Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль нарушений локального перекисного статуса в патогенезе перитонита

На правах рукописи

КАШАФЕЕВА АЛЛА АНАТОЛЬЕВНА

РОЛЬ НАРУШЕНИЙ ЛОКАЛЬНОГО ПЕРЕКИСНОГО СТАТУСА В ПАТОГЕНЕЗЕ ПЕРИТОНИТА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

11 МАР 2015

005560512

Чита-2015

005560512

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Читинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения РФ

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Хышиктуев Баир Сергеевич Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Цыбпков Намжил Нанзатович Официальные оппоненты:

Ефремов Анатолий Васильевич - член-корреспондент РАН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Новосибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения РФ, заведующий кафедрой патологической физиологии и клинической патофизиологии Патеюк Андрей Владимирович - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Забайкальский государственный университет" Министерства образования и науки РФ, профессор кафедры социальной работы

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения РФ, г. Москва

Защита состоится " ^" 2015 года в часов на заседании

Диссертационного совета Д 208.118.01 при ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" по адресу: 672090, г. Чита, ул. Горького, 39 а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" (672090, г. Чита, ул. Горького, 39 а) и на сайте организации: http://chitgma.ru/nauka/ 2а5ЬсЬйа-&35ег1а1зу?1а5к=Иет.у1е\у&1с1=19

Автореферат разослан " ^т■С " 2015 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета 0

Д 208.118.01 д.м.н., профессор 6) а^^" И.Н. Гаймоленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. К проблеме свободнорадикально-го окисления (СРО) в организме человека привлечено внимание многих исследователей (Порядин Г.В. и др., 2013). Сбой в антиок-сидантной системе и усиление СРО повреждает структуру и нарушает функции биологических мембран в патогенезе различных заболеваний, в том числе и перитонита (Денисов J1.H, Лобарева JI.C., 1998). Полиорганная недостаточность - одна из причин высокой летальности при воспалении брюшины (Гараев Г.Ш. и др., 2011; Терещенко O.A. и др., 2013) и, несмотря на совершенствование техники хирургических вмешательств, внедрение новых методов лечения, смертность при данной патологии достигает 60% (Магомедов М.М. и др., 2014; Гостшцев В.К. и др., 2002).

Степень разработанности темы. В основе патогенеза перитонита лежит комплекс патофизиологических реакций с нарушением функций всех систем организма, и особая роль отводится нарушению баланса процессов липопероксидации и антиоксидант-ной защиты (Гаймоленко С.Г., 2004). В последние годы уделяется большое внимание изучению патогенетических механизмов протекающих в организме при воспалении брюшины (Плеханова Е.В. и др., 2012). Многие ученые, врачи, занимаются поиском новых, качественных методов и способов лечения перитонита (Макушкин Р.З. и др., 2009). Комплексная терапия данного заболевания включает интра- и послеоперационную санацию брюшной полости раствором антисептика (Винник Ю.С., Здзитовецкий Д.Э., 2011; Пет-росян Э.А. и др., 2005). Одним из таких препаратов является ги-похлорит натрия (ГХН), воздействующий на грамположительную, грамотрицательную флору и анаэробы (Петросян Э.А. и др., 2010). Кроме того, ГХН способствует индукции свободнорадикальных реакций и при его местном действии приводит к повышенной генерации активных форм кислорода, вызывая деструкцию патологических агентов (микробные тельца, токсины) (Суковатых Б.С. и др., 2009; Петров С.И. и др., 2005). Известно, что 3% раствор ги-похлорита натрия способствует лизису некротических тканей, а 5% - токсичен для клеток человеческого организма (Мартынов А. 1С. и др., 1995; Эвентов B.JI., Адрианова М.Ю., Богорад И.В., 1998). Рядом ученых для обработки брюшной полости при вторичных перитонитах используется 0,06-0,09% раствор электролизного гипох-

лорита натрия, при этом изучались показатели системы "перекис-ное окисление липидов-антиоксиданты" крови, а влияние ГХН на состояние брюшины при её воспалении и отдаленные последствия практически не изучены (Суковатых Б.С. и др., 2008).

В связи с этим определенный интерес представляет исследование локального перекисного статуса при воспалении брюшины в эксперименте, что позволит установить патогенетические особенности изменений в системе "ПОЛ-антиоксиданты" при перитоните и создать предпосылки для выяления эффективных методов его лечения.

Цель исследования: изучить течение процессов липоперок-сидации и морфологических изменений брюшины животных и на основании полученных данных обосновать патогенетическую терапию экспериментального перитонита.

Задачи исследования:

1. Исследовать патогенетические закономерности изменений системы "перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита" в париетальной брюшине животных при воспалении.

2. Изучить патоморфологические изменения брюшины при экспериментальном перитоните.

3. Оценить у животных с экспериментальным перитонитом динамику показателей системы "ПОЛ-антиоксиданты" в брюшине и изменение её морфометрических характеристик при санации брюшной полости раствором гипохлорита натрия различных концентраций.

4. На основании полученных результатов выбрать оптимальный вариант патогенетической терапии при перитоните у крыс.

