Автореферат и диссертация по медицине (14.00.03) на тему:Роль структурно-функциональных изменений мембран эритроцитов в механизмах развития ангиопатии у больных инсулинзависимым сахарным диабетом и их фармакологическая коррекция

б од

^ 1 ЬМ шз •

На правах рукописи 9дк 616,??9-008.64:616.155.1:616.18-092

ТОЙИЛОВЯ Елена Николаевна

РОЛЬ структурно-фувдиогнальш йзненений йембрйн ЭРИТРОЦИТОВ в механизмах развития йнгиоший а вольных иншиизшсиш сахирш лиабетон и нх

ФЙРЙЙКОЛОГЙЧЕСКЙЯ КОРРЕКЦИЯ

14.00.03. - эндокринология 14.00.16. - патологическая йизиология

Автореферат

диссертации на сонгканив ученой степени кандидата медицинских начк

Москва - 1933

Работа выполнена в Российской Медицинской Академии Последипломного образования МЗМП РФ

Научные руководители: , . доктор медицинских наук, члвн-иорр. РАМН, профессор А.А.Кцбатиев

доктор медицинских наук, профессор М.И.Балаболкнн

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Н.Т.Старкова доктор медицинских наук, профессор Б.В.Долгов

Ведущая организация - Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф.Владимирского

Зацита состоится 'Л^ 1996 г, в

часов на заседании диссертационного Совета К.074.04.03 при Российской Медицинской Академии последипломного образования КЗМП РФ (123836. Москва .ул.Баррикадная.2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РМАПО

автореферат разослан "1996 г.

Ичений секретарь .

Диссертационного совета кандидат медицинских яаук.

профессор А.Б.Окулов

05КЯЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЯБОЙ!

Актуальность проблемы. Заболеваемости инсуливзависимим сахарным диайетом составляет 202 от обцей заболеваемости СД. Однако, эта форма заболевания имеет высокуп со'цнальнуо значимость, поскольку оазвива-ется у лиц молодого возраста, а многочисланньв осложнения, осо-(5екно, сосудистне поражают больны» в наиболее.активном периоде зизни. вазнеая васокув инвалидкзацив и смертность.

Однако, современная медицина ке располагает эффективными методами профилактики • и лечения диабетических сосудистых ослоанений. Остается спорнан дсстикени* компенсации диабета как единственного пути предупреждения сосудистых поражений. Одна из главных .причин теропеатической Яесионокности - недостаточное знание механизмов р«вигия акгиоиатий. Это определяет необходимость дальнейшего изучения патогенез! сосудистых ослсянений у больных сахарный диабеток с цель» Йолзе полной • и точной расаифровки яго славных хгханизаое к обоснования ноькх аспектов комплексной терапии и профилактики диабетической аи-гиопатия. ■ •

На современной этапе развития представлений о патогенезе сосудистых осложнений при_ СД весьма перспективным становится подход с позиция иемйранологии. Показано, что лвбе-й патологический процесс сопряаеи со структурной деферкацийй клеточннх ниабран, более того, не сасествдет едикциоядеьмах кзивкеняй,' которое не сопрозоядались бы глрцктцрпоЯ ягресгро^шЗ '.'.¡видного бясдоя илеточяпж игкбрзи {Б'.екресеясхгя 0.1!., _ 1054. !Ыа1а • С.. Шпс» Р.. 1292). .

К чисдц ВОЗМ01НЫХ механизмов, вызывавших деставилизацкв клеточных ненбран иогвт бить стнесени: избыточнаа активность процессов пврекисного окисления лнпидов, изменениям снстсио антиоксидантиой защиты метки, повыгенив активности эйдогевкых фссфояаиаэ, нарц^енн« .в снсгвиэ зонного транспорта чврв? йлЬз-ватчЧескув иеибрану ч др. (За1п 5.К., 1989. Не 1.1. 1990. Сагг 8.. 1990), ;.'

Все это говорит в пользу высокой значимости цглублеииого мсследосания структурно-функциональной дезорганизации' клеточ-нцк нембран как ванного звона в механизме реализации изменений сосудистой стенки при СД. Следовательна, исследования, напраз-лошшо иа изучение ыаханйзыов развития аембраиной патологии клеток крови и эритроцитов, как клв>ик с гысокой функциональной нагрузкой. Сияят способствовать формирование болов элективного подхода к вопрос!) лечения и профилактики диабетической ангнопатнн. .

Цель работы. Изучить норфо-фаикционадьное состояние иеыбран «ритроиитов у бодьйах ИЗСД в зависимости от наличиа сосудистых осдрэнеииа, вида диабетической Гнкроаи11}1отак£Г4ШМаа отаго-наследственности по СД. Определить характер изменения ^ОЦЦ'Ч./'£!>{шк характеристик эритроцитов иаблэдаения групп вол^к^/о" ?">цессе терапия пропаратаи» инсулина человека и иа падуче "'чих даннах обосновать вффектшшость и? цспользо-в^р. .^дла ш^рекциа выявлзвивх варуаенвй. ' . *

Задачи «сслидйван'лз. . «

1. С посацьа растровой электронной шгаросиопин дать вор' '¿з&изгхаасидо Еараитеркстику сратровдтоа больше ЦЗСД с резинки

видами сосудистмх ослскнений

2. Изучить интенсивность свободио-радикального окисления липидов и активность ферментов антионсидантной защиты я .эритроцитах больных ИЭСД в процессе терапии рвкомбйнантйыми кнсу-яинаии

3. Иэцчигь кэиеяеЙКа транспорта коиоо через плазматические явйбраиу эритроцитов наблвдаекнх групп Аояьнык в процессе терапии ренонСинаитннми ичсилинаки

4. Выявить нзибслае информативны» критерии нэруиения аор-фо-функцноналытго состояния иоабран зритроцитов ц обследувних групп больних.

5. Оценить эффективность использования препаратов миелина человека и больиич НЗСД

Научная норизна.

