Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Система гемостаза при интраабдоминальном пролонгированном протеолизе иммобилизованной протеиназой имозимазой у больных распространенным гнойным перитонитом

На правах рукописи

БОНДЫРЕВА Галина Владимировна

СИСТЕМА ГЕМОСТАЗА ПРИ ИНТРААБДОМИНАЛЬНОМ ПРОЛОНГИРОВАННОМ ПРОТЕОЛИЗЕ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ПРОТЕИНАЗОЙ ИМОЗИМАЗОЙ У БОЛЬНЫХ РАСПРОСТРАНЕННЫМ ГНОЙНЫМ

ПЕРИТОНИТОМ (экспериментально-клиническое исследование)

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2005

Работа выполнена в ГУ «Научный Центр Реконструктивной и Восстановительной хирургии Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения РАМН»

Научные руководители:

доктормедицинскихнаук кандидатбиологическихнаук

Пушкарев Борис Георгиевич Марченко Валентина Ивановна

Официальные оппоненты:

Лауреат премии правительства РФ, Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор • Коган Александр Семенович

Ведущее учреждение: ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия МЗ и СР РФ

на заседании Диссертационного совета Д. 001.054. 01 при ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН» по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН»

Автореферат разослан «_»_2004 г.

кандидат биологических наук

Нешина Елена Иннокентьевна

Защита состоится «

2005 г. в «.

,» часов

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Список сокращений

РГП - распространенный гнойный перитонит

ДВС - диссеминированное внутрисосудистое свертывание

МДА - малоновый диальдегид

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПДФ - продукты деградации фибрина

РФМК- растворимые фибрин-мономерные комплексы

АДФ - аденозиндифосфат

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Нарушение системы гемостаза, вызванное эндогенной интоксикацией, является одним из важнейших звеньев патогенеза гнойного перитонита. Эндогенная интоксикация оказывает воздействие на все звенья системы гемостаза. И нарушения, возникающие в системе гемокоагуля-ции, нередко приводят к возникновению диссеминированного внутри-сосудистого свертывания, являются одним из факторов развития полиорганной недостаточности (Грачев СВ., 1992; Minnema M.C. et al., 1998; Vasil'kov V.G. et al., 2001; Tashev Kh.R. et al., 2002).

Воспалительные, гнойно-деструктивные процессы, неизбежно сопровождающие течение гнойного перитонита, способствуют интенсификации процессов перекисного окисления липидов. Активация ПОЛ, в свою очередь, ведет к гиперкоагуляции, гиперагрегации, ускорению внутрисосудистого свертывания крови (Шаталина Л.В., 1993; Fujimura N. et al., 2000; Шаповалов П.Я. и др., 2000; Соловьев А.В., 2001; Shakh B.N. et al., 2001). Активация эндоперекисного каскада арахидоновой кислоты служит существенной составляющей в патогенезе синдрома эндогенной интоксикации (Власов А.П., Конышева О.В., 2001).

Экспериментальными и клиническими исследованиями показано, что синдром эндогенной интоксикации при распространенном гнойном перитоните (РГП) обусловлен поступлением в кровоток продуктов распада де-витализированных тканей и токсинов микрофлоры инфицированной брюшины. Образующиеся при РГП фибринозно-гнойные напластования на брюшине, являясь питательной средой для патогенной микрофлоры, служат, в свою очередь, серьезным барьером для эффективной антибактериальной терапии (Салганик Р.И., Коган А.С., 1981; Фадеева Т.В., 1998).

В образовании фибринозно-гнойных напластований большая роль принадлежит свертывающей системе. Активированные под воздействием эндотоксемии тромбоциты создают вокруг бактерий тромбоцитар-ные агрегаты в очаге воспаления, защищая их от бактерицидных плазменных агентов. Тем самым создаются условия для культивирования

микроорганизмов (Матвеев С.А., 1987; Мазуров В.И., 1989; Kermarrec N. et al., 1998; Vlasov A.P. et al., 2000). При гнойной инфекции происходит внутримолекулярная перестройка фибриногена при переходе в фибрин за счет формирования дополнительных водородных и пептидных связей. Это резко замедляет расщепление фибрина, что также способствует формированию плотных продуктов воспаления на брюшине (Кузин М.И., Костюченок Б.М., 1990; Грачев СВ. и др., 1992; PlescaL.A. et al., 1995).

Применяемый в последние годы при гнойных процессах органов и мягких тканей иммобилизованный протеолитический фермент имози-маза показал высокую эффективность при лизисе плотных продуктов воспаления, девитализированных тканей (Усов С.А., 1990; Гумеров Р.Р., 2001). Это дало основание применить его для внутрибрюшинного проте-олиза фибринозно-гнойных напластований при разлитом гнойном перитоните (Григорьев Е.Г., Коган А.С., 1998; Нечаев Е.В., 1998).

К моменту начала работы не были изучены фибринолитические свойства имозимазы в плане влияния фермента на фибрин и фибриноз-но-гнойные наложения в зависимости от дозы фермента, времени экспозиции и рН среды. Отсутствовали сведения о воздействии интраабдо-минального применения имозимазы на системную фибринолитическую активность крови больных РГП. Не были раскрыты механизмы и результаты влияния комплексного лечения перитонита с использованием про-теолитического фермента имозимазы на параметры системы гемостаза больных гнойным перитонитом.

Все вышеизложенное определило цель и задачи настоящей работы.

Цель исследования:

Определить эффект интраабдоминальныхсанаций с применением про-теолитического фермента имозимазы по параметрам системы гемостаза больныхраспространенным гнойным перитонитом.

Задачи:

1. Определить степень и скорость лизиса имозимазой стандартных пленок фибрина и фибринозно-гнойных наложений больных распространенным гнойным перитонитом в зависимости от количества (дозы) фермента, времени экспозиции и рН среды в условиях in vitro.

2. Изучить изменения в системе гемостаза и перекисного окисления липидов у больных распространенным гнойным перитонитом с санированием брюшной полости традиционными методами в сравнении с применением внутрибрюшинного протеолиза имозимазой.

3. Исследовать особенности влияния интраабдоминального проте-олиза с имозимазой на параметры гемостаза и перекисное окисление липидов в крови больных с распространенным гнойным перитонитом при развитии необратимых системных осложнений.

4. Выявить наиболее информативные показатели системы гемостаза, позволяющие прогнозировать развитие необратимых изменений в системе гемокоагуляции больных распространенным гнойным перитонитом.

Научная новизна

Изучены фибринолитические свойства имозимазы при воздействии данного фермента на фибрин и фибринозно-гнойные наложения в зависимости от дозы фермента, времени экспозиции и рН среды.

Установлено, что при внутрибрюшинном применении имозимаза не оказывает влияния на уровень системной фибринолитической активности крови больных распространенным гнойным перитонитом. Определено, что применение имозимазы в интраабдоминальных санациях у больных РГП существенно ускоряет нормализацию большинства параметров системы гемостаза.

Выявлены наиболее информативные показатели системы гемостаза, позволяющие оценить степень риска развития необратимых гемоко-агуляционных осложнений. По материалам работы подана заявка на изобретение «Способ прогнозирования исхода комплексного лечения больных РГП» (Приоритетная справка № 2003 133 325/15 (035 863) от 17.11.03).

Практическая значимость

Выявлены оптимальные условия, необходимые для осуществления эффективного лизиса фибринозно-гнойных напластований у больных гнойным перитонитом.

Установлено, что интраабдоминальный протеолиз с применением имозимазы значительно ускоряет нормализацию параметров системы гемостаза у больных гнойным перитонитом.

Определены наиболее информативные тесты лабораторной диагностики — показатели агрегационной и дезагрегационной функции тромбоцитов, концентрация плазминогена и ПДФ — позволяющие оценить степень риска развития необратимых изменений в системе гемокоагуляции.