Научная новизна. Показано, что интенсивность процессов перекисного окисления липидов в брюшине при перитоните оставалась на уровне или несколько ниже значений контрольной группы (диеновые конъюгаты, кетодиены и сопряженные триены, основания Шиффа). Неблагоприятным фактором для течения перитонита служит угнетение активности энзимов. Начиная с 3 суток, происходит ингибирование основных ферментов (супероксиддисмутазы, глутати-онпероксидазы и глутатионредуктазы), а к 7 - подавляются все исследуемые энзимы (СОД, каталаза, ГПО и ГР). При этом общая антиокислительная активность остается в пределах значений контроля.

Санация брюшной полоста 0,09% раствором гипохлорита натрия (в отличие от 0,02% и 0,045% растворов) при перитоните способству-

ет в большей мере уменьшению продуктов перекисного окисления липидов (ДК, КД и СТ) на фоне повышения с 3 дня исследования су-пероксидщшмутазной, каталазной, глутатионпероксидазной и глута-тионредуктазной реакций и общей антиокислительной активности.

Незначительно выраженная альтерация тканей брюшины и петель кишечника при перитоните регистрируется после обработки 0,09% раствором ГХН и выражается нарушениями микроциркуляции и образованием единичных фибринозных наложений на брюшине. В то же время 0,02% и 0,045% растворы антисептика не обладают достаточным бактерицидным эффектом и способствуют дальнейшему течению перитонита с формированием фибринозно-гнойных очагов с участками микроэррозий.

Последовательная санация брюшной полости растворами 0,09% ГХН и 5% аскорбиновой кислоты частично нивелирует негативный эффект антисептика на морфологию брюшины, а также приводит к мобилизации антиоксидантных ресурсов тканей полости живота.

Теоретическая и практическая значимость работы. В работе раскрыты закономерности изменений показателей перекисного окисления липидов и антирадикальной защиты брюшины при её воспалении, а также после санации брюшной полости различными растворами. Установлено, что при перитоните к 7 суткам усугубляется ингибирование антиоксидантных энзимов на фоне сохраняющейся общей антиокислительной активности. Использование различных растворов при перитоните для промывания патологического очага вызывает разнонаправленные сдвиги как в перекисном статусе, так и в морфологической картине тканей брюшной полости. Наиболее позитивным в этом аспекте является раствор 0,09% гипохлорита натрия в сочетании с 5% раствором витамина С.

При выполнении работы выбрана модель перитонита на белых крысах, подтвержденная морфологическим субстратом воспаления брюшины, которая к концу эксперимента без санации брюшной полости растворами антисептиков приводит к образованию множественных висцеро-висцеральных и висцеро-париетальных спаек.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности применения 0,09% гипохлорита натрия и 5% аскорбиновой кислоты в качестве санирующих растворов в клинике.

Основные положения, выносимые иа защиту: 1. В патогенезе экспериментального перитонита у крыс в первые сут-

ки регистрируются нарушения перекисного статуса в брюшине, характеризующиеся накоплением продуктов ПОЛ на фоне подавления антирадикалыюй защиты; в последующем (3 и 7 сутки) происходит ингибирование всех антиоксидантных ферментов, однако общая антиокислительная активность остается на уровне контроля.

2. Патогенетическая терапия, заключающаяся в орошении брюшной полости при перитоните 0,09% раствором (по сравнению с 0,02% и 0,045% концентрациями) гипохлорита натрия в большей степени приводит к снижению уровня интермедиатов ПОЛ и мобилизации антиоксидантных ресурсов.

3. Применение 0,09% раствора ГХН у животных с перитонитом наряду с удовлетворительными санирующими и бактерицидными свойствами вызывает наименее выраженную альтерацию окружающих тканей (нарушение микроциркуляции, формирование единичных фибринозных наложений на брюшине). В то же время 0,02% и 0,045% концентрации гипохлорита натрия не оказывают противомикробно-го эффекта и способствуют дальнейшему течению перитонита.

4. Использование (при экспериментальном перитоните) санации брюшной полости 0,09% раствора ГХН и 5% аскорбиновой кислоты частично устраняет отрицательное воздействие гипохлорита натрия на морфологию брюшины, приводя к снижению уровня ТБК-активных продуктов, оснований Шиффа и стабилизируя антиоксидантную защиту.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры общей и специализированной хирургии с курсом топографической анатомии и оперативной хирургии ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" Минздрава России для студентов 2 и 3 курса по специальности "Педиатрия" и "Лечебное дело" при подготовке к практическим занятиям и лекциям. Исследованный локальный пе-рекисный статус брюшины при воспалении и обоснованная патогенетическая терапия перитонита 0,09% раствором гипохлорита натрия внедрены в клиническую практику, отделения гнойной хирургии ГУЗ "Краевая детская клиническая больница" г. Чита.

