующих подобно кардиомиоцитам рецепторы к ней-ромедиаторам вегетативной нервной системы имеют значительные преимущества в виду доступности получения биоматериала, возможности стандартизации лабораторных исследований и наличия разнообразных подходов к изуче-

нию апоптоза этих клеток [Красникова Т.Л., Габрусенко С.А., 2000; Yamada S. etal., 1996].

В целом, при доказанности участия иммунологических механизмов в патогенезе ИМ в настоящее время отсутствуют методические подходы к интегральной, комплексной оценке состояния иммунной системы, её взаимодействия с вегетативной нервной системой при развитии данного патологического процесса в клинике и эксперименте. Проведение подобных исследований необходимо для расширения теоретической базы в целях разработки новых диагностических и терапевтических подходов к коррекции иммунологических нарушений при инфаркте миокарда.

Цель исследования

Установить особенности участия иммунологических механизмов в развитии и исходах инфаркта миокарда в эксперименте и клинике, повысить эффективность клинико-лабораторной диагностики и прогнозирования течения данного заболевания на основании системного многофакторного анализа и математического моделирования морфофункционапьного состояния иммунной системы.

Задачи исследования:

1 Разработать комплекс методов для оценки in vitro влияния нейромедиаторов вегетативной нервной системы на апоптоз лимфоцитов крови человека и экспериментальных животных (собаки).

2 Определить закономерности изменений показателей морфофункционапьного состояния лейкоцитов крови (иммунологические, морфологические, морфо-метрические), активности системы комплемента, уровней иммуноглобулинов классов А, М, G и С-реактивного белка в крови собак в динамике экспериментального инфаркта миокарда; на основе системного многофакторного анализа разработать математические модели состояния иммунной системы собак в зависимости от тяжести поражения сердечной мышцы.

3 Выявить особенности изменений показателей морфофункционапьного состояния лейкоцитов (иммунологические, морфологические, морфометриче-ские), активности системы комплемента, уровней иммуноглобулинов классов

5

А, М, G; С-реактивного белка и провоспалительных цитокинов (интерлейкин ip, интерлейкин 6, фактор некроза опухоли а) в крови больных с инфарктом миокарда с патологическим зубцом Q и без зубца Q; на основе системного многофакторного анализа разработать математические модели морфофунк-ционального состояния системы иммунного гомеостаза человека в динамике острого инфаркта миокарда в зависимости от объема поражения сердечной мышцы.

4 Провести сравнительный анализ математических моделей морфофункцио-нального состояния систем иммунного гомеостаза человека и экспериментальных животных при остром инфаркте миокарда.

5 На основе математического моделирования обосновать наиболее значимый спектр клинико-лабораторных и иммунологических показателей для эффективной диагностики, прогнозирования течения и исходов инфаркта миокарда.

Научная новизна исследования

Впервые проведён анализ проапоптотического действия нейромедиаторов вегетативной нервной системы (норадренапин и ацетилхолин) на лимфоциты крови в сравнении с классическим активатором апоптоза - преднизолоном. Показано, что ацетилхолин при инкубации in vitro индуцирует апоптоз лимфоцитов крови человека и экспериментальных животных, а норадренапин не вызывает апоптотической гибели, но изменяет экспрессию ряда антигенов диффе-ренцировки на поверхности лимфоцитов.

На основе комплексного системного анализа с применением математического моделирования выявлены и сопоставлены особенности изменений состояния иммунной системы человека и животных при остром ИМ, включая оценку выраженности процессов апоптоза и чувствительность лейкоцитов к нейромедиаторам вегетативной нервной системы в зависимости от тяжести патологического процесса. Полученные данные расширяют экспериментальную базу для изучения патологических процессов, происходящих при ИМ, и позволяют адекватно экстраполировать данные экспериментов в клинику.

Впервые проведена комплексная оценка содержания в крови провоспали-тельных цитокинов в сравнительном аспекте при остром инфаркте миокарда. Выявлены однонаправленные изменения показателей вне- и внутриклеточного (моноциты) содержания интерлейкина 1 р, интерлейкина 6 и фактора некроза опухоли а в крови в динамике острого инфаркта миокарда. Установлено, что уровни вне- и внутриклеточного содержания провоспалительных цитокинов в крови коррелируют со степенью поражения сердечной мышцы.

Новыми являются разработанные математические модели морфофункцио-нального состояния иммунной системы при поражении сердечной мышцы различной степени тяжести при остром ИМ в эксперименте и клинике. Определён перечень наиболее значимых иммунологических показателей для оценки выраженности иммуновоспалительных реакций в динамике острого инфаркта миокарда.

Научно - практическая значимость работы

Полученные экспериментальные и клинические данные дополняют и углубляют представления о патогенетическом значении компонентов иммунной системы и процессов апоптоза лимфоцитов в развитии и исходах инфаркта миокарда.

Разработанные методические подходы к оценке чувствительности лейкоцитов крови к нейромедиаторам вегетативной нервной системы с использованием математического моделирования являются перспективными для изучения механизмов нейро-иммунных взаимодействий при различных патологических состояниях в клинике и эксперименте.

Комплексная оценка и сопоставление особенностей состояния иммунной системы человека и экспериментальных животных (собаки), с разработкой математических моделей позволяет повысить эффективность диагностики и прогнозирования исходов острого инфаркта миокарда.

Разработана и зарегистрирована в Роспатенте (Свидетельство о регистрации № 2006610352) компьютерная программа для мониторинга состояния иммунной системы пациентов при различных патологических состояниях.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты диссертационного исследования внедрены в научную работу Института экспериментальной медицины и биотехнологий, в научную и учебно-методическую работу кафедр общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии; факультетской педиатрии; гистологии и эмбриологии, в практическую работу отделения гематологии и трансфузиологии; нефрологии, хирургического отделения пересадки органов Клиник ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Основные положения, выносимые на защиту

1 Нейромедиатор парасимпатического звена вегетативной нервной системы ацетилхолин индуцирует апоптоз лимфоцитов крови человека и животных в условиях инкубации in vitro.

2 В зависимости от степени поражения сердечной мышцы при остром инфаркте миокарда наблюдаются различные по выраженности, но одинаковые по направленности динамические изменения в состоянии иммунной системы, отражающие этапы развития иммуновоспапительных процессов в организме.

3 Динамические изменения состояния модельной системы иммунного гомео-стаза человека и животных в первые две недели после возникновения инфаркта миокарда характеризуются общими закономерностями, что позволяет использовать экспериментальную модель инфаркта миокарда у собак для разработки патогенетически обоснованной иммунокорригирующей терапии при данном заболевании.

4 Математическое моделирование морфофункционального состояния иммунного гомеостаза необходимо для объективной оценки характера реагирования иммунной системы на возникновение острого инфаркта миокарда и определения наиболее значимых прогностических показателей.

Апробация работы

Результаты исследований доложены на Итоговых годичных конференциях ЦНИЛ Куйбышевского медицинского института (Куйбышев, 1990, Самара, 1994, 1996); II Всероссийском симпозиуме с международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии» и конференции «Теория и практика клеточных биотехнологий» (Самара, 2004); Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации», посвящённой памяти члена-корреспондента АМН СССР проф. Ф.М. Ла-заренко (Оренбург, 2008); X международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН СССР А.Д. Адо (Казань, 2009); VII Российской конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической иммунологии и аллергологии» (Архангельск, 2009); XIII Всероссийском форуме с международным участием им. Академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009), VII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 160-летию со дня рождения И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 20 работ, в том числе 9 - в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации, монография; зарегистрирована компьютерная программа в Роспатенте.

Объём и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследований», 7 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, который содержит 226 работ отечественных и 342 - зарубежных авторов, приложения. Работа изложена на 210 страницах машинописного текста, содержит 33 таблицы и 51 рисунок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Экспериментальные исследования были проведены на 54 взрослых беспородных собаках массой тела от 15 до 20 кг обоего пола с соблюдением современных принципов биоэтических норм. Инфаркт миокарда у собак вызывали перевязкой нисходящей ветви левой венечной артерии на границе верхней и средней её трети [Виноградов С.А., 1955]. Для этого у животных в состоянии премедикации проводили интубирование, катетеризацию бедренной вены, получали кровь для исследования (контроль), вводили тиопентал натрия медленно до исчезновения корнеального рефлекса и снимали исходную электрокардиограмму (ЭКГ) в 12 отведениях с помощью электрокардиографа ЭЛКАР-6. Через 40 минут после перевязки коронарной артерии проводили повторную запись ЭКГ для подтверждения воспроизведения инфаркта миокарда. Через 1, 3, 7 и 14 суток у животных в состоянии премедикации проводили взятие крови из бедренной вены для иммунологического исследования, снимали ЭКГ; животных выводили из эксперимента передозировкой наркоза, забирали материал для морфологического исследования из центра ишемизированной области миокарда. Из парафиновых срезов миокарда готовили гистологические препараты, окрашивали* гемаггоксилин-эозином, анализировали при увеличении светового микроскопа 8x20.

Для оценки состояния иммунной системы человека при остром ИМ были исследованы образцы крови 49 пациентов - мужчин в возрасте 44-56 лет (52,5±2,7 лет): 29 человек (59,2%) с острым ИМ с патологическим зубцом (}, у 3-х из которых (5,1%) в период наблюдения развился повторный ИМ; 20 больных (40,8%) с острым ИМ без формирования зубца О, у 1 -го из которых (2,0%) в период наблюдения развился повторный инфаркт миокарда с зубцом 0. Диагноз ИМ у больных был выставлен на основании клинических признаков, лабораторных показателей и данных ЭКГ. Все больные острым ИМ получали стандартную терапию (З-блокаторами, дезагрегантами, антикоагулянтами, нитратами, ингибиторами ангиотензинпревращающего фермента. У всех обследо-

ванных пациентов в анамнезе имела место ишемическая болезнь сердца, отсутствовали сопутствующие заболевания, вызывающие выраженные изменения иммунного статуса, ранее перенесённый инфаркт миокарда.

В группу контроля вошло 37 практически здоровых мужчин сопоставимого возраста (52,7±2,5 лет). Все исследования крови проводились на основании добровольно-информированного согласия. Для иммунологических исследований кровь у больных острым ИМ и здоровых добровольцев получали из локтевой вены утром натощак на 1-е, 3-й, 7-е, 14-е и 21-е сутки после возникновения инфаркта миокарда.

Комплексную оценку иммунной системы при ИМ в клинике и эксперименте осуществляли с помощью иммунологических, морфологических, морфо-метрических методов и методов лазерной проточной цитометрии. По результатам исследования мазков периферической крови, окрашенных по Романовско-му-Гимзе, рассчитывали лейкоцитарную формулу крови и индексы: лейкоцитарный индекс интоксикации по Кальф-Калифу: ЛИИ = (4Мл+Зме-таМл+2Г1+С)-(Пл+1) /(Л + Мон)-(Э+1); индекс сдвига лейкоцитов крови: ИСЛК = (Э+Б+С+П+Мл+метаМл)/(Л+Мон); лимфоцитарно-гранулоцитарный индекс: ЛГИ=Л • 10/(Мл+метаМл+П+С+Э+Б) [Караулов A.B., 1999].

Оценку морфометрических параметров лимфоцитов, нейтрофильных гра-нулоцитов и моноцитов крови проводили в окрашенных мазках с помощью автоматизированной системы визуализации изображений и микроскопа Olympus (Япония), программного обеспечения Image Tool (UTHSCSA, Version 2.00, США). Определяли площадь лейкоцитов (Sk), их ядер (Бя), ядерно-цито-плазматическое отношение [ЯЦО= 5я/(5к-8я)]. Оценку структурно-функциональных характеристик клеток крови проводили методом лазерной проточной цитофлюориметрии на проточном цитометре Becton Dickinson FACS Calibur с помощью компьютерной программы Cell Quest Pro (США). Анализировали параметры светорассеяния: фронтального - forward scattering (FSC), характеризующего размеры клеток, и бокового - side scattering (SSC), интегрально оценивающего структурную «гранулярность» лейкоцитов.