Внедрение в практику

Полученные данные о фибринолитической активности имозимазы расширили область ее клинического применения и позволили разработать эффективный способ санации при лечении гнойных перитонитов любой этиологии.

Способ применяется в лечении больных госпитальной хирургической клиники на базе Иркутского Государственного медицинского университета, в Областной клинической больнице № 1. Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедры госпитальной хирургии Иркутского Государственного медицинского университета, научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Иммобилизованная протеиназа имозимаза интенсивно лизирует фибринозно-гнойные продукты воспаления и белковые субстраты, содержащие фибрин, полностью разрушая фибрин при времени экспозиции фермента от 1 до 3-х часов и дозе имозимазы от 5 до 2-х ПЕ/мг соответственно, проявляя максимальную фибринолитическую активность при рН = 7,6.

2. При интраабдоминальном применении имозимаза оказывает местный фибринолитический эффект и не влияет на уровень системной фибринолитической активности.

3. Под воздействием интраабдоминального протеолиза с применением имозимазы нормализация большинства показателей системы гемостаза происходит значительно быстрее по сравнению с больными, которым санации брюшной полости осуществлялись без имозимазы.

4. Риск развития несовместимых с жизнью гемокоагуляционных осложнений может быть спрогнозирован в ранние сроки с помощью информативных показателей системы гемостаза.

Апробация основных положений работы

• Республиканская конференция «Вахидовские чтения» (Ташкент, 1996);

• Всероссийская научно-практическая конференция хирургов (Улан-Удэ, 1997);

• II Конгресс Ассоциации хирургов им. Пирогова (Санкт-Петербург, 1998);

• Симпозиум «Лабораторная диагностика и лекарственная терапия» (Москва, 1998);

• Конференция «Современные проблемы анестезиологии, реаниматологии и интенсивной терапии» (Иркутск, 1999);

• Научно-практическая конференция «Современные технологии в хирургии» (Минск, 2002);

• Всероссийская конференция хирургов (Тюмень, 2003);

• Конференция «Современные наукоемкие технологии» (Хургада, 2003).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ.

Структура и объем работы

Работа содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, три главы результатов собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы. Список литературы содержит 219 источников, из них 180 отечественных и 39 зарубежных авторов. Текст диссертации изложен на 114 страницах машинописного текста, иллюстрирован 9 таблицами и 32 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работу включены экспериментальный раздел, выполненный в условиях in vitro, и клинический раздел, включающий анализ результатов исследования параметров системы гемостаза 60 пациентов с распространенным гнойным перитонитом различной этиологии. Диагноз распространенного гнойного перитонита был поставлен на основании клинических, рентгенологических и лабораторных данных. В подавляющем большинстве случаев (81 %) РГП развивался после экстренных абдоминальных операций. Более 50 % пациентов были переведены в клинику, в связи с возникновением РГП или неэффективностью его лечения, из других лечебных учреждений города и области.

Объекты и методы исследований in vitro

Для изучения фибринолитических свойств имозимазы in vitro использовалась стандартная пленка фибрина, приготовленная из пула донорской плазмы (к 1 мл плазмы добавляли 0,1 мл 5% раствора хлористого кальция и 0,1 мл раствора тромбина активностью 50 ME), фибри-нозно-гнойные напластования и экссудат больных гнойным перитонитом, выделенные во время санации брюшной полости.

Стандартная фибриновая пленка (фибрин) и фибринозно-гнойные напластования использовались в виде навесок по 50 мг. Активность применяемой имозимазы 50 ПЕ/мг. Для определения степени фибринолиза использовали метод НА Авдеевой (1980). Количественная оценка степени лизиса подтверждалась маркером фибринолиза - ПДФ (Лычев В.Г., 1981). Все экспериментальные исследования проводились при температуре 37 ± 0,10С.

Было проведено in vitro 6 серий опытов.

В первой серии исследовалась зависимость скорости лизиса фибрина от дозы имозимазы.

Имозимазу в дозе 0,5; 1,0 и 2,0 ПЕ/мг и фибрин инкубировали в 2-х мл физиологического раствора в течение 18 часов. Навески фибрина взвешивали (определяли M(t)) через 1, 2, 3 и 18 часов.

Степень лизиса рассчитывали по формуле:

% лизиса = [(Мисх - M(t) ) / Мисх] х 100 %.

Во второй серии исследовалась зависимость фибринолитической активности имозимазы от рН буферного раствора. Фибрин и имозимазу в дозе 1 ПЕ/мг инкубировали в 2 мл физиологического раствора с рН от 6,0 до 8,0 в течение 4-х часов. Расчет фибринолиза проводился по указанной выше формуле.

В третьей серии опытов определялась минимальная доза имозимазы, необходимая для полного растворения фибрина. Фибрин и имозимазу в дозе 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,2; 4,5; 4,6; 4,8; и 5,0 ПЕ/мг инкубировали 4 часа в 2 мл физиологического раствора. Фибриновая пленка взвешивалась через 1, 2, 3 и 4 часа инкубации и рассчитывался процент фибринолиза.

Четвертая серия опытов повторяла условия третьей серии, но в качестве субстрата были использованы фибринозно-гнойные наложения из брюшной полости больных РГП.

В пятой серии опытов проводилось исследование фибрин олитической активности экссудата больных гнойным перитонитом и его влияния на фибринолитические свойства имозимазы. Фибрин или фибринозно-гной-ные наложения инкубировали в течение 3-х часов в 2-х мл экссудата или физиологического раствора и определяли степень лизиса. При тех же условиях изучали степень лизиса этих же субстратов при действии имозимазы в дозе 1 ПЕ/мг, растворенной в физиологическом растворе или в экссудате.

В шестой серии исследовалось влияние внутрибрюшинного введения имозимазы на фибринолитическую активность крови больных РГП через 1, 3 и 24 часа после применения фермента при экспозиции его в течение 3-х часов. В крови пациентов определялись уровень плазминогена и ПДФ-

Исследование системы гемостаза у больных РГП

Клиническая часть работы основана на исследовании изменений параметров системы гемостаза и ПОЛ в процессе лечения 120 больных, поступивших в клинику с диагнозом распространенного гнойного перитонита. Продолжительность течения интраабдоминального гнойно-воспалительного процесса до поступления в клинику у большинства больных (64 %) составила более 3-х суток.

Все больные были разделены на 2 группы. В основной группе (44 человека) санации брюшной полости проводились с применением имозимазы, а в группе сравнения (76 человек) санации проводились традиционным методом. Как по степени тяжести РГП, так и по количеству оперативных вмешательств до поступления в клинику, группы были вполне сопоставимы. В основной группе, по данным отчета отделения гнойной хирургической инфекции, летальность составила 27,3 %, а группе клинического сравнения — 47,4 %.

Из общего числа (120 человек) прооперированных больных для 60 пациентов (30 человек - санации с имозимазой и 30 человек — санации традиционным способом) была исследована подробная динамика параметров гемостаза и уровень МДА в плазме и эритроцитах. В каждой из этих двух групп (по 30 человек) было выделено по 10 пациентов с неблагоприятным (летальным) исходом заболевания, которые составили основную подгруппу (лечение с имозимазой, летальный исход) и подгруппу сравнения (лечение без имозимазы, летальный исход).

Средние значения параметров гемостаза при поступлении для сформированных групп и подгрупп были сопоставимы (достоверных различий выявлено не было). Количественный состав групп и подгрупп определился тем, что в основную подгруппу (10 человек) вошли все прооперированные больные (летальный исход, санация с имозимазой), а увеличение численного состава сравниваемых групп более чем в два раза не способствует по-

вышению точности измерения. Две группы по 20 больных с благоприятным исходом заболевания составили основную группу (лечение с имозимазой, благоприятный исход) и группу сравнения (лечение без имозимазы, благоприятный исход) (табл. 1). Больные с летальным исходом заболевания были выделены в отдельные подгруппы для решения одной из основных задач исследования - выявления связи параметров гемостаза с прогнозом развития системных осложнений, приводящих к летальному исходу.

