Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль НАД+-зависимых механизмов в регуляции нейрон-глиальных взаимодействий при ишемии головного мозга и нейродегенерации

На правах рукописи

Малиновская Наталия Александровна

РОЛЬ НАД+-ЗАВИСИМЫХ МЕХАНИЗМОВ В РЕГУЛЯЦИИ НЕЙРОН-ГЛИАЛЬНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ПРИ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА И НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИИ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

21 НОЯ 2013

005538660

Кемерово - 2014

005538660

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В. Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные консультанты:

доктор медицинских наук,

профессор Салмина Алла Борисовна

доктор медицинских наук,

профессор Прокопенко Семен Владимирович

Официальные оппоненты:

Попонникова Татьяна Владимировна - доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кемеровская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, проректор по научной и лечебной работе

Уразова Ольга Ивановна - доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра патофизиологии, профессор кафедры

Амстиславская Тамара Геннадьевна - доктор биологических наук, Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, лаборатория нейрогеномики поведения, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр неврологии» Российской академии медицинских наук, г. Москва

Защита состоится " " ^—2014 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.035.02 при ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России по адресу: 650029, г. Кемерово, ул. Ворошилова 22а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России

Автореферат разослан "_"_2013 г.

■з

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Разумов Александр Сергеевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Одной из важнейших проблем современной медицины является высокая распространенность патологии ЦНС. В развитых странах смертность от нейродегснеративных и цереброваскулярных заболеваний в структуре общей смертности занимает 2-3-е места, в России наблюдается схожая ситуация (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001). Изучение механизмов повреждения нейронов и глиальных клеток при поражении центральной нервной системы представляет собой актуальную проблему патофизиологии, биохимии, молекулярной и трансляционной медицины. Несмотря на значительное количество исследований, посвященных анализу развития клеточных и молекулярных механизмов нарушения жизнеспособности и функциональной активности нейронов и клеток глиальной природы, современная медицина все еще далека от создания высокоэффективных технологий коррекции дисфункции мозга (Салмина А.Б. и др., 2008).

Острая нейродегенерация. На первом месте среди причин инвалидности, втором месте среди причин смерти человека (в течение года после дебюта заболевания умирают 48% пациентов), и одними из наиболее распространенных заболеваний зрелого, пожилого, а в последние десятилетия и молодого возраста, являются острые нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) ишемического типа. Причем наибольшую долю от всех ОНМК (80%) составляют ишемические инсульты (Костычев Н.А., Коршунова А.Б., 2010).

Гипоксически-ишемическое перинатальное поражение головного мозга (перинатальная гипоксия-ишемия, 111 Й) оказывает существенное влияние на многие индивидуальные особенности физической и интеллектуальной сфер развивающегося организма (Northington F.J. et al., 2005), является одной из основных причин смертности (60% заболевших детей умирает в период новорожденное™) и неврологаческой инвалидности (у 25% выживших детей развивается выраженный неврологический дефицит) (Vannucci R.C. et al., 1999; Tu Y.F. et al., 2011; Dickey E.J. et al., 2011). Последствия ПГИ в раннем детском возрасте проявляются в виде синдромов внутричерепной гипертензии, расстройства функции вегетативной нервной системы, гипервозбудимости и гиперактивного поведения, нарушения моторного развития, симптоматических судорог и пароксизмальных расстройств (Шакина Л.Д., Смирнов И.Е., 2010).

Хроническая нейродегенерация. По разным данным, распространенность болезни Паркинсона (БП) в России колеблется от 117000 до 338000 пациентов.

Болезнь Паркинсона развивается в достаточно молодом возрасте: средний возраст дебюта БП - 55 лет, в то же время, у 10% пациентов БП начинается еще раньше - до 40 лет (Воронина Т.А. и др., 2008).

Нарушения развития мозга. Действие повреждающих факторов в пренатальном или раннем постнатальном периоде может существенным образом повлиять на механизмы развития головного мозга, которое представляет собой сопряженные процессы синаптогенеза, нейрон- пролиферации, дифференцировки и миграции клеток, лежащие в основе сложных форм поведения. Развитие признаков аутистического поведения характерно при действии ряда факторов в пренатальном периоде (вальпроевая кислота, липополисахарид и пр.), что может быть применено в эксперименте для оценки вклада механизмов нарушения развития головного мозга в патогенез нейродегенерации в зрелом мозге (Angelidou A. et al., 2012).

Степень разработанности темы исследования

Известны общие механизмы патогенеза острой и хронической нейродегенерации: развитие воспаления и окислительного стресса (Fukuda S. et al., 2004; Tu Y.F. et al., 2011; Fruhbeis C. et al., 2012), развитие реактивного астро-и микроглиоза (Bemaudin M. et al., 1998; Miller D.W. et al., 2004), нарушение проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) (Baneijee S., Bhat M.A., 2007; Chalbot S. et al., 2010; Onore C.E. et al., 2012), митохондриапьная дисфункция (Miller D.W. et al., 2004), эксайтотоксичность (Jensen F.E., 2005; Matute C., Cavaliere F., 2011), дисфункция нейрон-глиальных взаимодействий (Shaham S., 2005; Ren K., Dubner R., 2008), нарушение нейрогенеза (Arias-Carrion О. et al., 2006; Arias-Carrion O., 2008; Салмина А.Б. и др., 2012), ведущие к клеточной гибели (Pulera M.R. et al., 1998; Гореликов П.Л., Савельев С.В., 2006; Salmina А.В. et al., 2011; Салмина А.Б. и др., 2012). Однако данные о «молекулярных основах» патогенеза острой и хронической нейродегенерации и о взаимосвязи НАД^-зависимых механизмов с проявлениями нейродегенерации были изучены лишь в отношении экспрессии CD38 при аутизме (Higashida Н. et al., 2012).

Известны механизмы, которые могут быть предложены в качестве «мишеней» или «маркеров» при заболеваниях ЦНС (Hirabara S.M. et al., 2012):

НАД^-зависимые механизмы регуляции функциональной активности клеток головного мозга, играющие критическую роль в активации и функционировании нейроглиальных клеток в ответ на различные стимулы, с участием НАД ^зависимых путей метаболизма (пуринергические рецепторы,

НАД^-метаболизирующие ферменты, НАД(Ф)Н-оксидаза), контролирующих гомеостаз НАД4 и его биодоступность для других ферментов, участвующих в процессах матричных синтезов, репарации ДНК, эпигенетических модификациях ДНК и постгрансляционной модификации белков (Aksoy P. et al., 2006; Dong M. et al., 2011).

Молекулярные механизмы нейрон-астроглиальных взаимодействий, важные для реализации феномена метаболического сопряжения и глиоваскулярного контроля, что определяет значение локального микроокружения, формируемого астроцитами, для функционирования нейронов в (пато)физиологических условиях (Aldskogius Н.К., Kozlova E.N., 1998), поэтому идентификация событий, характеризующих нарушение нейрон-астроглиальной коммуникации, определит прогресс в разработке новых, эффективных методов нейропротекции (Gates M.A. et al., 1993; Fields R.D., Stevens В., 2000; Gomes F.C.A. et al., 2001; Ricci G. et al., 2009).

Молекулярные механизмы воспаления в ЦНС, которые играют роль в активации микроглии и астроглии, запускают» локальную гиперпродукцию цитокинов, формирование инфламмасом, изменение экспрессии ряда молекул, определяющих характер межклеточных взаимодействий. Независимо от причины воспаления при нейродегенерации, терапевтические вмешательства, направленные на предотвращение или подавление этих механизмов, могут быть полезными для остановки прогрессии или развития патологического процесса (Velez-Fort M. et al., 2012), однако данные о механизмах развития воспаления при нейродегенерации или нарушениях развития мозга носят противоречивый и неполный характер (Salmina А.В. et al., 2012).

До сих пор затруднено развитие современных методов диагностики, профилактики и терапии заболеваний центральной нервной системы вследствие недостаточной изученности клеточно-молекулярных механизмов повреждения головного мозга, молекул-маркеров патологических процессов, характеризующих общие компоненты патогенеза или обладающих специфичностью в отношении того или иного вида патологии (Mehta S.L. et al., 2007; Hirabara S.M. et al., 2012).

Таким образом, поиск общего и специфического при острой и хронической дегенерации, нарушениях развития головного мозга - был и остается одной из актуальных задач патофизиологии (Pascual J.M. et al., 1998; Ren К., Dubner R., 2008). Кроме того, существует значительная потребность в оценке влияния дизрегуляции межклеточных взаимодействий на реализацию интегративных

функций головного мозга, в том числе регуляцию сложных форм поведения при нейродегенерации и нарушениях развития мозга.

Цель исследования - выявить вклад НАД^-зависимых механизмов дизрегуляции нейрон-глиальных взаимодействий и нарушения сложных форм поведения в патогенез ишемии головного мозга и хронической нейродегенерации (экспериментальная болезнь Паркинсона) в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Изучить экспрессию молекул, участвующих в НАД+-зависимых механизмах внутриклеточной сигнализации и межклеточных взаимодействий (Р2Х7 рецепторы, СВ38/НАД+-гликогидролаза, Сх43, СБ 157) в клетках нейрональной и глиальной природы при ишемии, хронической нейродегенерации.

2. Выявить изменения метаболического статуса и функциональной активности клеток нейрональной и глиальной природы при ишемии, хронической нейродегенерации.

3. Изучить особенности апоптоза при ишемии головного мозга, хронической нейродегенерации, нарушении развития мозга во взаимосвязи с изменением НАД^-зависимых механизмов внутриклеточной сигнализации и межклеточных взаимодействий и механизмами нейровоспаления, контролируемыми НАД+-зависимыми процессами в клетках глиальной природы.

4. Исследовать особенности нейрогенеза в различных регионах мозга при острой и хронической нейродегенерации.

5. Выявить специфические изменения, характерные для острой и хронической нейродегенерации на примере экспериментальных моделей ишемии головного мозга и болезни Паркинсона.

6. Оценить вклад изменения нейрон-глиальных взаимодействий в нарушение регуляции сложных форм поведения при ишемии, хронической нейродегенерации (в том числе при действии фактора, индуцирующего нарушение развития мозга в пренатальном периоде).

7. Патогенетически обосновать теорию нейропротективной стратегии и этиопатогенетической терапии острой и хронической нейродегенерации, идентифицировав новые молекулы-маркеры и молекулы-мишени нарушения нейрон-глиальных взаимодействий и дополнить существующую концепцию патогенеза острой и хронической нейродегенерации, нарушения развития мозга новыми данными о механизмах нарушения нейрон-глиальных взаимодействий.

Научная новизна исследования

Впервые предложены новые молекулы-маркеры и молекулы-мишени для диагностики и фармакологической коррекции активности клеток нейрональной и глиальной природы при ишемии и хронической нейродегенерации.

Впервые показаны особенности экспрессии НДД+-конвертирующих ферментов CD38 и CD 157 в дофаминергических нейронах и клетках глии в среднем мозге во взаимосвязи с развитием характерной неврологической симптоматики при экспериментальной болезни Паркинсона и дана оценка изменения количества CD38-, Р2Х7-, Pgp-, Сх43-, CD157-, Мас-1, СЗ/СЗЬ-экспрессирующих клеток нейрональной и глиальной природы при ишемии и хронической нейродегенерации.

Охарактеризованы новые особенности нарушения НАД+-зависимых механизмов нейрон-астроглиального метаболического сопряжения (уровни НАД1", лактата, активность АДФ-рибозилциклазы) при ишемии и нейродегенерации.

Впервые показаны особенности экспрессии маркера ранних этапов нейрогенеза и апоптоза клеток головного мозга при нарушении НАД-зависимых механизмов межклеточных взаимодействий и развитии нейровоспаления при ишемии, хронической нейродегенерации.

Выявлены новые особенности экспрессии НАД+-конвертирующих ферментов - CD38 и CD157 - в клетках нейрональной и глиальной природы при развитии нейровоспаления, в том числе во взаимосвязи с НАД+-транспортирующими системами (Сх43) и молекулами, регулирующими провоспалительный потенциал клеток микроглии (Мас-1, СЗ/СЗЬ).

