Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Системная воспитательная реакция у больных тяжелой пневмонией: молекулярно-генетические механизмы патогенеза и их прогностическая роль в оценке эффективности антибактериальной терапии

На правах рукописи

Игонин Антон АЛЕКСЕЕВИЧ

Системная воспалительная реакция у больных тяжелой пневмонией: молекулярно-генетические механизмы патогенеза и их прогностическая роль в оценке эффективности антибактериальной терапии

14.00.25- фармакология, клиническая фармакология 14.00.43 - пульмонология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Москва 2004

Работа выполнена в Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова

Научные консультанты:

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Кукес Владимир Григорьевич

Академик РАН и РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Пальцев Михаил Александрович

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Петров Владимир Иванович член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Страчунский Леонид Соломонович

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Палеев Николай Романович

Ведущая организация:

Московский Государственный медико-стоматологический университет

Защита состоится_2004 г. в_часов на заседании

Диссертационного совета Д 208.040.13 при Московской медицинской академии имени И.М.Сеченова (119992, Москва, ул. Б. Пироговская, д. 2, стр.

3).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Московской медицинской академии имени И.М.Сеченова (Москва, 117998 Нахимовский проспект, 49).

Автореферат разослан_2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 208.040.13 кандидат медицинских наук Архипов Владимир Владимирович_

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Ежегодное число заболевших пневмонией больных в России составляет около полумиллиона человек (Чучалин А.Г. и соавт. 2002). Несмотря на доступность новых эффективных антибактериальных средств, около 10 % госпитализированных с диагнозом внебольничная пневмония попадают в отделения интенсивной терапии (FineMJ et al. 1997; NiedermanMS et al. 1998). В США пневмония занимает пятое место среди всех причин смерти. В 1999 году было зарегистрировано около 90 тысяч летальных исходов от различных форм пневмонии, 40 тысяч из которых были следствием пневмококковой пневмонии (Natl Vital Stat Report 1999). Пневмония, развившаяся в стационаре, занимает второе место по частоте заболеваемости и летальности среди всех нозокомиальных инфекций. Летальность при бактериальной пневмонии по разным источникам составляет от 5% до 20% (Чучалин А.Г. 1999; Ноников В.Е. 2000), а у пациентов, находящихся в отделениях интенсивной терапии, возрастает до 30-50% (Hirani NA et al 1997, Leroy О. et al. 1995). Если пневмония относится к разряду внутрибольничных, то по некоторым данным летальность колеблется от 60-80% (Sheld WM et all991). На неблагоприятное течение пневмонии указывает появление признаков синдрома системного воспалительного ответа (ССВО), которое позволяет рассматривать инфекционное воспаление нижних дыхательных путей как сепсис. С позиций этого определения пневмония является самой распространенной причиной терапевтического сепсиса (Malot I, et al. 2001). Легкие более, чем у 50 % пациентов с тяжелым сепсисом являются «первичным» очагом инфекции (Angus DC, et al. 2001).

Ключевым патогенетическим звеном приводящим к высокой летальности при пневмонии является системная воспалительная реакция, которая на определенном этапе теряет свою защитную роль и приводит к многочисленным нарушениям как на клеточном, так и на органном уровнях (Bone RC et al 1996). Использование бронхо-альвеолярного лаважа позволило выявить преобладание локального воспаления над системным при пневмонии (Monton et al. 1997). С другой стороны, преобладание системной концентрации провоспалительных цитокинов (интерлейкин (IL)-6 и фактор некроза опухоли (TNFa)) связывают с неблагоприятным исходом при сепсисе (van der Poll et al. 1997). Предполагается, что в основе дисфункции ранее интактных органов и синдрома полиорганной недостаточности может лежать генерализованная воспалительная реакция, механизмы развития и прогностическое значения которой при пневмонии остается малоизученным. Циркулирующие лейкоциты принадлежат к основным эффекторным клеткам воспаления, но исследования их значения в патогенезе системного воспаления при тяжелой пневмонии ограничивается единичными наблюдениями (Friedland et al, 1992; Ertel et al, 1995). При этом практически отсутствуют

данные, основанные на клиническом

взаимосвязь противовоспалительных медиаторов с активностью

лейкоцитов и прогнозе при пневмонии (Wakefield CH et al. 1993). Очевидно, что понимание механизмов развития системного воспаления при пневмонии позволяет более адекватно подойти к фармакотерапии и, вероятно, повлиять на исход заболевания.

Формирование экстрапульмональных осложнений в рамках СПОД значительно ухудшает прогноз заболевания (Rangel-Frausto et al, 1995), поэтому очевидно, что ранняя диагностика дисфункции внутренних органов может способствовать правильной оценке тяжести заболевания. Особое внимание требует изучение состояния печени при пневмонии, так как ее функциональная активность обеспечивает процессы детоксификации и элиминации продуктов деятельности инфекционных агентов. Кроме того, печень занимает центральное место в регуляции остро-фазовой воспалительной реакции, метаболизме биологически активных веществ и ряда антибактериальных средств. Принятые в клинической практике рутинные статические тесты не обладают высокой чувствительностью и прогностической ценностью в отношении функциональной активности печени (Oellerich et al. 1998). Способность моноэтилглицинэксилидид (MEGX)-TecTa идентифицировать латентную или субклиническую дисфункцию печени показана у больных отделений интенсивной терапии (Maynard et al, 1997). Ранняя диагностика патологии печени при тяжелой пневмонии может позволить своевременно скорректировать тактику терапии способствовать профилактике возможных осложнений, в том числе синдром полиорганной дисфункции (СПОД). Однако для этого требуется оценка прогностических свойств применяемых для диагностики маркеров.

Системная воспалительная реакция изменяет характер клинического ответа на антибактериальную терапию при пневмонии, в то время как информативность традиционных клинико-лабораторных критериев для оценки эффективности лечения может снижаться (Woodhead et al, 1998). Особенность течения пневмонии с системной воспалительной реакцией подразумевает возможность использования медиаторов, находящихся в системном кровотоке, в качестве индикаторов интенсивности воспаления (Niederman et al, 1998) и маркеров эффективности антибиотиков у данной категории больных. Другой аспект применения антибиотиков - это отмеченная в экспериментальных работах способность влиять на выраженность воспаления (Galley et al, 1997; Dofferhoff et al, 1991). При этом клинические наблюдения такого характера практически отсутствуют.

Цель исследования

Изучить роль системной воспалительной реакции в патогенезе тяжелой пневмонии, исследовать прогностическую ценность биологических маркеров воспаления и их значение для оптимизации фармакотерапии.

Задачи исследования

1. изучить концентрацию провоспалительных (IL-6, -8, TNFa, С реактивный белок (CRP)) и противовоспалительных маркеров (IL-10) в плазме больных тяжелой пневмонией

2. исследовать экспрессию провоспалительного (мРНК IL-6 и мРНК IL-8) и противовоспалительного цитокинов (мРНК IL-10) циркулирующих лейкоцитов и сопоставить с их концентрацией в системном кровотоке у больных тяжелой пневмонией

3. исследовать экспрессию ранних стрессовых генов (egr-1, c-jun, c-fos, белок теплового шока (HSP70)) циркулирующими лейкоцитами больных тяжелой пневмонией

4. оценить выраженность оксидативного стресса (малоновый диальдегид) и его влияние на состояние антиоксидантной защиты (мРНК каталаза (Cat), Cu/Zn и Мп содержащая супероксиддисмутаза (SOD), глютатион пероксидаза (GSH-Px), глютатион редуктаза (GR)) циркулирующих лейкоцитов у больных тяжелой пневмонией

5. исследовать экспрессию CD lib, CD25, CD95 и HLADR на циркулирующих лимфоцитах, нейтрофилах и моноцитах у больных с пневмонией на фоне антибактериальной терапии

6. сопоставить состояния больных пневмонией с тяжестью системной воспалительной реакции

7. определить выраженность внелегочных поражений на примере исследования состояния печени (MEGX-тест и глюкуроновая кислота (ПС)) и выяснить связь между ее функциональной активностью и тяжестью системного воспаления при тяжелой пневмонии

8. изучить значимость изменений системной концентрации цитокинов для оценки эффективности эмпирической антибактериальной терапии

9. сопоставить прогностическую ценность стандартных клинических критериев, отражающих эффективность эмпирической антибактериальной терапии, и биологических маркеров воспаления (TL-6, IL-10, CRP)

Ю.разработать критерии для оценки эффективности эмпирической антибактериальной терапии с использованием маркеров, отражающих активность циркулирующих лейкоцитов и выраженность системного воспаления у больных тяжелой пневмонией с ССВО.

Научная новизна

1. Впервые в мире у больных с тяжелой пневмонией произведено детальное изучение роли циркулирующих лейкоцитов в патогенезе системного воспаления с применением молекулярно- биологических

технологий, включающих количественную полимеразно-цепную реакцию в режиме «реального» времени (РТ-ПЦР).

2. На основании новых данных, полученных при изучение экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов, были охарактеризованы внутриклеточные механизмы самоограничения воспалительной активности циркулирующих лейкоцитов.

3. Впервые у больных тяжелой пневмонией с ССВО было установлено влияние системного воспаления на тяжесть течения заболевания и установлено значение шкалы предложенной Британской торакальной ассоциацией (BTS) для клинической оценки выраженности системного воспаления у данной категории пациентов.

4. Впервые была показана связь между функциональной активностью печени и выраженностью системной воспалительной реакции при пневмонии, также были установлены ключевые механизмы ведущие к метаболической дисфункции печени. показана информативность MEGX-теста в диагностике патологии печени у больных тяжелой пневмонией и установлена высокая чувствительность MEGX-теста по сравнению со стандартными биохимическими тестами печени.

5. Разработаны новые рекомендации по оценке эффективности эмпирической антибактериальной терапии, базирующиеся на клинической характеристике и изменение концентрации интерлейкина-6 в системном кровотоке, для больных тяжелой пневмонией с системной воспалительной реакцией.

Практическая значимость

Полученные в результате исследования данные позволяют по новому рассмотреть патогенез тяжелой пневмонии с точки зрения системной воспалительной реакции, а также оптимизировать подходы к антибиотикотерапии.

В работе показано, что динамический мониторинг за уровнем IL-6 в плазме позволяет пересмотреть существующие критерии оценки эмпирической антибактериальной терапии у больных с тяжелой пневмонией на фоне ССВО. Указания на связь неблагоприятного исхода с выраженностью системной воспалительной реакцией подчеркивает важность мониторинга за концентрацией IL-6 еще до начала терапии, так как высокий риск смертности у данной категории больных требует использования дополнительных неантибактериальных средств для локализации воспаления.

Использование молекулярно-биологических методов исследования для изучения экспрессии генов, кодирующих IL-10 и HSP70 не обладает выраженной прогностической ценностью по сравнению с определением циркулирующих в крови белков (IL-6, EL-1O и CRP), а высокие материальные

затраты делают рутинное исследование этих маркеров при тяжелой пневмонией не целесообразным.

Результаты исследования функциональной активности печени с использованием MEGX-теста доказывают его более высокая информативность MEGX-теста по сравнению со стандартными функциональными тестами печени. Обнаружении дисфункции печени при снижении концентрации MEGX ниже 30|ig/l отражает тяжесть течения пневмонии, а также свидетельствует о необходимости ограниченного использования комбинаций лекарственных средств с печеночным клиренсом для избежания нежелательных реакций.

Внедрение

Использованные методики и результаты работы внедрены в практическую деятельность пульмонологического и терапевтического отделений ГКБ №23 им. Медсантруд, лаборатории фармакокинетики НИЦ ММА им. И.М. Сеченова и лаборатории фармакокинетики и клинической химии Институт клинической фармакологии НЦ ЭСМП Министерства Здравоохранения РФ. Полученные данные применяются при чтении лекций и проведении практических занятий, семинаров и элективных курсов со студентами на кафедре клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ММА им. И.М. Сеченова.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 26 печатных работ.