Таблица 1

Характеристика клинических групп больных

Благоприятный исход

Основная группа 20 чел Санациясимозимазой

Группа сравнения 20 чел. Санация без имозимазы

Летальный исход

Основная подгруппа 10 чел. Санация с имозимазой

Подгруппа сравнения 10 чел. Санация без имозимазы

Внутрибрюшинный протеолиз, проводимый пациентам основной группы и основной подгруппы, осуществляли в варианте фракционного лаважа брюшной полости в послеоперационный период путем введения через дренажи в брюшную полость имозимазы в суммарной дозе 15 000 ПЕ и 300-500 мл изотонического раствора №С1 с добавлением антибиотиков широкого спектра действия.

Исследование системы гемостаза проводилось при поступлении больного в клинику, перед проведением санационной релапаратомии, через 18-24 часа после каждой санации брюшной полости, а затем один раз в 5 дней после перевода больного в отделение клиники из палаты реанимации.

Пациентам группы сравнения и подгруппы сравнения проводилось аналогичное хирургическое и консервативное лечение, но абдоминальный протеолиз при этом не применяли.

Система гемостаза оценивалась следующими методами определения:

• гематокрита (по Колб В.Г., СятковскомуВ.А., 1980).

• вязкости крови (по ПироговуА.Ф., Джорджикия В.Д., 1968).

• агрегации тромбоцитов на фотоэлектрокалориметре (по Балу-даВ.П., Сушкевичу Г.Н., Зяблицкому В.М.,1980).

• протромбинового времени (по ршсИ, 1966).

• содержания фибриногена (по БелицерВ.А., Варецкой Т.В., Ве-ремеенко К.Н., 1983).

• растворимых фибрин-мономерных комплексов (фенантролиновый тест) (по МомотА.П., Елыкомову ВА, Баркагану З.С, 1996).

• естественного лизиса фибринового сгустка (по Котовщико-войМ.А., Кузнику Б.И., 1962).

• антитромбина III (по Abilgaard и соавт., 1970, в модификации Бишевского К.М., 1983).

• резерва плазминогена и суммарного уровня ингибиторов фибри-нолиза (по Лычеву В.Г., Дорохову А.Е., 1981).

• продуктов деградации фибриногена (ПДФ) и растворимых фибрин-мономерных комплексов в сыворотке по тесту склеивания стафилококков (по Лычеву В.Г., 1981).

• перекисного окисления липидов (по Гончаренко М.С, Латино-войА.М., 1985).

Статистическая обработка цифрового материала проведена методами вариационной статистики с использованием t-критерия для независимых выборок и метода Стьюдента. Так как малые размеры выборок не позволяют сделать достоверное заключение о характере распределения, при анализе наиболее важных результатов параллельно был использован критерий Ман-на-Уитни (представляющий собой непараметрическую альтернативу t-кри-терия для независимых выборок) и метод ранговой корреляции Спирмена.

Различия считали значимыми прир < 0,05 и доверительные интервалы рассчитывались при доверительной вероятности 95 %. Достоверность различия отмечалась на графиках и в таблицах и рассчитывалась относительно исходных значений при анализе динамики или относительно контроля (сравниваемой группы) при анализе сравнительных данных. Статистическая значимость отличия обозначалась одной звездочкой (*) при p<0,05, двумя звездочками (**) при р<0,01 и тремя (***) при p < 0,005. Для наиболее важных случаев приведено точное (численное) значение достоверности различия.

Статистическая обработка проведена с использованием программ Statistic 6 (for Windows) и Statlets (2002 г.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты эксперимента in vitro

В эксперименте in vitro были исследованы фибринолитические свойства имозимазы, сведения о которых были необходимы для разработки метода эффективного интраабдоминального протеолиза. Так как короткие экспозиции фермента требовали использования большой дозы имозимазы, а длительные экспозиции увеличивали вероятность резорбции продуктов протеолиза, большинство исследований были проведены в диапазоне от 1 до 3-х часов.

В результате проведенных исследований было установлено, что с увеличением дозы имозимазы скорость лизиса фибрина возрастает пропорционально дозе фермента, соответственно повышается концентрация ПДФ - маркеров фибринолитической активности.

При изучении зависимости фибринолитической активности имо-зимазы от рН буферного раствора выявлено, что имозимаза сохраняет высокую фибринолитическую активность в широком диапазоне рН (от 6,2 до 8,0), при этом максимальная фибринолитическая активность имо-зимазы проявляется при рН 7,6.

Установлено, что для полного растворения 1 мг стандартной пленки фибрина в течение 1 часа требуется доза имозимазы, равная 4,8 ± 0,2 ПЕ. Для полного лизиса того же количества фибринозно-гнойных наложений больных РГП за 1 час достаточно в два раза меньшего количества имозимазы (2,0 ± 0,4 ПЕ). При этом концентрация ПДФ при 100 % лизисе фиб-ринозно-гнойных наложений была в 2 раза ниже (124 ± 4 мкг/мл) по сравнению со стандартными пленками фибрина (240 ± 5 мкг/мл), что свидетельствует о меньшем содержании фибрина в фибринозно-гнойных наложениях (по сравнению со стандартной фибриновой пленкой).

В эксперименте с перитонеальным экссудатом больных РГП выявлено, что перитонеальный экссудат фибринолитической активностью не обладает и снижает фибринолитическую активность имозимазы. Это подтверждено в опытах как со стандартными фибриновыми пленками, так и с фибринозно-гнойными наложениями — присутствие экссудата в равной мере снижало процент лизиса в том и другом случаях, соответственно была низкой и концентрация ПДФ. Это, вероятно, обусловлено наличием в экссудате белков, конкурирующих за взаимодействие с активным центром фермента. С целью устранения ингибирующего влияния экссудата на процесс фибринолиза, брюшная полость пациента должна перед введением имозимазы промываться физиологическим раствором. К тому же, данная процедура повышает рН среды, что также способствует эффективному лизису, потому что, как показано в наших опытах, максимальную активность имозимаза проявляет в слабощелочной среде.

Изучение влияния интраабдоминального протеолиза с имозимазой на фибринолитическое звено системы гемостаза больных РГП показало: внутрибрюшинное введение имозимазы не влияет на фибринолитическую активность крови больных. Концентрация ПДФ и уровень плазминогена, измеренные через 1, 3 и 24 часа после введения имозимазы, достоверно не отличались от значений до введения протеолитического фермента.

На основании полученных данных о фибринолитических свойствах имозимазы, был разработан и впервые применен в клинической практике Е.В. Нечаевым (1998 г.) способ интраабдоминальных санаций с применением протеолитического фермента.

Влияние санаций с имозимазой на параметры системы гемостаза

и ПОЛ больных гнойным перитонитом

Следующим этапом работы явилось исследование закономерностей изменения параметров системы гемостаза у больных РГП при различных методах санации брюшной полости.

У всех больных при поступлении наблюдались изменения в показателях системы гемокоагуляции, характерные для подострой формы ДВС-синдрома. Было отмечено нарушение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов, со снижением способности тромбоцитов к дезагрегации и активация процессов ПОЛ - отмечалось увеличение уровня МДА в плазме и в эритроцитах - в 1,5-2 раза выше нормы.