Впервые установлено, что действие фактора, нарушающего развитие головного мозга в пренатальном периоде (вальпроат-индуцированная модель аутизма) существенно меняет профиль неврологической симптоматики и реализации сложных форм поведения при развитии экспериментальной болезни Паркинсона, однако доминирующими остаются проявления нейродегенерации.

Теоретическая значимость работы состоит в установлении новых молекулярных механизмов патогенеза острой и хронической нейродегенерации: дополнены данные как о неспецифических механизмах патогенеза острой и хронической нейродегенерации (экспрессия молекул внутриклеточной сигнализации и межклеточных взаимодействий [CD157, CD38, Сх43], нейровоспаления [Р2Х7, Macl, СЗ-СЗЬ], схожие особенности клеточной гибели и нейрогенеза, повышение концентрации лактата и снижение НАД4), так и

специфических особенностях их патогенеза (разнонаправленная метаболическая активность клеток: при ишемии головного мозга отмечается снижение АДФ-рибозилциклазной и функциональной активности клеток ЦНС, при болезни Паркинсона - их увеличение) и выявлении взаимосвязи между молекулярными механизмами и развитием неврологического дефицита при острой и хронической нейродегенерации.

Практическая значимость и внедрение результатов

Разработан новый метод регистрации функциональной активности клеток головного мозга по кинетике их аутофлуоресценции, рекомендуемый для применения при проведении экспериментальных исследований в нейробиологии, нейрофармакологии, нейрохимии.

При последующей разработке персонифицированных методов диагностики и терапии ишемического повреждения и хронической нейродегенерации могут быть использованы полученные данные о молекулах-маркерах и молекулах-мишенях, определяющих характер протекания НАД+-зависимых процессов внутриклеточной сигнализации и межклеточных взаимодействий (CD157, CD38, Сх43), нейровоспаления (Р2Х7, НАДФН-оксидаза, Macl, СЗ-СЗЬ).

Уточненные механизмы развития ишемического повреждения головного мозга, хронической нейродегенерации (экспериментальная болезнь Паркинсона), ассоциированные с нарушением нейрон-глиальных взаимодействий и сложных форм поведения, существенно дополняют концепцию патогенеза повреждения клеток центральной нервной системы и нарушения интегративных функций головного мозга.

Получен патент на изобретение: «Способ коррекции постишемической когнитивной дисфункции» (2008).

Результаты проведенного исследования внедрены в научный процесс НОЦ «Трансляционная медицина» и НИИ молекулярной медицины и патобиохимии при ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России (акт внедрения от 06.09.2013), учебный процесс кафедры биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России (курс «Трансляционная медицина» на русском и английском языках для студентов 5 курса лечебного факультета, курс «Нейробиология развития. Новые молекулы-маркеры и молекулы-мишени для

диагностики и терапии заболеваний головного мозга» на русском и английском языках для аспирантов КрасГМУ, акт внедрения от 06.09.2013).

Методология и методы исследования

Работа носит экспериментальный характер. Материал исследования -крысы линии Wistar. Для решения поставленных задач выполнено моделирование острой и хронической нейродегенерации, поведенческое фенотипирование животных и оценка у них интегративных функций головного мозга, проведены физико-химические (флуориметрические и фотометрические методы) и клеточно-биологические (иммуногистоцитохимия, TUNEL, флуоресцентная и конфокальная микроскопия) методы исследования на полученных образцах головного мозга; достоверность полученных данных подтверждена методами статистического анализа.

Положения, выносимые на защиту:

1. В патогенезе ишемического повреждения мозга и хронической нейродегенерации важную роль играют нарушения НАД'-зависимых механизмов внутриклеточной сигнализации и межклеточных взаимодействий, связанные с развитием астро- и микроглиоза, сопровождающиеся изменением экспрессии Р2Х; рецепторов, СБ38/НАД+-гликогидролазы и Сх43, с преимущественной локализацией CD38 в активированных астроцитах и уменьшением активности АДФ-рибозилциклазы при ишемии головного мозга, преимущественной локализацией CD38 в астроцитах и активированной микроглии и увеличением активности АДФ-рибозилциклазы при экспериментальной болезни Паркинсона. Маркерами нарушения нейрон-глиальных взаимодействий при ишемии и хронической нейродегенерации являются уровни лактата и НАД+ во внеклеточном пространстве, экспрессия CD38 и Сх43 в клетках нейрональной и астроглиальной природы, экспрессия CD157, Мас-1 и СЗ/СЗЬ в клетках микроглиальной природы. Увеличение экспрессии CD38, Сх43 и Р2Х7 маркирует повреждение клеток «вторичного» характера (вследствие высвобождения активных метаболитов во внеклеточное пространство) при острой ишемии и хронической нейродегенерации.

2. Развитие ишемического повреждения и хронической нейродегенерации сопровождается появлением признаков повреждения ткани: увеличенная экспрессия Р2Х7 рецепторов, CD38, Мас-1 и СЗ/СЗЬ, и признаков восстановления поврежденных клеток: увеличенная экспрессия Рахб в гиппокампе или среднем мозге, экспрессия Р-гликопротеина, снижение уровня НАД', динамическое равновесие между которыми определяет развитие апоптоза

клеток нейрональной и глиальной природы в поврежденной области мозга, а также неврологической симптоматики, характерной для ишемии или экспериментальной болезни Паркинсона. Увеличение экспрессии Мас-1 в среднем мозге при экспериментальной болезни Паркинсона и в пораженной области коры мозга при ишемии сопровождается увеличением экспрессии СЗ/СЗЬ, что свидетельствует о вкладе комплемент-опосредованного механизма повреждения клеток в патогенез острой и хронической нейродегенерации. Коэкспрессия CD157 с комплексом CDllb/CD18 характеризует изменение С0157-контролируемых механизмов регуляции уровня НАД+ в активированных клетках микроглии.

3. Экспрессия CD38 на клетках нейрональной и глиальной природы дифференцирует процессы, сопровождающие развитие острой и хронической нейродегенерации: при ишемическом повреждении мозга нейрональная экспрессия CD38 соответствует усилению нейрогенеза в коре и гиппокампе, а астроглиальная экспрессия CD38 характеризует интенсивность локального метаболизма НАД1"; при болезни Паркинсона нейрональная и астроглиальная экспрессия CD38 соответствует реакции активированной микроглии, микроглиальная экспрессия CD38 характеризует интенсивность развития апоптоза в среднем мозге. Активность НАД(Ф)Н-оксидазы в клетках микроглии меняется однонаправленно с активностью АДФ-рибозилциклазы/СБ38, причем при ишемии головного мозга активность ферментов уменьшается, а при экспериментальной болезни Паркинсона - увеличивается.

4. Нарушение НАД*-зависимых механизмов нейрон-глиальных взаимодействий, определяющее чувствительность клеток к действию апоптогенных стимулов, находит свое отражение в развитии неврологической симптоматики и поведения, специфически характеризующих повреждение клеток при острой ишемии и экспериментальной болезни Паркинсона (в том числе на фоне действия индуктора нарушения развития головного мозга в пренатальном периоде).

5. Направленная регуляция НАД^-зависимых механизмов межклеточных взаимодействий достигается применением модуляторов активности CD38, нуклеотидных рецепторов Р2Х7 подтипа, НАД(Ф)Н-оксидазы в клетках нейрональной и глиальной природы.

Степень достоверности полученных результатов

Все научные положения и выводы обоснованы применением системного анализа поставленной проблемы, современных методов нейробиологии,

достоверной выборкой исследуемых животных, большим объемом фактического материала, который подвергнут адекватному статистическому анализу.

Апробация результатов

Основные положения работы были доложены и обсуждены на школе-семинаре для молодых ученых «Новые терапевтические стратегии: клеточно-молекулярные мишени действия» в рамках Сибирского конгресса «Человек и лекарство» (Красноярск, 2009), IV,VI и VII Российско-Японских семинарах по нейронаукам (Красноярск, 2009, 2011, 2012), симпозиуме «Образование и интеграция специалистов в области медицинской генетики и молекулярной медицины» в рамках I Российского конгресса с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное» (Москва, 2010), 1 международной 3D онлайн-конференции «Фундаментальная медицина: от скальпеля - к геному, протеому и липидому» (Казань, 2011), международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011), Школе молодых ученых «Экспериментальные модели заболеваний центральной нервной системы» в рамках выездного Пленума проблемной комиссии «Фундаментальные вопросы нейронаук» Научного Совета РФ по неврологии (Красноярск, 2011), III Съезде физиологов СНГ (Украина, Ялта, 2011), II Всероссийской Интернет-Конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2011), международном конгрессе «BITs 2nd Annual World Congress of NeuroTalk» (Dalian, China, 2011), I Международной Интернет-Конференции «Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы» (Казань, 2012), научных семинарах научно-образовательного центра «Трансляционная медицина», НИИ молекулярной медицины и патобиохимии КрасГМУ (Красноярск, 2010-2013).

Публикации по теме диссертации

Результаты проводимых исследований опубликованы в 46 печатных работах, 16 из которых - в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук, 2 - в зарубежных изданиях, получен патент РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 262 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материал и методы, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов), выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа иллюстрирована 10

рисунками, 65 таблицами и 22 приложениями. Библиографический список состоит из 420 источников (68 отечественных и 352 зарубежных).

Личный вклад автора

Разработка дизайна исследования, анализ литературных данных, сбор, анализ, статистическая обработка материала, написание диссертации и научных публикаций по теме исследования выполнены лично автором.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Исследование одобрено Локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России и поддержано грантами: госконтракт №02.442.11.7407 на выполнение научно-исследовательских работ (2006-РИ-19.0/001/625, 2006-2007); международный благотворительный фонд "SM.Charity" (2008-2009); грант КрасГМУ Б (2008-2009); ККФПН и НТД (2010); грант КрасГМУ 2010 года (2010-2011); ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной Россию) (проект № 8061, 2012-2013), конкурс Совета по грантам Президента РФ по государственной поддержке молодых российских ученых - кандидатов наук в 2012 году (проект № МК-6907.2012.7,2012-2013).

Материалом исследования являлись самцы белых нелинейных и линейных (Wistar) молодых крыс возрастом 3-4 месяца (модель ишемии головного мозга, п=70) и зрелых крыс возрастом 11-12 месяцев (модель ротенонового паркинсонизма, п=75), нелинейные и линейные крысята обоего пола возрастом 7 дней (модель 111 И, п=15) и 1-60 дней (модель нарушения развития головного мозга, п=48). Животных декапитировали под фторотановым наркозом и на льду производили забор исследуемых областей головного мозга (кора передних полушарий головного мозга и средний мозг). Забор материала проводили на 30-е сутки с момента моделирования экспериментальной БП и на 60-е сутки постнатального развития животных с моделью нарушения развития мозга, через 24 и 48 часов после создания ишемии, через 72 часа - при ПГИ.

Моделирование острой глобальной неполной ишемии головного мозга крыс осуществлялось анестезированным животным (фторотан ингаляционно) путем экстравазальной окклюзии (перевязки лигатурой) общих сонных артерий (ОСА) в течение 24 и 48 часов, использовались два варианта: неполная глобальная ишемия с более легким течением - унилатеральная перевязка правой OCA (Levine S., Payan Н., 1966) и неполная глобальная ишемия с более тяжелым

течением - билатеральная перевязка OCA (Eklof В., Siesjo В. К., 1972). Моделирование перинатальной гипоксии-ишемии головного мозга осуществлялось на 7 сутки постнатального развития крысят путем экстравазальной окклюзии правой ОСА с последующим помещением крысят на 1 час в атмосферу с низким содержанием (8%) кислорода при температуре 28-30°С (Rice J. et al., 1981). Экспериментальная ротеноновая модель паркинсонизма выполнялась по методикам R. J. Ferrante et al. (1997) и Т. В. Sherer (2003) с модификациями. Данная модель представляет собой хроническое системное введения ротенона (ежедневные подкожные инъекции, 1-3 мг/кг/сут) с растворителем (100% ДМСО). Экспериментальная модель нарушения развития головного мозга создавалась путем подкожных инъекций беременным самкам крыс на 12-й день после зачатия либо 0,5 мг/кг веса ротенона в растворителе (100% ДМСО, группа Э7, п=17), либо комбинацию вальпроевой кислоты и ротенона (инъекция 500 мг/кг веса вапьпроевой кислоты в физиологическом растворе и инъекция 0,5 мг/кг веса ротенона в растворителе, группа Э8, п=11), либо 500 мг/кг веса вальпроевой кислоты (классическая модель аутизма, группа Э9, п=7), либо растворитель (100% ДМСО, группа Кб, п=13) из расчета 1 мл/кг веса.