Определение активности миелопероксидазы, содержания фосфолипидов и гликогена в нейтрофильных гранулоцитах определяли с помощью тест-систем производства «Абрис Плюс» (Санкт-Петербург, Россия) с расчётом среднего цитохимического коэффициента, согласно приложенным инструкциям.

Уровень провоспалителькых цитокинов: интерлейкина-ф (IL-lff), интер-лейкина-6 (IL-6) и фактора некроза опухоли a (TNFa) в сыворотке, плазме и на-досадке клеток крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью тест-систем производства ЗАО Вектор-Бест (Новосибирск, Россия); С-реактивного белка (С-РБ) в сыворотке крови - методом ИФА (тест-системы производства НПК ИМТЕК, Россия) на иммунофермент-ном анализаторе «Пикон» (Москва, Россия). Внутриклеточное содержание цитокинов оценивали методом проточной цитометрии, используя конъюгирован-ные с флюорохромами мышиные моноклональные антитела к ILl-(3, IL-6 и TNFa человека (R&D Systems, США), согласно инструкции производителя. Определяли базальный уровень цитокинов в сыворотке и плазме крови, а также способность клеток вырабатывать цитокины in vitro после 4-х часов инкубации цельной гепаринизированной крови в присутствии (опыт) и отсутствии (контроль) бактериального липополисахарида (Sigma, США). Рассчитывали индекс стимуляции (ИСт) продукции цитокинов по отношению разностей показателей контроля и опыта к показателю контроля, результат выражали в условных единицах.

Содержание иммуноглобулинов классов А, М, G (IgA, IgM, IgG) в сыворотке крови определяли методом радиальной иммунодиффузии с помощью тест-систем производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (Москва, Россия). Оценку гемолитической активности системы комплемента проводили по 50%-му гемолизу сенсибилизированных эритроцитов барана (ФримельГ., 1987).

Чувствительность лимфоцитов крови к действию ацетилхолина и норадре-напина in vitro определяли по изменению морфометрических и морфострук-турных характеристик, ДНК-цитометрии, экспрессии CD95- и CD3- антигенов

клетками до и после инкубации с различными разведениями нейромедиаторов в питательной среде RPMI 1640 (ПанЭко, Россия). Для этого кровь (при проведении ДНК-цитометрии - суспензию мононуклеарных клеток, выделенных с помощью градиента плотности Lympholyte, Канада) в объеме 0,1 мл вносили в пластиковые микропробирки на 1,5 мл и инкубировали при температуре 37°С в атмосфере 5%-ого С02 в течение 1-го, 2-х и 24-х часов с равным объемом питательной среды (контроль), ацетилхолина хлорида (Диа М, Россия) или норадре-налина гидротартрата (раствор для инъекций, ГНИИ стандартизации и контроля лекарственных средств МЗ России), используемых в конечных концентрациях МО"3, МО'5 и 1 •10" моль/л, или преднизолона (Gedeon Richter, Германия; конечная концентрация МО"3, 0,5-10"3 и 0,25-10"3 моль/л). Через 1 и 2 часа инкубации проводили оценку жизнеспособности с трипановым синим (Sigma, США), определяли морфометрические (площадь клетки и ядра, ЯЦО) и морфоструктурные характеристики (FSC и SSC) лейкоцитов. Через 24 часа определяли относительное количество CD3 , CD3 CD95 , CD3 CD95 - лимфоцитов с учетом параметров FSC и SSC; осуществляли ДНК-цитометрию методом проточной цитомет-рии (тест-системы DNA QC, Becton Dickinson, США) и иммунофлюоресцен-ции (микроскоп Люмам - ПР1 производства ЛОМО, Россия), используя окраску пропидиума йодидом (Sigma, США). Для каждого показателя рассчитывали в условных единицах индекс сдвига значений под действием нейромедиатора или гормона (ИСд), как отношение разностей показателей опыта и контроля к показателю контроля.

Влияние ацетилхолина и норадреналина на нейтрофильные гранулоциты оценивали по изменению их фагоцитарной активности в тесте поглощения по-листерольного латекса [Фримель Г., 1987] после инкубирования гепаринизиро-ваной крови в течение 2-х часов при температуре 37°С в питательной среде RPM1 1640 в атмосфере 5%-ого С02 в присутствии ацетилхолина или норадреналина. По полученным данным рассчитывали индекс сдвига нейромедиатора, как описано выше.

Для иммунофенотипирования лейкоцитов крови человека методом проточной цитометрии использовали следующие комбинации моноклональных антител (Caltag, Австрия): CD14-FITC+CD45-PE, CD8-FITC+CD4-PE+CD3-Рс5, CD3-FITC+CD19-PE, CD3-FITC+CD16-PE+CD56-PE, CD3-FITC+CD25-РЕ, CD3-FITC+CD95-PE, CD3-FITC+HLA-DR-PE. Для дополнительной характеристики функционального состояния лейкоцитов оценивали интенсивность флюоресценции меченых моноклональных антител на соответствующих клетках, используя параметры «Меап», отражающие среднестатистическое положение максимума пика распределения частиц на гистограммах в выбранном канале флюоресценции в программе Cell Quest Pro.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью параметрических и непараметрических методов анализа. Рассчитывали средние арифметические значения (М), их средние квадратичные отклонения (с). Сравнение групповых данных проводилось с использованием критерия Стью-дента, для возможности применения которого предварительно вычисляли критерий Фишера-Снедекора. В случае отсутствия нормального распределения -использовали критерий Манна-Уитни (Вилкоксона). Взаимозависимость между рядами оценивалась с помощью рангового анализа сопряженности по Спир-мену. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05. Данные представлены в виде М±а (Реброва О.Ю., 2002). Для оценки характера и направленности изучаемых процессов на математических моделях применяли системный многофакторный анализ, в процессе которого вычисляли интегральные показатели (XBi) и весовые коэффициенты (коэффициенты влияния) конкретных показателей (Pi) [Углов Б.А. и др., 2004],

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка проапоптотического действия нейромсдиаторов норадрена-лина и ацетилхолина на лимфоциты in vitro

На первом этапе исследования нами были разработаны методологические подходы (условия инкубации, концентрации нейромедиаторов, показатели морфофункционального состояния клеток) к оценке проапоптотического дей-

14

ствия норадреналина и ацетилхолина на лимфоциты крови практически здоровых лиц и интактных животных, Апоптотическое действие нейромедиаторов на лимфоциты крови оценивали в сравнении с классическим индуктором апоп-тоза лимфоцитов - преднизолоном. В ходе проведения нескольких серий предварительных экспериментов in vitro нами было установлено, что оптимальными условиями для оценки влияния исследуемых веществ на лимфоциты крови при 37°С являются конечные концентрации норадреналина и ацетилхолина в крови человека - 1-Ю"5 моль/л, собак - 1-Ю"6 моль/л (кровь собак), преднизоло-на - 0,25 -103 моль/л (для крови человека и собаки); время инкубации для оценки морфометрических и морфоструктурных характеристик клеток - 2 часа, ДНК-цитометрии и оценки экспрессии CD95- и СОЗ-антигенов - 24 часа. Эти условия инкубации были нами использованы в дальнейших исследованиях.

В ходе оценки проапоптотического действия нейромедиаторов на лимфоциты нами было установлено, что инкубация крови практически здоровых лиц и интактных животных с норадреналином в течение 2-х часов не приводила к изменениям морфометрических и морфоструктурных характеристик лимфоцитов, в то время как в присутствии преднизолона и ацетилхолина наблюдалось снижение значений показателей площади клеток и ядер, параметра FSC и повышение ЯЦО, что может свидетельствовать об апоптоти-ческих изменениях в клетках под влиянием ацетилхолина и преднизолона (рисунок 1).

Известно, что на лейкоцитах, способных воспринимать сигналы к апопто-тической гибели, экспрессируется CD95 (Fas)-aimireH. Вместе с тем, этот антиген рассматривается как активационный, появляющийся, прежде всего, на активированных клетках, гиперпродукция которых будет в дальнейшем ограничиваться их гибелью по пути апоптоза [Барышников и др., 2002]. В связи с этим для комплексной характеристики проапоптотического действия нейромедиаторов нами была проведена оценка изменений экспрессии CD95- антигена на поверхности лимфоцитов крови, как признак апоптотической гибели.

(человек) (человек) (животные) (животные)

□ площадь клетки ЕЗ площадь ядра □ ЯЦО ■ FSC

Рисунок 1 - Изменение морфоструктурных характеристик лимфоцитов крови человека и экспериментальных животных после 2-х часов инкубации с ацетил-холином и преднизолоном (данные представлены в процентах к соответствующим контрольным значениям)

Определяли содержание CD95+, CD3+95+ и CD3"95+ лимфоцитов, параметров FSC данных клеток вместе с уровнем гиподиплоидных лимфоцитов после 24-х часов инкубации in vitro в тех же условиях.

Анализ полученных результатов показал, что инкубация крови с норад-реналином приводила к снижению экспрессии CD95- и CD3- антигенов на лимфоцитах, но при этом изменений значений FSC параметров и содержания ДНК, характерных для апоптоза лимфоцитов, не происходило (рисунок 2).

Присутствие ацетилхолина в инкубационной среде статистически значимо увеличивало относительное содержание CD95+ -, CD3+95+ - и CD3"95+лимфоцитов, по сравнению с контролем, в 1,7; 1,95 и 1,4 раза соответственно и изменению ИСд показателей. При этом под влиянием ацетилхолина на гистограммах распределения клеток по параметру FSC появлялся дополнительный пик, свидетельствующий о появлении лимфоцитов с уменьшенными размерами. Одновременно при проведении ДНК-цитометрии на гистограммах появлялся выраженный пик гиподиплоидных клеток: процент гиподиплоидных лимфоцитов возрастал до 11,5±1,2 (р<0,001) против 0,5±0,2 в контроле.

□ ацетилхолин □норадреналин О преднизолон

1 - CD3'(%); 2- CD3'95*(%); 3- CD3"95'(%); 4- CD95*(%); 5- CD3'95'(FSC); 6-CD3"95'(FSC); 7- CD95'(FSC); 8- гиподиплоидные лимфоциты (%).

Рисунок 2 - Сравнительная оценка чувствительности лимфоцитов крови к ацетилхолину, норадреналину и преднизолону

Преднизолон оказывал аналогичное действие на изменение параметра FSC и содержание ДНК в лимфоцитах, но увеличение содержания клеток, позитивных по СВ95-антигену было не столь выраженным, как под влиянием ацетил-холина.

Таким образом, оценка in vitro чувствительности лимфоцитов крови практически здоровых лиц и интактных животных к проапоптотическому действию нейромедиаторов вегетативной нервной системы показала, что в использованных условиях инкубации ацетилхолин способен индуцировать апоптоз лимфоцитов, а норадреналин только подавляет их активность, снижая экспрессию CD3- и CD95- антигенов. Разработанные методические подходы к оценке проапоптотического действия нейромедиаторов на лимфоциты были использованы нами в дальнейшем в комплексной оценке состояния иммунитета в динамике ИМ с учётом нейроиммунных взаимодействий.

Оценка морфофункционплыюго состояния лейкоцитов крови при экспериментальном инфаркте миокарда

При перевязке коронарной артерии ИМ был подтвержден характерными изменениями на ЭКГ и/или морфологическими признаками у 49 из 54 проопе-

17

рированных собак (90,7%): у 24 животных (44,4%) развивался трансмураль-ный, в 27 случаях (50,0%) - нетрансмуральный инфаркт миокарда. В 7,4% случаев при развитии нетрансмурального ИМ не было выявлено наличия патологического зубца С? на ЭКГ, однако, некроз сердечной мышцы был обнаружен на гистологических препаратах. Следует отметить, что у четырёх собак (7,4 % от числа прооперированных животных) на ЭКГ были выявлены признаки нового повреждения миокарда: у одной на 7-е и у трёх - на 14-е сутки эксперимента, в дальнейшем подтверждённые морфологически.