Нарушения реологических свойств крови у больных обеих групп при поступлении проявлялись низкими значениями гематокрита, высокими показателями вязкости крови, высокой концентрацией фибриногена и фибрин-мономерных комплексов. Показатели протромби-нового индекса у больных обеих групп при поступлении были ниже нормы. Истощение фибринолитической системы у больных как в группе сравнения, так и в основной группе проявлялось в сниженной концентрации плазминогена, низком уровне спонтанного фибринолиза и высоком уровне ПДФ. Уровень антитромбина III (антикоагулянтная система) находился в пределах нормы у больных обеих групп.

В процессе лечения были выявлены различия в изменении параметров гемостаза для больных основной группы и группы сравнения. В основной группе большинство параметров свертывающей системы нормализовалось к 25-м суткам, в группе сравнения нарушения многих показателей гемостаза сохранялись вплоть до 45-х суток наблюдений.

Уровень МДА в группе сравнения как в плазме, так и в эритроцитах оставался высоким до конца периода наблюдений (45 суток), что свидетельствовало об активации процессов ПОЛ. В основной группе нормализация уровня МДА в эритроцитах отмечена на 5-е сутки. Значимые различия между уровнями МДА эритроцитов в основной группе и группе сравнения отмечены на 7-е сутки ф<0,05), (рис. 1). Достоверные различия в показателях МДА плазмы (р< 0,05) отмечены позднее — на 25-е сутки.

К Ъ <5

Сутки после операции

^ —О—Санация без имозимазы

—&—Санация имозимаэой (норма 8,4-8,8 мкМ/мл).

Рис. 1. Динамика изменений МДА эритроцитов в основной группе и группе сравнения.

Нарушения агрегационной функции тромбоцитов в группе сравнения прослеживались на протяжении всего периода наблюдения: значения агрегации тромбоцитов сопровождались повышениями на 15-20 % (по отношению к норме), со значительным снижением дезагрегации. Значимые различия в показателях агрегации между двумя группами отмечены на 15-е сутки (р < 0,05) — к этому сроку в основной группе агрегация тромбоцитов нормализовалась, в группе сравнения значения превышали норму.

Полной нормализации показателей дезагрегации тромбоцитов в группе сравнения не было отмечено вплоть до конца периода наблюдений (45 суток). Согласно данным В.И. Мазурова и др. (1989), отсутствие тенденции к восстановлению дезагрегационной функции тромбоцитов на 7-8-й день после операции свидетельствует о нарушении внутреннего метаболизма тромбоцитов и является показателем наличия очага нагноения. В основной группе значительное повышение дезагрегации произошло уже на 7-е сутки (р < 0,05), полная нормализация отмечена на 20-е сутки (р < 0,05) (рис. 2).

30

25 X т

20 15

10

5

0

Сутки после операции —О—Санация без имозимазы —Л—Санация с имозимазой (норма 20 - 30%).

Рис. 2. Динамика изменений дезагрегации тромбоцитов в основной группе и группе сравнения.

Концентрация фибриногена у больных группы сравнения оставалась высокой практически на протяжении всего периода наблюдений. Снижение уровня фибриногена на 20—25-е сутки до нормы сопровождалось его последующим повышением, что свидетельствовало о неполном купировании воспалительного процесса. На 40-е сутки значения фибриногена превышали норму более чем в 2 раза. В основной группе концентрация фибриногена нормализовалась на 15-е сутки.

Достоверные различия в значениях РФМК (высокий уровень которого свидетельствует об активации процессов внутрисосудистого свертывания крови, является маркером тромбинемии) наблюдались, начиная с 15-х суток (р < 0,05). При этом уровень РФМК у пациентов основной группы пришел к норме на 25-е сутки, у пациентов группы сравнения на 45-е сутки уровень РФМК превышал норму в 5 раз.

Рис. 3. Динамика изменений плазминогена в основной группе и группе сравнения

Низкий уровень плазминогена (фибринолитическая система) у больных группы сравнения прослеживался до 40-х суток. В основной группе нормализация данного показателя была отмечена на 20-е сутки. Достоверные различия в значениях плазминогена отмечены на 10-е сутки (р< 0,05) (рис.3).

Наблюдение за динамикой изменения концентрации ПДФ (маркера активации внутрисосудистого свертывания) показало, что значительное снижение уровня ПДФ у больных основной группы произошло на 7-е сутки (р < 0,05) в то время как у пациентов группы сравнения тенденция к некоторому снижению отмечена лишь к 45-м суткам (рис. 4)

Рис. 4. Динамика изменений ПДФ в основной группе и группе сравнения

Таким образом, у больных группы сравнения нормализация параметров гемостаза происходила значительно медленнее по сравнению с основной группой. Нарушения в системе гемостаза, обусловленные эн-дотоксемией - активация системы гемокоагуляции, процессов внутри-сосудистого свертывания, снижение активности фибринолитической системы создавали опасность нарушения микроциркуляции, угрозу возникновения полиорганной недостаточности, что отражено на приведенной схеме состояния системы гемостаза в патогенезе РГП (рис. 5). Нарушения многих параметров гемостаза в группе сравнения не исчезали к моменту завершения лечения, на 45-е сутки, вероятно, вследствие того, что санации брюшной полости без применения имозимазы не приводили к полному удалению некротизированных тканей, сформированных плотными наложениями фибрина, и не обеспечивали достаточного снижения эндогенной интоксикации.

Рис. 5. Схема состояния системы гемостаза в патогенезе РГП.

У больных основной группы интраперитонеальный протеолиз с использованием имозимазы способствовал лизису и очищению брюшной полости от фибринозно-гнойных напластований, что способствовало подавлению инфекционного процесса в брюшной полости, снижению эндогенной интоксикации и, как следствие, скорейшей нормализации параметров системы гемостаза — на 25-е сутки. Схема коррекции системы гемостаза под воздействием интраабдоминального протеолиза с применением имозимазы приведена ниже (рис. 6).

Рис. 6. Схема коррекции системы гемостаза в патогенезе РГП при комплексном

лечении больных с использованием протеолитического фермента имозимазы.

Динамика показателей системы гемостаза у больных РГП

с неблагоприятным исходом заболевания

У больных обеих подгрупп (пациенты с летальным исходом, по 10 человек в каждой подгруппе) в динамике наблюдалось углубление нарушений в системе гемокоагуляции.

Интенсивность ПОЛ в обеих подгруппах нарастала. Уровень МДА в плазме на 15-е сутки составил 2,1±0,5мкМ/мл у больных основной подгруппы (норма 0,84-0,88), у больных подгруппы сравнения -2,3 ± 0,5 мкМ/мл, уровень МДА в эритроцитах - 21,8±4,1 мкМ/мл и 22,9 ± 4,0 мкМ/мл соответственно. Усугублялись нарушения в тромбо-цитарном звене гемостаза. Значения агрегации и дезагрегации тромбоцитов снижались. На 7-е сутки агрегация снизилась до 16 ± 5 % у больных основной подгруппы, у больных подгруппы сравнения - до 5 ± 4 %, на 10-е сутки отмечено практически полное угнетение агрегации и дезагрегации тромбоцитов у пациентов обеих подгрупп.

Концентрация фибриногена, превышающая норму при поступлении у больных обеих подгрупп в 1,5 раза, снизилась на 15-е сутки у больных основной подгруппы до 1,5 ± 1,1 г/л, у больных подгруппы сравнения до 1,1 ± 1,0 г/л. Уровень РФМК в обеих подгруппах до конца периода наблюдений оставался высоким: 24 х 10-2г/л (основная подгруппа) и 28 х 10-2г/л (подгруппа сравнения) на 15-е сутки.

В обеих подгруппах в динамике выявлено снижение протромбинового индекса, истощение факторов противосвертывающей системы - снижение активности антитромбина III, уровня плазминогена и спонтанного фибри-нолиза. Таким образом, у больных обеих подгрупп в динамике наблюдалось усугубление нарушений в системе гемостаза, развитие гипокоагуляции на фоне депрессии фибринолитической и антикоагулянтной систем.