Апробация работы

Основные результаты, полученные в ходе исследования, доложены на конференции кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ММА им. И.М. Сеченова и лаборатории фармакокинетики НИЦ ММА им. И.М. Сеченова (Москва 2003), на 7 Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2000), на Европейском конгрессе по биомаркерам патологии внутренних органов (Кембридж, Великобритания 2000), на 7 конгрессе ассоциации терапевтического мониторинга ЛС (Вашингтон, США 2001), на 12 ежегодном конгрессе Европейской Респираторной Ассоциации (Стокгольм, Швеция 2002), на 13 ежегодном конгрессе Европейской Респираторной Ассоциации (Вена, Австрия 2003), на 3 международной конференции «Клинические исследования ЛС» (Москва, 2003). Работа проводилась при поддержке научно-исследовательского гранта Германского фонда академических обменов (DAAD # А/02/14013) и Университета Георга-Августа (ФРГ).

Различные фрагменты работы были отмечены индивидуальными грантами и премиями конгрессов: EMBODY 2000 (travel grant), IATDMCT 2001 (Roger Boekx Memorial Award), ERS 2002 (Gold Sponsorship) и ERS 2003 (Young Scientist Sponsorship, Silver Sponsorship).

Структура и объем диссертации

Основной текст диссертации изложен на 263 страницах машинописи и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждение, заключение, выводы и практические рекомендации. Диссертация иллюстрирована 54 таблицами и 65 рисунками. Библиография состоит из 251 отечественного и зарубежного источника.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У больных тяжелой пневмонией, в системном кровотоке определяется повышенный уровень как воспалительных (ИЛ-6, ИЛ-8, СРБ), так и противовоспалительных (ИЛ-10) маркеров, характеризующих системную воспалительная реакцию, ассоциирующуюся с неблагоприятным исходом заболевания.

2. На фоне ССВО при пневмонии происходит активация защитных противовоспалительных механизмов, способствующих ограничению локализации системной воспалительной реакции.

3. Дисфункция печени, как пример экстраггульманарной патологии при пневмонии связана с выраженностью системного воспалительного ответа и отражают тяжесть состояния больных пневмонией.

4. Назначение антибактериальных средств сопровождается уменьшением выраженности признаков системной воспалительной реакции у больных тяжелой пневмонией с ССВО.

5. Динамический контроль за уровнем 1Ь-6 может быть использован в качестве дополнительного маркера, отражающего эффективность эмпирической антибактериальной терапии у пациентов с тяжелой пневмонией и ССВО.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Общая характеристика больных и критерии их включения

Обследование больных проводилось на кафедре клинической фармакологии ММА им. И.М.Сеченова, расположенной на базе терапевтического и пульмонологического отделения ГКБ№ 23 им. «Медсантруд». Включение в исследование происходило после получения письменного информированного согласия пациентов. Лабораторный этап

работы осуществлялся при технической поддержке кафедры клинической химии Университета Георга-Августа, г. Геттинген, ФРГ (заведующий кафедрой клинической химии Университета Георга-Августа, профессор Ольрих М.), а также при содействии объединенной клинической лаборатории клиник г. Штутгарта (директор, профессор Виланд Э.). Разрешение на проведение исследования и вывоз образцов крови из РФ были получены в локальном этическом комитете ГКБ№ 23 им. «Медсантруд» и комитете по науке МЗ РФ (приказ: 2510/10918-02-26). Работа была построена на принципах ретроспективного исследования с контролем в параллельных группах, отличающихся по тяжести состояния, клиническому ответу на эмпирическую антибактериальную терапию и исходу заболевания. Результаты, полученные в ходе работе не влияли на принятие решения о стратегии проводимой терапии.

Критериями включения в исследование служил диагноз пневмонии, который верифицировался на основании жалоб (влажный кашель, появление или изменение характера мокроты, «плевральные» боли, одышка), данных физикального исследования (влажные мелкопузырчатые хрипы, крепитация, лихорадка), рентгенографии легких (новые инфильтративные изменения) При верификации диагноза учитывались данные микробиологического анализа:

о изоляция патогена из мокроты или материала, полученного

при бронхоскопии о бактериемия, источником которой с высокой вероятностью является респираторный тракт

В исследование включались больные с внебольничной приобретенной инфекцией и с диагнозом госпитальная пневмонии, клиническая картина у которых соответствовала признакам ССВО и расценивалась как сепсис. Критериями исключения из исследования являлись: пациенты, получающие препараты вне зависимости от пути введения, обладающие выраженным противовоспалительным эффектом хронические заболевания печени; пациенты, получающие per os или парентерально лекарственные средства с иммуносупрессивной активностью; пациенты с иммунодефицитными состояниями, в том числе при лейкоцитопении менее 1000 в мл; аллергия к лидокаину и препаратам группы местных анестетиков; брадикардия менее 50 уд./мин; A-V блокада 2-3 степени; патология сердечно-сосудистой системы, XCHIV

На первом этапе исследования больные внебольничной пневмонией разделялись на группы на основании тяжести патологии, которая оценивалась на основании шкалы, представленной Британской Торакальной Ассоциацией (2002). На основании предложенных критериев производилось разделение пациентов с тяжелым (группа I) и нетяжелым (группа II) течением пневмонии.

На основании клинического ответа пациенты с тяжелым и нетяжелым течением заболевания составляли группу с положительной и негативной реакцией на эмпирическую антибиотикотерапию, проводимую в течении 72 часов с момента поступления в отделение и включения в исследование. На

принятие решения об эффективности проводимой антибактериальной терапии влияла динамика общего клинического состояния. Ключевым критерием указывающим на положительный эффект терапии было снижение температуры ниже 38.3 °С и уменьшение частоты дыхания менее 20 в минуту. Среди критериев неэффективности эмпирической антибактериальной терапии (через 72 часа после назначения) при НП рассматривались характеристики, предложенные в исследовании Ioanas et al (2001,2003):

а) сохранение температурной реакции (>38°С) или гипотермия (<35.5°С) при наличии гнойного характера мокроты;

б) увеличение площади воспалительного инфильтрата по данным рентгенографии в сочетании с ухудшением оксигенации крови (по данным пульсоксиметрии);

в) динамическое ухудшение состояния, связанное с развитием септического шока или СПОД, отсутствовавшие в первые сутки исследования;

д) смертельный исход, связанный с основным заболеванием.

На следующем этапе распределение на группы, включенных в исследование больных, происходило в зависимости от исхода заболевания на 28 день с момента госпитализации. При этом причина смерти должна была быть патогенетически связана с основным заболеванием. Таким образом была сформирована группа умерших и выживших больных.

Дополнительно тяжесть состояния всех больных оценивалась ежедневно с помощью шкалы SAPS II. Кроме того, в комплекс диагностических мероприятий включен общий анализ крови, биохимический анализ крови и оценка кислотно-щелочного равновесия. Бактериологическое исследование мокроты, включавшее тесты на антибиотикорезистентность, проводилось у всех больных, включенных в исследование. Бактериологическое исследование крови и материала, полученного при бронхоскопическом исследовании, назначалось в соответствии с клинической ситуацией (резистентность к проводимой терапии, госпитальный характер пневмонии).

На 1,2,3,5,7 и 10 день с момента госпитализации, а также в предпоследний день (L) перед выпиской либо из периферических сосудов, либо из подключичной или яремной вены проводился забор крови для экспериментальных исследований. У умерших больных за последний (L) считался день забора крови предшествующий смерти или 20 день наблюдения.

В качестве контрольной группы для исследования экспрессии генов были включено здоровые добровольцы, у которых в анамнезе и на момент проведения эксперимента отсутствовали признаки острой или хронической воспалительной патологии или заболевания способного исказить результаты лабораторных измерений. Группой контроля для исследования уровня циркулирующих цитокинов служили пациенты с ВП без признаков ССВО.

Клинические и лабораторные методы

Критерии тяжести BTS (2002) для больных ВП (пациент, включенный в исследование, относился к группе с тяжелым течением при соответствии клинической картины двум большим или одному большому и двум малым критериям).

Большие критерии

1. Нарушение или снижение уровня сознания

2. Мочевина более 7 ммоль/л

3. Частота дыхания более З0 в минуту

4. Артериальное давление - систолическое менее 90 мм рт ст, диастолическое менее б0 мм рт ст

Малые критерии

1. не смотря на оксигенотерапию

2. Двухсторонняя или многодолевая инфильтрация при рентгенографии органов грудной клетки

^ндром системного воспалительного ответа (CCBО) характеризовался двумя или более признаками:

1. температура >38°C или <36°C,

2. Ч^90/мин,

3. ЧД > 20/мин, РаШ2<32 мм рт ст.,

4. лейкоциты >12000/мл или <4000/мл, палочко-ядерные лейкоциты

Оценка тяжести состояния по шкале SAPS II (1993). Всем пациентам с признаками CCBО проводилась оценка тяжести состояния в соответствии со шкалой SAPS 11. По ниже приведенной формуле вычисляется вероятность госпитальной смертности.

Logit = ßo+ßi (сумма баллов SAPS И) +ß2(ln(SAPS II+1)),

Pr (у= Mogit)= e'cgl,/l+eIOEIt, где Рг- вероятность госпитальной смертности, е -математическая константа (2,718).

Количественная полимерзно-цепная реакция в режиме «реального» времени. Образцы крови были получены из центральной или кубитальной вены Для изоляции клеточной РНК кровь помещалась в пробирки PAXgene Blood RNA (cat. nos. 762125, PreAnalytiX GmbH, Switzerland). Cпектрофотометрическое определение количества РНК в материале проводилось на приборе GENEQUANT. Процесс обратной транскрипции проводился на персональном cycler В iometer. Полимеразно-цепная реакция проводилась с использованием прибора LightCycler (Roche Diagnostics). Cпецифические олигонуклеотидные праймеры были синтезированы MWG-Biotech (Ebersberg, Germany) в соответствии с нуклеотидной последовательностью человеческого генома (EMBL/Gene Bank). Итоговое число копий мРНК вычислялось путем умножения концентрации мРНК (fg/|ll) на фактор (число копий РНК в |il). В качестве референтного гена (house-keeping gene) изучалась экспрессия элонгационного фактора -2.

Результаты исследования представлены как отношение числа копий изучаемой мРНК к числу копий элонгационного фактора -2.

Определение малонового диальдегида в реакция с тиобарбитуровой кислотой проводилось для оценки активности свободно-радикальных реакций на спектрофотометре Beckman DH7500. Конечная концентрация МДА вычислялась умножением среднего на сумму средних калибровочной кривой и выражалась в цто1/1.

Исследование экспрессии поверхностных молекул на циркулирующих лейкоцитах проводилось с помощью лазерного проточного цитофлуориметра (FACScalibur, BD 1998) с программой СимулСет для анализа данных. Для проведения анализа использовались моноклональные антитела НПЦ МедБиоСпектр (Москва, Россия), аттестованные в рамках 5 (США, 1994) и 6 (Япония, 1996) Международного совещания по дифференциальным антигенам человека. В тесте применялись моноклональные антитела прямо меченные FITS и фикоэритрином. Результаты измерений представлены в виде уровня флуоресценции (%) и средней интенсивности флуоресценции (rMFI). Для уменьшение влияния вариабельности показателей, полученных при использовании проточной цитометрии, по мимо стандартного расчета средней интенсивности флуоресценции (rMFI ), проводилось исследование с применением внешнего контроля, в качестве которого использовались образцы крови здоровых добровольцев. Забор крови добровольцев соответствовал дню забора материала у больных, включенных в исследование. Формула расчета значения интенсивности свечения корригированная по отношению к показателям добровольцев (Muller Kobold et al, 2000):

Отношение экспрессии - MFI пациекты*позитивные клетки-

(%)пациенты*Ю0% / MFI ко(щопь*ПОЗИТИВНЫе КЛвТКИ (%) контроль

Расчет отношения экспрессия проводился только в первый день при заборе крови до начала терапии. Если уровень экспрессии пациента и контрольного добровольца

совпадал, то значение соответствовало 100%. Значение отношения экспрессии выше или ниже 100% указывало на повышенную или сниженную экспрессию по отношению с экспрессией клетками контрольной группы.