Анализ гистологических препаратов выявил характерные для экспериментального ИМ морфологические изменения в сердечной мышце животных: через 24 часа после операции в зоне ишемии обнаруживались признаки, характерные для завершения прединфарктной стадии; через 3-е суток морфологические изменения в сердечной мышце соответствовали стадии формирования ИМ; на 7-е сутки эксперимента обнаруживались признаки организации ИМ. При нетрансмуральном ИМ к 14-м суткам наблюдения выявлялись признаки завершения стадии организации ИМ, начала процессов рубцевания; при транс-мурапьном ИМ в эти сроки процессы организации ИМ прогрессировали незначительно по сравнению с 7-ми сутками, что означало некоторое замедление процессов заживления. При этом у двух животных данной группы на 7-е сутки и у трёх собак на 14-е сутки эксперимента были выявлены рецидивирующие инфаркты на фоне распространенных первичных трансмуральных очагов.

При изучении особенностей состояния лимфоцитов крови в динамике трансмурального и нетрансмурального ИМ й эксперименте нами были проанализированы изменения 20-ти показателей, характеризующих морфологические, морфометрические параметры, выраженность процессов апоптоза и чувствительность к нейромедиаторам симпатического и парасимпатического звеньев вегетативной нервной системы.

При возникновении нетрансмурального ИМ в эксперименте были выявлены изменения показателей морфофункционального состояния лимфоцитов

крови в зависимости от срока реализации возникшего патологического процесса (рисунок 3).

1 - содержание лейкоцитов

2 - относительное содержание лимфоцитов

3 -абсолютное содержание лимфоцитов

4 - площадь клетки 5 -площадь ядра ядра

6 - ядерно-цитоплазматическое отношение

7 -Индекс сдвига ацетилхолина (площадь клетки)

8 - Индекс сдвига ацетилхолина (площадь ядра)

9 - Индекс сдвига ацетилхолина (ЯЦО)

10 - Индекс сдвига норадреналина (площадь клетки)

11 - Индекс сдвига норадреналина (площадь ядра)

12 - Индекс сдвига норадреналина (ЯЦО)

□ кош роль

О иетрансмуральный инфаркт миокарда ОНраисмурилышй инфарю миокарда

Рисунок 3 - Изменение основных параметров морфофункционального состояния лимфоцитов крови собак в динамике экспериментального инфаркта миокарда (данные представлены в процентах к соответствующим контрольным значениям)

Через сутки после перевязки коронарной артерии в крови у собак происходило снижение относительного содержания лимфоцитов. Для них было характерно значительное увеличение размеров клеток и ядер. При этом прирост площади ядер преобладал и приводил к повышению ЯЦО, что могло быть связано с перераспределением популяционного состава лимфоцитов и активацией клеток вследствие неспецифической реакции лейкоцитов на стресс. В данный срок эксперимента отмечалось повышение чувствительности клеток к про-апоптотическому действию ацетилхолина in vitro.

На 3-й сутки наблюдалось снижение числа лейкоцитов в крови, возрастало содержание лимфоцитов, отмечалась некоторая стабилизация

размеров клеток, однако, повышенные значения ЯЦО сохранялись. Чувствительность клеток к ацетилхолину продолжала нарастать.

Реализация процессов организации инфаркта миокарда (7-е сутки эксперимента) сопровождалась нормализацией морфометрических параметров клеток. Оставались изменёнными только параметры, характеризующие чувствительность лимфоцитов к ацетилхолину.

На 14-е сутки после возникновения нетрансмурапьного ИМ наблюдалось практически полное восстановление большинства показателей состояния лимфоцитов крови, их чувствительности к ацетилхолину, оставались повышенными (р<0,05) только значения абсолютного содержания лимфоцитов.

При развитии трансмурального ИМ характер изменений морфофункцио-напьного состояния лимфоцитов крови отличался более выраженным снижением относительного содержания лимфоцитов в крови в течение всего срока наблюдения и повышением чувствительности клеток к ацетилхолину. В 1-е сутки формирования очага некроза в сердечной мышце циркулирующие в крови лимфоциты отличались низким ЯЦО из-за интенсивного снижения площадей их ядер. Чувствительность лимфоцитов к ацетилхолину достигала максимальных уровней. На 3-й сутки после операции, в стадию формирования ИМ, отмечалась некоторая стабилизация морфометрических параметров лимфоцитов крови. При этом чувствительность клеток к ацетилхолину начинала постепенно снижаться. На 7-е и 14-е сутки после операции при нормализации большинства морфологических признаков чувствительность лимфоцитов к апоптотиче-скому действию ацетилхолина оставалась высокой. Необходимо отметить, что максимальные значения индексов сдвига ацетилхолина наблюдались у животных непосредственно до возникновения новых очагов некроза в сердечной мышце на фоне развившегося трансмурального инфаркта миокарда.

Таким образом, в ходе исследования были выявлены сложные, отличающиеся по выраженности, динамические изменения состояния лимфоцитов, зависящие от тяжести поражения сердечной мышцы. Наиболее значительные изменения были характерны для показателей чувствительности лимфоцитов к

проапоптотическому действию ацетилхолина, максимальные при трансму-ральном инфаркте миокарда. Все это свидетельствует о реактивном характере изменений показателей морфофункционального состояния лимфоцитов, максимально выраженных на начальных этапах реализации патологического процесса в сердечной мышце и отражающих, в первую очередь, неспецифическую реакцию лимфоцитов на появление очага некроза в организме. Выявленные изменения чувствительности к ацетилхолину при отсутствии реакции на норадреналин свидетельствуют о структурных и функциональных перестройках в лимфоцитах, связанных с их вовлечением в патологический процесс при ИМ и о регуляции вегетативной нервной системой иммунологических реакций посредством модуляции апоптоза лимфоцитов.

С целью проведения интегральной и объективной оценки выявленных изменений в лимфоцитах, а также определения закономерностей и направленности их реагирования в динамике экспериментального ИМ мы применили системный многофакторный анализ с построением математических моделей (рисунок 4).

а °'51

^0,45 ■

* 0.35 -0.3 0.25 -0,2 ♦ 0.15 0.1 -0.05 - )■ О--

I сугкн 3 СУ1КИ 7 сугки ' 14 су!КИ

•...... |[С||Ш|К:МУ|Х«Л|.1|МЛ Ш[с|к1ркт ми1!ка{\>ш ■ — т|шцсму|шл1.||Ы| и[к|щ|1КТ мыокарли — |№рмц

Рисунок 4 - Изменения интегральных показателей морфофункционального состояния лимфоцитов крови собак при экспериментальном инфаркте миокарда

Анализ математической модели морфофункционального состояния лимфоцитов крови собак при возникновении нетрансмурапьного ИМ выявил максимальную активацию системы на 1-е сутки и постепенную нормализацию состояния к 14-м суткам наблюдения. В 1-е и 3-й сутки после возникновения нетрансмурапьного ИМ наибольшее влияние на общее состояние модельной

21

системы лимфоцитов, оцененное по изменениям весовых коэффициентов отдельных показателей, оказывали значения ЯЦО (Р1=388,6 и 545,3, соответственно), относительное содержание лимфоцитов в крови (Р1= 147,0 и 60,1, соответственно), индексы сдвига ацетилхолина по площадям клетки (Р1=136,3 и 116,4, соответственно).

На 7-е сутки эксперимента наибольшее влияние имели значения ЯЦО (РН170.3), общее содержание лейкоцитов (Р1= 100,1) и индекс сдвига ацетилхолина по площади клеток (Р1=85,3). На 14-е сутки после развития нетрансму-рального ИМ, при приближении интегрального показателя к норме, максимально высокие значения весовых коэффициентов были у ЯЦО (Р1=389,2); индекса сдвига ацетилхолина (Р1=113,3); относительного содержания лимфоцитов (Р1= 100,7).

При развитии трансмурального экспериментального ИМ характер и направленность математической модели морфофункционального состояния системы лимфоцитов крови отличались от описанных для нетрансмурального, особенно на 3-й сутки эксперимента. К 14-м суткам наблюдения имели место признаки активации системы, выражающиеся в увеличении значений интегрального показателя. Полной нормализации состояния модельной системы лимфоцитов не происходило. Через сутки после развития трансмурального ИМ наиболее значимый вклад в функционирование системы вносили такие параметры лимфоцитов, как индекс сдвига ацетилхолина по площади ядра (РН342,9) и площади клетки (Р1=297,2), ЯЦО (Р1= 100,2). На 3-й сутки эксперимента - в момент максимального отклонения состояния системы от нормы -наиболее важными для её активности являлись показатели, характеризующие чувствительность клеток к апоптотическому действию ацетилхолина (для показателей индекса сдвига ацетилхолина по площади лимфоцитов Р1=562,0). На 7-е сутки наибольшее влияние на морфофункциональное состояние системы оказывали ЯЦО (Р1=542,0) и индекса сдвига ацетилхолина по площади лимфоцитов (Р1= 102,0). На 14-е сутки наиболее важными для состояния системы

явились изменения ЯЦО (Р1=545,5) и относительное содержание лимфоцитов в крови (Р1=104,5).

Таким образом, в динамике развития экспериментального инфаркта миокарда отмечаются колебательные изменения активности лимфоцитов с максимальным отклонением от нормы на 1-е (при нетрансмуральном ИМ) и 3-й (трансмуральный ИМ) сутки после перевязки коронарной артерии. Наиболее выраженные отклонения в состоянии модельной системы лимфоцитов от нормы наблюдаются при трансмуральном инфаркте миокарда. Наиболее значимыми для состояния системы являются показатели ЯЦО и чувствительности лимфоцитов к проапоптотическому действию ацетилхолина, что подтверждает важную роль парасимпатической нервной системы в регуляции иммунокомпе-тентных клеток при экспериментальном инфаркте миокарда.

Вне зависимости от степени повреждения сердечной мышцы в начальный период формирования очага некроза в миокарде именно изменения парасимпатической регуляции состояния иммунной системы являются ведущими. В стадию формирования ИМ (3-й сутки), в момент максимальной активации системы при нетрансмуральном ИМ критическое значение имеют значения ЯЦО и сниженное содержание лимфоцитов в крови, а при трансмуральном - высокая чувствительность клеток к ацетилхолину. На 7-е сутки, в период организации ИМ, при его более тяжелом течении чувствительность клеток к ацетилхолину менее выражена. В период завершения стадии организации ИМ и начала процессов рубцевания (14-е сутки), возрастание коэффициентов влияния ацетилхолина на лимфоциты является отражением напряженности системы и готовности лимфоцитов к восприятию регулирующих сигналов. Максимальная выраженность значений коэффициентов влияния показателей чувствительности лимфоцитов к ацетилхолину является признаком неблагоприятного течения патологического процесса.

При изучении особенностей состояния нейтрофильных гранулоцитов крови собак в динамике нетрансмурального и трансмурального ИМ в эксперименте нами были проанализированы изменения 16-ти показателей, характеризующих морфологические, морфометрические, цитохимические параметры,

фагоцитарную активность и чувствительность к нейромедиаторам симпатического и парасимпатического звеньев вегетативной нервной системы - ацетил-холину и норадреналину в реакции фагоцитарной активности; проведены расчет и оценка лейкоцитарных индексов (ИСЛК, ЛИИ).

При возникновении нетрансмурапьного ИМ у собак реализация стадий формирования, организации и начала рубцевания ИМ сопровождалась динамическими изменениями показателей морфофункционального состояния нейтро-фильных гранулоцитов (рисунок 5).

Рисунок 5 - Изменения основных параметров морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов крови собак в динамике экспериментального инфаркта миокарда (данные представлены в процентах к соответствующим контрольным значениям)

В 1-е сутки в крови животных на фоне выраженного увеличения общего количества лейкоцитов статистически значимо (р<0,05) возрастало относительное и абсолютное содержание нейтрофильных гранулоцитов (в 1,9 и 1,7 раз по

9 В

1 - Содержание лейкоцитов, КЛ.7 с 10 /л

2 - Относительное содержание нейтрофильных гранулоцитов, %

14 сутки 3- Абсолютное содержание нейтрофильных гранулоцитов.клеток хК) /л

4- Индекс сдвига лейкоцитов крови

5 - Лейкоцитарный индекс интоксикации

6 -Площадь клетки., мкм

7 - Плошадь ядра, мкм2

8 - Ядсрно-цнтопяазматичсскос отношение

9 - Активность мислопсрокскдазы, усл.сд. Ю - Содержание гликогена, усл.сд.