На таком выраженном неблагоприятном фоне включение в комплексное лечение имозимазы для больных основной подгруппы не было достаточно эффективным, значимых различий в показателях системы гемостаза в процессе наблюдения у больных основной подгруппы (санации с имозимазой) и у больных подгруппы сравнения (санации без имозимазы) выявлено не было.

Согласно секционным данным, у больных основной подгруппы летальный исход произошел на фоне полностью, либо преимущественно купированного перитонита и был обусловлен перитонеальным сепсисом и полиорганной недостаточностью, в то время как в группе сравнения перитонит явился причиной летального исхода в 26,3 % случаев. Следовательно, основное назначение интраперитонеального протеолиза с имозимазой, состоящее в купировании проявлений перитонита, было реализовано и в случае неблагоприятного исхода.

Так как у больных основной подгруппы (лечение имозимазой) летальный исход был обусловлен перитонеальным сепсисом и полиорганной недостаточностью, вероятность неблагоприятного исхода, вероятно, могла бы быть снижена своевременным применением средств, пре-

пятствующих генерализации гнойного воспаления и углублению нарушений в системе гемокоагуляции.

Выявление информативных показателей, свидетельствующих о необратимых изменениях в системе гемостаза

Анализ изменения показателей системы гемостаза в процессе лечения для основной группы (лечение имозимазой, благоприятный исход), в сравнении с основной подгруппой (лечение имозимазой, летальный исход) (рис. 7 а-г), позволил разработать прогностические тесты, руководствуясь которыми можно в ранние сроки прогнозировать высокий риск развития необратимых изменений в системе гемокоагуляции больных гнойным перитонитом.

Установлено, что наиболее информативными прогностическими тестами (маркерами) являются показатели агрегации, дезагрегации тромбоцитов, уровень плазминогена и ПДФ - то есть наиболее рано на неблагоприятные изменения в системе гемокоагуляции у больных РГП реагируют тром-боцитарное и фибринолитическое звенья системы гемостаза. Значимые различия в показателях фибринолитической системы отмечены на 3-й сутки наблюдений - найдены достоверные различия у пациентов основной группы и основной подгруппы в значениях концентрации плазминогена (р = 0,009) и в значениях ПДФ (р = 0,005). На 5-е сутки достоверные различия отмечены в показателях дезагрегации (р < 0,005) и агрегации тромбоцитов (р < 0,005).

Рис. 7 (а, б). Информативные прогностические показатели Звездочками (*, ** или ***)

указана вероятность (р < 0,05, р < 0,01 и р < 0,005 соответственно) отличия показателей основной группы от показателей основной подгруппы.

Рис. 7 (в, г). Информативные прогностические показатели. Звездочками (*, ** или ***)

указана вероятность (р < 0,05, р < 0,01и р < 0,005 соответственно) отличия показателей основной группы от показателей основной подгруппы.

Таблица 2

Достоверностьразличия показателей гемостазау больныхРГП, пролеченныхимозимазой, для параметров, имеющихвысокую корреляцию с исходомзаболевания

Достоверность различия Сутки после опер. Агрегация Дезагрегация Плазминоген ПДФ

По Манну-Уитни 1 сут. р = 0,367 р = 0,019 р = 0,182 р = 0,033

Зсут. р = 0,843 р = 0,016 р = 0,008 р < 0,005

5 сут. р < 0,005 р < 0,005 р < 0,005 р < 0,005

Ранговая корреляция по Слирмену 1 сут. г = 0,172 р = 0,356 г =0,580 р= 0,002 г = 0,326 р = 0,784 г = 0,031 р = 0,095

Зсут. г = -0,041 р = 0,826 г =0,454 р = 0,016 г = 0,555 р= 0,006 г = 0,435 р = 0,019

5 сут. г = 0,824 р < 0,005 г = 0,617 р < 0,005 г = 0,817 р < 0,005 г = 0,531 р = 0,005

Так как малые объемы выборок не позволяют сделать достоверные заключения о характере распределения исследуемой величины, для выбранных параметров достоверность различия дополнительно была рассчитана с помощью непараметрического аналога ^критерия - теста

Манна-Уитни, и проведен ранговый корреляционный анализа по Спир-мену. Данные, приведенные в табл. 2, демонстрируют высокую достоверность тестов и хорошее соответствие результатов различных методов статистической обработки.

Таким образом, сравнительный анализ показателей системы гемостаза - агрегации, дезагрегации, уровней плазминогена и ПДФ -показал, что снижение агрегации тромбоцитов на 5-е сутки более чем в 2 раза (по сравнению с исходными значениями), отсутствие повышения дезагрегации на 5-е сутки, отсутствие снижения уровня ПДФ и повышения концентрации плазминогена на 3-й сутки, свидетельствуют о высокой вероятности развития необратимых изменений в системе гемостаза.

ВЫВОДЫ

1. Имозимаза интенсивно лизирует фибринозно-гнойные продукты воспаления и фибриносодержащие субстраты при времени экспозиции фермента от 1 до 3-х часов, сохраняя высокую фибриноли-тическую активность. Доза имозимазы, необходимая для полного лизиса субстрата, уменьшается пропорционально длительности экспозиции. При экспозиции 1 час для полного лизиса in vitro стандартной фибриновой пленки требуется доза 4,8 ± 0,2 ПЕ/мг. Для полного лизиса фибринозно-гнойных наложений при тех же условиях достаточно в 2 раза меньшего количества имозимазы - 2,0 ± 0,4 ПЕ на миллиграмм субстрата.

2. Имозимаза сохраняет высокую фибринолитическую активность в широком диапазоне рН (от 6,2 до 8,0), при этом максимальная фиб-ринолитическая активность имозимазы проявляется при рН 7,6. Пери-тонеальный экссудат фибринолитической активностью не обладает и значительно снижает фибринолитическую активность имозимазы.

3. При интраабдоминальном применении имозимаза оказывает местный фибринолитический эффект и не влияет на уровень системной фибринолитической активности больных распространенным гнойным перитонитом.

4. У больных распространенным гнойным перитонитом, лечение которым проводилось с применением интраперитонеального протеоли-за, нормализация основных показателей системы гемостаза и уровня перекисного окисления липидов наступает к 25-м суткам, т.е. в 2 раза быстрее, чем у больных с санациями без имозимазы, у которых нормализация исследуемых показателей начинает проявляться только к 45-м суткам лечения.

5. Наиболее информативными показателями системы гемостаза, которые позволяют на 3—5-е сутки с момента поступления пациентов в стационар прогнозировать высокую вероятность развития у больных

распространенным гнойным перитонитом несовместимых с жизнью гемокоагуляционных нарушений, являются агрегация, дезагрегация тромбоцитов, уровень плазминогена и продуктов деградации фибрина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бондырева Г.В. Динамика реологических свойств крови при лечении послеоперационного распространенного гнойного перитонита / Г.В. Бондырева, В.И. Марченко, Е.В. Нечаев // Актуальные вопросы реконструктивной и восстановительной хирургии: Сб. статей. - Ташкент: Изд-во мед. лит-ры им. Абу Али ибн Сино, 1996. — С. 348-350.

2. Бондырева Г.В. Диагностическая ценность маркеров внутрисосу-дистого свертывания крови при гнойном перитоните / Г.В. Бондырева, В.И. Марченко, В.В. Садах // Материалы Всероссийской научно-практической конференции хирургов. - Улан-Удэ, 1997. - С. 27-28.

3. Бондырева Г.В. Лабораторные критерии оценки эффективности применения имозимазы в комплексном лечении перитонитов / Г.В. Бондырева, В.И. Марченко, В.В. Садах // Клиническая лабораторная диагностика. - 1998. - № 8. - С. 44.