Результаты MEGX-теста исследовались с помощью флуорисцентного поляризационного иммунного анализа (Abbot Laboratories, Chicago, IL, USA). Контроль полученных результатов производился методом

высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с использованием флуориметрического детектора на аппарате фирмы Shimadzu. Значение MEGX оценивалось по уровню в крови, измеренному на 30 минуте с момента инъекции лидокаина. Снижение значения MEGX менее 30 ng/1 расценивалось как крайне низкое. Нормальная концентрация MEGX составляла более 40

Уровень интерлейкинов в плазме определялся с помощью ELISA теста с использованием наборов фирмы Diagnostic Products Corporation (Los-Angeles, USA).

Статистический анализ

Результаты проведенных экспериментов отражены в работе в виде медианы и 2.5 и 97.5 процентили, заключенных в скобки. Для оценки статистической достоверности различий между двумя независимыми группами использовался непараметрический метод - Манна-Уитни (MannWhitney) U тест. Для сравнения более чем двух независимых групп, применялся непараметрический метод - Крускала - Воллиса (Kruskal-Wollis) Н тест. Если возникала необходимость сравнить динамику изменений внутри одной группы, но в разные промежутки времени использовался тест Вилкоксона (Wilcoxon). Качественные различия между группами оценивались с помощью теста Фишера (Fisher). Для подсчета риска летальности, а также эффективности проводимой терапии оценивались относительный риск (realtive risk, RR) и отношения шансов (odds ratio, OR). Для проведения корреляционного анализа между двумя переменными использовался коэффициент Спирмена (Spearmen). Статистическая значимость считалась при значении р менее 0.05. Для проверки объективности рандомизации пациентов применялась характеристическая кривая (Reciever Operating Curve, ROC). На основании результатов анализа сделан вывод о чувствительности и специфичности лабораторных показателей. Для проведения статистического анализа использовались статистические программные пакеты GraphPad Prism ver. 4.0 (GraphPad Software, Inc.), Statistica 6.0 (StatSoft, Inc.) и Analyze-It ver. 1.44 (Analyse-It Software, Leeds, UK).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика больных

Общее количество пациентов с пневмонией на начальном этапе исследования составляло 297 человек, однако по различным причинам, включающим не соответствие критериям включения и выявление признаков, относящихся к критериям исключения, 73 пациента выбыли из исследования и их данные не использовались при дальнейшем анализе. Согласно представленным критериям общее количество человек, включенных в основную группу составило 214 больных с двумя клиническими формами пневмонии- внебольничной и нозокомиалыюй. При поступлении у всех пациентов был диагностирован ССВО (таблица 1). В целом в исследуемую группу вошли 126 (59%) мужчин и 88 (41%) женщин в возрасте 50± 16 лет. Больные с пневмонией, но без ССВО сформировали контрольную группу (п=30). Между группами не было выявлено существенных демографических

различий. У 142 пациентов была диагностирована внебольничная пневмония. Практически у половины (49%) из включенных больных отмечалось тяжелое течение заболевания и у 51% нетяжелая пневмония. В группе с нетяжелым течением ВП летальных исходов зарегистрировано не было. В группе больных НП, в которую было включено 72 человека, отмечалось наибольшее число умерших пациентов (26%). Суммарный риск смертности при НП, оцененный по шкале SAPSII на первый день исследования 9.7 % (8.8-25), был значительно выше, чем у пациентов с ВП (р= 0.01). В группе тяжелых больных с ВП по шкале BTS летальность, составившая 6% от группы I в целом, так же как и риск смертности по SAPS II превышали соответствующие показатели по сравнению с группой П (р<0.0001).

Таблица 1. Общая хар;

ктеристика больных

Клинические формы пневмоний

ВП

Группа I

Группа П

НП

Общее

число

больных

Общее число

больных

70/142 (49%)

72/142 (51%)

72

214

Умершие

9/142

0/142

19/72 (26%)

28/214 (13%)

Пол (м/ж)

38/32

40/32

48/24

126/88

Возраст

45±17

51±16

56 ±18

50±16

SAPS вероятность* смертности в день 1 (%)

П

5.5

(0.5-15.3)

1.5

(0.46-5.2)

9.7

(8.8-25)

ССВО

*р (группа! - группа II) <0.0001; р (группа! - НП) = 0.01

Объем поражения паренхимы легких существенно отличался между больными с тяжелой ВП, НП и пациентами из группы II. Пневмония у пациентов из группы II характеризовалась преимущественно инфильтрацией одного легкого (89%), в то время как в группе I и у больных НП преобладало двухстороннее поражение, которое было отмечено у 46% и 45%, соответственно. У больных с более тяжелым течением ВП (63%) и в группе НП (85%) преобладали воспалительные изменения в 2 и более долях легких, а в группе П у 60% обнаруживался однодолевой процесс. Субтотальная инфильтрация легких, либо поражение 3 и более долей были отмечены при ВП тяжелого течения и больных НП, что суммарно составляло 11% от 214 больных, принимавших участие в исследование. При НП однодолевых процессов не обнаруживалось. Сторона поражения существенно не зависела ни от тяжести поражения, ни от клинической формы пневмонии. Во всех изучаемых группах выявлялись внутрилегочные осложнения, которые по

общей частоте не отличались между группами - в группе I у 31 % человек (22/70 человек), при пневмонии нетяжелого течения по БТ8 35% (25/72 человек), а при НП 29% больных (21/72 человек). Общая частота внелегочных осложнений среди больных с пневмонией и ССВО составила 29% (62/214 человек). Наибольшее количесвто таких больных 57% отмечалось в группе с НП (41/72 человек), а у больных с тяжелым течением ВП это число достигало 30% (21/70 человек). При нетяжелом течение ВП внелегочных осложнений не обнаруживалось. Спектр внутрилегочных осложнений при ВП и НП значительно отличался по частоте ОРД С, который в группе I составил 4%, а при НП достигал 20% (таблица 26). Для больных из группы II не было характерно развития внелегочных осложнений пневмонии, в то время как при НП преобладали септический шок (8%), СПОД (27%) и необходимость в ИВ Л (14%). При тяжелой ВП незначительно доминировала потребность в ИВЛ.

Общее число лиц с сопутствующими заболеваниями составило 99 человек (46%). В группе I было выявлено 14 больных (20% человек), в группе II -12 (17% человек), а у группы больных с НП 72 человека (100% человек). Поводом госпитализации пациентов с НП служили причины несвязанные с бактериальным воспалением легких, поэтому спектр сопутствующих заболеваний был значительно выше в этой группе (таблица 2). Лидирующими причинами госпитализации лиц из группы НП были острое нарушение мозгового кровообращения, ХОБЛ и хирургическая патология. В группе больных с ВП и НП наиболее часто пневмонии сопутствовали ХОБЛ.

Таблица 2. Сопутствующие заболевания у больных с различными

клиническими вариантам и пневмоний

ВП НП

Группа I Группа II

ХОБЛ 9/70 3/72 18/72

Сахарный диабет 2 типа 3/70 2/72 -

ИБС - 7/72 6/72

ОНМК 2/70 - 17/72

Перфоративная язва желудка - - 11/72

Желудочно-кишечное кровотечение - - 12/72

Острый панкреатит - - 2/72

Отморожение мягких тканей конечностей - - 7/72

Бактериологическое исследование мокроты проводилось у 42% пациентов. Результаты оказались положительными у 11% больных. В группе больных с ВП микробиологический анализ мокроты оказался положительным

у 17 пациентов (12% человек), а у больных НП только у 8 человек (11% человек). При ВП в анализе мокроты преобладали грам-положительные кокки, в то время как при НП встречались либо грам-отрицательные бактерии, либо пенициллин-резистентные пневмококки. Средние показатели пребывания в стационаре между ВП и НП принципиально не отличались (таблица 3). Хотя характер патологии в группе НП подразумевал более длительный период госпитализации, высокая частота смертности в первые 28 суток сглаживала различия в средних показателях. Единственным показателем, указывающим на статистические различия между группами был день появления положительных изменений на рентгенограмме легких, который при тяжелом течении составил 17 дней (5-30), а в группе П - 9 дней (7-24; р =0.006).

Таблица 3. Характеристика больных, отражающая эффективность проводимой терапии _

ВП НП

Группа I• Группа П

Койко-день 24 (9-61) 18 (9-30) 22 (4-34)

Длительность антибактериальной терапии (день) 20 (9-37) 15 (8-29) 14 (4-32)

Число больных, с неэффективной эмпирической терапией 40/70 44/72 54/72

День нормализации температуры (от начала лечения) 13 (1-35) 11 (3-21) -

Положительные изменения при рентгенографии легких (день)* 17 (5-30) 9 (7-24) -

*р =0.006

Характеристика контрольной группы. У пациентов с пневмонией без признаков ССВО (п=30), 17 из которых мужчины и 13 женщины, средний возраст был равен 57±10 лет. У 27 человек была выявлена внебольничная пневмония, а у 3 пациентов обнаружен нозокомиальный клинический вариант. У 9 пациентов при микробиологическом анализе мокроты обнаружен рост S. pneumonia. Характеристика состояния больных контрольной группы на основании шкалы SAPS II не проводилась. У 100% больных (30 человек) проводилась монотерапия ампициллином или цефалоспоринами Ш поколения (цефотаксим или цефтриаксон). Для изучения экспрессии генов в качестве контроля использовались 28 здоровых добровольцев в возрасте от 26 до 69 лет.

Характеристика тяжести состояния и критериев, составляющих ССВО

Клиническая характеристика больных базировалась на симптомах, входящих в состав ССВО (таблица 4). Средние показатели температуры не продемонстрировали существенной разницы между изучаемыми группами. Однако низкое значение медианы температуры у больных НП относительно пациентов с внебольничной пневмонией был следствием изначально более тяжелого состояния, на которое в том числе указывал уровень температуры ниже 36 градусов у 31% человек.

Таблица 4. Критерии СС ВО при поступлении

Параметры ВП НП

Группа I Группа II

Температура (С) 39 (35.2-39.7) 38.5 (37.4-40) 37.5 (34-39)

ЧСС (в мин) 112* (100-160) 100* (100-130) 116 (100-150)

ЧД (в мин) 28** (24-40) 22** (20-32) -

Лейкоциты 10.5 (1.4-26) 11.5 (6-15) 15.75 (11.2-21)

Палочко-ядерные пейтрофилы (%) 15.5 (2-46) 9 (1-58) 11 (3-40)

*р = 0.02 **р = 0.0005

При НП анализ показателя не проводился в связи с проведением ИВЛ в принудительном режиме у части пациентов при включении в исследование. Достоверная разница была обнаружена между больными с нетяжелым течением ВП и группой I, у которых выраженность тахипноэ на момент включения была выше (р =0.0005). Единственным показателем, который в динамике демонстрировал различия между группами, была ЧД, которая к 3 дню у больных с ВП тяжелого течения составил 24 в минуту (18-30), а в группе II 20(16-22; р= 0.003). К 10 дню все различия между группами исчезли.

При анализе данных больных с ВП, разделенных на основании клинического ответа на эмпирическую антибактериальную терапию, были обнаружены различия в динамике признаков ССВО в течение первых 72 часов (таблица 5). Наибольшую достоверность в различиях продемонстрировал уровень температура, который снизился к третьему дню лечения (р =0.004). Значимые отличия в динамике также отмечены в уровне ЧСС И ЧД. Следует подчеркнуть, что через 72 часа лечения средние значения основных параметров (температура и уровень лейкоцитов) в группе, ответивших на лечение, достигли нормального уровня.