Апробация диссертации. Основные положения диссертации и результаты исследований доложены и обсуждены на конференциях: "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (Москва, 2008), "Актуальные проблемы клинической и экспериментальной меди-

цины" (Чита, 1-2 октября 2008), X конгрессе молодых ученых и специалистов "Науки о человеке" (Томск, 2009) и на конференции "Актуальные вопросы травматологии, ортопедии и хирургии" (Иркутск, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 4 статьи в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста на русском языке, иллюстрирована 31 рисунком и 19 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав результатов собственного исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы состоящего из 161 отечественного и 96 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика экспериментальных групп и методика исследования

Для решения поставленных задач нами проведено экспериментальное исследование на 212 беспородных половозрелых крысах обоего пола с массой 190 - 250 г, которые были разбиты на следующие группы:

- Контрольная группа (п=30);

- Группа животных с перитонитом (п=35);

- 1-я группа сравнения с перитонитом и обработкой брюшной полости 0,9% раствором натрия хлорида (п=28);

- 2-я группа сравнения - воздействие 0,09% раствора электролизного гипохлорита натрия на интактную брюшину (п=26);

- 1-я опытная группа животных с перитонитом, у которых санация брюшной полости проводилась 0,02% раствором электролизного гипохлорита натрия (ГХН) (п=23);

- 2-ая опытная группа животных с перитонитом и санацией брюшной полости 0,045% раствором электролизного гипохлорита натрия (п=25);

- 3-ая опытная группа животных с перитонитом и санацией брюшной полости 0,09% раствором электролизного гипохлорита натрия (п=24);

- 4-я опытная группа животных с перитонитом и санацией брюш-

ной полости 0,09% раствором гипохлорита натрия, с последующим орошением 5% раствором аскорбиновой кислоты (п=21).

Все эксперименты выполнены в соответствии с "Международными рекомендациями по проведению биомедицинских исследований с использованием животных" принятыми Международным Советом Медицинских Научных Обществ (СЮМБ) в 1985 г. Лабораторные животные содержались в условиях вивария, имели свободный доступ к пище и воде, после отбора проб безболезненно усыплялись эфиром. Данное диссертационное исследование одобрено Локальным этическим комитетом протокол № 2 от 06.11.2009 г. и заслушано на заседании Проблемной комиссии по медико-биологическим наукам (ПК-6) ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" протокол № 18 от 16.01.2015 г.

Животным контрольной группы под эфирным наркозом выполняли лапаротомию, ревизию брюшной полости и ушивали рану наглухо. Сразу после вскрытия брюшной полости (исходные данные) на 1, 3 и 7 сутки забирали участок брюшины в бессосудистой зоне брыжейки, промывали в охлажденном физиологическом растворе. Образцы гомогенизировали в 0,05% трис-НС1-буфере (рН=7,8), затем центрифугировали (Ещенко Е.Д., 1982) и супернатант использовали для изучения параметров системы "перекисное окисление липидов-антиоксиданты". Также у некоторых животных иссекали часть тонкого кишечника для гистологического исследования. В контрольной группе оценивали комплексное воздействие механического (операционная травма) и физического (излучение операционной лампы) факторов на исследуемые показатели.

Для моделирования перитонита использовалась методика М.А. Магомедова (2004). Под эфирным наркозом животным осуществлялась срединная лапаротомия, и проводилось механическое повреждение серозной оболочки петель тонкого кишечника марлевым шариком с последующим орошением брюшной полости 20% каловой взвесью в объеме 1 мл. На следующие сутки после рела-паротомии у части животных иссекали участок брюшины площадью 1,5 см2 в бессосудистой зоне брыжейки тонкого кишечника для биохимического изучения параметров перекисного окисления липидов, удаляли петлю тонкой кишки для гистологического исследования. Брюшная полость крыс опытных групп обрабатывалась раствором различных концентраций электролизного гипохлорита

натрия с экспозицией 5 мин, затем трехкратно промывалась 0,9% раствором хлорида натрия. В 4-ой опытной группе после воздействия на брюшину 0,09% раствора гипохлорита натрия и её трехкратного промывания 0,9% раствором хлорида натрия, брюшную полость орошали 5% раствором аскорбиновой кислоты (2 мг на 200 г массы тела) и ушивали наглухо. В 1-ой группе сравнения после выполнения лапаротомии и моделирования перитонита на 1 сутки полость живота промывалась 0,9% раствором хлорида натрия. Во 2-ой группе сравнения интактная брюшная полость обрабатывалась 0,09% раствором гипохлорита натрия в течение 5 мин, затем трижды промывалась физиологическим раствором (0,9% NaCe), после этого у части животных проводили отбор материала для биохимического и морфологического изучения брюшины.

У животных с каловым перитонитом в первые трое суток изменялось поведение: снижалась двигательная активность, угнетался пищевой инстинкт на фоне повышенной потребности в воде. Летальность к 7 дню составила в группе перитонита - 43%, в 1-й опытной группе - 26,1% случаев, во 2-й опытной группе - 28%, в 3-й опытной группе - 16,7%, в 4-й опытной группе - 19%, в 1-й группе сравнения - 50% случаев, во второй группе сравнения - 3,9%, тогда как в контрольной группе её величина равнялась 3,3%.

Во всех группах материал для исследования забирали на 1, 3 и 7 сутки эксперимента.

Кишечник для гистологического исследования промывали от содержимого и фиксировали в 10% растворе формалина. Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Готовые микропрепараты изучались на морфометрическом комплексе "Olympus cover - 015" с программным обеспечением "МЕКОС", делали 5 фотографий полей зрения каждого препарата и измеряли толщину брюшины (3 измерения в 1-м поле).

У животных с каловым перитонитом на 1, 3-й, 7-е сутки забирали смыв из брюшной полости для посева на микрофлору. Все работы выполнялись согласно Приказу МЗ СССР № 535 от 22.04.1985 г. МУ по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования в клинико-диагностических лабораториях.