11 - Содержание фосфолипидов. усл. сд

12 - Фагоцитарная активность лсйкоцитов,%

13 - Фагоцитарная активность лейкоцитов в присутствии ацстилхояина.%

14 - Фагоцитарная активность лейкоцитов в присутствии норадрсналина.%

15 - Индекс сдвига ацетнлхолина. усл.сд. 16- Индекс сдвига норадрсналина. усл.сд.

р контроль

Онетрансмуральный инфаркт миокарда ртрансмуральный инфаркт миокарда

1 сутки

3 сутки

7 сутки

сравнению с контролем, соответственно). Происходило увеличение значений ИСЛК и ЛИИ в 2,5 раза и в 1,6 раза соответственно; морфометрические характеристики при этом не изменялись. Возрастали активность миелопероксидазы и фагоцитарная активность, увеличивалось содержание в клетках гликогена.

Описанные изменения свидетельствовали о функциональной активации нейтрофильных гранулоцитов и перераспределительном лейкоцитозе, связанном со стрессовой реакцией организма на возникновение очага некроза. Оценка чувствительности нейтрофильных гранулоцитов к нейромедиаторам вегетативной нервной системы выявила снижение реакции клеток на норадренапин и ацетилхолин. На 3-й сутки выраженность изменений количественных и функциональных показателей нейтрофильных гранулоцитов снижалась. Реакция клеток на норадренапин нормализовалась, чувствительность к ацетилхолину возрастала. На 7-е сутки оставались повышенными только ИСЛК и ЛИИ (р<0,05). К 14-м суткам эксперимента происходила нормализация большинства показателей морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов.

При развитии трансмурального ИМ изменения морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов крови были более значительными.

В 1-е сутки формирования очага некроза в сердечной мышце отмечался максимально выраженный нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом лейкоцитарной формулы крови влево, вследствие чего максимально возрастали значения ИСЛК и ЛИИ. В нейтрофильных гранулоцитах значительно падала активность миелопероксидазы, уменьшалось содержание .гликогена и возрастало содержание фосфолипидов, клетки отличались сниженной фагоцитарной активностью. Чувствительность клеток к норадреналину была максимальной, к ацетилхолину - минимальной.

На 3-й сутки отмечалась тенденция к нормализации показателей состояния нейтрофилов, однако, менее выраженная, чем при нетрансмуральном ИМ. На 7-е сутки эксперимента были повышены средние значения относительного содержания нейтрофильных гранулоцитов, их площадь, ИСЛК, снижена чувствительность клеток к норадреналину и ацетилхолину. У животных с развив-

шимся в дальнейшем повторным ИМ отмечалась максимальная выраженность указанных изменений. К 14-м суткам достоверно повышались средние значения общего содержания лейкоцитов в кровотоке и абсолютное количество ней-трофильных гранулоцитов, ЛИИ, ИСЛК, ЯЦО, реакция нейтрофильных грану-лоцитов на нейромедиаторы вегетативной нервной системы оставалась сниженной.

Математические модели морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов крови при нетрансмурапьном и трансмурапыюм ИМ отличались по выраженности отклонений интегральных показателей от нормы, однако общая направленность изменений активности системы была сходной с отклонением в сторону отрицательных величин на 7-е сутки (рисунок 6).

гранулоцитов крови собак в динамике экспериментального инфаркта миокарда

Анализ изменения ранжированных коэффициентов влияния показал, что при нетрансмурапьном ИМ в 1-е сутки развития патологического процесса наиболее значимыми для функционирования системы являлись показатели чувствительности к норадреналину (Р1=202,0); относительного содержания нейтрофилов (Р1=208,4); площади ядра (Р1=203,6), при трансмурапьном ИМ - ЛИИ (Р1=1664,4); активности миелопероксидазы (Р1=537,4); индекса сдвига ацетилхолина (Р1= 166,4). Ранжированное распределение коэффициентов влияния показателей на 3-й сутки нетрансмурального и трансмурального ИМ было одинаковым: наиболее весомыми были активность миелопероксидазы

(РИ538,4 и 412,5, соответственно), содержание фосфолипидов (Р1=334,6 и 212,5 соответственно), индекс сдвига ацетилхолина (Р1=105,3 и 102,5, соответственно).

На 7-е сутки наблюдения распределение показателей по значимости для функционирования системы отличались только тем, что максимальные значения при трансмуральном ИМ имело изменение площадей ядер нейтрофильных гранулоцитов (Р5=208,2). Через 14 суток, независимо от формы ИМ, ведущими были изменения значений площадей клеток, активности в них миелоперокси-дазы и, при трансмуральном ИМ, индексы сдвига ацетилхолина (Р1=102,4) и норадреналина (Р1=104,2).

В целом, системный многофакторный анализ морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов позволил выявить характерные закономерности реагирования данных клеток на возникновение очага некроза в сердечной мышце. Выраженность изменений морфофункционального состояния клеток отражает динамику их перераспределения в крови и тканях, а также функциональную активность в зависимости от этапов развития экспериментального ИМ. Установлено, что изменения показателей чувствительности нейтрофильных гранулоцитов к нейромедиаторам коррелировали с тяжестью течения патологического процесса.

Математическое моделирование морфофункционального состояния системы иммунного гомеостаза при экспериментальном инфаркте миокарда

С целью комплексной оценки морфофункционального состояния системы иммунного гомеостаза животных при экспериментальном ИМ нами на основе системного многофакторного анализа с учётом показателей, характеризующих морфофункционапьное состояние лейкоцитов крови, уровней иммуноглобулинов основных классов и С-РБ в крови, а также активности системы комплемента была создана математическая модель состояния иммунной системы в целом. Для рабочей модели были выбраны показатели с высокими значениями весовых коэффициентов в соответствующей модельной системе (рисунок 7).

0,3

8

0.2

0.1

0

7 сутки

1 сутки

3 сутки

14 сутки

-0.1

Рисунок 7 - Математические модели морфофункционального состояния иммунной системы при экспериментальном инфаркте миокарда

Согласно результатам сравнительного анализа математических моделей, в первые трое суток после воспроизведения экспериментального ИМ характер и направленность изменений активности иммунной системы определяется состоянием лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов крови. После 7-х суток максимально значимой является активность лимфоцитов крови.

При развитии трансмурального ИМ отклонения интегральных показателей иммунной системы от нормативных значений были наиболее выраженными. С учётом ранжированной оценки весовых коэффициентов, эти результаты отражают этапы реагирования иммунной системы на возникновение ИМ и подтверждают важную роль вегетативной нервной системы в регуляции иммунологических процессов при инфаркте миокарда.

Выявленные изменения чувствительности лейкоцитов крови к норад-реналину и ацетилхолину сопровождались изменениями морфометрических характеристик клеток, что могло явиться как отражением перераспределения популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов, так и изменением плотности рецепторов к нейромедиаторам на лейкоцитах в ответ на изменения активности вегетативной нервной системы.

Оценка морфофункционального состояния лейкоцитов крови у больных с острым инфарктом миокарда

Для определения закономерностей выявленных в эксперименте изменений и сопоставления их с клиническими данными, нами была проведена комплексная, на основе системного многофакторного анализа, оценка морфофункционального состояния системы иммунного гомеостаза человека при остром ИМ с патологическим зубцом <3 и без формирования зубца 0. При изучении особенностей состояния лимфоцитов крови были проанализированы изменения 38-ми показателей, характеризующих морфологические, морфометрические параметры клеток, их иммунофенотип, выраженность процессов апоптоза и чувствительность к норадреналину и ацетилхолину. Оценку морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов и гуморального иммунитета проводили в том же объёме, что и при экспериментальном инфаркте миокарда.

Анализ морфологических, морфометрических и морфоструктурных показателей лейкоцитов крови в динамике острого ИМ у человека выявил изменения, во многом сходные с описанными для экспериментального ИМ у собак. Исключение составила динамика изменений ЯЦО лимфоцитов, значения которого не отличались при остром ИМ с зубцом 0 и без зубца р. При возникновении острого ИМ с патологическим зубцом 9 изменения показателей морфофункционального состояния лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов также носили более выраженный характер, чем при ИМ без зубца О, без нормализации на 14-е и 21-е сутки. Как и при экспериментальном ИМ, наблюдались статистически значимые изменения морфометрических характеристик клеток и их чувствительности к норадреналину (нейтрофильные гранулоциты) и ацетилхолину с наибольшей выраженностью на 1-е и 3-й сутки. У пациентов с развившимся после 7-х суток повторным ИМ отмечалось максимальное снижение чувствительности клеток к ацетилхолину.

Общая направленность изменений морфофункционального состояния иммунной системы при остром ИМ в клинике и эксперименте была подтверждена при сопоставлении математических моделей (рисунок 8).

29

""•" 'нетраисмуральный инфаркт миокарда -трансмуральный инфаркт миокарда '—* норма

Рисунок 8 - Математические модели морфофункционапьного состояния лимфоцитов (А), нейтрофильных гранулоцитов (Б) человека при остром инфаркте миокарда

Максимальные отклонения интегральных показателей состояния лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов отмечались на 1-е и 3-й сутки, независимо от тяжести поражения сердечной мышцы. На 14-е и 21-е сутки при остром ИМ без зубца 0 интегральные показатели систем приближались к норме, в случае острого ИМ с патологическим зубцом 9 нормализации интегрального показателя не происходило. При сходной динамике изменений интегральных показателей, их отклонения от нормы в случаях ИМ у человека во все сроки наблюдения были более выраженными и длительными, чем при экспериментальном инфаркте миокарда у собак.

Распределение отдельных показателей морфофункционапьного состояния модельных систем в зависимости от их весовых коэффициентов в целом не отличалось от описанного для экспериментального ИМ, наибольшие значения Р1 имели такие показатели, как ЯЦО лимфоцитов, размер клеток, содержание

миелопероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах, чувствительность клеток к ацетилхолину, лейкоцитарные индексы.

Таким образом, проведённый анализ математических моделей морфо-функционального состояния лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов показал, что характер динамических изменений состояния лейкоцитов человека и собак при возникновении ИМ совпадает по выраженности и направленности, при этом отмечается более быстрая нормализация состояния модельных систем в случае экспериментального ИМ, связанная с ускоренными сроками заживления повреждения сердечной мышцы у животных.

У человека и экспериментальных животных в динамике ИМ наблюдаются сходные изменения чувствительности лейкоцитов к нейромедиаторам вегетативной нервной системы, прежде всего ацетилхолину, что подтверждает общебиологический характер выявленных изменений и возможность регуляции иммуновоспапительных реакций со стороны вегетативной нервной системы через механизмы апоптотической гибели лимфоцитов. Полученные данные подтверждают возможность использования модели экспериментального инфаркта миокарда у собак для разработки патогенетически обоснованной вспомогательной иммунокорригирующей терапии при инфаркте миокарда.

Для углубленной характеристики изменений в иммунной системе при ИМ и изучения механизмов действия нейромедиаторов вегетативной нервной системы на лимфоциты нами было проведено иммунофенотипирование лейкоцитов крови больных острым ИМ методами проточной цитометрии, изучены корреляционные взаимосвязи изменений морфо-структурных и иммунофенотипи-ческих характеристик клеток в зависимости от их чувствительности к норад-реналину и ацетилхолину.