Таблица 5. Критерии ССВО как маркеры клинического ответа на эмпирическую антибактериальную терапию

Критерии • Клинический ответ (-) Клинический ответ (+)

tLÜU/ДНИ 1 3 1 3

Температура (С) 38.6 38.6 38.3** 36.9**

(35.239.7) (37.2-39.3) (37.4-40) (36.7-37.8)

ЧСС (в мин) 120 115 100* 90*

(96-140) (100-130) (90-130) (80-120)

ЧД (в мин) 27 24 22* 19*

(24-40) (20-40) (20-32) (16-22)

Лейкоциты (mm1) 9.6 7.9 12 10

(1.919.9) (1.3-20) (6-7.1) (5.2-13)

Палочко- 16 27 5 5.5

ядерные нейтрофилы. (%)

(3-46) (5-50) (1-41) (1-22)

*р (группа II день 1 - день 3; Mann-Whitney) < 0.05 **р (группа II день 1 день 3; Mann-Whitney) <0.005

При анализе изменений представленных в таблице параметров в группах, сформированных на основе исхода заболевания, у умерших больных выявлялось отсутствие значимых изменений температуры на протяжении исследования. Медиана при этом колебалась на уровне 37 и 37.2 °С, что было вызвано изначально более низкой температруной реакцией у данной категории лиц. Кроме того, умерших больных на протяжении наблюдения отсутствовали значимые колебания в ЧД, медиана которой составила 30 °С в 1 и 3 дни исследования. Температура (таблица 6) у выживших в первый день, оказавшаяся выше по сравнению с умершими (р =0.034), снизилась в последний день исследования (р =0.006). В группе выживших к последнему дню исследования наблюдалось снижение ЧД с 22 (18-30) до 18 в минуту (17-

22; р< 0.0001). Уровень ЧД в группе умерших был изначально в первый день значительно выше, чем у выживших (р =0.006). ЧСС у больных из группы выживших к последнему дню достоверно снизилась (р <0.0001) в отличия от умерших.

Таблица 6. Ключевые клинические критерии у умерших и выживших больных с пневмонией

Умершие Выжившие

1 день Последний 1 день Последни

день й день■

Температура (Q 37 37.2 38.5* 37.1*

34-39 35-40 35-39.6 36.4-38.5

ЧСС (в мин) 113 115 113*** 89***

85-150 96-150 100-130 70-105

ЧД (в мин) 30 30** 22*** 18**'***

22-32 22-30 18-30 17-22

Лейкоциты (тл) 12.35 11.2 13 9.1

7.3-15.9 5.7-23.5 4.1-25 4.5-17

*р <0 01, ** р <0.001, *** р <0.0001

Между всеми группами выявлялись значимые различия в первый день исследования в тяжести состояния по SAPSII до начала терапии (таблица 7). Риск смертности был выше у больных с нозокомиальной пневмонией по сравнению с группой ВП, при этом отличия наблюдались на протяжении всего исследования как с группой I, так и с группой П. В тоже время тяжесть состояния по SAPS II был выше у больных с тяжелым состоянием по BTS в первый день исследования. В последующем на 3 (р =0.0008) и 5 (р =0.01) дни различия между группами уменьшались за счет нормализации состояния у больных с тяжелой ВП. На 7 (р =0.66) и 10 (р =0.1) дни по тяжести состояния группы I и II не отличались друг от друга. Риск смертности у больных умерших в течение 28 дней был выше, по сравнению с выжившими на протяжении всего периода наблюдения. При этом колебаний медианы риска смертности (8.8 %) в группе умерших практические не наблюдалось, а достоверность различий между группами нарастала к 10 дню исследования. То есть в первый день р составило 0.027, а в 7 и 10 день работы вероятность ошибки уменьшилась до 0.0001, что, прежде всего, было связано со

снижением риска смертности в группе выживших и со стойко высокими показателями SAPS II в группе умерших.

Таблица 7. Риск смертности по SAPS II у больных с внебольничной и нозокомиальной пневмонией

Дни вп нп

Группа I Группа П

1 5.5 1.5 9.7**

0.5-15.3 0.46-5.3 8.8-25

3 2.75 1.5 7.3*

0.5-8.77 0.5-3 3.7.48.4

5 2.6 1.5 3*

0.46-16.7 0.5-3 2-76.9

7 2.3 1.5 5*

0.46-41 0.5-3 2-82.6

10 2.3 1.51 5.9*

0.46-8.8 0.5-3 2-82.6

*р(НП- группа! <0.05, **р(НП-группа!) <0.01

Характеристика антибактериальной терапии

Среди всех пациентов с внебольничной пневмонией, включенных в данное исследование, 16% получали антибактериальную терапию на догоспитальном этапе, которая во всех случаях была признан не эффективной, что и послужила причиной госпитализации. Лидирующей группой препаратов по частоте назначения вне зависимости от тяжести пневмонии были полусинтетические пенициллины - 50 и более процентов больных. Всем больным поступившим в стационар в течение первых часов после верификации диагноза была назначена следующая антибактериальная терапия (таблица 8). Эмпирическая антибактериальная терапия оказалась неэффективна у 57% и 61% больных из группы I и П, соответственно. У пациентов с клинически положительным ответом через 72 часа терапии, первоначально выбранная схема была сохранена. Лечение было скорректировано на основании данных микробиологического анализа и предположение о спектре возбудителей.

У больных нозокомиальной пневмонией у 30% в качестве эмпирической схемы была выбрана монотерапия, которая у половины больных проводилась цефалоспоринами 3 поколения и фторхинолонами. У 25% применялись цефалоспорины 4 поколения. Нескольким пациентам также назначался меропенем. В тоже время 70% назначалась комбинированная терапия.

Таблица 8. Эмпирическая антибактериальная госпитализации

терапия в 1 день

Вид антибактериальной терапии Группа I Группа II

Монотерапия 16% (11/70) 52% (37/721

• полусинтетические пенициллины 3.2% (2/70) 32.3% (23/72)

• уреидопенициллины 3.2% (2/70) -

• макролиды(эритромицин) 9.7% (7/70) 3.2% (2/72)

• цефалоспорины 3 пок. - 16.1% (12/72)

комбин ированная 84% (59/70) 48% (35/72)

• полусинтетические 9.7% (7/70) -

пенициллины+макролиды(эритроми

цин)

• цефалоспорины 3 55% (39/70) 32% (23/72)

пок.+макролиды(эритромицин)

• цефалоспорины 3 - 10% (7/72)

пок.+метронидазол

• фторхинолоны +полусинтетические 16% (11/70) 6% (5/72)

пенициллины

Таблица 9. Антибактериальная терапия через 72 часа после госпитализации

Группа I ГруппаП

монотерапия • Цефалоспорины 4 16% (11/70) 9.7% (7/70) 36% (26/72)

поколения • Цефалоспорины 3 6.5% (4/70) 19% (14/72)

поколения • Фторхинолоны • Полусинтетические - 13% (9/72)

пенициллины • макролиды комбинированная. • Цефалоспорины 3 пок.+метронидазол • Фторхинолоны+ам иногликозиды 84%(59/70) 7% (2/70) 3% (1/70) 3.2%(21/72) 64%(46/72) 7% (5/72)

• Цефалоспорины 3 поколения+фторхи 13% (4/70) 14%( 10/72)

нолоны

• Цефалоспорины 3 пок.+макролиды (эритромицин) 41% (29/70) 43%(31/72)

Патофизиология системной воспалительной реакции при пневмонии

Системная концентрация про и противовоспалительных цитокинов в зависимости от тяжести пневмонии

Концентрация ГЬ-6 при поступлении в группе больных с тяжелой пневмонией (743.5 pg/ml; 115-42452 pg/ml) оказалась существенно выше по сравнению с группой II (64.6 pg/ml; 2.1-454 pg/ml, p =0.0001). К 7 дню уровень в обеих группах снизился, но по-прежнему оставался значительно выше в I группе (73 pg/ml; 0.23-1452 pg/ml), чем в группе II (7.9 pg/ml; 1.2-46 pg/ml, p =0.0007). К 10 дню различия в концентрации ГЬ-6 между группами (р= 0.036) значительно уменьшились - 12.94 pg/ml (1.2-980 pg/ml) и 5.73 pg/ml (0.23-242 pg/ml) соответственно (рисунок 1).

Рисунок 1. Концентрация ГЬ-6 в плазме у больных из группы I и П с 1 по 10 день исследования

Подобная картина была характерна для С-реактивного белка, концентрация которого в плазме достигла значимых различий между группами к 3 дню исследования, когда концентрация в группе I составила 175 pg/ml (48-289 pg/ml), а в группе с нетяжелой пневмонией 112 pg/ml (9.5-262 pg/ml; p = 0.02). К 5 дню исследования уровень в группе больных с тяжелым состоянием снизился до 135 pg/ml (49-347 pg/ml), а во второй группе до 77 pg/ml (2.2 - 203 pg/ml; p = 0.01). Тенденция к снижению уровня CRP наблюдалась до 10 дня исследований, но преобладание концентрации в группе I над группой II оставалась достоверной до 7 дня - 97 pg/ml (22-226 pg/ml) и 48.4 pg/ml (0.4174 pg/ml;p <0.02) соответственно.

Анализ концентрации Ш-8 не показал достоверных отличий между группами, рандомизированными по тяжести состояния, но подчеркнул тенденцию (р> 0.05) к снижению концентрации Ш-8 к 10 дню исследования в группе I. При поступлении концентрация ГЬ-10 в группе больных с тяжелой пневмонией (109 pg/ml; 8-882 pg/ml) оказалось существенно выше, чем в группе II (13 pg/ml; 4-155 pg/ml, p< 0.001) (рисунок 2). К третьему дню после начала терапии и включения в исследования концентрация Ш -10 снизилась,

однако по-прежнему сохранялась выше в группе I (32.5 pg/ml; 6-132 pg/ml) no сравнение с группой II (10.5 pg/ml; 4-56 pg/ml, p< 0.01). В дальнейшем сохранялась тенденция к снижению уровня цитокина, который у пациентов с тяжелой пневмонией к 7 дню составил 21 (3-371), а в группе II -8.5 pg/ml (3-17 pg/ml; p= 0.004). В тоже время к 10 дню между группами I (14 pg/ml; 3-77 pg/ml) и II (7 pg/ml;3-15 pg/ml) наблюдались минимальные статистические различия (р = 0.04).

Рисунок 2. Концентрация ГЬ-10 в плазме у больных из группы I и II с 1 по 10 день исследования

Для отношения Ш-6/1Ь-10 на протяжении с 1 по 10 день исследования наблюдалось заметное снижение значения, которое достигло статистической значимости к 3 дню - 11.97 (1.09-28.32) и 2.92 (0.36-31.31; р = 0.04) соответственно. К 7 дню исследования значение ГЬ-6/ГЪ-10 составило 6.92 (0.19-23.86) в группе больных тяжелой пневмонией и 0.8 (0-3.83; р 0.01 ) в группе П. Как в первый, так и в 10 день исследования показатели в обеих группах были не отличимыми, несмотря на то, что при индивидуальном анализе значения Ш-6 и ГЬ-10 обнаруживались статистически достоверные различия, что преимущественно происходило за счет снижения концентрации провоспалительного цитокина.

Для анализа связи выраженности системной воспалительной реакции с прогнозом пациенты разделялись на группы в зависимости от исхода заболевания на 28 день наблюдения. Причина смерти у умерших больных патогенетически была связана с основным заболеванием. В группу умерших вошли 28 человек, у 9 из которых была выявлена тяжелая ВП по BTS, и 19 человек с НП. К выжившим больным принадлежали 186 человек с различными клиническими формами пневмоний: ВП при тяжелом течении -33% (61/186 человек), ВП из группы II - 39% (79/186 человек), НП - 28% (53/186 человек). Суммарная концентрация ГЬ-6 в плазме выживших пациентов (12.01 pg/m; 0.2-4679 pg/ml) за весь период исследования оказалась

существенно ниже по сравнению с умершими (67.4 pg/ml; 1.9 - 1452 pg/ml, p< 0.00001). Тенденция для других циркулирующих цитокинов была статистически не достоверна и не отразилась на результатах проведенного анализа. Подобная соотношение между обеими изучаемыми группами с высокой степенью достоверности была отмечена для концентрации CRP в плазме (р =0.0002). Изучение динамики IL-6 позволил обнаружить неоднородность в образовании в период с 5 по 10 день исследования у выживших и умерших пациентов (рисунок 3).