1. Впсрвие произведен датальиай аналил ц&уфа -фцчкциональ-ногр состояния нвнйран ?ритроцитов а балъннх H5i.fi с разными садани сосудистшг оелгянеиий с цчетоя тйпести я дяптолькост.Ч зпболэваниа, наследственной прецрасполове.чности к ИЗСД

2. Определена интенсивность езобеднррад'ишччюгэ ..каелв-ния иоубратшх лмлилов, состеяняо снстени йктноисвдз.'шюй яз-нити эритроцита. спстса исного .троиспо^га чзроэ шчмгишатп« чаекдя мембрана метя, Вюгелешше иарцзения Фрнциомалмюй ектиапосг» эратроютоэ у вабдадаемвх бояъкнх ИЭГ.Д рвссьотпя с г.оз«к:гл кяятРкчкоЗ веыбрзнохогяп ■

3. Онапиеиа тонная соязь «эяду с^поствовашез сосудистой патоаопш у болышя НЗСД я ковго-здаздодшьлнн• свстолшвв

I •

эр;1троц:;тоз. врнчга вотозаял,,. чта яг-рангер изчевеяий лоелвдиах

Н3йд!103!1343!1 и СЗЭг.'сят 07 скзд доабстпчзсвсо ¿пгползтия .

• . • ■ ' _ 4 - • ' '

4. Показано влияние препаратов инсулина человека на измененные функциональные характеристики .кеибран* эритроцитов, а такав благоприятный клинический эффект использовании бносий-твтических иисулинсв у наблвдаекых больных ИЗСД

Полевении, виносниые на защиту,

У бодьнин ИЗСД одной из ведущих причин гевореодогическик расстройств является структурно-Функциональная дезор! аиизацно клеточных «енбрак эритроцитов вследствие патологической активации процессов, свободнорадикального окисления липидов и сва-зечких с нами изменений в функционировании систем конного транспорта через цитоплазиатнческув иеибрану,

Выравьнность струнгурно-фунициональкых' нарушений клеточная иеибран эритроцитов коррелирует с наличием никрс^нгнопа-тий, виаои иикроангиопагий, степенью компенсации ИЗСД, наличием наследственной предраслологенности к ИЗСД;

Пилучениие даннае с влиянии препаратов инсулина человека на изиенвнные функциональные характеристики меибран зритроци-. тов больных ИЗСД обосновывает использование биосинтетичэския ННСЦДИН08 нр. только для улучязния показателей состояния дглс-водного"обмена, но и для коррекции внавленнях функциональных нарциеиий меибран зритроцитов.

Ярактичаская значиность.

1. Показана кяиничаская эначниость выявленных нзиенеш.З функциональная характеристик арнтроцитов больных с микроангно-папшм в. ртне оценки тявестн заболевания, лечебной тактика и прогноза -

2. Обоснована »ффоктивность использования препаратов

инсулина человека для коррекции вмявлэннчх функциональных на-

рувений эритроцитов, для нормализации показателей состояния

углеводного обмена а больных ЙЗСД

л* + : . .

3, Степень открвтия Са-активируеми И-каналоз и скорость

функционирования На/Н обиенника могут быть использован« для оценки функционального состояния почек и сердечно-сосудистой системы v больных ЙЗСД . Апробация работа.

Материалы работы даловенн на со»и«стноа заседании кафедра обчей патологии и патофизиологии Российской «вдицинсной Рягде-ййя •Последипломного .Образования (эаэ. кафедрой члеи-корр, РййН. про®." Куватиев Л. О;) л кафедры эндокринологии Факультета усовериенствованяя врачей Ш и». И.Н. Сеченова (зав. кафедрой проф. Балаболкин В.И.) (21.12.95.)

Публикации.

По т^не диссертаций опубяикоаано 5 научна« статей в Цент- . ралькик зурнллах. . • .

Стриктура и ебьем диссертация, ,. . •

Диссертация состоит из введения, обзора литератури. глаз, ' посвящеиних яарактеркепшв обследованная Солъг-чх,' .«етодеэ исследования, загшзчэная', еыоодоз в списка литературы. Виб-ш-ограсичсскнй дквзатвяь кмвчаат омчветтшх и за* -рцбеаных источников. Работа 'иэлоя&и-а на страницах кашшо-, - . пясного тийста, оз потсрия основной текст зояикя&т ... 'сгрсь. ниц. Диссзртоцяя пягпстрирезака 'твблкггчярисpinci,'.

- в -

МАТЕРЯМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Нами была обследовано 63 больных НЭСД (из них ыувчин - 36, ионзин - 32), поступиввш: с эндокринологическое отделение 67 ГКБ н неправленних для консультации на кафедру ендокринологии ФИВ к'йй и». И,Й.Сеченова иэ московских городских поликлиник.

Диагноз ИЗСД устанавливали по совокупности данных анамнеза, клинических проявлений, результатов лабораторных исследований.

Ё работе испия^аов^ня классификация сахарного диабета Комитета вкспертзв ВОЗ (1965) и отечественная клиническая классификация, принятая на пленуме Всесогазкого научного общества знаокркнологоа (Дагомыс. 1331).

В гриппу исследования входили пациенты от 16 до 43 лет. Средние воерепт обслйдуемых пациентов составил 32,9 года. Длительность ЙЗСД у наблюдаемых больных колебалась от 9 месяцев до 25 лет. Сахарный диабет тяшелой. формы диагносциро-эан и И больных, средней степени тяаести - у 49. Диабетические сосудистые ослзянениа были выявлены у 38 (55,9%) чело-зон (диабетическая нефропатия •- у 16. диабетическая ретинопатия - у 20) Из всех обследованных и иаблвдвемих наыи больных 23 человек1(36,8Х) иыеди отягощенную наследственность по са-гарноку диабету,.

Оолышэ с сопутствувщей вндокрннной патологией, а такие с тяаеякыи сопцтстоувщиыи заболеваниями печени,"почек, легких обследование не подвергались.

Спектр сопцтст»увких заболеваний: 8 человек (П.бК) имели гипертоническую болезнь, 3 человек (?,Ш - ИБС, 5 человек (7.42) - хронический холецистит, б человек (8,82) - эаболева-вдя гастродуоденальиой зону.