Тесты поведенческого фенотипирования животных в моделях острой и хронической нейродегенерации включали осмотр животных и проведение тестов на наличие специфических признаков паркинсонизма (гипо-, бради-, олигокинезия, постуральная нестабильность, неустойчивость походки, ригидность мышц, тремор покоя и суммарная выраженность признаков паркинсонизма в баллах: от 1 до 18 при осмотре животных; нарушение горизонтальной и вертикальной двигательной активности, эмоциональности крыс, наличие вегетативной дисфункции; скорость и траектория движения крыс в тесте «открытое поле») и аутизма (агрессия и/или аутоагрессия, наличие стереотипных повторяющихся движений - аутогруминга и рытья подстилки в соответсвующих тестах - с трубой на агрессию, на аутогрумминг и тест «рытье подстилки») в моделях хронической нейродегенерации, шкалу NSS (Neurological Score System) для оценки неврологического дефицита животных в моделях острой нейродегенерации (Speiser Z. et al., 2007), тесты для оценки сенсомоторной и моторной дисфункции передних и задних конечностей («сужающаяся дорожка» для оценки моторной функции задних конечностей; «вибриссовый» тест для выявления сенсомоторной дисфункции передних конечностей; «вермишелевый», «семечковый» и «лестничный» тесты для оценки

мелкой моторной функции передних лап), тест для оценки ольфакторной функции крыс, тесты для оценки состояния неврологических рефлексов и физического развития животных при моделировании нарушений развития головного мозга. При осмотре животных в моделях острой нейродегенерации также учитывалась смертность крыс в группах, вычисляемая в процентах от общего числа крыс в группе.

Тесты для оценки интегративных функций головного мозга у исследуемых животных включали оценку социальной (тесты «3-камерная активность», «с трубой на агрессию»), когнитивной (тесты «водный лабиринт Морриса», Барнса, «Т-образный лабиринт», «распознавание нового объекта») и эмоциональной (тест приподнятый крестообразный лабиринт) сфер (Гуляева Н.В. и др., 1996; Ge Z-D. et al., 2002; Левин О.С., Докадина Л.В., 2005; Harrison F.E. et al., 2006; Салмина А.Б. и др., 2007; Waif A. A., Frye С.А., 2007; Леушкина Н.Ф. и др., 2010). Часть параметров тестов поведенческого фенотипирования записывались и оценивались с помощью программы для видеотрекинга ANY-maze (фирма Stoelting Co., США), остальные параметры оценивались вручную при анализе видеофайлов.

Иммуногистоцитохимическая оценка экспрессии (CD38, Р2Х7 рецепторы, тирозин-гидроксилаза, компонент комплемента СЗ/СЗЬ, транскрипционный фактор Рахб, Р-гликопротеин) и коэкспрессии (CD38 и тирозингидроксилазы, CD38.H маркеров вида клеток [NSE, GFAP, МАР2], CD38 и Сх43, «тройная» коэкспрессия CD157/CD1 lb/CD18) антигенов проводилась на замороженных и парафиновых срезах или суспензии клеток головного мозга согласно стандартным протоколам иммунофлуоресцентного варианта прямого и непрямого методов иммуногистохимии (для оценки экспрессии), одновременного или последовательного комбинированного (анализ коэкспресссии 2-3 антигенов) окрашивания препарата (Cuello А. С., 1993).

Идентификация апоптоза клеток головного мозга методом TUNEL выполнялась на замороженных и парафиновых срезах аффектированных регионов (средний мозг и кора больших полушарий) головного мозга согласно стандартным протоколам фирм-производителей (наборы «Mebstain Apoptosis Detection kit», Immunotech, Франция; «Apo-BrdU Apoptosis Detection Kit 886671», Millipore, США). При микроскопии регистрировались участки специфической фрагментации ДНК (FITC-метка), производился подсчет количества FITC-позитивных клеток на 100-300 клеток при анализе не менее 10 полей зрения.

Флуоресцентную микроскопию проводили при увеличении 450-1000 (микроскоп «Люмам Р8», ОМО, Россия/Olympus СХ41, Olympus, Япония; видеосистема для анализа изображений Nikon Coolpix 4500, Nicon, США/видеокамера Olympus DP71, Olympus, Япония; программа для обработки изображений и морфометрии Cell-F). Подсчет относительного количества клеток, экспрессирующих соотвествующий антиген, производился на 100-300 клеток в образце при анализе не менее 10 полей зрения.

Конфокальную микроскопию проводили с помощью полностью автоматизированного конфокального лазерного сканирующего микроскопа с водной иммерсией Olympus FV10i-W (Olympus, Япония). При анализе фотоснимков с конфокального микроскопа подсчитывали коэффициент колокализации (Colocalisation Test) антигенов (CD38/NSE, CD38/GFAP, CD38/MAP2, CD157/CDllb/CD18) и плотность интенсивности флуоресценции антигенов (СЗ/СЗЬ, Рахб) на единицу площади (IntDen/Area) с помощью программы MacBiophotonics ImageJ.

Гомогенат ткани дня флуориметрических и фотометрических исследований получали путем механической гомогенизации исследуемых участков головного мозга в 2 мл буферного раствора (PBS), затем полученный гомогенат разводили в 10 раз, разделяли на несколько аликвотов, манипуляции производили на льду, все измерения проводились на спектрофлуориметре СМ 2203 («COJIAP», Беларусь). АДФ-рибозилциклазная активность измерялась согласно стандартному протоколу (Graeff R.M. et al., 1994). Активность АДФ-рибозилциклазы вычислялась по разнице амплитуды флуоресценции (возбуждение 1=300 нм, эмиссия 1=410 нм, 37°С, условие постоянного перемешивания, измерение флуоресценции против контроля, не содержащего никотинамидгуаниндинуклеотид - НГД*) между 20-й и исходной минутами и выражалась в ед/мин/мг белка. Содержание белка определяли микрометодом Лоури без осаждения белка по протоколу фирмы-производителя (набор «Total Protein Kit, Micro Lowry, Peterson's Modification», Sigma-Aldrich, США), проводили фотометрию (поглощение между 500 и 800 нм, против контроля, не содержащего клеточной суспензии). Функциональная активность клеток головного мозга оценивалась на свежевыделенном гомогенате ткани по интегральным кривым кинетики их аутофлуоресценции при длине волны, соответствующей редокс-трансформации внутриклеточных пиридиновых нуклеотидов [в том числе и НАД(Ф)Н] по оригинальной методике (Салмин В.В. и др., 2006). Для количественной оценки функциональной активности клеток

использовались максимальная амплитуда интегральной кривой (отн. ед.) и время достижения полувысоты (т/2) интегральной кривой (сек.). Модуляция АДФ-рибозилциклазиой и функциональной активности осуществлялась непосредственно перед флуориметрическим анализом аденозинтрифосфатом (1 мМ АТФ, инкубация 15 минут, 37°С), окисленной формой АТФ (100 мкМ оАТФ: сначала образец инкубируют с 5 мкМ АТФ 15 минут при 37°С для активации нуклеотидных рецепторов, затем инкубируют с оАТФ 60 минут, 37°С), никотинамидадениндинуклеотидом (1 мМ НАД1', инкубация 15 минут, 37°С); дифениленйодониумом (только для функциональной активности; 10 мкМ DPI, 45 минут, 22°С).

Определение концентрации НАД1" в гомогенатах ткани головного мозга проводилось спектрофотометрическим методом (Nisselbaum J.S. et al., 1969), продукт реакции определялся в динамике при поглощении (37°С, 30 минут, режим постоянного перемешивания, кинетика фотометрии при X = 556 нм), результат реакции выражали в ммоль НАД7мг белка ткани. Определение концентрации лактата в гомогенатах ткани мозга проводилось спектрофотометрическим методом (Hohorst HJ., 1957), в динамике измеряли поглощение при 340 нм против контроля, не содержащего гомогечат, результат реакции выражался в мкг/мл.

Статистический анализ полученных результатов проводился с использованием программ Stätplus Professional 2009 и Statistica v. 6.0. В пределах каждой выборки определяли нормальность распределения (по критерию Шапиро-Уилка), дисперсию, среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение, ошибку среднего. Сравнение средних осуществляли с помощью Т-теста (гетеро- или гомоскедастического), U критерия Манна-Уитни (для порядковых и непараметрических количественных шкал). Изучение взаимосвязи признаков (г) проводилось с помощью линейных корреляций Пирсона или ранговых корреляций Спирмена (Рокитский П.Ф., 1973; Гайдышев И. 2001; Шапиро JI.A., Шилина Н.Г., 2003). Все результаты представлены в виде М±т, где М — среднее значение, т - ошибка среднего, р - уровень значимости: * - приемлемая граница значимости (р<0,05); ** - результат значим (р<0,01); *** (р<0,005) и **** (р<0,001) - результат высоко значим.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

При создании модели болезни Паркинсона (БП) на нелинейных животных были определены сроки забора материала: начиная с 7 суток с момента

моделирования паркинсонизма, у экспериментальных животных наблюдалось значимое нарастание суммарного значения исследуемых признаков паркинсонизма; пики наибольшей выраженности признаков наблюдались на 28-е сутки, эти же сроки (28-30-е сутки) являются наиболее подходящими для забора материала от животных.

Поведенческое фенотипирование крыс с ротеноновой моделью хронической нейродегенерации подтвердило развитие признаков паркинсонизма у экспериментальных животных в сравнении с контрольными (значимое нарастание олигокинезии, постуральной нестабильности, неустойчивости походки, уменьшение пройденного пути, дисфункция равновесия, появление тремора и ригидности мышц, увеличение латентного периода с момента посадки крысы, уменьшение средней скорости движения крыс в тесте, снижение горизонтальной двигательной активности крыс) и выявило продолжительные эпизоды аутогрумминга, характерные для расстройств аутистического спектра, появление моторной дисфункции конечностей. Фенотипирование поведения крыс с моделями острой нейродегенерации выявило наличие у крыс неврологического дефицита легкой, средней тяжести и тяжелого, являющегося в некоторых случаях летальным (при тяжелой ишемии — 50%), наличие мотосенсорной дисфункции конечностей.

Поведенческое фенотипирование крысят на 1-17 сутки развития в моделях внутриутробного воздействия ротенона, вальпроевой кислоты и их комбинации выявило значимое отставание в развитии некоторых рефлексов и признаков физического развития животных в сравнении с контролем (открытие глаз, вес крысят), однако по некоторым рефлексам, напротив, отмечалось значимое ускорение их развития (более раннее появление отрицательного геотаксиса и прорезывания резцов в экспериментальных группах). Некоторые параметры (рефлекс поднятия головы и передних лап) отличались значимо в группе с «классической» моделью аутизма в сравнении с остальными группами, в отношении других (рефлекс опоры на задние конечности и подъема всего тела, открытие глаз, отставание в весе на 7 и 14 сутки наблюдения, более позднее выполнение плавательного теста) - отмечались значимые различия в группах с приложением ротенона или ротенона и вальпроевой кислоты в сравнении с контролем и «классической» моделью аутизма с приложением вальпроата.