Рисунок 3. Концентрация IL-6 в группе выживших и умерших пациентов с пневмонией

На пятый день исследования концентрация IL-6 в системном кровотоке у выживших пациентов снизилась до 14.8 pg/ml (0.2-128 pg/ml), по сравнению с группой умерших (60 pg/ml; 26.05-213 pg/ml, p =0.01), у которых уровень образования интерлейкина существенно не изменилсяДанная тенденция была характерно и для значения CRP (р =0.038) - 62 pg/ml (2.2-347) и 162 pg/ml (89 - 281) соответственно (рисунок 31). К 7 дню уровень IL-6 в группе умерших существенно не изменился (52 pg/ml; 16-1452 pg/ml), в то время как у выживших больных он снизился до 9 pg/ml (0.2 - 127 pg/ml, p=0.003). Усиление различий между группами было выявлено и на десятый день исследования, как для IL-6 (р =0.01), так и для CRP (р =0.027).

При сравнении уровня данных показателей между умершими и выжившими пациентами в первый и в последний день забора материала была обнаружена достоверная динамика в концентрации воспалительных маркеров (IL-6 и CRP) в плазме. Если в первый день существенных статистических различий между обеими группами не отмечалось, то в последний день концентрация IL-6 у выживших пациентов (9 pg/ml; 0.2- 141 pg/ml) была достоверно ниже как по отношению к уровню цитокина в этой же группе в первый день исследования (54 pg/ml; 30-99 pg/ml), так и по отношению к значению в последний день у умерших (88 pg/ml; 9.1- 1452 pg/ml).

Концентрация CRP у выживших больных к последнему дню исследования снизилась до 35 mg/1 (1.1-187.3 mg/1), по сравнению с первым днем 196.1 mg/1 (27.4 - 599 mg/1) (рисунок 4).

Рисунок 4. Концентрация CRP в первый и в последний день исследования

Уровень цитокинов у пациентов с пневмонией, составивших контрольную группу

В контрольной группе значение ИЛ-6 в первый день составило 26 pg/ml (3-59 pg/ml). В дальнейшем клинически значимых колебаний обнаружено не было. Суммарный уровень ИЛ-6 за все время исследования, отмечавшийся в контрольной" группе достигал 15 pg/ml (3-59 pg/ml). Наибольшая концентрация Ш-8, полученная в контрольной группе, зарегистрирована в первый день (30 pg/ml; 14 - 42 pg/ml), в то время как суммарное значение цитокина достигало 42 pg/ml (14-89 pg/ml). В контрольной группе значение ИЛ-10 за пять дней исследования находилась в пределах референтного интервала, а медиана концентрации за весь период равнялась 3 pg/ml (3 -70 РёМ).

Уровень МДА в плазме как маркер оксндативного стресса

У больных с тяжелой пневмонией из группы II была обнаружена повышенная концентрация МДА в плазме крови как. по сравнению с пациентами из группы П, так и по отношению к контролю. Достоверное повышение образование МДА сохранялось до 3 дня исследования. В дальнейшем отмечалась тенденция к снижению концентрации МДА до границ соответствующих контрольной группе, наблюдаемая до последнего дня забора материала (таблица 10).

Таблица 10. Концентрация МДА в плазме у больных с из группы I и II за период исследования.

Дни Группа I Группа II контроль

1 3,87* 2,71** 2,43

3,12-12,85 0,56-3,21 1,96-3,64

3 3,55* 2,79*

2,68-4,59 1,51-4,82

5 2,80 2,50

2,69-7,93 1,06-7,93

7 2,86 3,21

1,93-4,06 2,28-4,87

10 2,57 2,36

1,24-3,25 1,24-2,66

*р < 0.05 (по сравнению с контрольной группой) **р< 0.01 (по сравнению с группой I, день 1) §р < 0 05 (по сравнению с группой I, день 3)

Значение циркулирующих лейкоцитов в патофизиологии системной воспалительной реакции при пневмонии

Экспрессия генов раннего стресса, антиоксидантов и цитокинов циркулирующими лейкоцитами

Изучаемые показатели обладали различным профилем экспрессии у выживших и умерших пациентов в различные дни исследования (таблица 11).

Таблица 11. Изменение экспрессии стрессовых генов циркулирующих

День с-йк с^ип егг-1

/показатель (копия мРНК/ (копия мРНК/ (копия мРНК/

копия мРНК ЕР-2) копия мРНК ЕР-2) копия мРНК ЕР-2)

Ум Выж Ум Выж Ум Выж

1 0,0259 0,0293 0,0077 0,0095 0,028 0,049

0,0026- 0,0022- 0,0019- 0,0015- 0,008- 0,005-

0,0712 0,1233 0,0262 0,0827 0,124 0,324

3 0,0114 0,0238 0,0079- 0,0126 0,024 0,027

0,0030- 0,0026- 0,0019- 0,0011- 0,008- 0,005-

0,0853 0,0999 0,0243 0,0513 0,130 0,440

5 0,0112 0,0211 0,0086 0,0045 0,025 0,020

0,005- 0,0028- 0,0025- 0,0010- 0,009- 0,003-

0,0622 0,1010 0,0204 0,4086 0,120 0,348

7 0,0155 0,0160 0,0065 0,0113 0,014 0,024

0,0109- 0,0019- 0,0028- 0,0008- 0,009- 0,001-

0,0228 0,0958 0,0079 0,0801 0,114 0,270

10 0,0118 0,0154 0,0102 0,0082 0,052 0,025

0,00780,0180 0,00120,0836 0,00480,0123 0,00070,0514 0,0100,097 0,0050,184

ь 0,0114 0,0119 0,0073 0,0071 0,025 0,021

0,00780,0180 0,00120,0836 0,00280,0123 0,00130,0586 0,0100,097 0,0010,300

Общие механизмы активации изучаемых генов при тяжелой пневмонии подтверждают результаты корреляционного анализа, указывающие на достоверную взаимосвязь между egr-1, с-ип и с-йв, наблюдающийся с первого и до последнего дня исследования (таблица 12). Таблица 12. Корреляционный анализ (г, Спирман) экспрессии мРНК egr-1, с-

Как выжившие, так и умершие пациенты обладали более высоким уровнем транскрипции egr-1 в первый день исследования по сравнению с контрольной группой. Однако у выживших (р =0.009) больных была выявлена тенденция к более значительному и достоверному приросту концентрации egr-1, чем у умерших (р =0.046). В последний день тенденция к уменьшению egr-1 мРНК/ ЕР-2 мРНК была более выраженной у выживших пациентов, в то время как среди умерших показатель не изменился (рисунок 5).

Рисунок 5. Экспрессия мРНК egr-1 у выживших и умерших больных пневмонией по сравнению с группой контроля в первый и последний дни исследования

В группе выживших отмечался более высокий уровень транскрипции мРНК Н8Р70 в первый день по сравнению с последним днем (р =0.0006) и с контрольной группой (р =0.037). У умерших пациентов в первый день не отмечалось роста экспрессии ШР70, который оказался существенно выше в последний день исследования по отношению к значению Н8Р70 мРНК/ ЕР-2 мРНК группы выживших (р =0.009) (рисунок 6).

Рисунок 6. Экспрессия мРНК ШР70 у выживших и умерших больных пневмонией по сравнению с группой контроля в первый и последний дни исследования

В сравнении с умершими пациентами в группе выживших отмечалась тенденция к активации транскрипции мРНК 1Ь-10 (рисунок 7) в первый день исследования (р =0.067).

Рисунок 7. Экспрессия мРНК 1Ь-10 у выживших и умерших больных пневмонией по сравнению с группой контроля в первый и последний дни исследования

При этом увеличение экспрессии 1Ь-10 у выживших пациентов (р =0.0002) по отношению к контролю оказалось более значимо в первый день исследования, чем в группе умерших (р =0.046). В последний день концентрация у умерших больных сохранилась на прежнем уровне, в то время как в группе выживших отмечалась тенденция к уменьшению экспрессии 1Ь-10 (р =0.07).

Изучение экспрессии мРНК 1Ь-6 и 1Ь-8 за весь период исследования не позволило обнаружить активации транскрипции генов, кодирующих данные цитокины, у циркулирующих лейкоцитов у пациентов с тяжелой пневмонией.

У больных с пневмонией было обнаружено достоверное увеличение экспрессии мРНК 80Б2 в 1 день исследования (рисунок 8) до начала терапии при сравнении со здоровыми добровольцами (р =0.006). Подобная тенденция наблюдалась вплоть до 7 дня исследования (р =0.011), в то время как к 10 дню статистических различий выявлено не было. В группе выживших пациентов обнаруживался достоверный рост экспрессии мРНК 80Б2 (р =0.006) в первый день по сравнению с контрольной группой. К последнему дню значимость различий между выжившими и контролем уменьшилась (р =0.043), но был отмечен рост экспрессии 80Б2 у умерших относительно показателей контрольной группы (р =0 027).

Рисунок 8. Экспрессия мРНК 80Б2 у выживших и умерших больных пневмонией по сравнению с группой контроля в первый и последний дни исследования

Результаты, полученные в ходе исследования указывают на положительную связь в экспрессии факторов транскрипции и ряда антиоксидантов (рисунок 46). Концентрация 80Б2 положительно коррелировала с синтезом е£р--1 (г =0.95), с-)ип (г =0.45) и с-йж (г =0.64). В тоже время уровень экспрессии ШР70 за весь период исследования достоверно коррелировал с мРНК каталазы (г =0.38) и вРх (г =0.36). Кроме того, была обнаружено прямая корреляция в экспрессии антиоксидантов. Уровень мРНК каталазы коррелировал с 80Б1 (г =0.45) и вРх (г =0.49), также отмечалась связь между вРхН80Б1(г=0.35).

Экспрессия поверхностных рецепторов циркулирующими лейкоцитами при пневмонии с системным воспалительным ответом.

Экспрессия СБ95 на нейтрофилах до начала терапии на фоне максимальных выраженности системного воспаления составила 130% (28150%) от этого же показателя, изученного у здоровых добровольцев (таблица 13). При изучении данного показателя в динамике отмечалась достоверное увеличение к 10 дню (р =0.03) антибактериальной терапии. Значение отношения экспрессии НЬЛ-БЯ больных с пневмонией и ССВО к экспрессии данной поверхностной молекулы у здоровых добровольцев составило 41% (11-183%). На протяжении исследования наблюдался рост показателя на фоне проводимой антибактериальной терапии. Наиболее достоверное увеличение значения экспрессии НЬЛ-БЯ наблюдалось с 5 по 10 день (р =0.03).

Таблица 13. Экспрессия молекул СБ95 и НЬЛ-БЯ

СБ95 НЬЛ-ОИ.

л м н л м

20 30 28 19 146

13 26 15 10 92

32 64 60 46 261

27 33 26 26 182

15 20 22 8 47

38 48 40 104 386

28 32.5 36.5 40 302

15 22 19 9 206

33 49 44 128 584

Высокий корреляционный коэффициент (г >0.5) характеризовал взаимосвязь СБ25, НЬЛОЯ и СБ11Ь, экспрессируемый лимфоцитами. С другой стороны, экспрессия на нейтрофилах, моноцитах и лимфоцитах молекулы ко-активации СБ25 описывалась высокими положительными значениями г, превышающими 0.5. Другой пример экспрессии НЬЛОЯ лимфоцитами и моноцитами отражает график 9.