- ? -

До перевода на биосинтетичэские инсулина больнее использовали препараты «H0otH"ro происхоядення. Среднесуточная доза инсулина у больных без сосудистых ослоянений составляла 0,80+0,04 ед/кг веса, у больных с диабетически»« ангиопатия-" ии 0,(30+0.06 ед/кг паса. Набладаеиые больные бш;и переведены на двухкратный реаим ннсулкногврапии с использзванкеы биосин-тэтичесниг. инсулкнов: 40 человек использовали комбинаций Hirtulln 5 к Huiultn Lone, 20 человек - профильный инсулин КЗ.

Вс«к бо/ьчым проводили стпнвартное клиническое и лабораторное обследование, внлвчавяве ой«ий анализ крови, обший анализ иочи, ЗКГ, рентгсногрлфив грудной клетки, биохимическое исследование крови, исследование глазного дна. УЗИ брлвной полости й почек. Функциональное' состояние почек у наблюдаемых Сольных уточняли на основании анализа иочйвгто осадка, проба Зиынкцкога, определения няубочкогой фильтрации по зндогеиноку иреатинину, величины хроагинемии, уровня иочевин» s ярови, суточной протеинурии. По показаниям проводилось рентгенологическое и радиоиэотопное исследование почек.

В соответствии с щльп и задачаки исследования, a гакве для удобства излоаения получении дакинх мы сначала рас яатря-вали группу больных в целом., эатва в завкснносш оу наличка, или отсутствия сосудистых омовиекий, вида иякровнгиопатий й наличия отягощенной наследствёикестн по сахариову янабвт».

Эффективность терапия пргпаратаии онсианна чвйоеека оценивали через 2.6,12 недель иисулкнотераПиа.

Содераанив глвкоэа в 5еноэной кровя определяли гяггкозо-оксидантныв аетодон.

Для определения ypostia г.,ккозилнрованного гемоглобина -Hbftlc использовали нвгод »кегйс.еойяой коЛвяо njofi крема гетрами»

-OR- •

с помоцьв набора SloTard (Германия).'

Полученние данные сравнивали с результатами контрольной груплы. В качестве контрольной группы било обследовано 15' практически здоровых добровольцев в возрасте 25-46 лет (10 мувчнн л 9 лбнции) беа отягощенной ло »ндокринйой патологии наследственности и без карц«вннй углеводного обмена, с нормальной массой' тело.

В настоящей работе для биохимических исследований использовалась суспензия отмытих эритроцитов (СОЭ).

■ Изучение морфологии эритроцитов проводилось методом раст-

ровой злектронной микроскопии с использованием электронного . микроскопа JSH-35C при увеличении 3.200. Исследования проводи-< лись совместно с сотрудниками лаборатории латонорфологии ИНИН ^ туи^куявза РГЧН под руководством д.м.н. Л.К.Филиппенко. i Интенсивность свободнорядикального окисления липидов мембран »ритроцитов определяли по уровни малонового диальдегида . (МДй) в гемолизате эритроцитов. Определение проводили спектро- . флуорииетрически* аетодом на спектрофлуориметре "Hltachl-1000". Метод основан на измерении флюоресценции ТБК-активных продуктов (взаимодействующих в кислой сред» пр»5 нагревании с тйобар-битуровой кис^птрй - ТЕК) в.бутанодовом слое; npw длине волнв-еоэбужденив разной . 913 ни к длине флуоресценции 533 ни- (Yèg$ К.А. 1976). Уровень НДй расчитывали в нмоль на мг белка (Loury-О.Н. et al.. 1931). 1

Активность с«пороксиддиснутаэи (СОД) измеряли в осветлен"-^ . Нри от гомоглобина геиолизате эритроцитов, используя фврыект-яавмсимОб иигибнрованиа "адреналин-адрвнохромового превращения.' - <Брусов 0.С, 1970). Осаждение гемоглобина проводили смесь» -зтаяола с хлороформом по Туви-Xaix (Thughi-Hushl 1923). Изие-

рения проводили на спектрофотометре "Becksan СИ-50" (С@Й).

Активность каталззи ШТ) определяли при 240 нм по скорости изменения поглощениям H ûg, которуя использовали в качестве субстрата ферментативной реакции (flebi G. 1970).

Активность глутатионпероксидазн (П1) опродоляли по Ö.E.Pagila. U.U. Valentine Г190?) в воднфннацин L.Flohe (1070) с перекисью водорода. Метод основан на измерении степени падения оптической плотности при 540 нх в реяиме непрерывной регистрации в течение 1-2 минут.

* +

Скорость функционирования йа/Н обиенникя определяли по методу < H.Escobales, i3Оß> в модификации С.II.Орлова ( 1903) с j 'мльэозакиен ингибитора скорости внхода протона.в эритроцитам - ймилорида. В работе использовался 500 иИ раствор анмо-рида (конечная концентрация i кМ). Кинетику онсвобойдения протонов регестрирооали на pii-иатре рНМ-54 ("RadloEeUn". Дания)

f- +

с злекгродем 91-15 ("Orion", Cl fi ?, Скорость Ma/h' ойнина определяли как разницу скорости ягнения pH среди, соответственно содеряацей и несодервацей .¡я.

л+ . +

. йембренннй потенциал и активность Са-актийируеыыя- К-кака-

лов определяли рН-иетричвскин . ийтодом С8.Ueste-"gaard-".i0ind

1987) с использование« рН-аетра р1Ш-04 ("Radlonetep"; Дания) с

электродом 91-15 ("Orion". . Cüft), В работе использовались: 2üii

протонофор £ 1 ССР (.чарбснил цианид а-хлоро^ииил-гндрйэон) fictif

печная концентрация 20ни'4 и 100 нк8 Са-ионофор ft23lù? {кокпч-нот концентрация 0,3 йкИ). Нотод основан не памаивмш клеточной pH и менбраниого потенциала сцслензии эритрящггов за счет

А+

иэноиопия содервання ионов Ca ь среда яййВбацгА кз.^оча добаз-

i Л*

леиия пратонофара Cl ССР и Са-ко.Чофора ¡123Ш.