Анализ результатов иммунофенотипирования лимфоцитов крови (рисунок 9) показал, что независимо от наличия или отсутствия патологического зубца 0 на ЭКГ, при остром ИМ через сутки после возникновения очагов некроза

17

16

□ контроль

Онетрансмуральный кнфарктммокарла (Зтрансмуральный инфаркт миокарда

21 250

.2

21 сутки

5

7

6

1 - СШ 'лимфоциты, %

2 - СОЗ'лимфоциты, клеток х Ю /л

3 - СОЗ'4'лимфоциты, %

4 - СОЗЧ'лпмфошггы, клеток к I0%

5 - СОЗ'8'лимфоциты, %

6 - СОЗ'8'лимфоциты, клеток к 10%

7 - СОЗ"8'лимфоциты, %

8 - СШ'8'лимфоциты, клеток х I 0 /л

9 - СШ"19'лимфоциты,%

10 - ССЗ"19'лимфотпы, клеток х 109/л ] I- СОЗ'16'56 лимфоциты, %

12 - СШ'!6'56лимфоциты, клеток х 10%

13- СОЗ'16'56'лимфоциты, %

14 - СИЗ' 16'56'лимфоциты, клеток х 10%

15-СОЗ*25'лимфоциты, %

16 - СБЗ '25 'лимфоциты, клеток х 10%

17- СОЗ'НЬА-ОИ' лимфоциты.%

18 - СОЗ'НЬЛ-ОЯ' лимфоциты, клеток к 10%

19- СОЗ'95'лимфоциты, %

20 - СОЗ'95'лимфоциты, клеток х 10%

21 -Яндекс сдвига ацетилхолина(по С095'), усл.ед.

Рисунок 9 - Изменение иммунофенотипических параметров лимфоцитов крови человека при остром инфаркте миокарда.

в сердечной мышце отмечалось увеличение относительного содержания С03'8 лимфоцитов по сравнению с контролем (р<0,01).

У больных острым ИМ с зубцом 9 содержание СОЗ^-клеток достигало максимальных значений, составляя в среднем 37,4 ±3,9% против 2б,1±1,9% и 31,4±2,1%, в контроле и группе больных с острым ИМ без зубца С), соответственно. Одновременно увеличивалось (р<0,01) относительное содержание других эффекторных клеток - СОЗ"8+- и СОЗ"16+56+-лимфоцитов. Процентное содержание СОЗ-, СОЗ 4 -, СОЗ"19 - клеток не изменялось, но их абсолютное количество уменьшалось вследствие значительного снижения (р<0,01) общего числа лимфоцитов в крови. При остром ИМ с зубцом 0 отмечалось значительное снижение процентного содержания СОЗ+25+- лимфоцитов (до 3,7±0,3%; в

контроле - 5,8±0,6%), СОЗ+НЬА-ГЖ'- лимфоцитов (до 6,8±0,4% против

11,1±1,9% в контроле) и СОЗ+95+клеток (до 6,3±0,04 % против 12,4±2,0% в контроле). Одновременно отмечалось снижение экспрессии СОЗ-антигена на активированных лимфоцитах. В случае острого ИМ без зубца Q изменений относительного содержания данных клеток, по сравнению с контрольными значениями, не происходило, имело место только снижение экспрессии СШ-антигена. Перераспределение субпопуляционного состава лимфоцитов крови сопровождалось увеличением чувствительности лимфоцитов к проапоптотическому действию ацетилхолина, при этом была выявлена сильная положительная корреляционная связь между изменениями значений площади клеток, параметров FSC и содержанием CD3+8+- (г=0,81 и 0,89, соответственно), CD3"8+- (г=0,79 и 0,85, соответственно) и СОЗ"16+56+-лимфоцитов (i=0,84 и 0,91, соответственно). Чувствительность к норадреналину не изменялась.

На 3-й сутки острого ИМ изменения субпопуляционного состава лимфоцитов и их чувствительности к ацетилхолину сохранялись и были более выраженными при остром ИМ с зубцом Q. Возрастала чувствительность клеток к норадреналину, что проявлялось снижением экспрессии CD3- и CD95- антигенов на лимфоцитах после инкубации крови с норадреналином in vitro.

На 7-е сутки у пациентов с острым ИМ без зубца Q содержание основных популяций и субпопуляций лимфоцитов статистически не отличалось от значений контрольной группы, но было повышено относительное и абсолютное содержание СОЗ+95+-клеток, чувствительность лейкоцитов к нейромедиаторам нормализовалась. У больных ИМ с патологическим зубцом Q содержание эффек-торных лимфоцитов оставалось повышенным, также повышалось количество СОЗ+95+-клеток, чувствительность клеток к ацетилхолину была высокой. Максимальные значения содержания CD3+8+- CD3'8+ - и CD3"16+56+ - лимфоцитов, экспрессии СОЗ-антигена и индексов сдвига ацетилхолина наблюдались у двух пациентов с развившимся на 9-е - 12-е сутки повторным инфарктом на фоне острого ИМ с зубцом Q.

На 14-е - 21-е сутки наблюдения в группе больных ИМ без зубца Q продолжалась нормализация популяционного и субпопуляционного состава лимфоци-

тов, их чувствительности к нейромедиаторам вегетативной нервной системы. При ИМ с зубцом 0 значения большинства показателей приближались к контрольным только на 21-е сутки, однако количество СОЗ+95+-клеток и чувствительность лимфоцитов к ацетилхолину оставались достоверно повышенными (Р<0,05).

Таким образом, иммунофенотипирование лимфоцитов показало, что при развитии острого ИМ уже в первые сутки отмечалось перераспределение суб-популяционного состава клеток за счёт значительного увеличения содержания лимфоцитов, выполняющих эффекторные функции (Т-цитотоксические клетки, естественные киллеры), наиболее выраженные при остром ИМ с зубцом

В дальнейшем при развитии резорбционно-некротических процессов в миокарде происходит дополнительная активация эффекторных лимфоцитов, повышение количества клеток, экспрессирующих поздний активационный маркер СБ95 и готовых воспринимать сигналы к индукции апоптоза. При этом наиболее неблагоприятными для течения острого ИМ является значительное (более чем в 1,5-2 раза) увеличение в крови относительного содержания СРЗ+8+-, СОЗ" 8+-, СОЗ'16+56- и С095+-лимфоцитов при повышенной чувствительности клеток к проапоптотическому действию ацетилхолина.

Выявленная тесная положительная корреляционная связь между количеством СОЗ+8+-, СОЗ'8+-, СОЗ"16+56- и СЭ95+- лимфоцитов в крови и чувствительностью лимфоцитов к проапоптотическому действию ацетилхолина, убедительно свидетельствует о том, что посредством апоптоза эффекторных клеток вегетативная нервная система, и прежде всего её парасимпатическое звено, регулирует интенсивность иммуновоспалительных реакций в организме.

Известно, что система моноцитов/макрофагов играет важную роль в реализации иммуновоспалительных реакций. Одной из ключевых функций данной системы является продукция провоспалительных цитокинов. В связи с этим в рамках комплексной оценки системы иммунного гомеостаза при остром ИМ нами была проведена оценка содержания 1Ь-1р, 1Ь-6 и Т№а в плазме крови при остром ИМ, а также способность лейкоцитов (моноцитов) крови боль-

ных ИМ вырабатывать провоспалительные цитокины при стимуляции бактериальным липополисахаридом in vitro.

При анализе спонтанных уровней провоспалительных цитокинов в плазме крови у всех больных ИМ (таблица 1) было выявлено статистически значимое (по сравнению с группой практически здоровых доноров) повышение IL-lp, IL-6 и TNFa через сутки после возникновения очага некроза в миокарде.

Таблица 1. Изменение уровней провоспалительных цитокинов в плазме крови больных острым инфарктом миокарда (М±а)

Показатель Контроль п =37 Острый инфаркт миокарда

1 сутки п=49 3 сутки п =49 7 сутки л =49 14 сутки п=49 21 сутки п =49

IL-lp, пг/мл 5,3 8± 1,8 64,7± 9,9* 57,4± 6,7* 27,4± 3,3* 10,4± 1,7 9,9± 1,3

IL-6, пг/мл П,2±2,5 40,1± 6,9* 46,1± 4,8* 27,4± 3,7* 17,б±2,1 15,4±2,1

TNFa, пг/мл 9,5±2,2 42,9± 8,7* 46,6± 5,3* 185,6±10,4* 92,3±10,6* 35,6±4,6*

Примечание: . - статистически значимые отличия (р<0,001) от соответствующих значений в группе практически здоровых доноров (контроль)

Статистически значимых отличий между группами больных ИМ с зубцом О и ИМ без зубца 0 не было выявлено. Через 3-е суток после возникновения ИМ показатели претерпевали незначительные изменения. На 7-е сутки заболевания отмечено значительное повышение уровня ТОРа в плазме крови больных с О-образующим ИМ, максимальные значения наблюдались у пациентов с осложнениями инфаркта миокарда.

Наибольшие отличия в динамике показателей у больных ИМ с зубцом 0 и ИМ без зубца 0 во все сроки наблюдения проявили индуцированные липополисахаридом уровни вне- и внутриклеточных провоспалительных цитокинов. Индексы стимуляции продукции цитокинов были статистически значимо выше при остром ИМ с патологическим зубцом С}. Возрастание значений индексов стимуляции коррелировали с неблагоприятным прогнозом дальнейшего течения заболевания.

Таким образом, динамика изменений спонтанных и индуцированных уровней провоспалительных цитокинов в крови больных с острым ИМ отражает динамику развития системной воспалительной реакции, сопровождающуюся активацией моноцитов крови и подтверждает важную роль иммуновоспалитель-ных процессов при развитии ИМ и свидетельствует о перспективности применения иммунокорригирующей, в том числе и цитокиновой, терапии при данном заболевании. Установленная нами длительная гиперпродукция ТЫРа, являющегося индуктором апоптоза как для лейкоцитов крови, так и для кардиомио-цитов, максимально выражена при более тяжёлом течении ИМ, развивается на фоне повышенной чувствительности лимфоцитов крови к проапоптотиче-скому действию ацетилхолина и подтверждает важность процессов регуляции апоптотической гибели клеток в патогенезе инфаркта миокарда.

В целях интегральной оценки состояния системы иммунного гомеостаза человека при остром ИМ, выявления общей направленности изменений и определения наиболее важных прогностических параметров все полученные количественные данные, включая показатели гуморального иммунитета, были обработаны с помощью системного многофакторного анализа с расчётом коэффициентов влияния отдельных показателей и построением математических моделей (рисунок 10).

® нетрансмуральный инфаркт миокарда • трансмуральный инфаркт миокарда

Рисунок 10 - Математические модели состояния системы иммунного гомеостаза человека при остром инфаркте миокарда

Анализ математических моделей подтвердил наличие изменений со стороны иммунной системы в динамике острого инфаркта миокарда с наибольшим отклонением интегральных показателей на 3-й сутки после возникновения острого инфаркта миакарда. Максимальная активация во все сроки наблюдения и отсутствие нормализации общего состояния иммунной системы отмечались в случаях ИМ с зубцом Q. Общий характер и направленность изменений активности модельной системы иммунного гомеостаза определялись в 1-е -3-й сутки после возникновения ИМ в первую очередь морфофункциональ-ным состоянием лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, что подтверждается сравнительным анализом значений соответствующих интегральных показателей и ранжированной оценкой коэффициентов влияния отдельных параметров. Начиная с 7-х суток основной вклад в общее состояние иммунной системы вносили параметры морфофункционального'состояния лимфоцитов и их чувствительность к ацетилхолину. Более выраженное отклонение интегрального показателя морфофункционального состояния иммунной системы при остром ИМ с зубцом Q на 21-е сутки после возникновения ИМ свидетельствовало об относительной стабилизации и патогенетической незавершённости изучаемых процессов при более тяжёлом поражении сердечной мышцы,

Сопоставление средних значений и весовых коэффициентов отдельных иммунологических показателей выявило, что в первые 3-е суток развития острого ИМ отмечалась тесная корреляция в изменении ряда иммунологических и клинико-лабораторных показателей. Так, коэффициенты влияния уровней в крови IL-lß, IL-6, TNF а были сопоставимы с весовыми коэффициентами таких параметров, как ИСЛК и ЛИИ. Максимальную прогностическую значимость проявляли показатели чувствительности лейкоцитов к нейромедиаторам вегетативной нервной системы.

На 7-е и 14-е сутки возрастала прогностическая значимость уровня TNFa, ЯЦО лимфоцитов, относительного содержания CD3+CD8+- и CD3"CD16+56+-лимфоцитов, Наибольшую прогностическую значимость на 21-е сутки тече-

ния острого ИМ приобретали такие показатели, как ЛИИ, содержание С03+С095+ лимфоцитов, чувствительность лимфоцитов к ацетилхолину.