Электролизный 0,09% раствор гипохлорита натрия готовился на аппарате электрохимической детоксикации организма - ЭДО-4. Для

приготовления 0,045% раствора гипохлорита натрия в операционной

0.09% раствор гипохлорита натрия разводили непосредственно перед операцией физиологическим раствором хлорида натрия в соотношении 1:2, а для получения 0,02% раствора гипохлорита натрия 1:3.

Биохимические методы исследования показателей системы "ПОЛ-антиоксидангы"

В супернатанте были изучены следующие показатели: величины веществ с изолированными двойными связями, диеновых конъ-югатов (ДК), кетодиенов и сопряженных триенов (КД и СТ) (Вол-чегорский И.А. и др., 1989), уровень соединений, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активные продукты) (Андреева Л.И., 1988), концентрация оснований Шиффа (Каган В.Е., 1986) и активности ферментов: супероксиддисмутазы (Верболович В.П., Подгорная Л.М., 1987), каталазы (Королюк М.А.и др., 1988), глу-татионпероксидазы (Моин В.М., 1986), глутатионредуктазы (Верболович В.П., Подгорная Л.М., 1987) и общей антиокислительной активности (АОА) (Промыслов М.Ш. и др., 1989).

Статистическая обработка данных проводилась с помощью параметрических и непараметрических методов с применением программы "Вк^аГ (Иа^г Б., 1999).

Оценка нормальности экспериментальных выборок проводилась по "\У-критерию Шапиро-Уилка, так как его свойства обладают наибольшей мощностью, из широкого выбора критериев нормальности, при размерности выборки от 8 до 50 элементов и в этот интервал попадает численность всех исследуемых групп. Если рассчитанная \¥-статистика значима, то гипотеза о нормальном распределении значений переменной отвергалась. Для оценки показателей выборок, не отвечающих нормальному закону распределения или небольшого объема, применялись сопоставимые методы непараметрической статистики в видеМе (25-й; 75-й персентиль): парный и - критерий Манна-Уитни и множественный Н - критерий Крускала-Уоллиса (Петри М.А., 2010; вк^г Б., 1999). Критический уровень значимости при проверке гипотез р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Динамика показателей системы "ПОЛ-антиоксидангы" брюшины животных при перитоните

При изучении образцов брюшины с воспалительными измене-

ниями на протяжении всего эксперимента при перитоните снижалось количество соединений с изолированными двойными связями, как по сравнению с контролем, так и в динамике (таблица 1). В последнем случае их уровень на 7 сутки составлял 78,9% и 75,0% соответственно от величин в 1 и 3 сутки. Кроме того, снижались значения диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных трие-нов в среднем на треть по сравнению с 1-ми и 3-ми сутками соответственно. На 7 день эксперимента отмечалось снижение коэффициента АЕ232/220 в 1,1 раза (р=0,027)ио. Шиффав 1,4 раза (р=0,027) по отношению к 1 суткам перитонита (таблица 1). Таблица 1 - Динамика показателей липопероксидации брюшины животных Ме (25-й; 75-й персентиль, числитель-контроль; знаменатель-перитонит)

Показатель 1 сутки 3 су га I 7 сутки

п=11/ п=33 п=14/ п=13 п=7/п=13

ДЕ,,в/мг лнпидов 0,95 (0,65; 1,15) 1,04(0,69; 1,49)* 0,70 (0,61; 0,72)

0,76 (0,68; 1,08) 0,80 (0,75; 0,90) 0,60 (0,53; 0,76) р=0,03 р,=0,014

ДКДЕи2гмг липидов 0,87 (0,63; 1,18) * 0,77 (0,64; 1,31) * 0,68 (0,57; 0,72)

0,75 (0,63; 0,88) 0,73 (0,64; 0,84) 0,50 (0,44; 0,66) р=0,003 р,=0,016

КДиСТ ДЕ^^г лнпидов . 0,59 (0,39; 0,75) 0,59 (0,52; 0,90) * 0,44 (0,36; 0,48)

0,55 (0,42; 0,62) 0,53 (0,48; 0,57) 0,36 (0,30; 0,47) р=0,007 р,=0,007

л^и2/22с> 1,03 (0,94; 1,07) 0,85 (0,75; 0,93) 0,97 (0,94; 0,97)

0,99 (0,88; 1,05) 0,91 (0,74; 1,02) 0,88 (0,76; 0,94)** р=0,045

О. Ц^ффа (УЕ/мг липидов) 1,97 (1,43; 2,22) 1,56(1,18; 1,84)" 1,78 (1,26; 1,97)

1,72 (1,51; 1,98) 1,52(1,09; 1,72) 1,24(1,09; 1,52)** р=0,016

Примечание: ** - статистически значимые различия по сравнению с контролем; р - статистически значимые различия но отношению к 1 суткам группы перитонита; р, - статистически значимые различия по отношению к 3 суткам группы перитонита (и - критерий Манна-Уитнн).

При изучении антиокислительного звена на 1 сутки зарегистрирован рост активности ГПО в 2,4 раза (р=0,015) и снижение на 7 сутки в 1,3 раза (р=0,008) по сравнению с контролем.