Рассчитала сяедиигяие похазатегл: зилчйияз яенбршшго.

; - 10 - ' потенциала до стимуляции входядего потока кальция (Ем), значение мембранного потенциала, соответствуете максимальному

f-

цровнп гнперполяризации мембраны и открытии Са-зависимых К-ка-

калов (El), значение мембранного потенциала, соответствумщее

+

реполяризации мембраны.и дезактивации К-каналов (Е2). Процент открытка каналов определялся как Е1/Е2 х 100%,

Расчет н статнсткческуя обработку Полученных экспериментальных данных проводили методом вариационной статистики с нслольэоэаинем критерия достоверности Стьюдента с последмвцнм графическим построением на персональном компьютере с ломоцьв пакета сервисных программ. Изменение величины оценивали как > достоверное при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуядеиие; 1. Уровень МДй и состояние АО-закнты эритроцитов. . 9 наблюдаемых больных исходные показатели баэальнсй глмка-вми м уровня Hbftlc достоверно предавали контрольные значения» Однако, уае на 0-й неделе инсулинотвраплк иаблвдала'сь нормализация гликеиических показателей у вс»х больных.

Дцтенснвнссть ПО/i б мембранах эритроцитов больнях НЭСД

' Тйкаеовла достоверно выеа контрольных значений: уровень УДй

т-'

, яеибрен эритроцитов больных НЗСЯ превывал данный показатель у доноров на 1302 (рис..1ft). Б процессе лечение препаратами инсу-человека, начиная с 3-й недели, наблюдалось . с.:и1ение КДЙ. и stot показатель ПОЛ прэвыиал контрольный .уровень но fit , а на 12-й неделе тэралии он на отличался о,т крщрряя и С:, достоверно нине своего исходного значения (рисЛЙ). Нро-'^Зст ЧДй .1) больнык с ангиопитиями ив отличался от йтого пока-«адем ч■ 6f чьных без ангиопатий, й обеих группа;; наблйдйяось нрони? ууогня Mfi е иекбранах еритроцитов в процессе лочо-

Уровень 1ЛДА /имоль на 1' мг болта/ в мембранах гритроцитов больдах И^СД в процессе лечения биоинсулинамн.

Рис. 1

/ х

£3 Ш5* . ГЭ ♦ ••л«» ЕЗ ¡г

К -. контроль ' •

А больные ИЗСД / группе в,целом / В - больнке ИЗСД с ангнопатипии П •'.болыпю КЗСД сез аигислатий х - различия достоверки но егавтт.ю о кснтг»лпм

«-р<0,05 х х*р<о,оат _ '

о - различия достслерни по сравнения и урэтн'-м до начала лечения" <3-Р"<0,е5 оо-р<0,00Г

Д- различия дсстсверта» I р^О ,65 / нетду Сслыдаыя с ангиопатаямя и без татезъ-х

- И _

н;)я. хотя ц болышх с ангиопатияни да»е на 12-й неделе терапии этот показатель оставался вике контрольного на 47У. (рис. 1БJ. У больных Ces сосудистых ослошнений к 12-й неделе терспии концентрация ИЛА в эритроцитах соответствовала контрольно*!} уровня и достоверно отличалась от уровня ЫДй в эритроцитах больных с ангиопатмамй (рисЛВ). Достоверных различий в уровне ИДЯ в зависимости от айда диабетической ангнопатии получено не было.

Таким образом. результаты нашего исследования совпадаит с ■¿цвода.'.1К ряда авторов (Sato Y. et al. 1379, 3aln S.К. 1984, Freyinireer £.. et al. 1989), что MÍA и другие промежуточные продукты ПОЛ способна инициировать. формирование сосудистых оезомвениа при СД. Предполагают, что активация процессов ПОЛ и хонформаиишжк3 изменения мембраны*- эритроцитов при диабете связаны с образование«! гидроксильного анион-радикала при автоокислении глюкозы (Hunt 3.U. et al. 1Sfl8). Однако, учитывая результаты натго исследования, ыокно предлоловить, что си-п»рглилемня - ко единственный Фактор, способствующий активации ■ ПОЛ при СД. У набладаемых больных инсулин еызызал нормализацию * показателей состояния углеводного обмена, и изменение уровня МДй g эритроцитах. но у больных ИЗСД с ангиопатиями норкализа-' ия глиптического профиля не сопровождалась восстановлением !1с^аматроа ПОЛ.. Известно, что у бальных СД с ангиопатиями Солее вырамены гиперлипопрстеинемия, гииерхолестеринеыия, повы-в»ио содержание НЭ8К л триглицеридов. В условиях избыточного содержания продуктов ИОЛ в плазме возможно образование окисленных прощктоэ холвиерина, модифицированных молекул йПНП, увеличение доли ненасыщенных жирных кислот, что приводит к стловеннв этих продуктов в сосудистой стенке, компенсаторному усилена образования пероксисоы в зндотелиальных клетках.

- 12 - 4 усиления В-окисленпя вирник кислот в пвронсисомах (ГеЬегЗ. Н а!.. 1985). Это, в своя очервщ, сопревоямвгся образование* большого количества свободных радикалов, их избыток приводит К ловрезденип сосудистой стенки, выходу свободных радикалов в ' плазму и прооксидантному Действия на клетки кроки: эритроциты и тромбоциты. Кроме тпгв, окйсйеннке. модифицированные иолеку-лы липопротеидов (в частности. ЛПНП и ЛИОНА), легче фагоцитируется макрофагами, фагицЯтоз сопровоядавте« "респираторный взрывом' и генерацией свибодных радикалов. Вероятно, у больны» ИЗСД с онгиопатиямн при лечении рекомйинантниии инсулинанк в течение 12 недель. несмотря на компенсация углеводного обмена, сохраняйте» прооксидантнкв воздействия, прелягст^уивиз полной нормализации процессов ПС/1 в Иеибраня эритроцитов.