Рисунок 9. Корреляция анализ экспрессии HLADR на моноцитах и лимфоцитах

О 20 40 М . «О . . 100 120 МО

' <1 ' • ' HUDR ямфощта / ^ - ■

Основным клиническим признаком генерализации процесса служит ССВО. Результаты работы демонстрируют, что в основе этого синдрома лежит комплекс изменений, который на белковом уровне проявляется повышением концентрации провоспалительных медиаторов (CRP, IL-6, IL-8, и высокое значение отношения IL-6/IL-10) и оксидативным стрессом (МДА), а на уровне генома - преходящей активацией экспрессии некоторых стрессовых генов (Egr-1 и HSP70) и повышением внутриклеточной концентрации мРНК антиоксидантов (SOD2, GSH-GPx) циркулирующими лейкоцитами. У больных с пневмонией без ССВО уровень цитокинов в крови был значительно ниже, чем при пневмонии и ССВО. Это свидетельствует о том, что клинические критерии, составляющие ССВО, манифестируют на фоне появление провоспалительных медиаторов в системном кровотоке. При этом чем выраженней системная реакция, тем большее количество критериев ССВО и более тяжелое течение пневмонии фиксируется у больных.

Генерализация воспаления приводит к синтезу организмом противовоспалительных медиаторов, препятствующих дальнейшему распространению процесса. Повышенное образование ИЛ-10 соответствует пациентам с высоким уровнем ИЛ-6, доказывающее гипотезу, что при пневмонии с ССВО как при частном случае сепсиса противовоспалительный ответ тем сильнее, чем интенсивней активация провоспалительного каскада. Среди других признаков СКПО, обнаруженных у больных с пневмонией и ССВО, выявлена сниженная экспрессия HLA-DR циркулирующими моноцитами, что косвенно подтверждает способность

противовоспалительных цитокинов подавлять как функцию моноцитов, так и в целом ингибировать лейкоцитарную активность.

Результаты, настоящего исследования не продемонстрировали того, что развитие системного воспалительного ответа при пневмонии сопровождается

активацией транскрипции, генов кодирующих как IL-6, так и IL-8 циркулирующими лейкоцитами. Учитывая, что в целом процесс образования цитокинов осуществляется de novo, высокий уровень IL-6 в плазме может быть обусловлен активацией экспрессии генов клеток, находящихся в очаге пневмонии и располагающихся экстрапульмонально, в то время как значимый вклад циркулирующих лейкоцитов в системную концентрацию IL-6 маловероятен. Таким образом, результаты нашего исследования демонстрируют, что поддержание высокой концентрации данных IL-6 и IL-8 в плазме, отражающих степень системного воспаления, не осуществляется за счет активности циркулирующих лейкоцитов. Изучение динамики уровня ИЛ-10, принадлежащего к противовоспалительным цитокинам, показало высокий уровень прямой корреляции с ИЛ-6, что может свидетельствовать о протективной роли ИЛ-10, балансирующей воспалительный ответ организма. Этот вывод подтверждается фактом низкой концентрации ИЛ-10 при невысоком уровне ИЛ-6 в контрольной группе пациентов с пневмонией без ССВО. Такой вариант иммуномодуляции предполагает органопротективное значение, которое подчеркивается тем, что степень индукции системной противовоспалительной реакции пропорциональна выраженности системного воспалительного ответа при пневмонии и ССВО. Полученные результаты позволяют заключить, что системная воспалительная реакция не вызывает клинически значимой активации циркулирующих лейкоцитов, которая позволила бы им стать дополнительным фактором аутоагрессии при пневмонии, сопровождающейся ССВО. Транзиторная индукция экспрессии Egr-1 только в первый день исследования на фоне отсутствия существенных изменений в транскрипции c-Jun и c-Fos и экспрессии генов провоспалительных цитокинов (IL-6 и IL-8) может свидетельствовать о подавлении координированного воспалительного ответа, продуцируемого циркулирующими лейкоцитами. В тоже время увеличенная концентрация мРНК HSP70, GPx, SOD1 и SOD2, прежде всего, говорит о функциональной активности лейкоцитов, которое подчеркивает транзиторное повышение экспрессии egr-1 в первый день исследования, отражающее наиболее раннюю реакцию клеток на экстрацеллюлярный стресс.

Тяжесть состояния больных и функциональное состояния печени при

пневмонии.

Результаты исследования концентрации MEGX и гиалуроновой кислоты

В период с 1 по 3 день исследования значения МЕвХ-теста у всех больных в группе I были ниже 30 (таблица 14). В первые три дня исследования отмечалась тенденция к стойко низкому уровню образования МЕвХ, медиана концентрации которого составила 23.5 \щ/[ на первый день и 27 Ц^ во второй и третий дни. В период с 5 по 7 день значение МЕвХ-теста

увеличилось и достигло 60 ЦЦЛ (13-141 Ц§/1). В группе II значения МЕвХ-теста на протяжении всего наблюдения находились в пределах референтного интервала (ОеИепсЬ й а1, 1998). Суммарный уровень образования МЕвХ (рисунок 10) в группе I (медиана 36 Ц|>/1; процентили 9.5- ]ц4У®)б ы л достоверно ниже (р 0.0008), чем в группе II (медиана 69 процентили 31 -145 уф).

Рисунок 10. Уровень МЕвХ в плазме за 10 дней исследования

Уровень гиалуроновой кислоты изначально в 1 день исследования был выше у больных с тяжелой пневмонией. К 3 дню концентрация ПС снизилась до 73 ц§/1. На протяжении всего исследования в группе I отмечалась стойкая тенденция к снижению уровня ПС, достигшей 63 (35-144) к 10 дню после госпитализации. Однако достоверность различий с группой П, в которой концентрация ПС оказалась значительно ниже, чем при тяжелой пневмонии, наблюдалась вплоть до 10 дня исследования.

Таблица 14. Значения МЕвХ-теста и концентрации гиалуроновой кислоты за

День МЕСХ Гиалуроновая

(Цй ¡и кислота (до/Ь)

I П I II

1 22.05 54.4 118 21

8.56-76 31-96 11-288 9-86

Р 0.0001 0.001

3 27.5 68.3 72 41.2

2-56 35-145 17-208 16-67

Р 0.0001 0.006

5 29.5 72 69 23

9-99 39-106 19-146 10-106

Р 0 0041*- национ -г^—цислиот Ц1ЬНАЯ| о.02 СК*-1---

С.Петер6ург ОЭ ТОО >кт

7 60 13-141 83 31-141 68 11-282 17 10-48

Р 0.19 0.01

10 62 41-102 63 36-103 63 35-144 38 14-38

Р 0.9 0.17

Показатели стандартных биохимических печеночных тестов

За все время исследования исследуемые группы достоверно не отличались по уровню трансаминаз (р>0.05). Медиана концентрации билирубина за десятидневный период наблюдения также соответствовала референтному интервалу. Значения альбумина как маркера синтетической функции печени оставались в рамках нормальных концентраций.

Взаимосвязь функциональной активности печени с тяжестью состояния и выраженностью системной воспалительной реакции при • тяжелой пневмонии

Наибольшие изменения в концентрации MEGX-теста происходили в период с 1-5 день. В связи с этим корреляционный анализ с использованием коэффициента Спирмена между значениями MEGX-теста и значением шкалы SAPS II, а также риском смертности SAPS II, проводился за первые пять дней исследования. Корреляционный коэффициент (г) соответственно составил -0.64 и -0.60 (р<0.0001). Результаты корреляционного анализа, отражающего связь с маркерами системного воспаления, показаныив таблице 15.

Таблица 15. Корреляция между результатами MEGX-тестом и другими параметрами за 5 дней исследования

SAPS II -0.64 <0.0001

IL-6 -0.65 <0.0001

CRP -0.5 <0.0001

Гиалуроновая кислота -0.47 <0.0001

IL-10 -0.32 0.001

IL-8 -0.23 0.0625

ACT 0.04 0.753

AJIT 0.01 0.958

Альбумин 0.02 0.898

Билирубин -0.16 <0.0001

Оценка эффективности эмпирической антибактериальной терапии у больных тяжелой пневмонией с системным воспалительным ответом

Различия в клиническом ответе на проводимую антибактериальную терапию вне зависимости от тяжести состояния позволили разделить включенных в исследование больных с пневмонией на пациентов с положительной и отрицательной реакцией на 3 сутки наблюдения. При этом вариант ответа на терапию не зависел от тяжести состояния больных, то есть и в группе I и в группе II наблюдались больные с обоими типами реакций на проводимое лечение. Статистически не удалось установить связь тяжести ВП и варианта клинического ответа на антибиотикотерапию через 72 часа лечения. В группе I оказалось 30 больных (43%) с положительным ответом, на лечение, что, прежде всего, отразилось на динамике температуры, которая на 3 день уменьшилась и была ниже 38.3 °С (рисунок 11). У 40 больных (57%) из этой же группы температурная реакция была либо без изменений, либо отмечалось повышение, по сравнению с днем поступления, что указывало на негативный ответ на лечение. В группе II с ВП нетяжелого течения по БТ8 у 28 пациентов (39 %) был зарегистрирован положительный ответ и значение температуры снизилось ниже порогового уровня, в то время как у 44 пациентов (61%) изменения характера температурной кривой указывали на отсутствие позитивного клинического ответа на проводимую антибактериальную терапию.

Рисунок 11. Температурная реакция на 1 и 3 день исследования на примере некоторых пациентов из группы I (А) и группы II (Б).

Л- пациенты с клиническим ответом (-), - пациенты с клиническим ответом (+)

Использование ROC анализа с построением характеристической кривой позволило рассчитать прогностическую ценность значения изучаемых показателей, обнаруженных в плазме в отношении клинического ответа, который оценивался через 3 суток терапии. Единственным показателем, значение площади под кривой (AUC) которого достоверно указывало на

клинический ответ, был Ш-6. AUC для ГЬ-6 составил 73% (р =0.03). То есть при поступлении низкая концентрация ГЬ-6 указывала на большую вероятность положительного клинического ответа через 72 часа терапии. Чем выше был уровень Ш-6 при поступлении, тем выше была вероятность негативной реакции на антибактериальную терапию. Концентрация ГЬ-6 1000 pg/ml, обладающая оптимальным соотношением чувствительности и специфичности, составляла 88% и 54% соответственно. С другой стороны, изучение концентрации цитокинов в крови позволило выявить существенную статистически значимую динамику показателей у больных с ВП в первые 72 часа эмпирической терапии. Значение Ш-6 в первый день исследования, измеренное до введения антибиотиков, оказалось повышенным у всех пациентов с ССВО по сравнению с группой больных с пневмонией без признаков системного воспаления. Подъем концентрации цитокина преобладал в группах с более тяжелым состоянием. Снижение Ш-6 на фоне антибактериальной терапии к 3 дню наблюдения наблюдалось как у больных ВП с позитивным клиническим ответом (общий состав группы - 58 человек), так и в группе, составленной из пациентов, не продемонстрировавших клинической реакции на лечение (общий состав группы — 88 человек). При этом число пациентов в обеих группах было практически одинаковым - 81% (47/58 человек) и 80% (71/88 человек). Кроме того, средняя величина снижения концентрации ГЬ-6 оказалось более существенной у больных из группы с клинически негативным ответом на лечение

При анализе групп, разделенных по шкале тяжести BTS и характеру клинического ответа на терапию, также были выявлены существенные изменения значения циркулирующего Ш-6. К 3 дню исследования произошло достоверное падение (р, тест Вилкоксона < 0.005) уровня ГЬ-6 в группе пациентов с тяжелой ВП и отсутствием клинически позитивных признаков ответа на проводимую антибактериальную терапию (рисунок 12). Также снижение концентрации цитокина было отмечено и у больных из группы I с положительным ответом на терапию. В группе I к больным, не ответившим на лечение, относились все умершие пациенты (9 человек), у 8 из которых концентрация Ш-6 к 3 дню терапии не снизилась. У одного умершего больного через 72 часа терапии концентрация снизилась, но к 5 дню вновь наблюдался подъем синтеза интерлейкина, сохранявшийся вплоть до последнего дня наблюдения, предшествовавшего дню смерти. У больных с пневмонией нетяжелого течения по BTS статистический анализ с использованием критерия Вилкоксона указал, что достоверное снижение присутствовало, только у больных с клинически положительным ответом на терапию. При отсутствии клинического ответа отмечалась тенденция к уменьшению концентрации Ш-6.