На 3 сутки обнаружено снижение показателя СОД в 1,3 раза (р=0,001), ГР в 1,1 раза (р=0,027) относительно контрольной группы и рост цифр глутатионредуктазы в 1,6 раза (р=0,032) на 3 сутки и в 1,2 раза (р=0,039) на 7 день по отношению к 1 суткам исследования (таблица 2).

К 7 суткам выявлено уменьшение скорости реакций всех ферментов в среднем в 1,3 раза относительно контрольных значений данных суток (таблица 2).

По критерию Крускала-Уоллиса наблюдались статистически значимые отличия уровня субстратов (р=0,019) и начальных ин-термедиатов ПОЛ (р=0,003; р=0,016), оснований Шиффа (р=0,001), активности всех изучаемых ферментов (р=0,001) и общей антиокислительной активности (р=0,001).

Таблица 2 - Динамика параметров антиоксидантной защиты брюшины животных Ме (25-й; 75-й персентиль, числитель-контроль; знаменатель-перитонит)

Показатель I сутки 3 сутки 7 сутки

(п=11)/(п=33) (п—14)/(Пг=13) (п=7)/(п=13)

СОД (% акгнвности) 28,5 (21,5; 31,4) 31,8 (26,2; 33,6) 29,4 (27,8; 46,7)

25,2 (21,3; 27,1) 25,3 (23,1; 28,7)** 24,6 (20,4; 30,6)**

Каталаза (нмоль/с мг белка) 2,73 (2,27; 3,38) 4,58 (1,90; 13,2) 6,02(4,77; 17,8)

3,35 (1,90; 3,74) 5,7(1,43; 12,8) 4,35(2,97; 16,1)**

ГПО (мкмоль/с мг белка) 17,2(13,5; 33,1)* 46,3 (22,3; 59,4) * 42,3 (28,4; 63,5)

41,6 (32,1; 53,6) 42,3 (34,9; 51,5) 24,4 (17,9; 41,3)**

ГР (мкмолъ/с мг белка) 22,0 (14,8; 29,1) * 37,6 (27,5; 45,6) 38,0 (21,2; 61,4)

21,0(11,9; 30,3) 34,0 (23,2; 36,3) ** р=0,032 28,9 (22,7; 43,6)** р=0,039

АОА (%) 9,15 (7,43; 10,1) * 8,42(8,16; 12,3)* 9,49 (8,38; 12,2)

9,37 (7,41; 10,8) 9,45 (7,61; 10,1) 11,30 (9,12; 13,1)

Примечание: см.таблицу 1.

Перитонит подтвержден бактериологическими и морфологическими исследованиями. Так, в бактериальных посевах из брюшной полости на 1 сутки у всех животных с перитонитом обнаружен рост бифидобактерий до 108 КОЕ/мл; молочнокислых бактерий до 107 КОЕ/мл; бактероидов до 106-Ю7 КОЕ/мл; молочнокислых бактерий стрептококка до ЮМ О8 КОЕ/мл; энтерококков до Юб-Ю7 КОЕ/ мл; кишечной палочки с нормальной ферментативной активностью до 2x108 КОЕ/мл; кишечной палочки со сниженной ферментативной активностью до 4хЮ9 КОЕ/мл; лактозонегативной кишечной палочки до 3x108 КОЕ/мл; негемолитического стрептококка до 8x104 КОЕ/мл; сапрофитного стафилококка до 2x103 КОЕ/мл; дрож-жеподобных грибов до 105 КОЕ/мл. На 3 сутки исследования выявленная микрофлора в смывах существенно не изменялась. В конце эксперимента отмечалось снижение бифидо- и лактофлоры (с Ю8 до Юб КОЕ/мл ) и значительный рост сапрофитного стафилококка (с Ю2 до Ю5 КОЕ/мл).

Выполнение срединной лапаротомии у животных контрольной группы не сопровождалось деструктивными изменениями - фиксировался отграниченный серозно-фибринозный перитонит (в зоне ла-паротомной раны).

В брюшной полости макроскопически у животных с перитонитом на 1 и 3 сутки эксперимента выявлена гиперемия париетальной брюшины, брыжейки, небольшое количество мутного выпота с неприятным запахом, наложения фибрина на петлях тонкого кишечника, брыжейке и паренхиматозных органах. Кроме того отмечались признаки пареза кишечника: увеличение диаметра кишки в 1,5 и более раз, в просвете наличие жидкости и газа. К 7 суткам наблюдалось увеличение вертикальных размеров печени у 46,1 % животных.

Морфологическая картина при перитоните выражалась морфо-функциональными изменениями, характерных критериям разлитого калового перитонита - развитие типовых воспалительных изменений в висцеральной и париетальной мезотелиальных оболочках, с накоплением нейтрофильного инфильтрата в стенке кишечной трубки и выявлением микроэрозий на вершине отдельных ворсинок, частично прикрытых фибрином, формированием очагов некроза и множественных висцеро-висцеральных и висцеро-париетальных спаек.