Ввиду противоречивости- Данных литя[/атури о состоянии ЙО-эациты эритроцитов больных ИЗСД (Наа1оГ В. «I. а1. 1983, ига 1 й. 190?, Нз1коч1ся 0. е1 а1, 1985). мы евчлк интервент» оценить активность Фври»нтог ЙО-вачиты у набдкциекь'х Сольны*. Результаты собственных йсслвдовавкй показали, что активность Фериентов ЙО-эакиты эритроцитов больных ЙЗСД догтовернэ не отличается от контрольных Данных. Однако, пос^К 12 ^дель. использования препаратов ' инсулина человека .активность всех исследуемых Фериенгов достоверно менялась. Активность катадазм повивалась ка (о<0,05):Ис отношение к контроля, активнастЬ. СОД снихалась на 352 (р<0.91) н ГП - на Ш *р<0,001К Ч больных ИЗСД с ангиопатияии н сосудисты* осдоакений ¿втивнисть фериентов ао-закити достоверно не различалась. 8 . процессе ; ийсулинотерапин наблидалась вдйнакзвая дййамяяа..акггшя!?ети ферментов,, в обеих группах Зойыыя. Активность каталазы в зрит--роцитах больных ИЗСД с алгнопагиянл на Л2-А неделя -«бчшгаа .

составляла 153£ (р<0,05)от контрольного значения, у больных, без ангиипатий наблвдалось незначительное недостоверное повы-аенке активности наталазк. Снижение активности ССД к ГП носило одноьаправлгнный характер в обеих группах и составляло 63Х

(р<0,05) активности СОД, 34Х (р<0.001) активности ГП у больных

/

с ингиопатиями и 572 Ср<0.05) и Збг. (р<0.001) соответственно у больных без сосудистих осложнений.

Известно, что транспортная система глвкозы в эритроцитах активна при "окисленном" состоянии плазматической мембраны. В . -литературе высказано предпояояэиие, что окисление 5Н-групп до диильфиаа в белках плазматической мембраны мовет быть важным тон в механизме действия инсулина, когда инсулинчувстви-, темная ШЭДФ-дегидрогеиаза, генерирувжая' НдОл. мовет бить ' использована в качестве трансдуктора гормонального сигнала (11ав«агва Т.. 1332). Вызванная гормоном генерация перекиси может индуцировать компенсаторное увеличение активнссти ката, лазы. для которой ({¿0; является субстратом. Снимение активности ГП на 12-й неделе приема инсулина по сравнении с исходным уровнем ыомет бить связано с нарастанием концентрации Иг0х в клетке . (ГП эффективна только при низких концентрациях НдО^ ), с повымвнной активность« каталазм н (или) снижением в эрит-ропитах больниц СД уровня восстановленного глутатиона (Цге! б., е1 а!.. 198?), который необходим для функционирования ГП. Больяие концентрации Н^О/. подавляют активность СОД (РвЬег 3., а1., 1985). Возмояно, это является причиной снижения активности СОД в эритроцитах больных СД в процессе лечения рекомби-н&нгнымн инсулинами. Кроме того, у пациентов с СД наблвдабтся

относительная гипоцмнкемиа и гиперцинкурня (Нг»в1оГ Ь., 1983),

¿+ А*

что мовет привести к уменыенив синтеза Си, гп-СОД цитозоля

вритроцитов. так как Zn является компонентом, стабилизирующим молекулу фермента.

Таким образом, результат« намего исследования fiO-завитн эритроцитов больных ИЗСД такяе говорят в пользу того, что больший урсзень ПОЛ в мембране зритроцитов больных с микрсан-гиопатиями вызван не дефектом в А0-за«кте эритроцита, а боль-, ■ими проокскдантными влияниями, характерными дяя. течения СД с сосудистыми осяохненияии.

2. Na/H противотранспорт. ^

Согласно рездльтатам наиего исследования,- скорость Na/H обмена у больных ИЗСД достоверно не отличалось от контрольного

показателя. Такяе не было найдено достоверных различий ско-f ♦

рости На/Н обнена в.группах Зольных с микроангиопатияии и без микроангиопатий как мехду собой, так и по отношение к контролю. Терапия препаратами инсулина человека не вызывала досто-еернмх изменений скорости обмена у данных больных. Однако, скорость На/Н противотранспорта в эритроцитах больных с нефро-патией достоверно превывала контрольные значения на 23% (р<0.05) и на 302 tр<0.05) показатели скорости на/Н обмена и больных с ретинопатией (рис. 2). Подобные достоверные различия отмечались на протженни всего периода наблвдения и терапии, превыаая на 12-й неделе аналогичный контрольный показатель на 592 (р<0.05), показатель у больных с ретинопатией на 27И (р<0,05).

+ +

Выявленные нами изменения скорости Na/H обмена у*больных с

нейропатней подтэеркдавт точку зрения ряда авторов (Uibertl &. •

■ *■ * t

1983. He l- et ah,1390) об увеличении Ha/Li и Na/H лротиэо-транспорта в эритроцитах больных ИЗСД с неиропатией по сравнение. с эритроцитами больных ИЗСД без невропатии или у больных с

Скорость //a/H обмена' в рригроштах болькях ИЗСД с ие^ро- и р^инопатией

пачечной патологией без диабета. По аналогии с первичной гипер-

+ +

тёнзией, где ускорение На/Н обмена служит' маркером заболевания. бнла предложена гипотеза наследственной предрасположенности -к развитии нефропатии у больных ИЗСД. у которых имеет место нарьаение в структуре или экспрессии гена Na/H обненника (Kroleuski fi.S... et al. 1988, Trevisan R,, 1992). Однако, зта

гипотеза принимается не всеми (Soussan К., 13S2). Результаты

+ +

нашего исследования также указывавт и на то, что скорость .Ча/Н обмена ' в эритроцитах больных с отягощенным анамнезем по СЛ достоверно прееыиает показатель контроля на 69Z <р<0.05) и на 85Ü Ср<0.05) аналогичный показатель больных без отягощенной наследственности по СД. оставаясь пониженной на протянении всаго периода наблюдения (рис.3). Исходя из пелучеиннх результатов. нельзя однозначно определить механизм увеличения скорости Na/H обмена у наблюдаемых групп больных. Согласно современным представлениям, возмовно существование трех механизмов:

+ +

1. Транэиторное' усиление активности На/К обмена в результате

недлительной активации мембранносвязанной протеинкиназы С

+ +

(РКС) за счет РКС-опосредованного фосфорилирования Na/K обмен-ника (Hörle S. 1992). Более продолжительная активация РКС вызывает .хроническое увеличение Na/H обмена, что загисит от процессов транскрипции и трансляции. 2, Изменение структурного состояния мембраны. Показана взаимосвязь между составом липи-дов мембраны эритроцитов, плазмы и трансмекбраннкы транспортером (Carr S. , 1990), в частности, установлено наличие обратной

связи между содержанием холестерина, фосфолипидов, свободных

+ +

вирных кислот в мембране эритроцита н На/Н противотранспортом

f +•

( аналогичная корреляция установлена для На.К - йГФаэы) и наличие положительной корреляции ыемду уровнем триглицеридов

+ +

ШЫпгттятитвтопп K^miaommmuußRsmm-даняив о содержании холестерина, отнэаенив ШФЛ {наиболее-адекватный параметр, отрававзий нембранну» текнчесть) противоречива, нельзя убедительно утверядатъ,'что найденное нави уве-

г *

личение Ка/Н сбйена в эритроцитах вовет бнть связано со синае-'* mm« содервання холестерина и -KiI/ФЙ отиовения, тс-м более, что . больвинстоо исследований показало увеличение содержаний холестерина и огношанм ЗСЛ/ФЛ . в некбране эритроцитов больная ' ИЗСД (Hatala С.1993), Не исключено, что значительная разброс индевидуалышх значений. На/Н обмена о эритроцитах больных ИЗСД ноеет 6йть связан с раздичнив содзрааниеи лмпадов плазнн н мембран» гритроцмтов ö разных больнах. 3. Увеличение содержа- ■ имя йолвкуя переносчика на единииа плочади кекбрами. Длителъ-пая активация Иа/Н обмена вызывает цвеличенне экспрессии транспортера (Horir? S. st a]., Î992). Плохой гдиквйичоский контроль, длительно, действчвщая гнпергликения, дискония к де-« гидратация эритроцита (Lue T.S. .1985 ) иогцт бить причиной хронической актиэации РКС, что - приводит к усиление процессов

»

транскрипции и трансляции ДНК, к- образование »îobux kwibköä

I

транспортера. .

Однако, показано, что активность Na/ll обме-иа п лейкоцитах

больивх ИЗСД с иефропатиея увеличена независимо^от глкпеким и

артериального давления. Результаты наших исследования гакяе не

t- +

выявил» корреляции иевдй fia/И ойаеиоа к уровнем гдйкекии. Тайна обрдзеа. не «aas убедитеяьннх доказательств с пользу нару-

i +

вейка » структуре ил» экспрессии гена iia/îl обвенкика" s грдпнв

больных с невропатией, и» не зовое объяснить г.овазет:е с«о-+ +

рости На/Н оОиена у наблвдаекнх йодьшх только плохи» шшиш~ ческии контроле* или иаличиеи а них, к« кг родителей повиавк-

ного артериального давления. Вероятно, изменение скорости Na/H обмена в эритроцитах различных групп больных ИЗСД полиэтиоло-гично: нельзя исключить возможность наличия дефекта в гене транспортера, нельзя не учитывать влияния состава липидов плазмы н мембраны эритроцитов на На/Н противотранспорт при ИЗСД.

Л* +

3. Са-активируемые К-каналы.

К числу других ион-транспортиружцих систем, обеспечивавших нормальное функционирование красных клеток крови и изме-

*

-ненной при ИЗСД. относится система Са-активируемих К-каналов. Порученные данные указывает на изменение проницаемости мембра-

4-

ны эритроцитов для ионов К. Обнаружено незначительное (на

182), но достоверное изменение мембранного потенциала

л* ■ +

(р<0.001) и процента открытие Са-активируеиых K-каналов (на

14%, р<0,05) эритроцитов больных ИЗСД по сравнению с эритроцитами здоровых доноров (рис.4). Не выявлено достоверных различий данных показателей в эритроцитах больных ИЗСД в зависимости от наличия или отсутствия сосудистых осложнений, отягощенной наследственности по СД. Инсулинотерапия вызывала снижение мембранного потенциала эритроцитов до контрольных значений

уве через 2 недели применения бипинсулина, но из влияла на

J.+ +

процент открытия Са-актнвйруежых K-каналов (рис.4). Степень

гиперполяриэации мембрана у больных с разными видами сосудистых ослоинений была практически одинаковой, однако, процент . открытия К-каналрв у больных с нвфропатией был достоверно визе . (,р<0,001), чем у'больных с ретинопатией, где этот показатель ,не .отличался от контрольных значений (ркс.З). Кнсулиногерапия эффективно сниаала вембрвнний' потенциал в обеих группах, но м влияла на степень открытия Са-актнаируаных К-каналов (рнс.З).

Рисунок 4.

Изменение мембранного потенциала вритроцитов больных ИЗСД ва фоне иисулинотералии

Л* +

Изменение степени открытия Са-актнвируевдх К-каналов

мембран эритроцитов больных ИЗСД на фоне инсулинотерапии

В

иог

—1

.л

, .