Поведенческое фенотипирование крысят в более поздние сроки развития (60-е сутки) обнаружило появление у крысят с моделью нарушения развития головного мозга легкой неврологической дисфункции (связана главным образом

с нарушением равновесия), наличие особенностей, характерных для паркинсонизма (появление тремора и нарушения равновесия, значимое нарастание суммы баллов в экспериментальных группах в сравнении с контрольной, значимые различия горизонтальной двигательной активности, средней скорости движения крыс, латентного периода «замирания» крыс; однако эти различия менее выражены, чем у взрослых животных) и аутизма (значимое увеличение продолжительности аутогрумминга и рытья подстила, увеличение времени контакта с ранее «знакомой» крысой в сравнении с контролем при сохранении социального интереса к «незнакомой» крысе).

Изучение интегративных функций крыс выявило следующие изменения: у животных с ротеноновой моделью БП наблюдалось нарушение социального распознавания при межсамцовых взаимодействиях, нарушение эмоциональности по типу тревожности и синдрома гиперактивности/дефицита внимания, появление когнитивной дисфункции при исходно интактной когнтивной функции; при нарушении развития головного мозга у крыс когнитивная функция не страдала; при острой нейродегенерации развилась когнитивная дисфункция у животных с моделями ишемии путем 2-сторонней (через 24 и 48 ч) и 1-сторонней (только через 48 ч) перевязки ОСА при исходно нормальной пространственной памяти.

Таким образом, одним из аспектов патогенеза нейродегенерации является дизрегуляция и нарушение сложного поведения, связанного с интегративными функциями мозга, контролирующими когнитивные функции, социальное и эмоциональное поведение.

Кроме «классических» звеньев патогенеза острой и хронической нейродегенерации (нейровоспаление, эксайтотоксичность, окислительный стресс и т.д.), приводящих к гибели клеток, относительно недавно были обнаружены новые патогенетические механизмы, играющие критическую роль в гомеостазе уровня нуклеотидов, активации и функционировании клеток головного мозга, их гибели и жизнеспособности, в ответ на повреждающие воздействия, в их числе -механизмы утилизации НА/Г (НАД^-гликогидролазы/АДФР-циклазы, ПАРП, моноАДФ-рибозилазы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа и другие ферменты) и ассоциированные с ними молекулы (нуклеотидные рецепторы Р2Х и Р2У типов, белки щелевых контактов, аденозин, АТФ, глутамат и др.), которые могут играть роль и в нейрон-глиальных взаимодействиях в норме и при патологиях ЦНС. Вместе с тем, в литературе присутствует мало информации о роли этих механизмов в регуляции и дисфункции нейрон-глиальных

взаимодействий при острой и хронической нейродегенерации.

Обнаружено повышение количества клеток, экспрессирующих С038, у экспериментальных животных (таблицы 1-2). Получены данные о локализации СВ38 диффузно в цитоплазме клеток, в перикариальной области и по ходу отростков нервных клеток (рисунок 1), что соответствует литературным данным (М^сшисЫ М. е( а1., 1995; УагпаАа М. е1 а1., 1997) об особенностях экспрессии СБ38 в клетках головного мозга (нейронах и астроцитах).

Рисунок 1 — Внутриклеточная локализация антигена СБ38 в клетках среднего мозга (конфокальная микроскопия, х900)

Таблица 1 - Коэкспрессия СВ38/тирозингияроксилазы(ТГ) в среднем мозге

Клеточные субпопуляции (на 100 клеток) Группы животных

К5 (растворитель), п=9 Э6 (ротенон, БП), п=11

Кол-во С038+ клеток, % 2,3±0,79 7,6±1,70*

Кол-во ТГ+ клеток, % 21,8±2,84 6,7±0,95****

Кол-во коэкспрессир. СБ38/ТГ клеток, % 0,44±0,29 4,8±1,39*

Кол-во коэкспрессир. С038/ТГ' в % ог ТГ+ 2,2±1,5 32,0±8,7*

Кол-во коэкспрессир. С038/ТГ в % от СБ38+ 10,0±6,7 30,6±9,0

Суммарное кол-во СБ38+ клеток, % 2,8±0,86 12,5±2,36****

Суммарное кол-во ТГ+ клеток, % 22,2±2,82 11,5±1,82**

Примечание: * - уровень значимости при сравнении экспериментальной группы с моделью БП с контролем

При хронической нейродегенерации отмечается резкое снижение количества тирозингидроксилаза-экспрессирующих клеток, что является подтверждением создания модели болезни Паркинсона и свидетельствует о выраженной гибели дофаминергических нейронов (таблица 1). Обнаруженное увеличение числа клеток, коэкспрессирующих тирозингидроксилазу и СБ38, указывает на потенциальную роль СБ38 в реализации повреждения и гибели

дофаминергических нейронов, а рост числа клеток, не относящихся к дофаминергическим (позитивны только на С038) указывает на потенциальную роль СЭ38 во взаимодействии дофаминергических нейронов с другими типами клеток, приводящем к их гибели.

Таблица 2 - Количество CD38- и Р2Х7 рецептор-экспрессирующих клеток головного мозга крыс

Группы животных Параметры

CD38+, % Р2Х7+, %

К1 (интактные крысы, п=10) - 10,1±2,4

К2 (контроль, 24 ч, п=10) 10,4±1,5 13,5±4,0

КЗ (контроль, 48 ч, п=10) 12,3±1,2 15,9±1,8

К4 контроль для ПГИ, 72 ч, п=10) 4,1±0,7 -

К5 (растворитель, п=9) 2,8±0,86 0,6±0,4

Э1 (2-стор. ОСА, 24 ч, п=10) 16,5±2,1 36,5±10,0

Э2 (2-стор. ОСА, 48 ч, п=10) 37,1±2,2 53,1±10,1

ЭЗ (1-стор. ОСА, 24 ч, п=10) 31,0±2,3 -

Э4 (1-стор. ОСА, 48 ч, п=10) 30,0±2,2 -

Э5 (ПГИ, 72 ч, п=10) 7Д±1,1 -

Э6 (ротенон, БП, п=11) 12,5±2,36 26,2± 11,6

CD38+: рк2-31<0,05 рк2-эз<0,001 рЮ-э2<0,01 рк5-эб<0,001 Р2Х7+: рк!-э1<0,01 ркз.Э2<0,001 Рк5-э«<0,01

Выявлено, что развитие острой и хронической нейродегенерации характеризуется увеличением количества CD38- и Р2Х7-экспрессирующих клеток и процента клеток в апоптозе (Таблицы 2, 3), что согласуется с литературными данными об особенностях экспрессии CD38 и Р2Х7 рецепторов на клетках ЦНС (Mizuguchi M. et al., 1995; Yamada M. et al., 1997; Sun S.H. et al., 1999; Melani A. et al., 2006; Yu Y. et al., 2008).

В физиологических условиях выявлены сильные корреляции и корреляции умеренной силы у 10-дневных крысят (между количеством апоптотических клеток и CD3 8-экспрессирующих клеток г=0,59) и у крыс молодого возраста (между количеством CD38- и Р2Х7-экспрессирующих клеток г=-0,48, между количеством апоптотических клеток и СВ38-/Р2Х7-экспрессирующих клеток, г=0,33-0,9 в разных подгруппах контроля в случае CD38 и г=-0,48 в случае Р2Х7

рецепторов), у крыс зрелого возраста в норме подобных корреляций обнаружено не было. При ишемии головного мозга у крыс молодого возраста сохраняются корреляции между количеством апоптотических и СБ38-позитивных клеток (г=0,50), апоптотических и Р2Х7-позитивных клеток (г= -0,91), количеством Р2Х7- и СБ38-позитивных клеток (1=0,96) и появляются корреляции между количеством апоптотических клеток и С038-экспрессирующих клеток (г= -0,3) у зрелых крыс с хронической нейродегенерацией.

Таблица 3 - Идентификация апоптоза клеток головного мозга методом TUNEL

Группы животных % клеток в апоптозе

К1 (интактные крысы), п=6 7,0±1,7

К2 (контроль, 24 ч), п=6 9,6±2,0

КЗ (контроль, 48 ч), п=6 4,6±1,6

К4 (контроль для ПГИ, 72 ч), п=10 3,6±1,3

К5 (растворитель), п=14 6,9±1,2

Э1 (2-сторонняя ОСА, 24 ч), п=10 42,9±9,4

Э2 (2-сторонняя ОСА, 48 ч), п=8 28,7±3,0

Э5 (ПГИ, 72 ч), п=10 5±0,9

Э6 (ротенон, БП), п=14 15,2±4,5

Pkioi<0,001 Рк1-э2<0,005 Рк2-Э1<0,005 Ркз.э2<0,005 рК4-э5<0,05 рК5-Эб<0,05

С учетом данных об особенностях экспрессии Р2Х7 и CD38 на клетках нервной системы, очевидно, что увеличение количества Р2Х7- и CD38-позитивных клеток в поврежденных участках мозга может усугублять повреждение клеток нервной системы за счет повышения внутриклеточного уровня кальция, что, согласно литературным данным, может привести к «кальциевой перегрузке клеток», истощению содержания внутриклеточного НАД1", индукции клеточной гибели (Zambón A. et al., 1994; Labasi J.M. et al., 2002) и активации функциональной активности клеток ЦНС. Предполагаем, что эта активация связана главным образом с фагоцитами головного мозга («отдыхающая» микроглия, периваскулярные макрофаги и перициты, «патрулирующие» макрофаги) (Guillemin G.J., Brew B.J., 2004).

Фенотипирование видов клеток головного мозга (нейроны, астроциты и микроглия), экспрессируюших CD38 в среднем мозге, подтвердило наши предположения и выявило преимущественную экспрессию CD38 при болезни

Паркинсона в астроцитах и микроглии. Выявленные результаты, а также тенденции к усилению экспрессии СБ38 в нейронах, подтверждают возможную роль СЭ38 в реализации нейрон-глиальных (нейрон-астроглиальных и нейрон-микроглиальных) взаимодействий, приводящих в конечном счете к повреждению и гибели дофаминергических нейронов черного вещества, что и наблюдается в патогенезе болезни Паркинсона (таблица 4). В патогенезе острой нейродегенерации на примере ишемии головного мозга взрослых животных фенотипирование СБ38-экспрессирующих клеток выявило преимущественную экспрессию СТ)38 на астроцитах через 24 и 48 часов с момента развития ишемии.

Таким образом, основными клетками, экспрессирующими СБ38 в период 24-48 часов с момента развития ишемии головного мозга у крыс являются астроциты, а через 28 суток с момента развития хронической нейродегенерации, являются астроциты и микроглия, что косвенно свидетельствует о развитии реактивного астроглиоза и микроглиоза в патогенезе нейродегенерации.

Таблица 4 - Фенотипирование С038-позитивных клеток головного мозга (в % от общего количества клеток)

Нейроны Астроциты Активир. микроглия

(МБЕ+) (вРАР+) (МАР2+)

К1 (интактные крысы), п=5 3,2±1,06 2,4±0,40 5,5±1,41

К2 (контроль, 24 ч), п=5 2,7±0,51 4,7±1,32 4,2±0,43

КЗ (контроль, 48 ч), п=5 3,3±0,58 5,6±0,78 3,2±0,57

К5 (растворитель), п=5 7,3±0,87 3,0±0,60 4,2±0,75

Э1 (2-стор. ОСА, 24 ч), п=5 2,6±0,15 9,9±4,35 9,8±2,22

Э2 (1-стор. ОСА, 48 ч), п=5 4,6±1,12 10,4±0,92 11,6±2,49

Э6 (модель БП), п=5 9,1±0,10 13,3±1,96 13,1±2,11

ШЕ+: нет значимых результатов СРАР+: Рю-Э1<0,01 ркьэ2<0,01 ркг-э1^0,01 Ркз-Э2<0,01 ркз-эб<0,05 МАР2+: рК5.Эб<0,01

Возможно участие гликопротеида СБ38 в реализации апоптоза клеток головного мозга в периоде постнатального развития в физиологических условиях, при острой и хронической нейродегенерации. Вероятнее всего, эти эффекты опосредуются повышением содержания внутриклеточного кальция, что может наблюдаться при генерации АДФР-циклазой кальций-мобилизующих вторичных посредников (цАДФ-рибоза, НААДФ4). Полученные данные

соответствуют существующим представлениям о функционировании С038 в качестве редокс-сенсора, который сопрягает изменения клеточного редокс-потенциала и механизм высвобождения кальция из внутриклеточных депо (Впкгопе Б. с1 а1., 2001; Deshpande Б.А. й а1„ 2005).