4. Бондырева Г.В. Влияние интраперитонеального протеолиза на изменения тромбоцитарного гемостаза и перекисного окисления липидов при гнойном перитоните / Г.В. Бондырева, В.И. Марченко, В.В. Садах // Материалы II Конгресса Ассоциации хирургов им. Н.И. Пирогова. -СПб., 1998. - С. 34-35.

5. Бондырева Г.В. Диагностическая ценность маркеров внутрисо-судистого свертывания крови при гнойном перитоните /Г.В. Бонды-рева, В.И. Марченко, В.В. Садах // Сиб. мед. журн. - Иркутск, 1999. -№ 3- 4. - С. 36.

6. Бондырева Г.В. Влияние интраперитонеального протеолиза с использованием имозимазы на систему гемостаза больных РГП / Г.В. Бондырева, В.И. Марченко В.В. Садах // Актуальные вопросы реконструктивной и восстановительной хирургии: сб. статей. — Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, 1999. - С. 193- 195.

7. Бондырева Г.В. Влияние пролонгированного абдоминального протеолиза с применением имозимазы на агрегационную функцию тромбоцитов и перекисное окисление липидов / Г.В. Бондырева, В.И. Марченко, В.В. Садах // Сиб. мед. журн., Иркутск — 2001. - № 3— 4.-С. 57-59.

8. Бондырева Г.В. Изучение фибринолитических свойств иммоби-лизированного протеолитического фермента имозимазы / Г.В. Бондырева, В.И. Марченко, А.В. Малышев // Бюлл. СО РАМН. - 2001. - № 2. - С. 53-57.

9. Бондырева Г.В. Динамика системы гемостаза при применении физических и химических методов санации брюшной полости в лечении разлитого гнойного перитонита / Г.В. Бондырева, В.И. Марчен-

ко, В.В. Садах// Материалы Всеросс. конф. хирургов. - Тюмень, 2003. - С. 39-40.

10. Бондырева Г. В. Влияние интраабдоминального протеолиза с применением имозимазы на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз и пере-кисное окисление липидов в лечении больных с распространенным гнойным перитонитом / Г.В. Бондырева, Б.Г. Пушкарев, В.И. Марченко // Материалы Всеросс. конф. хирургов. — Тюмень, 2003. — С. 63-64.

11. Бондырева Г.В. Состояние системы гемостаза при сочетанном применении физических и химических методов санации брюшной полости в лечении разлитого гнойного перитонита / Г.В. Бондырева, В И. Марченко, Б.Г. Пушкарев // Успехи современного естествознания. -2003.-№3.-С.35.

Подписано в печать 20.12.2004. Бумага офсетная. Формат 60х841/16 Гарнитура Таймс. Усл. печ. л. 1,0 _Тираж 100 экз. Заказ № 345-04._

РИО НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН

(Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37)

i-

'О-,,'

8221

!

i ó til , \ "

Общепризнанным фактором, осложняющим течение разлитого гнойного перитонита, является нарушение гемокоагуляционого гомеостаза, усиливающее гиповолемию, гипоксию, способствующее прогрессированию эндогенной интоксикации. Эндогенная интоксикация оказывает воздействие на все звенья системы гемостаза - сосудисто - тромбоцитарное, коагуляционное. Эти расстройства приводят к нарушениям микро- и макрогемодинамики, к возникновению диссеминированного внутрисосудистого свертывания и являются одним из факторов быстрого развития полиорганной недостаточности [39,41,49,57,79,135,155,166,189,190, 205 ,213,216].

Под воздействием эндотоксинов происходит повреждение клеток эндотелия, что приводит к исчезновению эндотелиального покрова в отдельных участках сосудов с обнажением коллагена. Этим открывается путь к коллаге-новой активации коагуляции, агрегации тромбоцитов, кининового каскада. Агрегируя вокруг бактерий, тромбоциты создают им защиту от бактерицидных плазменных агентов, создавая тем самым условия для культивирования микроорганизмов, формирования очагов некроза, генерализации инфекционного процесса и увеличения эндогенной интоксикации [21,31,49,96,135,190,196,202,217].

Эндотоксины действуют как на коагуляционный каскад, так и на синтез прокоагулянтов в органах-продуцентах, при этом содержание в крови антикоагулянтов оказывается недостаточным для предупреждения агрегации тромбоцитов и активации коагуляционного каскада. При гнойной инфекции и эндотоксемии происходит внутримолекулярная перестройка фибриногена, способствующая формированию дополнительных водородных и пептидных связей при переходе в фибрин. При этом резко замедляется расщепление фибрина, что способствует формированию плотных продуктов воспаления на брюшине [49,80,135,169,208,209].

Воспаление, гнойная инфекция, появление очагов некроза, эндогенная интоксикация и гипоксия, сопровождающая эти процессы, способствуют активации перекисного окисления липидов (ПОЛ) и ингибированию антиокси-дантной системы защиты [35,78,160,212,216]. Увеличение интенсивности ПОЛ оказывает патогенное воздействие и на систему гемостаза: нарушается, в частности, внутриклеточный метаболизм тромбоцитов, что способствует потере способности их к дезагрегации и приводит к тромбогеморрагическим осложнениям [89,101,104,126,132,172,174,185,198,217]. По мнению некоторых авторов, уровень продуктов ПОЛ является показателем степени эндогенной интоксикации и тяжести состояния больного, и его высокий уровень требует применения специальных лечебных мероприятий [95,198,201,212].

Экспериментальные и клинические исследования показывают, что в процессе перманентного инфицирования брюшной полости и развития эндогенной интоксикации существенная роль принадлежит фибринозно-гнойным напластованиям на брюшине, в которых вегетируют патогенные микроорганизмы. Такой же процесс накопления бактериальной микрофлоры происходит в инфицированных сгустках крови и девитализированных тканях. В образовании фибринных наложений большая роль принадлежит свертывающей системе [50,51,89,105,200].

Таким образом, эндогенная интоксикация обусловливает нарушения в системе гемостаза, что способствует формированию фибринных образований на париетальной и висцеральной брюшине, осложняет течение гнойного перитонита. Плохое проникновение в указанные структуры антибактериальных средств является значимой причиной недостаточной эффективности сочетан-ного применения хирургических и лекарственных методов лечения [50,51,80,89, 105,169].

В последние годы наметился определенный прогресс в лечении больных гнойным перитонитом. Решение рассматриваемой проблемы видится в применении внутрибрюшинного протеолиза фибринозно-гнойных наложений с использованием имозимазы [149]. К моменту начала исследования не были изучены фибринолитические свойства имозимазы и воздействие протеолити-ческого фермента на фибринозно-гнойные отложения при различных условиях, которые могут быть смоделированы in vitro, с изменениями доз имозимазы, рН среды, времени экспозиции; не были раскрыты механизмы и результаты влияния комплексного лечения перитонита с использованием протеолити-ческого фермента имозимазы на параметры системы гемостаза больных распространенным гнойным перитонитом.

Изложенное выше определило цель и задачи настоящей работы, которая является фрагментом комплексной темы научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии ВСНЦ СО РАМН.

Цель:

Определить эффект интраабдоминальных санаций с применением протеоли-тического фермента имозимазы по параметрам системы гемостаза больных распространенным гнойным перитонитом.

Задачи:

1. Определить степень и скорость лизиса имозимазой стандартных плёнок фибрина и фибринозно-гнойных наложений больных распространенным гнойным перитонитом в зависимости от количества (дозы) фермента, времени экспозиции и рН среды в условиях in vitro.

2. Изучить изменения в системе гемостаза и перекисного окисления липидов у больных распространенным гнойным перитонитом с санированием брюшной полости традиционными методами в сравнении с применением внутрибрюшинного протеолиза имозимазой.