Б.

Рисунок 12. Изменение концентрации 1Ь-6 в плазме с 1 по 3 день исследования на фоне эмпирической антибактериальной терапии на примере некоторых пациентов из группы I (А) и группы II (Б).

1Д - пациенты с клиническим ответо1©(-)> 2. - пациенты с клиническим

ответом (+)

*р< 0.05, **р< 0.005

Значение достоверности для данной группы пациентов составило р= 0.058. В тоже время 75 процентиль концентрации ГЬ-6 для группы II в целом не превышал 100 pg/ml.

У больных с пневмонией тяжелого течения было обнаружено изменения концентрации циркулирующего ГЬ-10. К 3 дню у больных с клинически положительным ответом, а также у пациентов с отсутствием реакции на антибактериальное лечение отмечалось статистическое значимое снижение концентрации. У больных из группы II вне зависимости от ответа на терапию значимого снижения уровня ГЬ-10 выявлено не было. В тоже время максимальное значение ГЬ-10 среди всех больных не превышало 200 pg/ml и было значительно меньше, чем в группе I, а 75 процентиль в первый день не поднимался выше 50 pg/ml.

Таким образом, при исследовании концентрации цитокинов в плазме было отмечено, что высокий уровень Ш-6 в первый день исследования при тяжелой пневмонии с ССВО до начала терапии позволяет предположить высокую вероятность отрицательного клинического ответа на 3 сутки лечения. Данное наблюдение свидетельствует о том, что либо при таком варианте патогенеза пневмонии эффективность антибиотиков изначально ограничена, либо клинические критерии адекватности терапии требуют переоценки, прежде всего с позиций исхода заболевания. При определении концентрации ГЬ-6 в динамике на 3 день у больных тяжелой ВП с ССВО и клинически негативным ответом было обнаружено его достоверное снижение. Таким образом, отсутствие клинического ответа на антибиотикотерапию сопровождается подавлением образования одного из ключевых триггеров остро-фазовой реакции в плазме. Среди причин снижения ТЬ-б рассматриваются феномен «толерантности к эндотоксину», прямое и непрямое иммуномодулирующее действие антибиотиков. В связи с тем, что возбудителями пневмонии у большинства пациентов были грамположительные бактерии, то первым первой причиной можно пренебречь. Нельзя исключать возможность прямого влияния антибиотиков на выраженность провоспалительной активности лейкоцитов, но необходимо учитывать, что снижение концентрации Ш-6 происходило вне зависимости от группы назначенных антибактериальных средств. Среди факторов, способных повлиять на уровень синтеза изучаемых цитокинов, может быть рассмотрено косвенное противовоспалительное действие антибиотиков, как результат снижения индекса обсемененности в очаге воспаления.

Предсказательная способность исследуемых клинико-лабораторных параметров в отношении смертности при пневмонии

Прогностическая значимость исследуемых клинико-лабораторных параметров в отношении прогноза при пневмонии изучалась с помощью построения характеристической кривой. Показатель площади под кривой оказался максимальным у частоты дыхания, указывающий на то, что при данном виде статистического анализа тахипноэ с наибольшей вероятностью будет указывать на неблагоприятный исход при пневмонии по сравнению с другими параметрами (таблица 16). Наилучшим соотношением чувствительности и специфичность в этом случае обладала частота дыхания 24 в минуту - 83.8% и 84.6% , соответственно. Однако при оценке роли частоты дыхания искусственная вентиляция легких приравнивалась к тахипноэ с частотой дыхания 30 и более в минуту. В тоже время если рассматривать наличие ИВЛ как отдельный прогностический признак, то относительный риск смертности у больных пневмонией с ИВЛ составил 10.0 (С195% 2.17-40.06), что значительно превышает риск при любом другом из исследуемых факторов.

Таблица 16. Значения АЧС, отражающие способность представленных параметров дискриминировать между умершими и выжившими пациентами

Кривая AUC SE Р 95% CI AUC Смертность (изменение признака)

RR 0,932 0,0228 <0.0001 0,888 0,9 77 увеличение

SAPS2 0,916 0,0289 <0.0001 0,860 0,9 73 увеличение

IL-6 0,757 0,0489 <0.0001 0,661 0,8 53 увеличение

CRP 0,728 0,0480 <0.0001 0,634 0,8 22 увеличение

SIRS 0,707 0,0576 0,0002 0,5940,8 20 увеличение

MPHKHSP 0,662 0,0557 0,0019 0,552 0,7 71 увеличение

MPHK IL-10 0,603 0,0866 0,1167 0,433 0,7 73 уменьшение

Температура 0,636 0,0718 0,0294 0,495 0,7 77 уменьшение

Лейкоциты 0,513 0,0651 0,4207 0,385 0,6 41 увеличение

мРНК SOD2 0,523 0,0600 0,3525 0,405 0,640 уменьшение

Значение площади под кривой для шкалы SAPS II оказалось равным 0.916, а чувствительность и специфичность для порогового значения риска смертности 3% составила 78.8% и 92.3%, соответственно. Из лабораторных параметров наилучшие результаты показал системный уровень IL-6, продемонстрировавший максимальное значение AUC наряду с частотой дыхания и SAPS II. Относительный риск смертности (RR) у больных с отсутствием снижения уровня этого цитокина через 72 часа после начала эмпирической терапии составил 3.6 (1.5-8.7). Построение характеристический кривой, позволило заключить, что системный уровень IL-6 у пациентов с пневмонией обладает наибольшей дискриминирующей способностью в отношении прогноза заболевания по сравнению с другими лабораторными показателями. IL-6 может служить косвенным маркером, отражающим исход заболевания, так как пациенты с пневмонией из группы умерших демонстрировали стойко повышенную концентрацию этого цитокина в крови на протяжении всего исследования по сравнению с группой выживших больных (RR=9.0, CI95% 3.096-26.163). Хотя высокая вариабельность показателя не дает возможности определить верхнюю и нижнюю границу индивидуальной нормы, суточный мониторинг уровня IL-6 в крови, в особенности в первые 72 часа эмпирической антибактериальной терапии пневмонии, позволил судить о реакции со стороны системного воспаления на проводимое лечение. Однако если принять за верхнюю границу референтного интервала показатель (41 pg/ml), предложенный производителями лабораторного набора (Milenia Biotec, MKL6), использованного для измерения IL-6, то чувствительность и специфичность концентрации >41pg/ml в отношении смертности пациентов, включенных в исследовании, составила 65.6% и 78,2%, соответственно.

Оценка влияния на смертность результатов рутинных тестов (клиническая эффективность) показало, что при негативном ответе на эмпирическую антибиотикотерапию RR достигает 3.0 (1.7-5.2). Однако у

подгруппы с «негативным» клиническим ответом на эмпирическую терапию, но с достоверным снижением концентрации !Ь-6 на 3 день лечения (р =0.0022), роста риска смертности не наблюдалось (таблица 17).

Таблица 17. Относительный риск летального исхода у пациентов с

пневмонией по результатам исследуе мых показателей.

Относительный риск (1Ш) Доверительный интервал (С1 95%) Р

ивл 10.5 2.17-40.06 <0.0001

Отсутствие снижения Иу6 с 1-3 день терапии 3.6 1.5-8.7 0.01

Отсутствие кл. ответа на 3 день терапии 3.0 1.7-5.2 0.002

8АРБ2 >3% 3.0 1.7-5.3 0.0024

Частота дыхания >24 в минуту 2.4 1.49-3.85 0.0044

Отсутствие кл. ответа, но снижение ЕЬ-6 на 3 день терапии 0.26 0.08-0.94 0.0022

Построение таблицы сопряженности позволило произвести расчет вероятности (отношения шансов) выживаемости пациентов с тяжелой пневмонией (рисунок 13).

Рисунок 13. Вероятность (ОК) выживаемости пациентов с тяжелой пневмонией при (А.) снижении концентрации ГЬ-6 в плазме и (Б.) положительном клиническом ответе + снижении концентрации !Ь-6 в плазме на 3 день эмпирической антибактериальной терапии.

При снижении концентрации ГЬ-6 в кровотоке на 3 сутки терапии вероятность выживаемости достоверно увеличивается в среднем в 64 раза. При этом расчет предсказательной способности данных тестов через 72 часа терапии указал на то, что снижение ТЬ-б (р =0.0006) в отличие от признаков положительного клинического ответа (р =0.66) обладает более достоверной способностью свидетельствовать о выживаемости пациентов с тяжелой пневмонией. В тоже время если снижение концентрации ^-6 происходило на фоне позитивного клинического ответа на антибактериальную терапию, то повышение шансов на выживание повышалось в среднем 205 раз. Если при расчете предсказательной способности тестов снижение БЬ-6 анализируется в комплексе с клиническим ответом на терапию, то соотношение чувствительности и специфичности демонстрирует оптимальные значение -95% и 100% (таблица 18). Предсказательное значение отрицательного результата этого комбинированного параметра также оказался выше по сравнению со снижением ^-6 - 87 % и 62%, соответственно.

Таблица 18. Предсказательная способность клинико-лабораторных маркеров, оцененная через 72 часа эмпирической антибактериальной терапии, и

Чувствительное ть% (95% С1) Специфичное ть % (95% С1) РРУ % (95% С1) М»У %(95% СП

Положительны

й клинический 0 0 0 0

ответ

Снижение концентрации 1Ь-6 в плазме 87 (66-97) 100 (47-100) 100 (83-100) 62 (24-91)

Положительны

й клинический -

ответ + 95 100 100 87

снижение (76-99) (59-100) (83-100) (47-99)

концентрации 1Ь-6 в плазме

Таким образом, однократное изучение концентрации ГЬ-6 при поступлении в первый день исследования не позволило доказать прогностическую способность этого маркера в отношении исхода заболевания. Наличие существенных индивидуальных различий в генезе системного воспалительного ответа при пневмонии не позволяет выделить определенное референтное значение уровня цитокина, поэтому однократное измерение концентрации ^-6 в плазме обладает небольшим клиническим значением. С другой стороны, риск летального исхода при отсутствии снижения уровня ГЬ-6 в первые 72 часа эмпирической антибактериальной терапии имеет следующую после ИВЛ значимость по отношению к другим

изучаемым параметрам. Этот факт особенно важен в сравнении с тем, что негативный ответ при эмпирической терапии за тот же промежуток времени, оцененный на основании результатов стандартных рутинных тестов, обладает меньшим относительным риском летальности, по сравнению со снижением IL-6 у пациентов с тяжелой пневмонией. Мониторинг за концентрацией IL-6 в крови может способствовать выявлению больных, которые по результатам рутинных тестов не демонстрируют положительного ответа на лечение в первые трое суток, но в тоже время характеризуются снижением выраженности системной воспалительной реакции. В этой ситуации смена антибиотиков на основании, в том числе, и микробиологических данных и применение более агрессивной стратегии может быть отложена, так как снижение системного уровня IL-6 с 1-3 сутки лечения ассоциировалось с благоприятным прогнозом заболевания (OR 11.4; С195% 1.7-74.7; р =0.01). Кроме того, снижение концентрации IL-6 в крови за первые трое суток у пациентов с негативной реакцией на лечение при оценке рутшшыми тестами не связано с увеличением относительного риска смерти (RR 0.26; С195% 0.080.94; р =0.002). Поэтому комбинированный мониторинг за рутинными маркерами наряду с уровнем IL-6 в кровотоке способствует более объективной оценке клинического ответа в первые трое суток терапии пациентов с тяжелой пневмонией и признаками системного воспалительного ответа.

Выводы

1. Повышенная концентрация циркулирующих про- (IL-6 и IL-8) и противовоспалительных (1L-10) цитокинов, С-реактивного белка, а также косвенного маркера оксидативного стресса (МДА) в системном кровотоке при динамическом наблюдении в течение 10 дней исследования отражает трансформацию локального воспаления в легких в генерализованную реакцию, высокая степень которой ассоциируется с риском неблагоприятного исхода у больных тяжелой пневмонией с ССВО.