У 10-дневных крысят при ПГИ обнаружено увеличение количества Сх43+ клеток, при хронической нейродегенерации также отмечено значимое увеличение их коэкспрессии с СБ38 (таблица 5).

Таблица 5 - Коэкспрессия Cx43/CD38 в клетках головного мозга крыс

Группы животных Сх43+ CD38+ CD38+/Cx43+

К4 (контроль для ПГИ, 72 ч), п=5 7,7±1,8 - 6,2±1,9

Э5 (ПГИ, 72 ч), п=5 13,1±1,0* - 10,1±1,3*

К5 (растворитель), п=5 1,8±0,6 4,2±2,4 5,2±1,7

Э6 (ротенон, БП), п=5 2,9±1,0 4,5±1,0 12,9±1,7**

ЭЗ, ишемизир. полушарие (24 ч), п=5 17,8±0,8 15,5±2,7 22,9±2,4

ЭЗ, контралатер. полушарие (24 ч), п=5 16,5±2,4 4,1±2,3* 25,0±6,2

Э4, ишемизир. полушарие (48 ч), п=5 21,5±0,8 11,5±0,3 26,2±2,9

Э4, контралатер. полушарие (48 ч), п=5 21,1±2,0 8,7±1,4 24,2±2,8

Примечание: * - уровень значимости при сравнении экспериментальных групп с контрольными в моделях 111И и БП и ишемизировашюго полушария с контр алатеральным в модели ишемии головного мозга

Увеличение коэкспрессии СЭ38 с коннексином 43 свидетельствует о том, что большинство Сх43+-клеток одновременно являются С038-иммуннопозитивными (более 75% у крысят, свыше 53% у молодых и более 67% у зрелых крыс) как в головном мозге здоровых животных, так и в мозге животных, перенесших острую или хроническую нейродегенерацию. Увеличение коэкспрессии Сх43 и СБ38 в астроцитах свидетельствует также о наличии функциональной взаимосвязи между АДФ-рибозилциклазной активностью СБ38 (катализирует превращение НАД* в циклическую АДФ-рибозу) и коннексинами (регулируют биодоступность НАД+ в качестве субстрата реакции, транспортируют НАД+ и АТФ во внеклеточное пространство, где отш взаимодействуют с СБ38 и Р2Х7, соответственно).

Согласно литературным данным (Л^егаас!ак1 б А.( 1996) экспрессия Сх43 главным образом связана с астроцитами, и коннексин 43 является маркером

нейрон-астроглиальных взаимодействий. Известно, что увеличение экспрессии СЭ38 на астроцитах характерно для «глугаматной эксайтотоксичности», когда глугамат, высвобождаясь из нейронов, стимулирует экспрессию фермента на клетках глии. Можно предположить, что изменение экспрессии СБ38, Р2Х7 рецепторов и Сх43. на клетках головного мозга может являться маркером нарушения нейрон-глиальных взаимодействий при острой и хронической нейродегенерации. Зарегистрированное увеличение экспрессии СБ38, Сх43 и Р2Х7 в очаге повреждения как при острой ишемии, так и при хронической нейродегенерации свидетельствует о том, что общим неспецифическим механизмом для этих процессов является высвобождение АТФ и НАД^ из клеток (из поврежденных - через разрушенную мембрану, из неповрежденных - через коннексиновые «полуканалы») во внеклеточное пространство и реализация паракринного и аутокринного механизма действия за счет связывания с Р2Х7 и СБ38, соответственно. Учитывая, что первый механизм способствует формированию инфламмасом, а второй - образованию вторичных посредников с кальций-мобилизующей активностью, то логично предположить вклад инфламмасомы-зависимого процессинга провоспалительных цитокинов и распространения кальциевой волны повреждения клеток через коннексиновые каналы в пределах астроглиального синцития в повреждение клеток в очаге острой ишемии или при хронической нейродегенерации.

Таким образом, увеличение экспрессии СБ38, Сх43 и Р2Х7 маркирует повреждение клеток «вторичного» характера вследствие высвобождения активных метаболитов во внеклеточное пространство (рисунок 2).

На наличие нейрон-астроцитарных взаимосвязей в патогенезе острой и хронической нейродегенерации также указывает факт повышения концентрации лактата при экспериментальной болезни Паркинсона и ишемии головного мозга через 48 часов с момента ее развития. Показано, что в моделях ишемии головного мозга в невысоких концентрациях лакгат может оказывать нейропротективный эффект, защищая нейроны от повреждения. В то же время, в концентрации свыше 20 ммоль/л, лактат является токсичным для нейронов (ВегШе1 С. е1 а1., 2009). При БП, согласно литературным данным, повышение концентрации лактата может быть также связано с митохондриальной дисфункцией (ВеПЬег С. е1 а1., 1992).

Помимо СБ38, НАД'-гликогидролазная и АДФ-рибозилциклазная активность присуща молекуле СБ157, роль которой в патогенезе заболеваний головного мозга практически не изучена. При острой и хронической

нейродегенерации впервые зарегистрировано увеличение экспрессии молекул CD 157 (экспрессируется на фагоцитах), CDllb/CD18 (рецептор комплемента Mac-1, экспрессируемый при активации макрофагов и микроглии) и лиганда Мас-1 - СЗ/СЗЬ (компонент комплемента, экспрессируемый на иммунокомпетентных клетках, астроцитах и нейронах), указывающих на возможное наличие взаимосвязи микроглии с нейронами, другими клетками глии (астроциты) и лейкоцитами (таблица 6, рисунок 3). Кроме потенциального участия в реализации нейрон-микроглиальных взаимодействий, усиление экспрессии указанных молекул может свидетельствовать об их роли в развитии нейровоспаления и микроглиоза (Lalo U. et al., 2006), об активации микроглии и экспрессируемых в неактивном состоянии молекул (в частности, НАД(Ф)Н-оксидазы), что приводит к генерации активных форм кислорода, нейротоксичности и гибели нейронов при обеих патологиях (Seth P., Koul N., 2008; Ahn G.O. et al., 2010; Watters О., O'Connor J.J., 2011).

Ишемия головного мозга

Синтез цАДФР, дизрегуляция гомеостззэ

«Соседние» клетки ЦНС

Первичное повреждение, клеток ЦНС '

Вторичное яввреждеиие; ле^эг ЦНС

«Соседние» 1 ЦНС

Нейро-деге нерация

Рисунок 2 - Механизмы вторичного повреждения клеток ЦНС при острой и хронической нейродегенерации.

Впервые зарегистрирована коэскпрессия CD157, CD Hb, CD 18, что сопровождается увеличением экспрессии лиганда CD11 b/CD 18-комплекса - СЗ-компонента комплемента в очаге ишемического повреждения или нейродегенерации. По аналогии с ролью CD157/CD11 b/CD 18 в регуляции процессов адгезии и миграции активированных лейкоцитов, логично предположить, что развитие нейровоспаления и активация клеток микроглии

сопровождается комплемент-опосредованной цитотоксичностью и направленной миграцией клеток. Недавние данные о полиморфизме гена, кодирующего CD157, при некоторых формах болезни Паркинсона, дают право предполагать роль этой молекулы в контроле воспалительного потенциала активированной микроглии в среднем мозге.

Таблица 6 - Коэкспрессия CD157/CD1 lb/CD18 и экспрессия СЗ/СЗЬ в клетках головного мозга крыс

Группы животных CD157/CD1 lb/CD18+ (%) СЗ/СЗЬ+ (%)

К1 (интактные крысы), п=5 7,4±1,86 5,8±4,36

К2 (контроль, 24 ч), п=5 4,3±0,83 3,6±1,44

КЗ (контроль, 48 ч), п=5 3,1±0,39 5,3±0,73

К5 (растворитель), п=5 4,9±0,71 8,5±1,32

Э1 (2-стор. ОСА, 24 ч), п=5 18,5±0,84 16,1±1,59

Э2 (2-стор. ОСА, 48 ч), п=5 25,4±1,17 26,3±2,52

Э6 (ротенон, БП), п=5 14,9±1,20 21,3±4,74

CD157/CD1 lb/CD18+: рК1-ю<0,05 Рю-Э1<0,05 Pki-32<0,01 рк2-э1<0,01 рю-э2<0,01 Рк5-эб<0,01 C3/C3b+: Pki-k2<0,05 Pki-32<0,05 Рк2-э1<0,005 рю.Э2<0,01 Рк5.эб<0,05

Рисунок 3 - Внутриклеточная колокализация антигенов CD157/CDllb/CD18 в клетках головного мозга (конфокальная микроскопия, х1200).

Таким образом, острое повреждение головного мозга и хроническая нейродегенерация сопровождаются увеличением экспрессии НАД'-конвертирующих ферментов (CD38 и CD157) в клетках нейрональной и глиальной природы. Известно, что биодоступность НАД+ как субстрата и кофермекта регулирует такой важный репаративный процесс, как нейрогенез, индуцируемый повреждающими факторами (Geraerts М. et al., 2007; Seki Т. et al.,

2011). Зарегистрирована интенсификация нейрогенеза в среднем мозге при БП, в коре головного мозга и гиппокампе при ишемии головного мозга, что является защитным механизмом (Parent J.M., 2003; Geraerts М. et al., 2007; Seki Т. et al., 2011), запускаемым вследствие гибели клеток (рисунок 4, таблица 7).

Таблица 7 - Нейрогенез в головном мозге крыс при нейродегенерации

Группы животных Кора головного мозга (ишемия)/средний мозг (БП) Гиппокамп (ишемия)

К1 (интактные крысы), п=5 4,5±1,23 8,6±0,20

К2 (конгроль, 24 ч), п=5 10,0±5,33 4,3±0,64

КЗ (контроль, 48 ч), п=5 4,9±0,78 8,2±4,83

К5 (растворитель), п=5 3,3±1,74 -

Э1 (2-стор. ОСА, 24 ч), п=5 17,9±3,27 19,4±5,31*

Э2 (2-стор. ОСА, 48 ч), п=5 17,2±4,16 18,1±3,19*

Э6 (ротенон, БП), п=5 16,5±1,32 -

Кора/средний мозг: pKi-3i<0,01 рккй<0,05 рК5-эб<0,05 Гиппокамп: pKi-3i<0,05 Рю-Э2<0,05 Ркг-Э1<0,05 Ркз :и<0,05

Кроме усиления нейрогенеза, в патогенезе острой и хронической нейродегенерации, согласно литературным данным, также важную роль играет дисфункция, нарушение целостности и увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) (Ти У.Б. й а1., 2011).

) Ишемия

* 7:-... Нирушэнм

НАД"

^ьонцеяграцйй

над-:

/

/

I ft

Ч:

з*спресс*н CD3f

; сийлдда-

.'Повреждение 1 клеток ЦНС „v.- иг

А'.

экспрессии Р2Х7 • минтае« ' i

^ Bhipn-f«!.» Нвй^Ьиимииеи

■шунцин» «¡«¡»гуляем

UTO.-'-~t' -- «дан-

х вдаекяотных АТФ » <— микроггояишиы* !

Активация реларатавных процессов

(нейрогенез)

Рисунок 4 - НАД'-зависимые события, связанные с повреждением и репарацией клеток, при острой и хронической нейродегенерации.

При острой и хронической нейродегенерации обнаружено увеличение количества Рдр-позитивных клеток: у животных с моделью болезни Паркинсона также наблюдалось значимое увеличение Р§р-экспрессирующих клеток, а при ишемии головного мозга - тенденции к увеличению количества Рер+ клеток в коре ишемизированного полушария через 48 часов с момента ее моделирования (таблица 8).