С целью получения рабочей математической модели для использования в клинической практике в качестве иммунологического алгоритма прогнозирования течения ИМ нами был проведён расчёт интегральных показателей системы иммунного гомеостаза с учётом иммунологических параметров, имеющих наибольшие значения весовых коэффициентов в конкретные сроки наблюдения (таблица 2). Для определения группы риска в рабочую модель подставляются значения единичного показателя обследуемого пациента, рассчитывается интегральный показатель и определяется группа риска по максимальному приближению к диагностическим значениям интегральных показателей системы.

В целом, комплексная, на основе системного многофакторного анализа, сравнительная оценка состояния иммунной системы больных ИМ и собак при экспериментальном ИМ выявила общие закономерности изменений иммунологических показателей в динамике ИМ, зависящие от тяжести поражения сердечной мышцы и являющиеся отражением участия иммунологических механизмов в патогенезе инфаркта миокарда.

Показана ведущая роль лимфоцитов на всех этапах реализации иммуно-воспалительных процессов при ИМ, раннее увеличение содержания эффек-торных лимфоцитов при ИМ, что свидетельствует о предсуществующей активации иммунной системы у больных инфарктом миокарда.

Использованный комплекс методов позволил доказать важную роль вегетативной нервной системы, особенно её парасимпатического звена, в регуляции иммунных реакций посредством влияния на апоптоз лимфоцитов.

Полученные математические модели состояния иммунной системы человека и экспериментальных животных подтвердили общебиологический характер выявленных изменений со стороны иммунной системы и позволили определить наиболее значимые для диагностики и прогноза иммунологические показатели, позволяющие выделять среди больных острым инфарктом миокарда пациентов с высоким риском развития осложнений.

Таблица 2. Алгоритм прогнозирования течения инфаркта миокарда на основе оценки изменений интегральных показателей морфофункционального состояния иммунной системы

Сутки Иммунологические параметры Интегральные показатели (ХВ|'±с)

Группа невысокого риска Группа высокого риска

1 -ядерно-цитоплазматическое отношение в лимфоцитах - РБС лимфоцитов - индекс сдвига ацетилхолина (РЭС) - миелопероксидаза нейтрофильных гранулоцитов - индекс сдвига лейкоцитов крови - СОЗ+8+лимфоциты 0,312±0,001 0,280±0,001

3 -ядерно-цитоплазматическое отношение в лимфоцитах - РБС лимфоцитов - индекс сдвига ацетилхолина (РБС) - индекс сдвига лейкоцитов крови - СОЗ+8+лимфоциты 0,445±0,003 0,512±0,004

7 -ядерно-цитоплазматическое отношение в лимфоцитах - РБС лимфоцитов - индекс сдвига ацетилхолина (Р5С) - индекс сдвига лейкоцитов крови - СТО*8+лимфоциты - ТЫРа в плазме крови 0,283±0,031 0,480±0,004

14 -ядерно-цитоплазматическое отношение в лимфоцитах - РБС лимфоцитов - индекс сдвига ацетилхолина (РЙС) - индекс сдвига лейкоцитов крови - СОЗ+8+лимфоциты - ТЫРа в плазме крови 0,094±0,020 0,184±0,012

21 -ядерно-цитоплазматическое отношение в лимфоцитах - РвС лимфоцитов - индекс сдвига ацетилхолина(РвС) - лейкоцитарный индекс интоксикации - СОЗ+95+лимфоциты 0,039±0,008 0,294±0,035

Выводы

1 Анализ изменений средних размеров лимфоцитов, параметров светорассеяния ИЗС после 2-х часов инкубации цельной крови при 37°С в присутствии ацетилхолина хлорида (МО-5 моль/л и 1-Ю"6 моль/л для крови человека и собаки, соответственно) и экспрессии С095-антигена на клетках через 24 часа инкубации позволяет выявлять и оценивать проапопто-тическое действие нейромедиатора на лимфоциты крови.

2 Развитие экспериментального инфаркта миокарда у собак сопровождается динамическими изменениями показателей морфофункционального состояния иммунной системы, зависящими от стадии патологического процесса и тяжести поражения сердечной мышцы и отражающими выраженность иммуновоспалительной реакции. При возникновении нетрансму-рального инфаркта миокарда у собак максимальные изменения иммунологических показателей наблюдаются в первые трое суток и проявляются в увеличении площади лимфоцитов крови, их ядер, ядерно-цитоплаз-мэтического отношения, чувствительности к проапоптотическому действию ацетилхолина, активации нейтрофильных гранулоцитов при сниженной реакции на ацетилхолин и норадренапин, возрастании индекса сдвига лейкоцитов крови и лейкоцитарного индекса интоксикации. Нормализация показателей отмечается на 14-е сутки после возникновения очага некроза в сердечной мышце.

3 В динамике трансмурального инфаркта миокарда изменения морфофункционального состояния лимфоцитов крови собак носят сходный характер, но выражены в большей степени, чем при нетрансмурапьном инфаркте миокарда, с отсутствием нормализации чувствительности к аце-тилхолйну на 14-е сутки. Для нейтрофильных гранулоцитов характерны: снижение фагоцитарной активности и активности внутриклеточной мие-лопероксидазы при максимальной чувствительности клеток к норадре-налину на 1-е и 3-й сутки; увеличение ядерно-цитоплазматического отношения и снижение чувствительности к норадреналину и ацетилхолину

на 7- е и 14-е сутки; повышение значений лейкоцитарных индексов во все сроки наблюдения.

4 Использование системного многофакторного анализа с построением математических моделей позволило выявить максимальную активацию иммунной системы экспериментальных животных на 3-й сутки после воспроизведения инфаркта миокарда. При этом трансмуральный инфаркт миокарда, по сравнению с нетрансмуральным, сопровождается более выраженными и длительными изменениями морфофункционального состояния иммунной системы, с развитием дисбаланса чувствительности лейкоцитов к нейромедиаторам вегетативной нервной системы.

5 У пациентов с острым инфарктом миокарда выявляются динамические изменения показателей морфофункционального состояния лейкоцитов, включая чувствительность к норадреналину и ацетилхолину; уровней иммуноглобулинов классов А, М, С; С-реактивного белка и активности системы комплемента, сходные с таковыми у экспериментальных животных и отражающие участие иммунной системы в патогенезе инфаркта миокарда и влияние на неё со стороны вегетативной нервной системы.

6 Иммунофенотипирование лимфоцитов крови человека выявило, что при инфаркте миокарда без зубца <3 в первые трое суток заболевания происходит увеличение относительного содержания эффекторных лимфоцитов (СОЗ+8+-,СОЗ'8+-,СОЗ"16+56+-клетки), коррелирующее с повышенной чувствительностью клеток к ацетилхолину и норадреналину; на 7-е сутки увеличивается содержание СОЗ+95+лимфоцитов, начиная с 14-х суток происходит постепенная нормализация этих показателей. При инфаркте миокарда с патологическим зубцом 0 описанные изменения выражены в большей степени, сопровождаются на 1-е-З-и сутки снижением количества активированных клеток (СШ+25+~, СОЗ+НЬА-ОЯ+- и СБЗ+95+- лимфоциты) и экспрессии СОЗ-антигена; высокий уровень СОЗ+95+лимфоцитов наблюдается с 14-х по 21-е сутки, повышенная чувствительность клеток к проапоптотическому действию ацетилхолина со-

храняется на протяжении 21-х суток после возникновения инфаркта миокарда.

7 Перераспределение субпопуляций лимфоцитов и изменение их чувствительности к проапоптотическому действию ацетилхолина сопровождается динамическими изменениями спонтанных и индуцированных уровней провоспалительных цитокинов (интерлейкин-1р, интерлейкин-6 и фактор некроза опухоли а) в крови, что свидетельствует о целесообразности разработки иммунокорригирующей терапии при остром инфаркте миокарда.

8 Комплексная на основе системного многофакторного анализа оценка состояния иммунной системы в динамике острого инфаркта миокарда в эксперименте и клинике выявила общие закономерности изменений иммунологических показателей, зависящие от тяжести поражения сердечной мышцы, что свидетельствует о возможности использования модели экспериментального инфаркта миокарда у собак для разработки иммунокорригирующей терапии.

9 Системный многофакторный анализ позволил обосновать спектр наиболее значимых иммунологических параметров для прогнозирования течения инфаркта миокарда в динамике наблюдения: ядерно-цитоплазмати-ческое отношение лимфоцитов, их фронтальное светорассеяние и индекс сдвига ацетилхолина по параметру фронтального светорассеяния лимфоцитов.

Практические рекомендации

1 Разработанный комплекс методов оценки морфофункционального состояния иммунной системы на основе системного многофакторного анализа целесообразно использовать наряду со стандартными клинико-ла-бораторными показателями для повышения эффективности диагностики и прогнозирования течения острого инфаркта миокарда и разработки подходов к иммунокорригирующей терапии при данном заболевании.

2 Рекомендуется для изучения влияния вегетативной нервной системы на апоптоз лимфоцитов человека in vitro использовать инкубацию цельной ге-паринизированной крови с раствором ацетилхолина хлорида (конечная концентрация 1-Ю"5 моль/л) при 37°С в полной питательной среде RPMI в течение 2-х и 24-х часов с дальнейшей оценкой параметров фронтального светорассеяния (FSC) и содержания СОЗ+95+,СВ3 95+,С095+лимфоцитов. При проведении исследований на лимфоцитах крови собак концентрация ацетилхолина хлорида при тех же условиях инкубации должна составлять Ы0~б моль/л.

3 Для оптимального анализа данных иммунологических исследований, оценки адекватности возможной иммунокорригирующей терапии в динамике инфаркта миокарда и других заболеваний целесообразно использовать разработанную компьютерную программу обработки параметров состояния иммунной системы пациента «Иммунолог».

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Лимарева Л.В. Изменение адреночувствительности лимфоцитов периферической крови собак в дневное и ночное время суток / Л.В. Лимарева, Т.В. Суз-дальцева // Сборник научных трудов по материалам итоговой годичной конференции ЦНИЛ под ред. Проф. М.В. Угловой - Куйбышев, 1990 г.- С. 57 - 60.

2. Лимарева Л.В. Морфофункциональное состояние нейтрофильных лейкоцитов крови при экспериментальном инфаркте миокарда / Л.В. Лимарева, В.В.Богуш, Е.А.Захарова П Сборник научных трудов."Математическое моделирование в теоретической и практической медицине"- под ред. Проф. М.В.Уг-ловой и Г.П.Котельникова., посвященный 75-летию Самарского гос.мед.уни-верситета. -Самара, 1994,- С. 36 - 38.

3. Лимарева Л.В. Изучение морфофункционального состояния лейкоцитов крови в дневное и ночное время / Л.В. Лимарева // Сборник научных работ "Иммунологические и гуморальные аспекты клинической патологии" под ред. проф. С.М. Бабкина по материалам итоговой годичной конференции НИЦ Самарского мед. института,- Самара, 1996,- С. 43-45.

4. Лимарева Л.В. Использование иммунологических методов в оценке функциональных свойств лейкоцитов и фибробластов in vitro / Л.В. Лимарева, В.В, Богуш, И.Ю. Николаева, Т.В. Яценко // Материалы II Всероссийского симпозиума с международным участием "Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии. Теория и практика клеточных биотехнологий". Под общей ред. Г.П. Котельникова, С.П. Миронова, В.Д. Фёдорова, Л.Т. Воловой // Самара, Издательство «Офорт», 2004.-С. 139-140.

5. Лимарева Л.В. Комплексная оценка чувствительности лимфоцитов крови к нейромедиаторам вегетативной нервной системы при остром инфаркте миокарда в клинике и эксперименте / Л.В. Лимарева // Вестник Самарского государственного университета. Естественнонаучная серия. -2006. - № 9 (49). - С. 205 - 212.

6. Лимарева JI.B. Оценка диагностической и прогностической значимости параметров иммунофенотипирования лейкоцитов крови при остром инфаркте миокарда / Л.В. Лимарева // Вестник Самарского государственного университета. Естественнонаучная серия. - 2007. - № 9/1(59). - С. 391 -397 (принята в печать 26.12.2006).