Таким образом, практически все изученные биохимические показатели ПОЛ на протяжении всего эксперимента находились на уровне, а некоторые из них ниже контроля. На этом фоне неблагоприятным обстоятельством при перитоните служит истощение энзимов: начиная с 3 суток - ингибирование активности супероксид-дисмутазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы, а к 7 -подавляются все исследуемые ферменты (СОД, каталаза. ГПО и ГР). При этом общая антиокислительная активность в пределах значений контрольной группы, однако, её пул в этом случае поддерживается за счет низкомолекулярных соединений, большинство из которых являются экзогенными и достаточно быстро элиминируются из организма, что может способствовать хронизации патологического процесса и извращать нормальное течение репарации. 2. Сравнительный анализ системы "ПОЛ-антиоксиданты" и па-томорфологических изменений брюшины животных с перитонитом при различных способах санации брюшной полости

На данном этапе работы изучено влияние санации брюшной полости при перитоните раствором электролизного гипохлорита натрия различных концентраций от 0,02% до 0,09% на исследуемые параметры. Выбор таких концентраций был обусловлен тем, что данные растворы при местном применении не обладают токсичностью, не вызывают аллергических реакций, у них отсутствует канцерогенность, наряду с выраженными бактерицидными свойствами (Суковатых Б.С. и др., 2013; Глухов А.А. и др., 2009). Кроме того, в литературе имеются единичные сведения об успешном использовании этих растворов в клинической практике (Суковатых Б.С. и др., 2011; Эвентов В.Л. и др., 1998).

При сравнительном анализе изучаемых концентраций ГХН (рисунок 1) на 1 сутки выявлено повышение уровня коэффициента Е278/ 220 во 2-й и 3-й опытных группах в среднем в 1,1 раза относительно 1-й опытной группы (р=0,046; р=0,040).

Кроме того, на 3 сутки наблюдалось уменьшение ТБК-актив-ных продуктов во 2-й и 3-й опытных группах на 39% (р=0,011) и на 37% (р=0,014) соответственно по отношению к первой опытной группе (рисунок 2).

На 7-е сутки после обработки брюшной полости 0,09% раствором ГХН зарегистрировано снижение диеновых конъюгатов на 40% (р=0,013), КТ и СТ на 46,7% (р=0,040) по сравнению со 2-й опытной группой (рисунок 1).

—♦—0,02%

0,04% -4-0,09%

Примечание: * - значимые отличия относительно 1-й опытной группы соответствующих суток (ГХН 0,02%); # - значимые отличия относительно 2-й опытной группы соответствующих суток (ГХН 0,04%). Рисунок 1. Динамика уровня начальных продуктов ПОЛ брюшины при перитоните после воздействия ГХН (100% - перитонит в соответствующие сроки)

При изучении антиокислительной активности на 1 сутки в 3-й опытной группе наблюдался рост общей антиокислительной активности в 1,3 раза (р=0,015) по отношению к 1-й опытной группе и в 1,4 раза (р=0,005) по сравнению со 2-й опытной группой. Также в этой группе отмечалось повышение цифр СОД на 25% (р=0,049) относительно первой опытной группы. На 3-й сутки после санации полости живота 0,09% раствором гипохлорита натрия выявлено повышение активности всех ферментов в среднем в 1,8 раза, а на 7 сутки в среднем в 2,1 раза относительно 2-й опытной группы (ри-

сунок 3). Кроме того обнаружен рост АОА на 3 день на 19% (р=0,037) и на 7 день на 73% (р=0,048) по отношению ко 2-й опытной группе. На 7 сутки зарегистрировано повышение каталазной

активности на 207% (р=0,036) по сравнению с 1-й опытной группой. %

160 1S0 140 130 120 110 100 90 80 70 60

Примечание: * - значимые отличия относительно 1-й опытной группы соответствующих суток (ГХН 0,02%); # - значимые отличия относительно 2-й опытной группы соответствующих суток (ГХН 0,04%). Рисунок 2. Динамика уровня вторичных продуктов ПОЛ брюшинь: при перитоните после воздействия ГХН (100% - перитонит в соответствующие сроки)

При микроскопическом исследовании в 1-й опытной группе крыс (0,02% раствор ГХН) на 1 сутки эксперимента в тонкой кишке в подслизистом и мышечном слоях обнаружены участки микроабс-цедирования. Серозная оболочка утолщена, мезотелий местами отсутствует. На 3-й сутки выявлен отек стенки тонкой кишки. Обнаружено наличие сегментарной гангрены. На 7-е сутки эксперимента слизистая с множественными поверхностными микроэрозиями. Сосуды подлежащих слоев полнокровны с очаговыми кровоизлияниями. Брюшина с микробными колониями, резко утолщена за счет образования грануляционной ткани.

ТБК-активные продукты

^-^

1 сутки 3 сутки 7 сутки

0,02% -«— 0,04% —£—0,09%

1 сутки 3 сутки 7 сутки -»-0,02% -»-0,04% —л—0,09%

Примечание: * - значимые отличия относительно 1-й опытной группы соответствующих суток (ГХН 0,02%); # - значимые отличия относительно 2-й опытной группы соответствующих суток (ГХН 0,04%).

Рисунок 3. Динамика параметров антиоксидантной защиты брюшины при перитоните после воздействия ГХН ( 100% - перитонит в соответствующие сроки)

После санации брюшной полости 0,045% раствором гипохло-рита натрия при перитоните на 1 сутки в тонкой кишке выявлено слущивание клеток мезотелия брюшины.

На 3 сутки слизистая с множественными поверхностными микроэрозиями, в подслизистой и мышечной оболочке - диффузная лейкоцитарная инфильтрация. Брюшина утолщена, с наложениями фибрина. На 7 сутки брюшина утолщена, отечна, с массивными фиб-ринозно-лейкоцитарными наложениями, среди которых обнаружены микробные колонии. Фибрин с явлениями организации.