Таблица 8 - Экспрессия Р-гликопротеина в клетках головного мозга крыс

Группы животных PgP+(%)

К5 (растворитель), п=7 5,4±1,1

ЭЗ - ишемизированное полушарие (24 ч), п=5 37,7±9,4

ЭЗ - контрлатеральное полушарие (24 ч), п=5 46,8±1,6

Э4 - ишемизированное полушарие (48 ч), п=5 44,6±11,1

Э4 - контрлатеральное полушарие (48 ч), п=5 35,4±3,8

Э6 (ротенон, БП), п=11 16,6±3,4*

Примечание: * - уровень значимости при сравнении экспериментальной группы с контролем в модели БП и ишемизированного полушария с контралатеральным в модели ишемии головного мозга

Известно, что при ишемии головного мозга, травматическом повреждении ЦНС, гипералгезии происходит быстрое и раннее повышение экспрессии Р-гликопротеина (Chen Y., Liu L., 2012; McCaffrey G., Davis T.P., 2012), что приводит к снижению проницаемости ГЭБ для различных веществ (субстраты для Pgp, лекарственные препараты). Такая ситуация может являться защитной (Spudich А. et al., 2006) - высокое содержание Pgp предотвращает избыточное поступление экзогенных и эндогенных токсинов, провоспалительных цитокинов, обеспечивает нейропротекцию путем предотвращения протеолиза, замедления деградации протеасом и лизосом, ингибирования апоптоза и окислительного стресса (de Lange Е.С.М., 2004; Miller D.S. et al., 2008; Miller D.S., 2010; McCaffrey G., Davis T.P., 2012).

На основании полученных результатов и литературных данных можно предположить, что увеличение экспрессии Р-гликопротеина при острой и хронической нейродегенерации имеет защитное значение в головном мозге: увеличение экспрессии Р-гликопротеина на клетках ЦНС отмечается спустя некоторое время с момента развития острой и хронической нейродегенерации, в

условиях гипоксии повышенная устойчивость клеток головного мозга к ксенобиотикам и продуктам метаболизма может являться защитной реакцией, как это было показано при ишемии-реперфузии (Robertson S.J. et al., 2011). В то же время, негативным эффектом усиления экспрессии Pgp при патологии ЦНС является снижение чувствительности к лекарственной терапии (Cornford Е.М., Hyman S., 2005).

В отношении АДФ-рибозилциклазной активности при нейродегенерации отмечены разнонаправленные изменения: снижение при острой нейродегенерации у взрослых в период 24 и 48 часов с момента развития ишемии головного мозга и у 10-дневных крысят через 72 часа с момента их моделирования, увеличение - при хронической нейродегенерации (таблица 9).

Таблица 9 - Изменение АДФР-циклазной и функциональной активности клеток головного мозга при острой и хронической нейродегенерации

Группы животных АДФР-циклаза, ед/мин/мг белка Максимальная амплитуда флуор., отн. ед. т/2, сек

К1 (интактные крысы) 0,42±0,269 0,29±0,182 2076±414,22

К2 (контроль, 24 ч) 0,07±0,06 0,14±0,078 1740±146,97

КЗ (контроль, 48 ч) 0,02±0,006 0,20±0,079 1345,7±133,43

К4 (контроль для ПГИ) 0,2±0,07 - -

К5 (растворитель) 0,02±0,007 0,09±0,02 207,6±57,3

Э1 (2-стор. ОСА, 24 ч) 0,04±0,015 0,07±0,016 1848±215,83

Э2 (2-стор. ОС А, 48 ч) 0,01 ±0,002 0,07±0,019 2265±191,90

Э5 (ПГИ, 72 ч) 0,08±0,03 - -

Э6 (ротенон, БП) 0,04±0,006 0,20±0,04 432,1±99,2

АДФР-циклаза: Рк!-эг<0,05 рК4 Э5<0,05 рК5-эб<0>01 Макс, ампл.: рК|-э2<0,05 рК2. Э1<0,05 ркз-э2<0,05 рк5-эб<0,05 т/2: pKi-32<0,001 Рк5.эб<0,05

Примечание: во всех группах п=5

Снижение АДФ-рибозилциклазной активности может быть связано с отсутствием необходимого уровня субстрата для активности (НАД+) в ткани мозга животных (снижение содержания НАД+ наблюдается, в частности, в патогенезе ишемии головного мозга), а снижение содержания НАД+ может быть вызвано сверхактивацией других ферментов утилизации НАД1" в клетке

(например, поли-АДФ-рибозилполимеразы). Однако, вклад других НАД^-конвертирующих ферментов в обнаруженные изменения минимален, так как уровень НАД1" в клетках мозга у PARP-нокаутных животных не отличался от контроля, согласно литературным данным (Endres M. et al., 1997). Спад активности АДФ-рибозилциклазы также может быть связан с" истощением работы фермента.

Интересным аспектом регуляции чувствительности клеток к действию апоптогенных факторов, является внутриклеточный уровень НАД1". Известна доминирующая роль НАД+-гликогидролазы/СБЗ 8 в регуляции гомеостаза НАД1" в клетках различной природы (Aksoy P. et al., 2006). Часть клеток, экспрессирующих CD38/CD157 на поверхности клеточной мембраны, обладает способностью метаболизировать НАД1" и транспортировать цАДФР внутрь клетки. Также возможно перемещение CD38 внутрь клетки, следующее за мембранной олигомеризацией, под влиянием внеклеточного НАД* (Musso T. et al., 2001).

При развитии острой и хронической нейродегенерации обнаружено значимое снижение концентрации уровня внутриклеточного НАД1" (таблица 10). Однако, учитывая разнонаправленный характер изменения АДФ-рибозилциклазной активности CD38 при острой и хронической нейродегенерации, вероятнее всего, это снижение реализуется различными путями утилизации НАД+. При хронической нейродегенерации отмечается активация АДФР-циклазной активности CD38, а при острой нейродегенерации истощение уровня НАД1" может быть вызвано преимущественно усиленной активностью PARP. Кроме того, при острой нейродегенерации возможно функционирование CD38/CD157 не как АДФР-циклазы, а как НАД1-гликогидролазы, участие других ферментов, в утилизации НАД1" в клетке (например, за счет усиления моно- или поли-АДФ-рибозилизирования белков или активации ферментов гликолиза).

Уровень лактата в ткани отражает характер нейрон-астроглиального метаболического сопряжения, в котором продуцируемый астроцитами лактат утилизируется нейронами и способствует поддержанию их энергетических потребностей. Поскольку изменения уровня НАД1" и молочной кислоты носят разнонаправленный характер, можно предположить, что нейрон-астроглиальное метаболическое сопряжение регулируется доступностью НАД1" в качестве биосубстрата (для НЛД+-конвсртирующих ферментов) и кофермента (для НАД+-зависимых ферментов гликолиза). Таким образом, зарегистрированное

увеличение экспрессии CD38, CD157 и молекул, сопряженных с ними в реакциях метаболизма и транспорта НАД4 (Р2Х7, Сх43), маркирует изменения нейрон-астроглиальных взаимодействий при повреждении головного мозга.

Обнаруженные изменения активности АДФ-рибозилциклазы, совпадающие по времени с развитием реактивного астроглиоза и коэкспрессией CD38 и Сх43 в кортикальных астроцитах, представляют собой компонент нейропротективного механизма, индуцируемого на начальных этапах повреждения клеток. АДФ-рибозилциклаза/С038 является фактором, определяющим чувствительность клеток головного мозга к апоптогенному действию при острой и хронической нейродегенерации, что позволяет рассматривать этот фермент в качестве мишени для фармакологической коррекции при данных поражениях нервной системы. Направленная модуляция активности НАД+-конвертирующих ферментов является перспективным направлением развития фармакотерапии при ишемическом повреждении тканей (Salmina A.B. et al., 2012).

Таблица 10 - Концентрация НАД4 и лактата в гомогенате ткани головного мозга при нейродегенерации

Группы животных НАД+, ммоль/мг ткани Лактат, мкг/мл

К1 (интактные крысы, п=!0) 2900,0±617,8 28,3±4,5

К2 (контроль, 24 ч, п=10) 2360,0±777,6 27,8±4,5

КЗ (контроль, 48 ч, п=10) 2376,3±1265,0 30,5±2Д

К4 (контроль для 111 И, 72 ч, п=10) 8702,6±947,7 -

К5 (растворитель, п=10) 3400,0±862,6 34,4±3,1

Э1 (2-стор. ОСА, 24 ч, п=10) 1102,0±431,2 32,4±2,7

Э2 (2-стор. ОСА, 48 ч, п=10) 2160,0±547,4 51,0±11,5

ЭЗ (1-стор. ОСА, 24 ч, п=10) 2620,0±381,3 -

Э4 (1-стор. ОСА, 48 ч, п=10) 2460,0±360,0 -

Э5 (модель ПГИ, 72 ч, п=10) 3344,4±762,8 -

Э6 (ротенон, БП), п=10 1040,0±529,7 60,6±9,7

НАД4: рк1-э1<0,05 рК4-э5<0,001 ркз-зб^О.ОЗ лактат: pKi-32<0,05 Рк5-э«<0,01

Насколько велик вклад АДФ-рибозилциклазной активности, регулируемой Р2Х7 подтипом пуринергических рецепторов (согласно литературным данным, СБ38 является пурин-изменяемым эктоферментом), в регуляцию

функциональной активности клеток головного мозга? Для оценки функциональной активности клеток головного мозга использовался оригинальный спектрофлуориметрический метод, основанный на. регистрации кинетики аугофлуоресценции клеток, определяемой изменениями уровня НАД(Ф)Н. Одним из ферментов, реагирующих на повышении содержания кальция в клетке в ответ на выработку кальций-мобилизующих посредников, является многокомпонентно индуцируемая НАД(Ф)Н-оксидаза (Ebisu К. et al., 2001; Hancock J.T. et al., 2001). Известно, что в клетках ЦНС НАД(Ф)Н-оксидаза может экспрессироваться, прежде всего, на фагоцитах (перициты и микроглия) (Berthet С. et al., 1992), на эндотелиоцитах (Hancock J.T. et al., 2001), некоторых видах нейронов (Ohira К. et al., 2010) и астроцитах (Arias-Camón О. et al., 2009). Интересно, что НАД(Ф)Н-оксидаза при хронической нейродегенерации является причиной дизрегуляции Р2Х7 рецепторов (Berthet С. et al., 1992).

При острой и хронической нейродегенерации были получены результаты, напоминающие характер изменения ХДФ-рибозилциклазной активности: при острой нейродегенерации у взрослых в период 24 и 48 часов с момента развития ишемии головного мозга выявлено снижение функциональной активности клеток ЦНС, при хронической нейродегенерации в ротеноновой модели - ее усиление, однако сходным при острой и хронической нейродегенерации является удлинение времени достижения полувысоты функциональной активности клеток (таблица 10). Как и в случае АДФР-циклазы, снижение функциональной активности клеток ЦНС может быть связано с недостатком субстратов или стимулов для активации НАД(Ф)Н-оксидазы, ее истощением или включением других ферментов генерации активных форм кислорода и/или азота (в частности, миелопероксидазы, синтазы оксида азота и других ферментов). Косвенно об истощении фагоцитарного резерва через 24-48 часов с момента развития ишемии головного мозга также свидетельствует удлинение времени достижения полувысоты функциональной активности клеток вместо его укорочения. В целом, это может свидетельствовать о постепенном «истощению) функциональных резервов клеток.