2. Больные внебольничной пневмонией с ССВО тяжелого и нетяжелого течения по версии Британской Торакальной Ассоциацией отличаются различной выраженностью системной воспалительной реакции. Использование шкалы тяжести Британской Торакальной Ассоциацией, предложенной для внебольничных пневмоний, позволяет на основании клинико-лабораторных критериев выделить группу больных с более высоким уровнем провоспалительных маркеров в крови (IL-6 и CRP), указывающим на риск неблагоприятного исхода патологии.

3. Большие индивидуальные колебания исходного уровня циркулирующего IL6 требуют динамического мониторинга за показателем, а для уточнения прогноза при тяжелой пневмонии необходимо сопоставление с клинической картиной через 72 часа

лечения - снижение концентрации ^6 в плазме на 3 сутки антибактериальной терапии в сочетании с улучшением клинической картины свидетельствуют о позитивном прогнозе заболевания.

4. Исследование изменения концентрации циркулирующего ^-6 в комбинации с характером клинического ответа демонстрирует наилучшее прогностическую способность в отношении выживаемости при тяжелой пневмонии с ССВО и может служить комплексным маркером, отражающим эффективность эмпирической антибиотикотерапии.

5. Результаты МБвХ теста демонстрируют снижение способности печени к биотрансформации ксенобиотиков, несмотря на отсутствие изменений маркеров синдрома холестаза, цитолитического синдрома и синтетической функции печени при тяжелой пневмонии с ССВО. Патологическая роль системного воспаления в генезе экстрапульмональных осложнений при пневмонии подчеркивается связью с нарушением внутрипеченочной микроциркуляции печени о чем свидетельствует повышение концентрации гиалуроновой кислоты, и снижением экспрессии цитохрома Р450, косвенным, маркером активности которого являются результаты МБвХ-теста.

6. Подавление системной воспалительной реакции при пневмонии и ССВО подчеркивает отсутствие синтеза провоспалительного цитокина мРНК 1Ь-6 и ^-8, а также значимой экспрессии ранних стрессовых генов (Egr-1, е-1ип и е-¥о$) циркулирующими лейкоцитами как до назначения лечения, так и в процессе динамического наблюдения на фоне антибактериальной терапии. Механизмы реализации противовоспалительной реакции при пневмонии с ССВО характеризует повышенная экспрессия некоторых факторов антиоксидантной защиты (мРНК в8И-Рх и МпБОБ), клеточного хаперона (мРНК ШР70) и противовоспалительного цитокина мРНК ГЬ-10 циркулирующими лейкоцитами, увеличение уровня ГЬ-10 в кровотоке и снижение экспрессии ИЬА-БК моноцитами.

7. Клеточная дисфункция, связанная с неблагоприятным прогнозом заболевания, у умерших пациентов с тяжелой пневмонией и ССВО, проявляется отсроченной индукцией экспрессии белков теплового шока и ^-10 циркулирующими лейкоцитами, которая наблюдается только в последний день исследования, в то время как в группе выживших рост мРНК ЖР70 и НЛО отмечается еще до назначения антибактериальной терапии.

8. Прогрессирование локального воспаления как при пневмонии с ССВО в генерализованную реакцию реализуется вне системы циркулирующих лейкоцитов.

Практические рекомендации

1. Исследование величины ГЬ-6 в плазме венозной крови в динамике в первые 3 дня лечения позволяет оценить эффективность антибактериальной терапии, так как отсутствие снижения концентрации Ш-6 минимум на 20%-30% от исходного уровня является негативным прогностическим признаком.

2. Стабильное снижение концентрации ГЬ-6 наблюдающееся в течение 3 дней при ежедневном контроле на фоне лечения, может быть использован как ранний признак положительного эффекта антибактериальной терапии, несмотря на отрицательный клинический ответ больных с тяжелой пневмонией и ССВО.

3. Наличие в популяции лиц с низкой активностью CYP 450 ЗА4 заставляет исследовать MEGX в динамике для сравнения с исходным значением.

4. При падении уровня MEGX в плазме ниже 30 указывающем на снижение метаболической функциональной активности печени, необходимо дополнительный контроль фармакологической эффективности и безопасности применяемых лекарственных средств, обладающих печеночным клиренсом. Наиболее оптимальным методом, способствующем снижению риска нежелательных побочных реакций, является проведение терапевтического мониторинга указанной группы лекарственных средств.

5. Высокие показатели Ш-6 в период предшествующий началу эмпирической антибактериальной терапии указывают на высокую вероятность отрицательного клинического ответа через 72 часа лечения больных с тяжелой пневмонией и ССВО.

6. Изучение экспрессии мРНК DL-10 и мРНК HSP70 с целью прогнозирования исхода у больных при тяжелой пневмонии нецелесообразно, так как эти параметры не обладают существенными статистическими преимуществами перед шкалой BTS, SAPS2 и измерением 1Ь-б в плазме, а также требуют значительных экономических и технических затрат на проведение молекулярно-генетических исследований.

Список, опубликованных работ

1. Игонин Л.А., Кукес В.Г. Изучение метаболизма лидокаина для оценки функции печени у больных с тяжелой пневмонией// Ведомости НЦГКЛС -2001- №1(5) - стр.68-72

2. Игонин А.А., Сурнакова Н.Е., Кукес В.Г. Уровень молекул адгезии CD lib, CD22 и CD54 у больных внебольничной приобретенной пневмонией (ВПП)// Материалы 8 Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 10-14 апреля - 2001 г.-Стр.405

3. Игонин А.А., Кукес В.Г. Биомаркеры воспаления у больных пневмонией с признаками синдрома системного воспалительного ответа (ССВО)// Материалы П Российского конгресса молодых ученых-Москва- июнь 2001-стр. 180

4. Игонин АЛ., Сурнакова Н.Е., Кукес В.Г. Уровень молекул адгезии CD lib, CD22 и CD54 у больных внебольничной приобретенной пневмонией// Материалы П Российского конгресса молодых ученых-Москва- июнь 2001-стр.180

5. Igonin AA, Armstrong VW, Shipkova M, Kukes V, Oellerich M. The monoethylglycinexylidide (MEGX) test as a marker of hepatic dysfunction in septic patients with pneumonia// Ther Drug Mon - 2001-Vol.23 №4 - p.497

6. Tsoi AN, Arkchipov W, Igonin AA. Pharmacodynamic of the nebulized single dose bronchodilatators in patients with acute severe asthma.// Pharmacology and Toxicology - 2001- Vol. 89(S1) - p. 127-28.

7. Igonin AA, Surnakova NE. Expression of adhesion molecules in patients with pneumonia.// Scan J Immun-2001- Vol. 54S1 - p. 126

8. Игонин А.А., Кукес В.Г. Противовоспалительная терапия сепсиса// Ведомости НЦГКЛС -2001- №4(8) стр.42-46

9. Кукес В.Г., Стародубцев А.К., Игонин А.А. и соавт. Методические рекомендации. Изучение метаболизма лидокаина для оценки функции печени в клинике внутренних болезней. // Ведомости НЦГКЛС -2001-№4(8) стр. 19-24

Ю.Игонин АЛ. Иммуномодулирующий эффект антибактериальных препаратов у больных внебольничной приобретенной пневмонией.// Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия - 2002 -Т.4Прил.1- стр. 24-25

ll.Igonin A.A. Expression of CDllb, CD25, CD95 and HLA-DR in the leucocytes during the course of antibacterial therapy of patients with community-acquired pneumonia.// Eur Resp J - 2002 - Vol. 20 (S38) - p.480

12.1gonin A.A., V.W. Armstrong, M. Shipkova, V.G. Kukes, M. Oellerich. Detection of liver function in patients with severe community-acquired pneumonia.// Eur Resp J - 2002 - Vol.20(S38) - p. 15

13.Игонин А.А. Сурнакова Н.Е., Долгопольская Т.И. Апоптоз - возможный механизм реабилитации при антибактериальной терапии ВП. Материалы Международного конгресса «Здравница - 2002». Москва, 810 октября - 2002 г.- стр.87-88

Н.Игонин А.А. Сурнакова Н.Е., Долгопольская Т.И., Шатихин А.И. Подавление апоптоза при фармакотерапии синтетическими и полусинтетическими антибиотиками. Материалы Международного конгресса «Здравница - 2002». Москва, 8-10 октября - 2002 г.- стр.87

15.Игонин А.А., Сурнакова Н.Е., Яновский О., Алекса В. Изучение программированной гибели клеток и экспрессии CD 16, CD lib, CD54 и IgA, IgM, IgG, IgE у пожилых больных с бронхолегочной патологией. Клиническая геронтология -2002- №8(5)- стр.163

16.Игонин А.А., Сурнакова Н.Е., Колесников А.А. Исследования апоптоза и экспрессии рецепторов адгезии и активации лимфоцитов у пациентов с пневмонией. Клиническая геронтология - 2002 - №8(5) - стр. 67

П.Игонин А.А., Кукес В.Г. Общие принципы антимикробной терапии бактериальных инфекций с признаками сепсиса.// Клиническая медицина -2003- №81(6) - стр. 61-65

18.Игонин А.А Лазарева Н.Б., Кукес В.Г. Перспективы воздействия на систему гемостаза у больных сепсисомУ/ Клиническая фармакология и терапия -2003 - №12(2) - стр. 22-27

19.Игонин А.А., Кукес В.Г. Биомаркеры воспаления у больных пневмонией с признаками синдрома системного воспалительного ответа. // Пульмонология - 2003 -№4- стр. 15-21

20.Игонин А.А., Лазарева Н.Б., Кукес В.Г. Неантибактериальные подходы к фармакотерапии тяжелой пневмонии, протекающей с системной воспалительной реакцией // Фармация - 2003 -№5 - стр. 43-46.

21.Anton A Igonin, Victor W Armstrong , Eberchardt Wieland, Natalia В Lazareva, Regina V Archvadze and Michael Oellerich. Down-regulation of pro-inflammatory response genes of circulating leukocytes in ICU patients with severe pneumonia meeting criteria of systemic inflammatory response syndrome (SIRS) // Eur Resp J - 2003 - Vol. 22(S45> p.2

22. Anton A Igonin, Victor W Armstrong, Maria Shipkova, Natalia В Lazareva, Vladimir G Kukes and Michael Oellerich. Effects of empirical antibacterial therapy on the degree of systemic inflammatory response in patients with severe community-acquired pneumonia (SCAP)// Eur Resp J - 2003 - Vol. 22(S45): p.545-546

23.1gonin Anton, Armstrong Victor, Shipkova Maria, Lazareva Natalya, Kukes Vladimir, Oellerich Michael. Circulating cytokines as in severe community-acquired pneumonia// Cl Bioch - 2004 - Vol.37 №3 - p.204-209

24.Игонин A.A., Кукес В.Г., Пальцев М.А. Сепсис: молекулярные механизмы системного воспаления в качестве модели для изучения перспективных терапевтических мишеней// Молекулярная медицина -2004-№2-стр. 3-12

25.Игонин А.А., Лазарева Н.Б., Кукес В.Г. ГКС и сепсис// Фармация - 2004 №3- стр. 43-46

26.Антимикробные, противогрибковые и противовирусные препараты (глава 26). (соавт. Страчунский Л.С., Румянцев Д.В.) Клиническая фармакология: Учебник/ Под ред. В.Г. Кукеса - 3-е изд., перераб и доп. - М.: ГЭОТАР - МЕД, 2004- 944 с.

Р10495

Напечатано с готового оригивинаже™

Иадательсгю ООО "МАКС Пресс" Лицеями ИДК005Ю от 01.12.99 г. Подписано к печати 25.05.2004 г. Формат 60x901/16. Усилил. 3,0 Тираж И0 эаз. Заказ 251. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Те&/Ф*кс 939-3891. 119992, ГСП-2, Моста, Ленивое горы, МГУ ш. M.B. Ломоаосом, 2-й учебный корпус, 627 к.