После обработки брюшной полости 0,09% раствором гипохло-рита натрия при перитоните на 3 сутки на серозной оболочке немногочисленные фибринозные наложения с признаками организации. К 7-м суткам отмечен отек всех слоев стенки кишки и единичные фибринозно-лейкоцитарные наложения с организацией на серозной оболочке.

Таким образом, обработка брюшной полости 0,02% раствором ГХН на 1 сутки вызывает рост количества начальных интермедиатов ПОЛ, а к концу 7 суток уровня конечных продуктов. В ответ на это увеличивается активность глутатнонпероксидазы на 7 сутки. Санация брюшной полости раствором большей концентрации (0,045%) сопровождается гораздо меньшим перекисным дисбалансом: уровень КД и СТ увеличивается к концу недели, а ТБК-активных веществ в 1 сутки даже снижается. Со стороны факторов антирадикальной защиты на 7 день возрастает активность ГПО, а скорость обезвреживания пероксида водорода в начале эксперимента повышается, а затем уменьшается, но на этом фоне все равно к концу недели возникает суммарная антиоксидантная недостаточность. И, наконец, совершенно другая картина изменений исследуемых показателей характерна для животных, брюшная полость которых обрабатывалась 0,09% раствором ГХН - особенно это касается антирадикальной защиты. Так, в этой группе количество ТБК-позитивного материала снижалось на 1 сутки, при незначительном росте Е, в конце эксперимента; зато происходила активация всех факторов антиок-сидантной системы, достигавшая максимума к 7 дню. Вероятно, можно предположить, что гипохлорит натрия именно в этой концентрации (самой высокой в нашем исследовании) вызывает мобилизацию защитных факторов в брюшной полости и, в первую очередь, ферментативных. Скорее всего, анион гипохлорита каким-то

образом способствует экспрессии генов данных энзимов, но в литературе подобных данных нам обнаружить не удалось.

Резюмируя вышеизложенное, можно констатировать, что при экспериментальном перитоните наиболее эффективным средством для коррекции перекисного дисбаланса в брюшной полости является её обработка 0,09% раствором гипохлорита натрия.

Исходя из результатов, описанных выше, на следующем этапе работы проведено исследование по изучению влияния на перекис-ный статус композиции, состоящей из 0,09% гипохлорита натрия и 5% аскорбиновой кислоты, где оценивался дополнительный эффект витамина С, выступающего в роли как анти-, так и прооксиданта.

В 4-й опытной группе после санации брюшной полости 0,09% раствором ГХН и витамином С при перитоните на 3 сутки отмечалось снижение коэффициента Е278/220 на 12% (р=0,014) по сравнению с 3-й опытной группой (санация брюшной полости 0,09% раствором ГХН при перитоните). К 7 суткам зафиксирован рост уровня субстратов и диеновых конъюгатов в среднем на 49% (р=0,044) относительно 3-й опытной группы.

При исследовании ферментативного звена на 1 сутки обнаружено повышение скорости каталазной реакции более чем в 3 раза по сравнению с 3-ей опытной группой. На 3-й сутки выявлено снижение цифр ГПО на 60% (р=0,004) относительно 3-й опытной группы.

При микроскопическом исследовании в 4-й опытной группе на 1 день эксперимента выявлено полнокровие сосудов, воспалительная инфильтрация, гиперплазия лимфоидной ткани. Мезотелий местами слущен, брюшина выглядит "вуалеподобной", с нежным наложением нитей фибрина. На 3-й сутки в кишке обнаружены дегенеративно-воспалительные изменения слизистой оболочки, незначительный отек мышечной оболочки. Клетки мезотелия вакуолизируются, местами слущен ы, местами напротив - формируют пролиферирующие очаги, дающие эффект "псевдомногослойности". Наблюдались единичные кровоизлияния в серозную оболочку, расслаивающего характера, с её утолщением. К 7-м суткам клетки мезотелия также частично спущены вследствие гибели, располагаются "цепочкой".

Таким образом, обработка брюшной полости 0,09% раствором ГХН с последующим орошением 5% раствором аскорбиновой кислоты, приводит к выраженной активации каталазы на 1 сутки и снижению концентрации промежуточных интермедиатов ПОЛ.

Результаты проведенного исследования убедительно показывают, что использование гипохлорита натрия в высокой концентрации (0,09%), наряду с удовлетворительными моющими и бактерицидными качествами, сопровождалось незначительной вторичной альтерацией стенок брюшной полости и кишечных петель, что проявлялось в виде нарушения микроциркуляции и формирования единичных фибринозных наложений на брюшине. Комбинация 0,09% раствора ГХН с 5% раствором аскорбиновой кислоты позволяет частично нивелировать негативный эффект высококонцентрированного гипохлорита натрия на структурно-функциональные особенности тканей брюшной полости, что подтверждается данными как морфологического исследования, так и динамикой показателей системы "ПОЛ-антиоксиданты".

ВЫВОДЫ

1. Течение экспериментального перитонита у крыс характеризуется повышением активности глутатионпероксидазы на 1 сутки, с последующим угнетением активности супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы к 7 дню исследования. При этом общая антиокислительная активность на протяжении всего эксперимента не изменялась.