Между функциональной активностью клеток и экспрессией CD38 (г= -0,89*), экспрессией молекул CD157/Mac-1 и апоптозом клеток головного мозга (г= -0,74) выявлены корреляционные взаимосвязи при экспериментальной болезни Паркинсона. Установленные закономерности изменения экспрессии и активности молекул, регулирующих транспорт и утилизацию НАД* в клетках головного мозга и корреляционные взаимосвязи позволяют рассматривать

механизмы нейрон-глиальных взаимодействий, опосредованные активностью НАД+-зааисимых механизмов, в качестве патогенетически обоснованных мишеней для фармакологической коррекции. Для проверки этой гипотезы и оценки возможного сопряжения между активностью пуринергических рецепторов, АДФ-рибозилциклазы и функциональной активности клеток ЦНС, связанной с ферментом НАД(Ф)Н-оксидазой, в клетках нервной системы при острой и хронической нейродегенерации, была проведена серия экспериментов с применением агонистов и антагонистов Р2Х7 рецепторов, субстрата и лиганда для CD38 и CD157 - НАД+ и блокатора внутриклеточных флавопротеидов DPI.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют об усилении АДФР-циклазной активности в клетках среднего мозга при ротеноновом паркинсонизме при приложении АТФ и НАД+, также было выявлено усиление АДФР-циклазной активности при развитии ишемии головного мозга при приложении окисленной формы АТФ, вместо ожидаемой блокады фермента (таблица 11). Полученные данные указывают на наличие взаимосвязи между экспрессией пуринергических рецепторов и активностью CD38/CD157 в клетках среднего мозга, однако в клетках переднего мозга при развитии ишемии подобных взаимосвязей не выявлено. Кроме того, активация АДФР-циклазы клеток нейроглии при ишемии головного мозга может быть связана как с блокадой с нуклеотидных рецепторов Р2Х7 подтипа, так и с активацией нуклеотидных рецепторов других подтипов или других сигнальных молекул.

Таблица 11 - АДФР-циклазная активность С038/С0157 клеток головного мозга в модели острой нейродегенерации до и после приложении модуляторов

Группы животных Исходная После приложения модуляторов

АТФ оАТФ НАД"

К1 (интактные крысы) 0,42±0,269 0,08±0,057 0,05±0,018 0,23±0,176

К2 (контроль, 24 ч) 0,07±0,055 0,03±0,007 0,03±0,00б 0,06±0,043

КЗ (контроль, 48 ч) 0,02±0,006 0,05±0,026 0,01 ±0,005 0,16±0,121

К5 (растворитель) 0,02±0,007 0,05±0,007 0,04±0,007 0,01±0,001

Э1 (2-стор. ОСА, 24 ч) 0,04±0,015 0,03±0,015 0,04±0,023 0,02±0,014

Э2 (2-стор. ОСА, 48 ч) 0,01±0,002 0,01±0,007 0,03±0,003* 0,02±0,005

Э6 (ротенон, БП) 0,04±0,006 0,17±0,1* 0,05±0,001 0,08±0,003**

Примечания: * - уровень значимости при сравнении эффекта после воздействия модулятора с исходным значением в этой же группе; во всех группах п=5

При приложении модуляторов функциональной активности к гомогенату ткани среднего мозга в норме и при развитии нейродегенерации отмечаются значимое увеличение активности при приложении оАТФ и ингибирование при приложении DPI (таблица 12). Приложение всех модуляторов к гомогенату ткани молодых животных в физиологических условиях и при ишемии головного мозга однонаправленно увеличило функциональную активность. Полученные данные свидетельствуют о потенциальной взаимосвязи между CD38/CD157 и функциональной активностью клеток (НАД(Ф)Н-оксидазой) среднего мозга в нормальных условиях, при развитии паркинсонизма и ишемии головного мозга данной взаимосвязи не прослеживается.

Таблица 12 - Изменения максимальной амплитуды интегральной кривой кинетики флуоресценции клеток микроглии при приложении модуляторов

Группы животных Исходная После приложения модуляторов

АТФ оАТФ НАД1" DPI

К1 (интактные крысы) 0,29±0,182 0,40±0,105 0,36±0,082 0,43±0,076 0,27±0,049

К2 (контроль, 24 ч) 0,14±0,078 0,43±0,130* 0,29±0,059** 0,37±0,071* 0,21 ±0,030**

КЗ (контроль, 48 ч) 0,20±0,079 0,75±0,156* 0,50±0,133 1,04±0,371* 1,37±1,025

К5 (растворитель) 0,09±0,02 0,14±0,03 0,55±0,3* 0,18±0,04 0,03±0,01*

Э1 (2-стор. ОСА, 24 ч) 0,07±0,02 0,31±0,07* 0,34±0,03* 0,49±0,08* 0,29±0,06*

Э2 (2-стор. ОСА, 48 ч) 0,07±0,019 0,71±0,156* 0,41±0,12* 0,45±0,11* 1,25±0,681*

Э6 (ротенон, БП) 0,20±0,04 0,32±0,1* 0,25±0,12 0,17±0,03 0,10±0,07*

Примечания: * - уровень значимости при сравнении эффекта после воздействия модулятора с исходным значением в этой же группе; во всех группах п=5

Анализ полученных результатов позволяет предположить, что альтернативным механизмом регуляции активности пуринергических рецепторов может являться АДФ-рибозилирование молекулы рецептора или влияние НАД(Ф)Н-оксидазы по типу отрицательной обратной связи. Это вполне возможно с учетом данных об АДФ-рибозилирующей активности CD38 (Kastner А. et al., 1994). Ранее было показано, что в активированных клетках увеличивается синтез НАД4 de novo, что, как предполагалось, является ответом клеток на вызванную окислительным стрессом активацию поли-АДФ-рибозилполимеразы и истощение внутриклеточного пула НАД4 (Sian J. et al., 1994). Полученные данные позволяют предположить существование иного механизма регуляции гомеостаза НАД1" в активированных клетках, в рамках

которого гиперпродукция свободных радикалов вследствие увеличения НАД(Ф)Н-оксидазной активности является не единственной причиной колебаний внутриклеточного уровня НАД*, но и активация АДФ-рибозилциклазы, конкурирующего НАД*-конвертирующего фермента, регулирует активность НАД*-генерирующих метаболических путей. Теория нейропротективной стратегии и этиопатогенетической терапии ишемии головного мозга, базирующихся на направленной модуляции экспрессии и активности пуринергических рецепторов Р2Х7 подтипа, АДФ-рибозилциклазы/С038, активности НАД(Ф)Н-оксидазы в клетках головного мозга, патогенетически обоснована: указанные сигнальные молекулы могут являться молекулами-маркерами и молекулами-мишенями при нейродегенерации.

Для модуляции АДФР-циклазной активности CD38 при ишемии головного мозга целесообразнее всего использовать окисленную форму АТФ, при болезни Паркинсона, напротив - АТФ и НАД*. Для модуляции функциональной активности клеток нервной системы при ишемии головного мозга и в физиологических условиях можно использовать все нижеперечисленные модуляторы: АТФ, оАТФ, НАД* и DPI, при хронической нейродегенерации -АТФ и DPI, в физиологических условиях в зрелом мозге можно использовать оАТФ и DPI. Однако очевидна необходимость дальнейшего изучения роли модуляторов пуринергических рецепторов, С038/АДФ-рибозилциклазы в функционировании и гибели клеток головного мозга при острой и хронической нейродегенерации.

Интересно, что между двумя различными вариантами хронической нейродегенерации - «взрослых» (болезнь Паркинсона) и «детей» (аутизм) прослеживаются некоторые общие черты развития симптомов и общие патогенетические механизмы (участие дофаминергической системы и гибель дофаминергических нейронов, повреждение ГЭБ) как при пренатальном воздействии, так и во взрослом состоянии. Между симптомами и патогенетическими механизмами развития двух вариантов острой нейродегенерации - ишемии головного мозга «взрослых» и перинатальной гипоксии-ишемии «детей» - также выявлены схожие черты (особенности экспрессии CD38, Сх43, Pgp, изменения апоптоза клеток головного мозга и неврологического дефицита).

Между появлением неврологического дефицита и экспрессией некоторых молекул обнаружены сильные корреляционные взаимосвязи при острой (г= 0,87

с СШ8+ клетками через 24 ч ишемии; г= -0,98 и 1= -0,84 с Сх43+ клетками через 24 и 48 ч ишемии; г= 0,97 с Р2Х7+ клетками через 24 ч; г= 0,90 с С0157+/Мас-1+ и Рах6+ клетками в гиппокампе через 24 часа развития ишемии; г= 0,94* с количеством СБЗв-экспрессирующих астроцитов через 48 ч ишемии) и хронической (г= 0,93* с СБ38+ клетками; г= -0,89* с Р§р+ клетками) нейродегенерации. Также средней силы и сильные корреляционные связи были зарегистрированы между нарушением сложных форм поведения и экспрессией молекул-маркеров: при экспериментальной болезни Паркинсона уровень экспрессии СБ38 на нейронах среднего мозга коррелирует с эмоциональным поведением крыс в ПКЛ (г= -0,44), при острой ишемии уровень экспрессии СБ38 и Сх43 в астроцитах и уровень НАД1" в коре головного мозга коррелируют с когнитивной дисфункцией через 24 (г= -0,82 с экспрессией С038, г= -0,99** с экспрессией Сх43, г= -0,8 с уровнем НАД+) и 48 часов (г= 0,99** с экспрессией СБ38, г= 0,44 с экспрессией Сх43, 1= 0,83 с уровнем НАД*) развития ишемии головного мозга.

Таким образом, зарегистрированные изменения экспрессии и активности НАД"-конвертирующих ферментов и сопряженных с ними функционально молекул в клетках нейрональной и глиальной природы при нейродегенерации находят свое отражение в характере неврологической дисфункции и изменении интегративных функций мозга, вследствие чего могут рассматриваться как потенциальные молекулы-мишени для патогенетически обоснованной коррекции неврологического дефицита при патологии головного мозга. В целом, полученные результаты позволяют дополнить существующую концепцию патогенеза ишемического повреждения головного мозга и хронической нейродегенерации, что отражено в схемах на рисунках 5-6.

При болезни Паркинсона ведущим механизмом патогенеза является гибель дофаминергических нейронов среднего мозга, индуцируемая дисфункцией митохондрий и ЭПР, окислительным стрессом и нейровоспалением вследствие активации микроглии, цитотоксичностью некоторых метаболитов, связанных со снижением НАД+, усилением функциональной активности клеток, изменением функционирования НАД+-зависимых механизмов (усиление АДФ-рибозил-циклазной активности СВ38/СБ157) и нарушением нейрон-глиальных (главным образом нейрон-астроглиальных и нейрон-микроглиальных) взаимодействий.

Болезнь Паркинсона

Нарушение интегратианых функций мозга (когнитивная, Сфера): «оттмвнаядксфун^я,

нарушение социального рвсяшкашмия, аг(жссивж>сш, грвиожыостм « «дефицита внимвнил»

Симптомы болезни Паркинсона <п<няураяы«м

неставмлыюегь, неустойчивость

ттаят. ригмяносгь ымшц, нарушений равмснэдвия; моторики «вредит; н мяорыки задних | пап)

НАД+-зависимые механизмы

внутриклеточной сигнализации и одежкпеточных взаимодействий

Нейрсш-астроцитармые

вваимодвйстеи»: "СОЗв аотаммсщвйетшукт!

»даииексин

» астрвщчтах, лзктаг

{тюсращм&ш Ж^ШЯКМ Н&Йрг^н)

Овозиачвмия:

Ви»ижны»«ми тмттит $»т(тхт: етжтя тт

Нойрон-микреглиал ьные, астроцит-микроглиальные и лейкоцит-микроглияпьмью «чаи модейств ия:

С01§7Шас-1, С033 в мийрояади, СЗ/СЗЬ йзаишЩй^тауедддих с .микршгжей клетках (жггроц&ггы, шэ^хжьл, лаййсадиты)___

Мййропротвкция ?

< к

или

смиждаа мт утп^-тт Пошнцтпънш» мол««угад*м1щдам

Рамнкн к«йрогвнде (Ракб)

I е«£«мэ/шзироштммх 1 ,«иша* (в^г, авх) 1« 8 среднем тоже

Рисунок 5 - Патогенез болезни Паркинсона

она иыфярнтв

Аиокеичоска» деполяризация м&м&ран {нюбршадмо» клеточное мщтяфнт. на^рагичеекай гибель клопж, формщттти инфаркта)

Ишемия головного мозга

.............:.....1:...............