к - р<£0,05

«к - р<0,00х по сравнению-с контрольными значениями •

Рисунок 5,

и* ' . +

Процент открытия Са-ахтиаируемых К-каналов мембран эритроцитов больных ИЗСД с иефро- и ретинопатией в процессе лечения биоинсулинаш

% открытия К кана/юв 120 -

110 -

70 -

60 -1-1-1-1-

О 2 б .12 ■ -

недели инсулинотерапии

х * прцент открытия К-каналов больных о нефропатией

Д - процент открытия К-ханалов больных с ретинопатией . '

* - р-г.0,05 хх-р.<0,€Хк по сравнению ' с контролем

о - по сравнению с соответствующим показателем в эритроцитах' боль них с иефропатией .р ¿.0,05

Известно, что з эритроцитах Человека проницаемость мембра- . г

иы для ионов К-осуществляется Са-зависимым белком-регулятором кальмодулином. Увеличение- внутриклеточной концентрации свобсд-ного ¿"СаЗприводит к гиперполяризации мембрана за счет увеяиче-нпя ее К-проводимости (Орлов С.Н.. 1583). Выход Са из эритроцитов осуществляется за счет .работы Са-ЙТФазм'(Покудин Н.И., 1906), активность которой при СД в эритроцитах снимэна (йейсИ й.Б., 1992. Зспа'еГег и. 138?). Следовательно, наиболее вероятной причиной кальциевой перегрузки эритроцитов больных ИКД

л+

когат Лить снияение эффечти&ности работ Са-иаг.оса г.лаэмати-ческий иехоранн. Повниеиие внугринлеточного/Са^-сппрововдается иэменнииех целого ряда мембранпгеазаннмх функций: открытие« Са- активируемых К-каналов, гнперполяризацией меыбраны, инги-бироважем На-наЬоса. нарушением состояния белков. образующих -

у

цитоскеявт мембраны и изменением морфологии эритрицита (!1оку-дии Н.Й., 1986). Действительно, результаты настоящего исследования выявили существенные нарушения морфологии эритроцитов в виде появления в кровотоке Сольного количества измененных Форм эритроцитов в виде зхиноцитоз,' стоматоцитов, разА»чи*х сфероп-ластов и сокращение* числа нормальных дискоцитов до аОХ у больних НЗСД с неослоаненным течением ИЗСД и до 432 у больных с сосцдистими ослохнениями. Причем, у больны* с диабетической невропатией сферолластн были наиболее представленной формой (до {'?Х клеток). У больных с ретинопатией и. особенно, с про-лиферативной стадией наблюдалась избыточная агрегация эритроцитов сформированием кршшьх скоплений, в том числе по типу "монетных столбиков". Появление больирго количества измененных, функционально нгполноцекких клеток обусловлено, прежде' всего, .нарушением лиг,идк.лч спектра кембран в'виде накопления

триглицёридов. изменение« соотноиения Xfl/ФЛ, а также активацией процессов ПО/1. Структурно-функциональные перестройки био-мембраиы способствуют нарушения клеточного метаболизма, сниве-нио деформабелькости эритроцитов и усилении их адгезивности и агрегации, что особенно вираяено у больных ИЗСД с ангиопатия-ми. Активация процессов ПОЙ, в свои очередь, приводит к нару-венига функций митохондрий, дестабилизирует лизосомальные мембраны , способствует поврезденив клеточных неыбран. ингибирует способность эндотелия кровеносных капилляров синтезировать простациклин (Hall R. et ab 1987). вызывая наруаение взаиио-отновений неаду эндогелиальной выстилкой кровеносных капилляров, плазмой и форменными элементами крови. Таким образом, изменения физико-химических свойств эритроцитарной мембраны приводят не только к псвыиениа "жесткости'1 эритроцитов, уиеньао-нив их деформабельности, нарувенив скорости кровотока, но и к повреждению эндотелия кровеносных капилляров, способствуя формировании сосудистых осложнений.

Результаты проведенного исследования также выявили и уво-л* +

личскиэ процгага. открйтия Са-активкруемнх K-каналов и гиперпо-

ляризацио иенбраны эритроцитов больных ИЗСД. Выявленные разлила

чия в степени открытия Са-активируемых К-каналов эритроцитов

больных с нефро- и ретинопатией говорят в пользу возможной

f V-

связи К транспорта с Na/K обменов, который такае усилен а

эритроцитах больных СД с иефропатией, по сравнение с.эритроцитами больных с ретинопатией. В клетках,' гдо Функционирует t

система На/Са обмена такув взаимосвязь иоино объяснить за счет •»■ +

усиленна Na/H обмена, увеличения концентрации внутриклеточного + f ¿f-На и активации Na/Ca обмц;*, в результате чего поддервивается

повыввнное содераание/СаЗм увеличение степени открытия Са-ак-

тивируемых К-каналов. Однако, по данным Орлова С.Н. в эрйтро-

* л+

цитах человека отсутствуют системы Ка/Са.обмена и внутрикле-Л+

точных Са-транспортирувчих структур. Возможно, эритроцитах больных СД с нефропатией выве, чем у больных с ретинопатией . Бсльвяй уровень /Са^ вызывает больвий процент открытия Са-активи'руемкх К-каналов с одной стороны и больиую активации

Са-активируемой РКС, которая является регулятором функцнониро-+ +

вания Нэ/Н обиенника с другой стороны. К сова/енив. в доступной нам литературе ми не наалн данных о влиянии инсулинотера-

л+ +

пии на Са-активируемые К-каналы эритроцитов больных СД. Показано. что инсулин восстанавливает Са-ЙТФазу эритроцитов больных СД и диабетических крыс {1Ы<11 1992) и эитероцатов диабетических крыс (СНвИап Р.К.. 1993). Восстановление активности Са-йТ4>азк корнализугт выход Са из клетки. Однако, дааг

через 12 недель инсуликотералии количество откритих Са- активируемых К-каналов остается повывон^т», что воино объяснить сохранением высокой коицентрации/сё^в эритроците, Повыаеиная кснцйнтрация/Са[7.с эритроцитах больных СД на Фоне длительной инсулинотерапни повет быть связана с увеличенным входом Са через измененную кзмбрану зритроцитои. Согласно •результатам исследований о состоянии перекиснсго статуса ыеибран эритроцитов у больных ¡¡ЗСД, несмотря на инсулинотерапив в эритроцитах больных СЛ. особенно, если течение болозни сопровоадается раз-вятиен аягиопатий, сохраняется ловыаешшй уровень процессов ПОЛ, а усиление процессов ПОЛ приводит и образовании поре-

«¿г

киснах кластероэ и сходу Са с клетку. Е-ессшюьлонае цеибран-ного потенциала ыогег ' Сите связано с эссетаиовлэпион ентно-ности. Ка/К-йТФззи эратроцитоз 0мънах 'лЗСД при ввЬазшш- инсулина 51 нормализации глико^ичзсного