2. У животных контрольной группы в зоне лапаротомной раны наблюдалось слабовыраженное отграниченное серозно-фибриноз-ное воспаление. При экспериментальном перитоните на 1-3 сутки в стенке кишечника происходит накопление нейтрофильных лейкоцитов, выявляют очаги некроза и скопление фибринозно-гнойного экссудата. К 7 суткам при перитоните отмечается наличие висцеро-висцеральных, висцеро-париетальных спаек.

3. При перитоните наиболее эффективна коррекция перекисного дисбаланса 0,09% раствором гипохлорита натрия, приводящая к улучшению клинической картины заболевания.

4. Степень морфологических изменений брюшины и стенки кишечника при перитоните зависит от концентрации примененного гипохлорита натрия: 0,09% раствор, наряду с положительной санацией, вызывает слабую альтерацию окружающих тканей, тогда как 0,02% и 0,045% растворы ГХН не обладают достаточным бактерицидным эффектом.

5. Комбинация 0,09% раствора гипохлорита натрия с раствором 5% аскорбиновой кислоты частично нивелирует негативный эффект высококонцентрированного ГХН на морфологию брюшины, а так-

же приводит к снижению на 7 сутки уровня ТБК-активных продуктов, оснований Шиффа и мобилизации антиоксидантныхресурсов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для профилактики развития перитонита, в качестве антисептика, можно рекомендовать следующую схему санации: вначале 0,09% раствор гипохлорита натрия (с экспозицией 3-5 минут), а затем трехкратное промывание брюшной полости 0,9% раствором хлорида натрия.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в рецензируемых изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ

1. Состояние перекисного статуса брюшины при экспериментальном перитоните у крыс / A.A. Кашафеева [и др.] // Дальневосточный медицинский журнал. - 2009. - № 3. - С. 89-92.

2. Кашафеева, A.A. Воздействие различных концентраций гипохлорита натрия на динамику параметров системы "ПОЛ - антиок-сиданты" брюшины при перитоните в эксперименте / A.A. Кашафеева, С.Г. Гаймоленко, Б.С. Хышиктуев // Сибирский медицинский журнал. - Иркутск, 2010. - Т. 96, № 5. - С. 82-85.

3. Морфометрические параметры брюшины у крыс при воспалении и после местного воздействия на неё растворов гипохлорита натрия разной концентрации [Электронный ресурс] / A.A. Кашафеева [и др.] // Забайкальский медицинский вестник. - 2011. - № 2. - С. 116-124. - Режим доступа : http://chitgma.ru/zmv2/ index.php?option (11 фев. 2015 г.).

4. Кашафеева, A.A. Закономерности изменений параметров системы "перекисиое окисление липидов - антиоксиданты" брюшины после воздействия различных факторов в эксперименте / A.A. Кашафеева, С.Г. Гаймоленко, Б.С. Хышиктуев // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2012. - № 4. - С. 45-49.

Публикации в иных изданиях

5. Перекисный статус брюшины при экспериментальном перитоните / A.A. Кашафеева [и др.] // Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины : материалы Всерос. науч. - практ. конф., 1-2 октября 2008 г. - Чита. - 2008. - С. 185-186.

6. Влияние гипохлорита натрия на параметры системы "ПОЛ-ан-тиоксиданты" брюшины в эксперименте / A.A. Кашафеева [и др.] // Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины : материалы Всерос. науч.-практ. конф., 1-2 октября 2008 г. -Чита. - 2008. - С. 183-184.

7. Сравнительная оценка некоторых методов экспериментального перитонита у крыс / A.A. Кашафеева [и др.] // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины : тез. V конф. молодых ученых России с междунар. участием. - М., 2008. - С. 188.

8. Воздействие гипохлорита натрия на параметры системы "ПОЛ -антиоксиданты" брюшины при экспериментальном перитоните у крыс / A.A. Кашафеева [и др.] // Науки о человеке : материалы X конгр. молодых ученых и специалистов, 28-29 мая 2009 г. -Томск. - 2009. - С. 85-86.

9. Микробный пейзаж при экспериментальном перитоните у крыс / A.A. Кашафеева [и др.] // Бюллетень Восточно-Сибирскрго научного центра СО РАМН. - Иркутск, 2011. - № 4 (80), приложение. - С. 57-58.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АМК - активные метаболиты кислорода

АОА - антиокислительная активность

АО - антиоксиданты

АОЗ - антиоксидантная защита

Аск. к-та - аскорбиновая кислота

АФК - активные формы кислорода

ГПО - глутатионпероксидаза

ГР - глутатионредуктаза

ГХН - гипохпорит натрия

дк - диеновые конъюгаты

КД и CT - кетодиены и сопряженные триены

КОЕ - колонии образующие единицы

ОРП - острый распространенный перитонит

ПОЛ - перекисное окисление липидов

сод - супероксиддисмутаза

СРО -свободнорадикальное окисление

ТБК - тиобарбитуровая кислота

Лицензия ИД №03077 от 23.10.00. Подписано в печать 20.02.2015. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman Формат 60 х 84 '/,6. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100. Заказ № 26/2015.

Отпечатано в редакционно-издательском центре ЧГМА 672090, Чита, ул. Горького, 39-а.