3. Исследовать особенности влияния интраабдоминального протеолиза с имозимазой на параметры гемостаза и перекисное окисление липидов в крови больных с распространенным гнойным перитонитом при развитии необратимых системных осложнений. 4. Выявить наиболее информативные показатели системы гемостаза, позволяющие прогнозировать развитие необратимых изменений в системе ге-мокоагуляции больных распространенным гнойным перитонитом.

Научная новизна:

Изучены фибринолитические свойства имозимазы при воздействии данного фермента на фибрин и фибринозно-гнойные наложения в зависимости от дозы фермента, времени экспозиции и рН среды.

Установлено, что при внутрибрюшинном применении имозимаза не оказывает влияния на уровень системной фибринолитической активности крови больных распространенным гнойным перитонитом. Определено, что применение имозимазы в интраабдоминальных санациях у больных РГП существенно ускоряет нормализацию большинства параметров системы гемостаза.

Выявлены наиболее информативные показатели системы гемостаза, позволяющие оценить степень риска развития необратимых гемокоагуляци-онных осложнений. По материалам работы подана заявка на изобретение "Способ прогнозирования исхода комплексного лечения больных РГП" (Приоритетная справка № 2003 133 325/15 (035 863) от 17.11.03).

Практическая значимость:

Выявлены оптимальные условия, необходимые для осуществления эффективного лизиса фибринозно-гнойных напластований у больных гнойным перитонитом.

Установлено, что интраабдоминальный протеолиз с применением имо-зимазы значительно ускоряет нормализацию параметров системы гемостаза у больных гнойным перитонитом.

Определены наиболее информативные тесты лабораторной диагностики - показатели агрегационной и дезагрегационной функции тромбоцитов, концентрация плазминогена и ПДФ - позволяющие оценить степень риска развития необратимых изменений в системе гемокоагуляции. Апробация

• Республиканская конференция "Вахидовские чтения", Ташкент, 1996;

• Всероссийская научно-практическая конференция хирургов, Улан-Удэ, 1997;

• II Конгресс Ассоциации хирургов им. Пирогова, Санкт-Петербург, 1998;

• Симпозиум "Лабораторная диагностика и лекарственная терапия", Москва, 1998;

• Конференция "Современные проблемы анестезиологии, реаниматологии и интенсивной терапии", Иркутск, 1999;

• Научно-практическая конференция "Современные технологии в хирургии", Минск, 2002

• Всероссийская конференция хирургов, Тюмень, 2003;

• Конференция "Современные наукоемкие технологии", Хургада, 2003.

Внедрение в практику

Полученные данные о фибринолитической активности имозимазы расширили область ее клинического применения и позволили разработать эффективный способ санации при лечении гнойных перитонитов любой этиологии.

Способ применяется в лечении больных госпитальной хирургической клиники на базе Иркутского Государственного медицинского университета, в

Областной клинической больнице №1. Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедры госпитальной хирургии Иркутского Государственного медицинского университета, научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Иммобилизованная протеиназа имозимаза интенсивно лизирует фибри-нозно-гнойные продукты воспаления и белковые субстраты, содержащие фибрин, полностью разрушая фибрин при времени экспозиции фермента от 1 до 3-х часов и дозе имозимазы от 5 до 2-х ПЕ/мг соответственно, проявляя максимальную фибринолитическую активность при рН = 7,6.

2. При интраабдоминальном применении имозимаза оказывает местный фибринолитический эффект и не влияет на уровень системной фибрино-литической активности.

3. Под воздействием интраабдоминального протеолиза с применением имозимазы нормализация большинства показателей системы гемостаза происходит значительно быстрее по сравнению с больными, которым санации брюшной полости осуществлялись без имозимазы.

4. Риск развития несовместимых с жизнью гемокоагуляционных осложнений может быть спрогнозирован в ранние сроки с помощью информативных показателей системы гемостаза.

ВЫВОДЫ

1. Имозимаза интенсивно лизирует фибринозно-гнойные продукты воспаления и фибриносодержащие субстраты при времени экспозиции фермента от 1 до 3-х часов, сохраняя высокую фибринолитическую активность. До за имозимазы, необходимая для полного лизиса субстрата, уменьшается пропорционально длительности экспозиции. При экспозиции 1 час для полного лизиса in vitro стандартной фибриновой плёнки требуется доза 4,8±0,2 ПЕ/мг. Для полного лизиса фибринозно-гнойных наложений при тех же условиях достаточно в 2 раза меньшего количества имозимазы -2,0±0,4 ПЕ на миллиграмм субстрата.

2. Имозимаза сохраняет высокую фибринолитическую активность в широком диапазоне рН (от 6,2 до 8,0), при этом максимальная фибринолитиче-ская активность имозимазы проявляется при рН 7,6. Перитонеальный экссудат фибринолитической активностью не обладает и значительно снижает фибринолитическую активность имозимазы.

3. При интраабдоминальном применении имозимаза оказывает местный фибринолитический эффект и не влияет на уровень системной фибринолитической активности больных распространенным гнойным перитонитом.

4. У больных распространенным гнойным перитонитом, лечение которым проводилось с применением интраперитонеального протеолиза, нормализация основных показателей системы гемостаза и уровня перекисного окисления липидов наступает к 25-м суткам, т.е. в 2 раза быстрее, чем у больных с санациями без имозимазы, у которых нормализация исследуемых показателей начинает проявляться только к 45-м суткам лечения.

5. Наиболее информативными показателями системы гемостаза, которые позволяют на 3-5-е сутки с момента поступления пациентов в стационар прогнозировать высокую вероятность развития у больных распространенным гнойным перитонитом несовместимых с жизнью гемокоагуляцион-ных нарушений, являются агрегация, дезагрегация тромбоцитов, уровень плазминогена и продуктов деградации фибрина.

Заключение

Нарушение гемокоагуляционного гомеостаза является фактором, осложняющим течение разлитого гнойного перитонита, усиливающим гипово-лемию, гипоксию, способствующим прогрессированию эндогенной интоксикации и дискоординации целого комплекса обменных процессов и функций организма, что нередко является причиной неблагоприятного течения заболевания. Известно, что ведущим звеном в патогенезе гнойного перитонита, определяющим тяжесть его течения, является синдром эндогенной интоксикации, обусловленный поступлением в кровоток продуктов распада тканей и деятельности микрофлоры инфицированной брюшной полости. Питательной средой для патогенных микроорганизмов, как правило, служат фибринные наложения, инфицированные кровяные сгустки, девитализированные ткани, в которые плохо проникают антибактериальные препараты.

Воздействие на систему гемостаза - один из важнейших повреждающих эффектов эндотоксинов. Тяжесть нарушений системы гемостаза зависит от путей проникновения, дозы и кратности прорыва эндотоксинов. Многие факторы системы гемостаза претерпевают значительные изменения именно на высоте гнойно-деструктивных процессов. Эндотоксины вызывают эксфолиацию эндотелия сосудов, открывая этим путь к коллагеновой активации агрегации тромбоцитов, кининового каскада, гемокоагуляции [49]. Применение имозимазы в лечении больных гнойным перитонитом способствует лизису плотных продуктов воспаления, создает условия для более эффективного действия антибактериальных препаратов, способствуя купированию воспалительного процесса, снижению эндогенной интоксикации [60,76,83,105,108].

Для уточнения условий и возможности применения имозимазы в клинике нами была проведена серия опытов in vitro, где были изучены закономерности фибринолитической функции имозимазы. В опытах использовались стандартная фибриновая пленка, фибринозно-гнойные наложения больных и перитонеальный экссудат. Фибринолитическая активность имозимазы определялась в зависимости от времени экспозиции, дозы имозимазы, рН среды и наличия экссудата.