7. Меленберг Т.В. «Иммунолог» - программа для обработки данных о состоянии иммунной системы пациента / Т.В. Меленберг, A.B. Жесткое, Л.В. Лимарева, М.Ю. Доладов // Вестник Самарского государственного уни-вер-ситета. Естественнонаучная серия. - 2006. - № 6/2 (46). - С. 165 -169.

8. Лимарева Л.В. Сравнительная оценка влияния преднйзолона и нейромедиа-торов вегетативной нервной системы на апоптоз лимфоцитов периферической крови / Л.В. Лимарева, О.П. Данильченко // Аллергология. Иммунология. -2006. - T.7- № 3. - С. 272.

9. Лимарева Л.В. Методы проточной цитометрии в оценке влияния нейро-медиаторов вегетативной нервной системы на морфофункционалыюе состояние лейкоцитов крови / Л.В. Лимарева // Морфология. Научно-теоретический медицинский журнал. - 2008. -Т. 134. - №5. - С. 79.

10. Фёдорова О.И. Реакции периферической крови у больных пожилого возраста при распространенных заболеваниях / О.И. Фёдорова, В.Л. Кон-дурцев, ИЛ. Давыдкин, Л.В. Лимарева // Клиническая медицина: Ежемесячный научно-практический журнал. - 2008. - Т.86. - №2. - С. 48-51.

11. Попова Л.Л. Сравнительная оценка характера изменений основных иммунологических показателей при различных патологических состояниях / Л.Л. Попова, Л.В. Лимарева, М.В. Комарова // Уральский Медицинский Журнал . - 2008. - №14 (54). - С. 89-93.

12. Лимарева Л.В. Оценка диагностической и прогностической значимости показателей иммунного статуса при остром инфаркте миокарда / Л.В. Лимарева // Российский иммунологический журнал. - 2008. -Т. 2(11). - № 2-3. - С. 322-326.

13. Лимарева Л.В. Оценка диагностической и прогностической значимости показателей иммунного статуса у реципиентов аллотрансплантата почки / Л.В. Лимарева, A.B. Колсанов, С.И. Попова, A.A. Авдеева // Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток: Материалы всероссийской конференции с международным участием // Самара, Издательство «Офорт», 2008 - С. 276 - 277.

14. Кельцев В.А. Ранние артриты у детей и подростков - иммунный статус больных и перспективы лечения / В.А. Кельцев, Л.И. Гребёнкина, Л.В. Лимарева, М.А. Бочкарёва, Ю.Г. Григорьева, II Научно-практическая ревматология. -2008. -№ 2. - С. 64 - 68.

16. Лимарева Л.В. Математическое моделирование в оценке прогностической значимости иммунологических показателей при остром инфаркте миокарда / Л.В. Лимарева // Сборник трудов X международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии, посвященном столетию со дня рождения академика АМН А.Д. Адо (Россия, Казань, 20-23 мая 2009). - С. 365.

17. Лимарева Л.В. Определение интенсивности флюоресценции меченных моноклональных антител к CD3 антигену на поверхности Т-лимфоцитов

в комплексной оценке иммунного статуса больных ишемической болезнью сердца / Л.В. Лимарева // Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии -2009. - № 2/1 (24). - С. - 319 - 320.

18. Лимарева Л.В. Сравнительная оценка иммунного статуса больных ИБС в динамике гипертонического криза, острого инфаркта миокарда и после аорто-коронарного шунтирования / Л.В. Лимарева, И.В. Новокшёнова, И.В. Губарева // Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11. - № 4-5. - С. 468.

19. Лимарева Л.В. Особенности морфофункционалыюго состояния лейкоцитов крови при остром инфаркте миокарда / Л.В. Лимарева // Морфологические ведомости. - 2009. - № 3-4. - С. 59 - 66.

20. Лимарева Л.В. Комплексная оценка иммунной системы при остром инфаркте миокарда в клинике и эксперименте // Самара, Издательство Офорт, 2009,147с.

21. Меленберг Т.В. Программа для обработки данных о состоянии иммунной системы пациента «Иммунолог» / Т.В. Меленберг, A.B. Жесткое, Л.В. Лимарева, М.Ю. Доладов // Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2006610352 (Заявка № 2005612520 дата поступления 4 октября 2005 зарегистрирована в реестре программ для ЭВМ 20 января 2006 г.).

Подписано в печать: 14.09.2009 г. Формат: 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объем: 2,79 усл.печ.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 667

Отпечатано в типографии ООО «Издательство СНЦ» 443001, Самара, Студенческий пер., За тел.: (846) 242-37-07

Заболевания сердечно-сосудистой системы, более двух третей которых составляют ишемическая болезнь сердца, инсульт и заболевания периферических артерий, обусловленные атеросклерозом, остаются главной причиной смертности во всём мире. Их широкое распространение среди населения индустриально развитых стран (в том числе и в России) заставило уже во второй половине XX века говорить об эпидемии сердечнососудистых заболеваний. По прогнозам Всемирной Организации Здравоохранения, к 2020-му году смертность от этих заболеваний может достигнуть 25 миллионов в год, почти половину из них составит смертность от ишемической болезни сердца, прежде всего от инфаркта миокарда [Шальнова С.А., 2008; Шахнович P.M., 2008; Van de Werf F. et al.,2003].

В структуре смертности населения России сердечно-сосудистые заболевания составляют 56,4%, что значительно превышает этот показатель в развитых индустриальных странах. В связи с этим, в рамках национального проекта «Здоровье», большое внимание уделяется формированию системы кардиологической помощи, направленной на повышение уровня здоровья населения за счёт снижения предотвратимых потерь общества вследствие болезней сердечнососудистой системы, раннего выявления, адекватной диагностики, современного лечения и реабилитации на основе единой идеологии подходов к их диагностике и лечению [Беленков Ю.Н., Горохова С.Г., 2008].

В последнее десятилетие количество информации об особенностях клиники, патогенеза, возможности ранней диагностики инфаркта миокарда (ИМ) значительно возросло, однако, одной из важных задач остаётся разработка комплекса клинико-лабораторных методов, позволяющих своевременно поставить диагноз, оценить характер течения ИМ, прогнозировать возможность осложнений в его развитии. При этом выявление группы пациентов повышенного риска стало особенно важным после того, как появилась реальная возможность улучшить их прогноз, предотвратить дальнейшие осложнения с помощью медикаментозных и хирургических методов лечения [Бокерия JI.A. и др., 2007; Симбирцев А.С. и др., 2008; Темпов А.А., 2008].

В течение многих лет некроз миокарда рассматривался как фактор, определяющий степень поражения сердечной системы. Однако некротические изменения в кардиомиоцитах сами по себе являются мощным фактором воздействия на общебиологические системы организма [Бродык О.В. и др., 1997; Семёнова Ю.Б., 2003; Libby Р., 2001]. Бурное развитие иммунологии в последние годы позволило во многом пересмотреть механизмы участия иммунной системы, её взаимодействия с нервной и эндокринной системами в патогенезе инфаркта миокарда. Это потребовало комплексной оценки взаимосвязей отдельных компонентов иммунной системы при ИМ и выявило, во многом недостаточно изученную, не полную и неадекватную трактовку результатов исследований, отсутствие доказательной базы (многоцентровых клинических исследований) эффективности проведения иммунокорригирующей терапии при данном заболевании [Чукаева И.И., 2001; Логачева И.В. и др., 2002; Weismen I.H et al., 2002; Torre-Amione G. et al., 2008]. Вместе с тем более глубокое изучение роли иммунной системы в патогенетических механизмах возникновения и заживления ИМ в клинике и эксперименте позволит разработать новые подходы к его диагностике и лечению. Важность комплексной оценки системы иммунного гомеостаза при ИМ возрастает в связи с всё более широким внедрением в клиническую практику методов хирургической реваскуляризации миокарда, сопровождающихся системной воспалительной реакцией, риском инфекционных осложнений и требующих иммунокорригирующей терапии [Paparella D. et al., 2002], а также с перспективой использования клеточных технологий для лечения сердечнососудистых заболеваний [Потапов И.В., Крашенинников М.Е., 2001; Маслов Л.Н. и соавт., 2003; Assmus В. et al., 2002], что требует, прежде всего, проведения широких экспериментальных исследований. Интенсивное изучение терапевтического действия стволовых клеток при их введении (внутривенном или непосредственно в зону некроза сердечной мышцы) при проведении аортокоронарного шунтирования повысило интерес к воспроизведению экспериментального ИМ у крупных лабораторных животных, в том числе на собаках. При этом данные об особенностях иммунной системы собак, полученные с помощью современных методических подходов крайне скудны. Всё это свидетельствует об актуальности изучения состояния системы иммунного гомеостаза собак в норме и при экспериментальном инфаркте миокарда.

В свете последних открытий в области такого общебиологического феномена как апоптоз, возникла возможность дальнейшей разработки принципиально нового направления превентивного лечения ишемического и реперфузионного повреждения миокарда, обусловленного как некротической, так и апоптотической гибелью кардиомиоцитов [Galang N. et al., 2000; Yajita H. et al., 2000]. Изучение и расшифровка механизмов апоптоза клеток, в том числе и клеток иммунной системы, зависимость данных процессов от нейромедиаторов при ишемических повреждениях тканей, и в частности, при ИМ является одним из наиболее актуальных направлений современной биологической и медицинской науки. В настоящее время установлено, что ИМ характеризуется активацией каскада нейро-гуморальных и иммуновоспалительных процессов, влияющих на некротическую и апоптотическую гибель кардиомиоцитов [Потапов И.В., Крашенинников М.Е., 2001; Маслов JI.H. и др., 2003; Galang N. et al., 2000; Assmus В. et al., 2002]. Однако, исследования процессов апоптоза кардиомиоцитов в динамике ИМ, особенностей их реакций на сигналы со стороны нервной системы и апоптотические стимулы методически сложны, проводятся главным образом морфологическими методами, что может быть малоинформативным вследствие неадекватного забора биологического материала из очага поражения сердечной мышцы. В этой связи исследования аналогичных процессов в лимфоцитах крови, экспрессирующих, подобно кардиомиоцитам, рецепторы к нейромедиаторам вегетативной нервной системы имеют значительные преимущества в виду доступности получения биоматериала, возможности стандартизации лабораторных исследований и наличия разнообразных подходов к изучению апоптоза этих клеток [Красникова Т.Л., Габрусенко С.А., 2000; Yamada S. etal., 1996].

В целом, при доказанности участия иммунологических механизмов в патогенезе ИМ в настоящее время отсутствуют методические подходы к интегральной, комплексной оценке состояния иммунной системы, её взаимодействия с вегетативной нервной системой при развитии данного патологического процесса в клинике и эксперименте. Проведение подобных исследований необходимо для расширения теоретической базы в целях разработки новых диагностических и терапевтических подходов к коррекции иммунологических нарушений при инфаркте миокарда. Всё выше указанное позволило сформулировать цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования Установить особенности участия иммунологических механизмов в развитии и исходах инфаркта миокарда в эксперименте и клинике, повысить эффективность клинико-лабораторной диагностики и прогнозирования течения данного заболевания на основании системного многофакторного анализа и математического моделирования морфофункционального состояния иммунной системы.

Задачи исследования

1 Разработать комплекс методов для оценки in vitro влияния нейромедиаторов вегетативной нервной системы на апоптоз лимфоцитов крови человека и экспериментальных животных (собаки).

2 Определить закономерности изменений показателей морфофункционального состояния лейкоцитов крови (иммунологические, морфологические, морфометрические), активности системы комплемента, уровней иммуноглобулинов классов А, М, G и С-реактивного белка в крови собак в динамике экспериментального инфаркта миокарда; на основе системного многофакторного анализа разработать математические модели состояния иммунной системы собак в зависимости от тяжести поражения сердечной мышцы.

3 Выявить особенности изменений показателей морфофункционального состояния лейкоцитов (иммунологические, морфологические, морфометрические), активности системы комплемента, уровней иммуноглобулинов классов А, М, G; С-реактивного белка и провоспа-лительных цитокинов (интерлейкин ip, интерлейкин 6, фактор некроза опухоли а) в крови больных инфарктом миокарда с патологическим зубцом Q и без зубца Q; на основе системного многофакторного анализа разработать математические модели морфофункционального состояния системы иммунного гомеостаза человека в динамике острого инфаркта миокарда в зависимости от объема поражения сердечной мышцы.