- 21 -

Таким образом, результаты настоящего исследования показали , что q эритроцитах больных ИЗСД и. особенно, в эритроцитах

больных с диабетическими сосудистыми осложнениями наруэен нон-

+ JL+

ный транспорт и содершание ионов Ка, К. Са. Слоано установить причинно-следственные отношения, поскольку ■ разные виды транспорта ионов взаимосвязаны и нарувенне в одном из них влечет за собой вногиг другие. Бесспорно, что в эритроцитах-больна* НЗСД наеит место глубокие изменения структуры мембраны и. . преядв всего, ее лнпидного состава. Усиление процессов свобод-нораднкагьного окисления липидов. нзненение активности вазней-•shx нонтранспсртнрувзих спстев у больных ИЗСД с сосудистыми ословненияыи способствует ецэ более глубокой дезоорганизации клеточной неабранн эритроцита, инициируя его морфологические перестройки, повыаеннуа адгезия и аггрегацкв. сладхированио.

Результаты проведенных исследований убедительно показывает, что изменения структгрно-функциональных характеристик векбрака эритроцитов у больных НЗСД. которые не восстанавлива-втея иесвотра на инедлинотерапиа и хороаий гликекический контроль. йогут бить основой развития сосудистых осложнения.

В Ц В О й Н:

1. Развитие Сахарного диабета сопровоадается появлением d кровотоке бояьяого числа измененных Сори эритроцитов в виде ййпгацнтов, стоаатоцятов, сфвропластоа и сокращением числа áíicí!CU!!To3". ¿fas- больных с диабетической кефропатиеа характерно присутствие больвого числа соэропяастоэ. При диаботической ретинопатии, особенно,, в пролйфзративной стадии иабдвдавтея иэ-биточная агрегация изменениях фора зритроцизгоэ с форнировашш крупнах клеточных скоплений,

2. В эритроцитах Сольных НЭСД наблвдается избыточное образование продуктов лерекнсного окисления липидов. Терапия бяо-синтеткческиыи ннсулинамн не нормализует показатели ЛОЛ ц больных с диабетическими вихроаигиопатвямн. Повмвенннй уровень ПОЛ в мекбране эритроцитов больных с ангнопатиями, очевидно, • вызван не дефектов в антиоксндантной запите эритроцитов, а 1ольвни:1 пр'ооксидаитнняи влияниями плазиы. характерными для

, течения ИЗСД с сосуднстива исловненияма.

3. В эритроцитам больных.ИЗСД. и особенно, г эритроцитах

болышх с диабетическими ангнопатптш наруаен ионный транспорт . f Л+

и содьраание ионов N3, К, Са. .

4. Высокий уровень цитопяазматического /С<^в эритроцитах больных ИЗСД обусловливает гкпгрподзризацяа баэальной ьгэибрани и изеличенме степени открытия Са-актяьираеиих К-каналоо. Терапия бвосннютичэншаи иисуяииаии визивает нормализация «забранного потенциала эритроцита, но не влияет на процент открыла *

уяа Са-апткзирцоаая ¡{-каналов. Н больных с диабетической не$-

ропативй процент открытий Со-актиоируеиих К-ваналов достоверно

9

провииаот &ан51Уй показатель у болышх с ретинопатией.

«

3, С эритроцитах болышх 513СЛ с иефропатией и отягощенной

наследствонностыз по СД значительно увеличена скорость-На/Н

протисотранепорто. 12-недеяькаа ннсулииотерапия не визывает

нормализации данного показателя. Еиявлсшша различия с ско-

+ 1-

рости функционировании -На/Н оСпаппл'ла и степшш отиритиа Са-а«тиэ«ру*8ах К-ваиалоо у болыш с шеро- и ратинопатией говорят а пользу оозиокиоЗ связи И транспорта а На/11 оСяопа. 6. Еспояъэоаанц© препарат иасудяса чояозсага способствовало ;;остгленяз стойкой коипеисоц'.;:! сахаризго дкабота и Солмшх, сиигеииа потребности в каеддше. О резцяьтаге 12-«з-.

дельной 'терапии биосЕнтвтическяыи инсулииамн суточная доза инсулина была сниввна на 252 по сравнанн® с палучаейой дозой препаратов внвотного пропсноздониз.'

?

Ссшсоя рпбот, опубликованных по гена диссертации: >

1. Пзрекиснов ойцсязиив липндсз и аитионсидантнаа! зацита .

- >

эритроцитов 8 бадьиак сахарник дкабегоа// Тер. архнаЛ- 1993./-11 10.- с. 23-26. Соавт. Т.С.Балазова, Э.Й.Радько. Й.И.каяабол-кин. Й.П.Кубатаеэ.

2. Вдяание биосинтетаческого кпсудина на.перокнсноо окйслв-ниэ липндоо мембран эритроцитов у больных сахарина днабетоа I типа-// Проблема зидокранологви.- 1394.- Н 3.- «Ц 12-13. Соает. Т.С.Балавова. В.Й.Рудько. Н.Н.Балаболкин, Й.Й.Кубатнео.

3. АДФ- и тровбикяидиОДфованная кабилнзациа внутрккязгоч-него Са з троабоцнта* больнмх сеяарива дяабетоа с сосудйстнки

ослоянзшша // Балл.* вксп. биоя. «ед. - 1993,- N 1.-'с. 15-19.

>

Соавт. й.й.йубатвеа, Т.С.Балазова. Н.И.Балаболкнн. +■ *

4. Наруветеяе Да/Н обазаа о ерптроцптая больных инсулииза-впстпга сахарны» днабетоа // Тер. арянв,- 1993.- ¡1 2.~ с. Соавт. Т.С.Баранова. й.й.Квбатиеа. В.И.Баяабодкии»

.9. Особенности транспорта й+чорзз яеиСранц эритроцитов Солышх иисуяйиэааяснкйШ сахэравд дяебзтом;' ояизнпв кнсуяжс-Т0раПН!Ь/^БЕДЛ.-ЗКСП. бИОД. изд.- В ПЗЧаТЙ,' 1

Соавт'. Й.Й.Кубатиов, Т.С.Балазова. И.11.Бадабошш...