Было выявлено, что имозимаза в опытах in vitro обладает высокой фиб-ринолитической активностью при экспозиции от 1 до 3 часов. Скорость лизиса фибрина возрастает с увеличением дозы фермента, полный лизис в течение 1 часа достигается при соотношении 4,8±0,2 ПЕ имозимазы на 1 мг стандартной фибриновой плёнки, фибринозно-гнойные продукты воспаления лизируются в два раза меньшей дозой имозимазы по сравнению со стандартной фибриновой плёнкой, перитонеальный экссудат снижает фибринолити-ческую активность имозимазы, максимальная фибринолитическая активность наблюдается при рН=7,6.

Анализ параметров системы гемостаза больных основной группы и группы сравнения показал, что до начала санаций, при поступлении, у пациентов не было отмечено достоверных различий в гемокоагуляционных показателях, у всех отмечались нарушения системы гемостаза, характерные для подострой формы ДВС-синдрома. Это проявлялось нарушением АДФ-инду-цированной агрегации тромбоцитов, со снижением или утратой способности тромбоцитов к дезагрегации. Утрата дезагрегации, даже при нормальной или сниженной агрегации тромбоцитов, является первым и универсальным признаком нарушения гемостатической функции тромбоцитов, их внутреннего метаболизма. Снижение и утрата способности тромбоцитов к дезагрегации способствует формированию послеоперационных тромбогеморрагических осложнений. Известно, что интенсивность реакций перекисного окисления липидов может выступать в качестве опосредующего звена основных регуля-торных систем тромбоцитов, а также служить показателем их функциональной активности [174]. Высокий уровень МДА в плазме и эритроцитах при поступлении у больных обеих групп свидетельствует об активации процессов ПОЛ, что ведет, в частности, к повышению фосфолипазной активности, ускорению образования циклических эндоперекисей и тромбоксана А2, к нарушению тромбоксан-простациклинового равновесия и активации тромбоцитов, способствует повышению тромбогенного потенциала в системе тромбоциты - сосудистая стенка.

Нарушение реологических свойств крови у больных обеих групп проявлялось в повышении вязкости крови, уровня фибриногена и высоким содержанием в крови РФМК - показателя активации внутри сосудистого свертывания крови.

Показатели антитромбина III (антикоагулянтная система) у больных обеих групп при поступлении были в пределах нормы. Истощение фибрино-литической системы проявлялось в снижении концентрации плазминогена, спонтанного фибринолиза, высоким уровнем ПДФ.

В процессе лечения были выявлены различия в нормализации параметров гемостаза для больных основной группы и группы сравнения. По-видимому, у больных группы сравнения этапные санации брюшной полости не обеспечивали полного удаления некротизированных тканей, сформированных плотными наложениями фибрина, и снижения эндогенной интоксикации. Нарушения в системе гемостаза и ПОЛ у больных данной группы в динамике проявлялись высоким уровнем МДА в плазме и эритроцитах, нарушением агрегационной и дезагрегационной функции тромбоцитов и реологических свойств крови, снижением активности антикоагулянтной и фибри-нолитической систем. Данные нарушения у больных РГП ведут к дальнейшей активации системы гемокоагуляции, нарушению микроциркуляции, что создает опасность развития дистрофических и некротических изменений в органах и тканях и угрозу возникновения полиорганной недостаточности (схема 1). Тенденция к нормализации показателей системы гемостаза у больных группы сравнения отмечена лишь на 45-е сутки с начала лечения.

Эндогенная интоксикация при РГП

Нарушение показателей системы гемостаза

Сосудисто- тромбоцитарный гемостаз Коагуляционное звено гемостаза Фибринолитическая система

Активация ПОЛ в мембранах л

Высокий уровень

РФМК V

Нарушение агрегации и дезагрегации тромбоцитов.

Высокая вязкость крови Ф

7 \>

Высокий уровень фибриногена.

Нарушение микроциркуляции 7

Снижение уровня плаз-миногена и фибринолиза. Повышение уровня ПДФ

Дистрофические и некротические изменения в органах.

Полиорганная недостаточность

1. Схема состояния системы гемостаза в патогенезе РГП

В основной группе интраперитонеальный протеолиз с использованием имозимазы способствовал лизису и очищению брюшной полости от фибри-нозно-гнойных напластований, что способствовало снижению эндогенной интоксикации и нормализации показателей системы гемокоагуляции (схема 2), которая наступила почти в 2 раза быстрее по сравнению с контрольной группой - на 25-е сутки.

У больных обеих подгрупп с летальным исходом при поступлении отмечены нарушения в системе гемостаза, характерные для подострой формы ДВС-синдрома.

89

Интраперитонеальное введение протеолитического фермента имозимазы.

Фрагментация и протеолиз фибринозно-гнойных отложений.

Гомогенизация и лизис фибринозно-гнойных наложений.

Утилизация из брюшной гюлрсти продуктов протеолиза. Уменьшение интоксикации продуктами фибринозно-гнойных наложений.

ЗГ ж

Коагуляционное звено гемостаза.

Сосудисто-тромбоцитарны й гемостаз. и

Фибринолитическая системя.

Повышение функции анти оксидантной системы. Снижение уровня ПОЛ. И ч>

Снижение вязкости.

Снижение уровня, фибриногена

Нормализация агре-гационной и дезагре-гационной функции тромбоцитов. 7

Улучшение реологических свойств крови. 7

Восстановление активности фибриполитической системы.

Нормализация показателей системы гемостаза

Снижение, уровня ПДФ и РФМК.

2. Схема коррекции системы гемостаза в патогенезе РГП при комплексном лечении больных с использованием протеолитического фермента имозимазы

Как при поступлении, так и в процессе дальнейшего наблюдения, у больных обеих подгрупп не было выявлено достоверных различий в показателях системы гемостаза. В динамике в обеих подгруппах отмечено углубление гемокоагуляционных нарушений: отмечалось нарастание интенсивности перекисного окисления липидов (возрастание уровня МДА в плазме и эритроцитах), углубление нарушений гемостатических функций тромбоцитов, развитие гипокоагуляции на фоне депрессии фибринолитической и антикоа-гулянтной систем, увеличение концентрации РФМК и ПДФ - показателей активации внутрисосудистого свертывания. Таким образом, нарушения в системе гемостаза - срыв антикоагулянтной и фибринолитической систем, нарушения агрегатного состояния крови и микроциркуляции у больных обеих подгрупп прогрессировали, создавая условия для отложения фибрина в микрососудах и формирования микротромбов. Последующее нарушение кровоснабжения органов и периферических тканей способствовало развитию полиорганной недостаточности с поражением внутренних органов, развитию генерализованного воспаления, сепсиса. На таком выраженном неблагоприятном фоне включение в комплексное лечение имозимазы не было достаточно эффективным, значимых различий в показателях системы гемостаза у больных основной подгруппы (санации с имозимазой) и у больных подгруппы сравнения (санации без имозимазы) выявлено не было. Как было отмечено в главе 5, у больных основной подгруппы летальный исход произошел на фоне полностью, либо преимущественно купированного перитонита и был обусловлен перитонеальным сепсисом и полиорганной недостаточностью и, следовательно, основное назначение интраперитонеального протеолиза с имозимазой, состоящее в купировании проявлений перитонита, было реализовано и в случае неблагоприятного течения заболевания.

Проведенный анализ показателей системы гемостаза для основной группы (лечение имозимазой, благоприятный исход), и основной подгруппы (лечение имозимазой, летальный исход) позволил разработать прогностические тесты, согласно которым на 3-5-е сутки можно дать прогноз риска углубления гемокоагуляционных нарушений у больных РГП. Наиболее информативными прогностическими тестами являются показатели агрегации, дезагрегации тромбоцитов, уровень плазминогена и ПДФ - то есть показатели тромбоцитарного и фибринолитического звеньев системы гемостаза. С помощью перечисленных тестов может быть выявлена необходимость коррекции тактики лечения в ранние сроки, до развития необратимых системных осложнений.