4 Провести сравнительный анализ математических моделей морфофункционального состояния систем иммунного гомеостаза человека и экспериментальных животных при остром инфаркте миокарда.

5 На основе математического моделирования обосновать наиболее значимый спектр клинико-лабораторных и иммунологических показателей для эффективной диагностики, прогнозирования течения и исходов инфаркта миокарда.

Научная новизна исследования

Впервые проведён анализ проапоптотического действия нейромедиаторов вегетативной нервной системы (норадреналин и ацетилхолин) на лимфоциты крови в сравнении с классическим активатором апоптоза - преднизолоном. Показано, что ацетилхолин при инкубации in vitro индуцирует апоптоз лимфоцитов крови человека и экспериментальных животных, а норадреналин не вызывает апоптотической гибели, но изменяет экспрессию ряда антигенов дифференцировки на поверхности лимфоцитов.

На основе комплексного системного анализа с применением математического моделирования выявлены и сопоставлены особенности изменений состояния иммунной системы человека и животных при остром ИМ, включая оценку выраженности процессов апоптоза и чувствительность лейкоцитов к нейромедиаторам вегетативной нервной системы в зависимости от тяжести патологического процесса. Полученные данные расширяют экспериментальную базу для изучения патологических процессов, происходящих при ИМ, и позволяют адекватно экстраполировать данные экспериментов в клинику.

Впервые проведена комплексная оценка содержания в крови провоспалительных цитокинов в сравнительном аспекте при остром инфаркте миокарда. Выявлены типовые изменения показателей вне- и внутриклеточного (моноциты) содержания интерлейкина-ip, интерлейкина- 6 и фактора некроза опухоли-а в крови в динамике острого инфаркта миокарда. Установлено, что уровни вне- и внутриклеточного содержания провоспалительных цитокинов в крови коррелируют со степенью поражения сердечной мышцы.

Новыми являются разработанные математические модели морфофункционального состояния иммунной системы при поражении сердечной мышцы различной степени тяжести при остром ИМ в эксперименте и клинике. Определён перечень наиболее значимых иммунологических показателей для оценки выраженности иммуновоспалительных реакций в динамике острого инфаркта миокарда.

Научно - практическая значимость работы

Полученные экспериментальные и клинические данные дополняют и углубляют представления о патогенетическом значении компонентов иммунной системы и процессов апоптоза лимфоцитов в развитии и исходах инфаркта миокарда.

Разработанные методические подходы к оценке чувствительности лейкоцитов крови к нейромедиаторам вегетативной нервной системы с использованием математического моделирования являются перспективными для изучения механизмов нейро-иммунных взаимодействий при различных патологических состояниях в клинике и эксперименте.

Комплексная оценка и сопоставление особенностей состояния иммунной системы человека и экспериментальных животных (собаки), с разработкой математических моделей позволяет повысить эффективность диагностики и прогнозирования исходов острого инфаркта миокарда.

Разработана модель in vitro для изучения участия нейромедиаторов вегетативной нервной системы в регуляции процессов апоптоза иммунокомпетентных клеток.

Разработана и зарегистрирована в Роспатенте (Свидетельство о регистрации № 2006610352) компьютерная программа для мониторинга состояния иммунной системы пациентов при различных патологических состояниях.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты диссертационного исследования внедрены в научную работу Института экспериментальной медицины и биотехнологий, в научную и учебно-методическую работу кафедры общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии, кафедры факультетской педиатрии, кафедры гистологии и эмбриологии ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», в практическую работу отделения гематологии и трансфузиологии, отделения нефрологии, отделения хирургического отделения пересадки органов Клиник ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Основные положения, выносимые на защиту 1 Нейромедиатор парасимпатического звена вегетативной нервной системы ацетилхолин индуцирует апоптоз лимфоцитов крови человека и животных в условиях инкубации in vitro.

2 В зависимости от степени поражения сердечной мышцы при остром инфаркте миокарда наблюдаются различные по выраженности, но одинаковые по направленности динамические изменения в состоянии иммунной системы, отражающие этапы развития иммуновоспалительных процессов в организме.

3 Динамические изменения состояния модельной системы иммунного гомеостаза человека и животных в первые две недели после возникновения инфаркта миокарда характеризуются общими закономерностями, что позволяет использовать экспериментальную модель инфаркта миокарда у собак для разработки патогенетически обоснованной иммунокоррегирующей терапии при данном заболевании.

4 Математическое моделирование морфофункционального состояния иммунного гомеостаза необходимо для объективной оценки характера реагирования иммунной системы на возникновение острого инфаркта миокарда и определения наиболее значимых прогностических показателей.

Апробация работы

Результаты исследований доложены на Итоговых годичных конференциях ЦНИЛ Куйбышевского медицинского института (Куйбышев, 1990, Самара, 1994, 1996); II Всероссийском симпозиуме с международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии» и конференции «Теория и практика клеточных биотехнологий» (Самара, 2004); Всероссийской конференции с международным участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток» (Самара, 2008); Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации», посвящённой памяти члена-корреспондента АМН СССР проф. Ф.М. Лазаренко (Оренбург, 2008); X международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН СССР А.Д. Адо (Казань, 2009); VII Российской конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической иммунологии и аллергологии» (Архангельск, 2009); XIII Всероссийском форуме с международным участием им. Академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009), VII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 160-летию со дня рождения И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 20 работ, в том числе 9 — в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации, монография; зарегистрирована компьютерная программа в Роспатенте.

Объём и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследований», 7-ми глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, который содержит 226 работ отечественных и 342 - зарубежных авторов, приложения. Работа изложена на 210 страницах машинописного текста, содержит 33 таблицы и 51 рисунок.

ВЫВОДЫ

1. Анализ изменений средних размеров лимфоцитов, параметров светорассеяния FSC после 2-х часов инкубации цельной крови при 37°С в присутствии ацетилхолина хлорида (МО"5 моль/л и 1-Ю"6 моль/л для крови человека и собаки, соответственно) и экспрессии CD95-антигена на клетках через 24 часа инкубации позволяет выявлять и оценивать проапоптотическое действие нейромедиатора на лимфоциты крови.

2. Развитие экспериментального инфаркта миокарда у собак сопровождается динамическими изменениями показателей морфофункционального состояния иммунной системы, зависящими от стадии патологического процесса и тяжести поражения сердечной мышцы и отражающими выраженность иммуновоспалительной реакции. При возникновении нетрансмурального инфаркта миокарда у собак максимальные изменения иммунологических показателей наблюдаются в первые трое суток и проявляются в увеличении площади лимфоцитов крови, их ядер, ядер-но-цитоплазматического отношения, чувствительности к проапоптоти-ческому действию ацетилхолина, активации нейтрофильных гранулоцитов при сниженной реакции на ацетилхолин и норадреналин, возрастании индекса сдвига лейкоцитов крови и лейкоцитарного индекса интоксикации. Нормализация показателей отмечается на 14-е сутки после возникновения очага некроза в сердечной мышце.

3. В динамике трансмурального инфаркта миокарда изменения морфофункционального состояния лимфоцитов крови собак носят сходный характер, но выражены в большей степени, чем при нетрансмуральном инфаркте миокарда, с отсутствием нормализации чувствительности к ацетилхолину на 14-е сутки. Для нейтрофильных гранулоцитов характерны: снижение фагоцитарной активности и активности внутриклеточной миелопероксидазы при максимальной чувствительности клеток к норадреналину на 1-е и 3-й сутки; увеличение ядерно-цитоплазмати-ческого отношения и снижение чувствительности к норадреналину и ацетилхолину на 7- е и 14-е сутки; повышение значений лейкоцитарных индексов во все сроки наблюдения.

4. Использование системного многофакторного анализа с построением математических моделей позволило выявить максимальную активацию иммунной системы экспериментальных животных на 3-й сутки после воспроизведения инфаркта миокарда. При этом трансмуральный инфаркт миокарда, по сравнению с нетрансмуральным, сопровождается более выраженными и длительными изменениями морфофункционального состояния иммунной системы, с развитием дисбаланса чувствительности лейкоцитов к нейромедиаторам вегетативной нервной системы.

5. У пациентов с острым инфарктом миокарда выявляются динамические изменения показателей морфофункционального состояния лейкоцитов, включая чувствительность к норадреналину и ацетилхолину; уровней иммуноглобулинов классов А, М, G; С-реактивного белка и активности системы комплемента, сходные с таковыми у экспериментальных животных и отражающие участие иммунной системы в патогенезе инфаркта миокарда и влияние на неё со стороны вегетативной нервной системы.

6. Иммунофенотипирование лимфоцитов крови человека выявило, что при инфаркте миокарда без зубца Q в первые трое суток заболевания происходит увеличение относительного содержания эффекторных лимфоцитов (CD3+8+—,СОЗ"8+-,СВЗ"16+56+-клетки), коррелирующее с повышенной чувствительностью клеток к ацетилхолину и норадреналину; на 7-е сутки увеличивается содержание СОЗ+95+лимфоцитов, начиная с 14-х суток происходит постепенная нормализация этих показателей. При инфаркте миокарда с патологическим зубцом Q описанные изменения выражены в большей степени, сопровождаются на l-e-3-и сутки снижением количества активированных клеток (CD3+25+—, CD3+HLA-DRH "— и CD3 95 — лимфоциты) и экспрессии CD3-антигена; высокий уровень СВЗ+95+лимфоцитов наблюдается с 14-х по 21-е сутки, повышенная чувствительность клеток к проапоптотическому действию ацетилхолина сохраняется на протяжении 21-х суток после возникновения инфаркта миокарда.

7. Перераспределение субпопуляций лимфоцитов и изменение их чувствительности к проапоптотическому действию ацетилхолина сопровождается динамическими изменениями спонтанных и индуцированных уровней провоспалительных цитокинов (интерлейкин-1 р, интерлейкин-6 и фактор некроза опухоли а) в крови, что свидетельствует о целесообразности разработки иммунокорригирующей терапии при остром инфаркте миокарда.

8. Комплексная на основе системного многофакторного анализа оценка состояния иммунной системы в динамике острого инфаркта миокарда в эксперименте и клинике выявила общие закономерности изменений иммунологических показателей, зависящие от тяжести поражения сердечной мышцы, что свидетельствует о возможности использования модели экспериментального инфаркта миокарда у собак для разработки иммунокорригирующей терапии.

9. Системный многофакторный анализ позволил обосновать спектр наиболее значимых иммунологических параметров для прогнозирования течения инфаркта миокарда в динамике наблюдения: ядерно-цитоплаз-матическое отношение лимфоцитов, их фронтальное светорассеяние и индекс сдвига ацетилхолина по параметру фронтального светорассеяния лимфоцитов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанный комплекс методов оценки морфофункционального состояния иммунной системы на основе системного многофакторного анализа целесообразно использовать наряду со стандартными клинико-лабораторными показателями для повышения эффективности диагностики и прогнозирования течения острого инфаркта миокарда и разработки подходов к иммунокорригирующей терапии при данном заболевании.

2. Рекомендуется для изучения влияния вегетативной нервной системы на апоптоз лимфоцитов in vitro использовать инкубацию цельной гепаринизированной крови с раствором ацетилхолина хлорида (конечная концентрация 10"5 моль/л) при 37°С в полной питательной среде RPMI в течение 2-х и 24-х часов с дальнейшей оценкой параметров фронтального светорассеяния (FSC) и содержания СВЗ+95+,СОЗ~95+,СВ95+лимфоцитов. При проведении исследований на лимфоцитах крови собак концентрация ацетилхолина хлорида при тех же условиях инкубации должна составлять 10"6 моль/л.

3. Для оптимального анализа данных иммунологических исследований, оценки адекватности возможной иммунокорригирующей терапии в динамике инфаркта миокарда и других заболеваний целесообразно использовать разработанную компьютерную программу обработки параметров состояния иммунной системы пациента «Иммунолог».