4- мозгового кровоток« (4<5<ужоеого сиигела, 4 синтез АТФ, аме^-гйчос«»« наделгагочноаъ. дисфункция каналов иомнсво чгранторта, деегабипизаияй клеточных яйвА«6ран)

Марушони© интегративных функций мозга (когнитивная,.

Сфера): штитмшаи дисфушж*

Симптомы ишемии головного мозга (могор««>-

свисоризя ДИСФУНКЦИЯ, р^фпшгормые нишами«)

(Ьну.-'б >! <)>• - . и-'..--, „ 'у? ;

Циго-токс-нческий

НАД+-зависимы0 механизмы

внутриклеточной сигнализации и межклеточных взаимодействий

Нейрон -астроцитарныс

взаимодействия: СОЭ8 во

ках (астроцит-нейром). конмексин 43 в йютро«ит«х, яакчат

{посредник аС?раЦит--н£йрон)

Обозначения:

Выяз/тингда нами шшнемия экспрессии; снижен© или упттШй

Псщзмциш ш<ы& тюефпы-тртры

Н©йрон-микротизльные, | астроцит-микроглиальны© и [§ лейкоцит-микротиэльные взаимодействия:

; р СЗ/СЗЬ во с

клетках {астроциты, щ найзрояы, шйкацяты)

8ыаа<гшймь*а нам« иэмйм&НИЯ ¡¡ттттн или йонценгрйцйи: ъшжжт мл«

Пролиферация клеток (начало на 2-3 су%т.. гп»х -

Рисунок 6 - Патогенез ишемии головного мозга

Ранний иейрогенез {Рлхб)

нишах < м

коре головного мозга

Ведущими звеньями патогенеза острой нейродегенерации на примере ишемии головного мозга являются связанные со снижением мозгового кровотока развитие гипоксии, цитотоксического отека вследствие глугаматной эксайтотоксичности и цитотоксичности, активация астроглии, развитие нейровоспаления, снижение активности АДФР-циклазы при уменьшении концентрации субстрата НАД4, снижение функциональной активности клеток, дисфункция нейрон-астроглиальных взаимодействий. В то же время, обнаружены общие механизмы патогенеза острой и хронической нейродегенерации на примере болезни Паркинсона и ишемии головного мозга, маркирующие вторичное повреждение (повышение экспрессии Р2Х7 рецепторов, CD38, CD157, коннексина 43, Мас-1, СЗ/СЗЬ, увеличение концентрации лакгата, интенсификация апоптоза) или потенциальную нейропротекцию (усиление -нейрогенеза, увеличение экспрессии Pgp). Выявленные особенности Патогенеза острой и хронической нейродегенерации позволят сделать важнейший вклад в области персонифицированной диагностики, терапии и профилактики нейродегенерации.

ВЫВОДЫ

1. У животных с острой и хронической нейродегенерацией изменяются НЛД'-зависимые механизмы внутриклеточной сигнализации и межклеточных взаимодействий: усиливается экспрессия Р2Х7 рецепторов (увеличение Р2Х7+ клеток в среднем мозге в 26 раз - гиперэкспрессия Р2Х7 рецепторов при БП; при ишемии головного мозга - в 2-4 раза через 24-48 часов) и СБЗЗ/НАД4-гликогидролазы (в 4 раза увеличилось количество CD38+ клеток при БП, в 2-4 раза - при ишемии головного мозга через 24-48 часов ее развития, в сравнении с контролем). Однако у животных с моделью ишемии головного мозга преимущественная локализация CD38 отмечается в астроцитах (9,9% через 24 часа с момента ее развития; 10,4% - через 48 часов), а с экспериментальной болезнью Паркинсона- в астроцитах (13,3%) и микроглии (13,1%).

2. При острой и хронической нейродегенерации в нейрон-астроглиальных взаимодействиях важную роль нейрометаболического посредника выполняет лактат (при БП повышение концентрации лактата до 60,6 мкг/мл, при ишемии - до 51,0 мкг/мл через 48 ч), а реализация НАД^-зависимых сигналов осуществляется посредством увеличения экспрессии CD38 и коннексина 43 на взаимодействующих клетках (более 56% коэкспрессирующих CD38 и коннексин 43 Сх43-позитивных клеток через 24, 53% - через 48 ч с момента развития ишемии; 76% CD38+/Cx43+ клеток при перинатальной гипоксии-ишемии и 84,3% при

болезни Паркинсона); в нейрон-микроглиальных, астроцит-микроглиальных и лейкоцит-микроглиальных взаимодействиях ведущую роль выполняют CD157, комплекс Мас-1 и его лиганд СЗ/СЗЬ (повышение количества CD157/Mac-1-коэкспрессирующих клеток в в 3 раза и СЗ/СЗЬ+ клеток в 2,5 раза при БП; динамическое увеличение CD157+/Mac-1+ клеток в 2,5 раза через 24 и в 3,4 раза через 48 ч, СЗ/СЗЫ- клеток - в 2,7 раз через 24 ч, в 4,5 раза через 48 ч).

3. В патогенезе острой и хронической нейродегенерации интенсифицируется апопготоз клеток ЦНС (в 2,2 раза увеличивается количество TUNEL+ клеток при БП, в 6,1 раз - через 24 часа с момента развития ишемии, в 4,1 раза - через 48 часов; в 1,4 раза - в модели ПГИ), коррелирующая с развитием нейровоспаления (гиперэкспрессия CD 15 7/CD11 b/CD 18 (r= -0,74 при БП; i= 0,94 через 48 ч при ишемии), метаболических нарушений (увеличение концентрации лактата в ткани (г= 0,99* через 24 ч при ишемии), гиперэкспрессией НАД4"- и АТФ-рецептирующих молекул на мембранах взаимодействующих клеток (увеличение экспрессии CD38 на нейронах, г= 0,98 через 24 ч при ишемии), активности АДФР-циклазы (п= 0,78 через 48 ч при ишемии), экспрессии Р2Х7 рецепторов (г= -0,91 через 48 ч при ишемии).

4. При развитии острой и хронической нейродегенерации усиливается нейрогенез на ранних этапах в гиппокампе (увеличение Рах6+ клеток в 2 раза через 24 и 48 часов) и коре головного мозга (увеличение Рах6+ клеток в 4 раза через 24 и 48 часов) при ишемии, усиливаются нейрогенез (увеличение Рах&+ клеток в 5 раз) и экспрессия белка-транспортера Р-гликопротеина в 3,1 раза в среднем мозге - при экспериментальной болезни Паркинсона.

5. При острой и хронической нейродегенерации изменения АДФР-циклазной и функциональной активности клеток поврежденной области мозга носят разнонаправленный характер: при ишемии головного мозга через 24 ч (АДФР-циклаза - в 10,5 раз; функциональная - в 4 раза) и 48 ч (АДФР-циклаза - в 48 раз; функциональная - в 4 раза) они снижаются; при хронической нейродегенерации - обе активности увеличиваются в 2 раза.

6. В патогенезе острой и хронической нейродегенерации нарушение интегративных функций мозга, проявляющееся в виде когнитивной дисфункции при болезни Паркинсона и ишемии головного мозга, нарушений социального и эмоционального поведения при болезни Паркинсона (в том числе и при пренатальном действиии вальпроевой кислоты как индуктора нарушения развития мозга с проявлением аутистического паттерна поведения) коррелирует с уровнем экспрессии CD38 нейронах среднего мозга при экспериментальной болезни Паркинсона (г= -0,44 с эмоциональным поведением крыс в приподнятом

крестообразном лабиринте), с уровнем экспрессии CD38 и Сх43 в астроцитах и уровнем НАД" в коре головного мозга при острой ишемии (корреляция когнитивной дисфункци с: экспрессией CD38 - г= -0,82, экспрессией Сх43 - г= -0,99**, уровнем НАД* - г= -0,8 [через 24 часа развития ишемии], экспрессией CD38 - г= 0,99**, экспрессией Сх43 - г= 0,44, уровнем НАД+ - г= 0,83 [через 48 часов развития ишемии]).

7. Теория нейропротективной стратегии и этиопатогенетической терапии острой и хронической нейродегенерации, базирующаяся на направленной модуляции экспрессии и активности НАД^-зависимых механизмов реализации нейрон-глиальных взаимодействий, патогенетически обоснована: CD38, нуклеотадные рецепторы Р2Х7 подтипа и НАД(Ф)Н-оксидаза клеток микроглии могут использоваться как потенциальные молекулы-мишени, в качестве модуляторов активности которых эффективны 100 мкМ оАТФ (для изменения активности Р2Х7 рецепторов, АДФ-рибозилциклазы клеток коры головного мозга при ишемии и функциональной активности клеток среднего мозга в физиологических условиях), 1 мМ АТФ и НАД1" (для изменения функциональной активности клеток коры при ишемии и АДФ-рибозилциклазы среднего мозга при БП), 10 мкМ DPI (для модуляции функциональной активности клеток коры головного мозга при ишемии и среднего мозга в норме и при БП) in vitro.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Нуклеотадные Р2Х7-рецепторы, АДФ-рибозилциклаза/С038 и НАД(Ф)Н-оксидаза клеток головного мозга являются молекулами-мишенями для направленной регуляции функциональной активности клеток нейрональной и глиальной природы. При экспериментальной ишемии головного мозга и хронической нейродегенерации in vitro рекомендуется использовать в качестве модуляторов активности этих молекул-мишеней АТФ, оАТФ, НАД и DPI.

2. В экспериментальных исследованиях рекомендуется к применению метод регистрации кинетики аугофлуоресцении клеток головного мозга in vitro, позволяющий охарактеризовать функциональную активность, контролируемую НАД(Ф)Н- зависимыми механизмами.

3. Оценка экспрессии CD38, Сх43, Р2Х7, CD157, CD1 lb/CD18, СЗ/СЗЬ в очаге повреждения при острой ишемии головного мозга или хронической нейродегенерации рекомендуется к использованию для характеристики нарушения нейрон-астроглиальных и нейрон-микроглиальных взаимодействий.

4. Дифференциация НАД-зависимых механизмов при острой и хронической нейродегенерации может быть основана на оценке характера

экспрессии и активности CD38/CD157 на клетках нейрональной или глиальной природы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК на соискание ученой степени доктора наук

1. Развитие апоптоза и изменение активности АДФ-рибозилциклазы при ишемическом повреждении головного мозга / А. Б. Салмина, А. А. Фурсов, С. В. Михуткина, Н. А. Малиновская и др. // Сибирское медицинское обозрение. -2006. -№ 4. - С. 22-27 (0,38 п. л.).

2. Профилактика постишемического неврологического дефицита путем модуляции экспрессии АДФ-рибозилциклазы в клетках головного мозга / А. А. Фурсов, А. Б. Салмина, В. А. Мороз, С. В. Михуткина, Л. Д. Зыкова, Н. А. Малиновская и др. // Общая реаниматология. - 2007. - Т. 3, № 5-6. - С. 109113 (0,31 п. л.).

3. НАД"-зависимые механизмы нарушения жизнеспособности клеток головного мозга в остром периоде гипоксически-ишемического перинатального поражения / А. Б. Салмина, О. С. Окунева, Н. А. Малиновская и др. // Нейрохимия. - 2008. - Т. 25, № 3. - С. 1-8 (0,50 п. л.).

4. Перинатальное гипоксически-ишемическое поражение нервной системы вызывает изменение экспрессии коннексина 43, CD38 и активности АДФ-риболзил цикл азы в клетках головного мозга / А. Б. Салмина, Н. А. Малиновская, О. С. Окунева и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. -Т. 146,№ 12.-С. 641-645 (0,31 п. л.).

5. Роль нейрон-астроглиальных взаимодействий в дизрегуляции энергетического метаболизма при ишемическом перинатальном поражении головного мозга / А. Б. Салмина, О. С. Окунева, Т. Е. Таранушенко, А. А. Фурсов, С. В. Прокопенко, С. В. Михуткина, Н. А. Малиновская и др. // Анналы клинической и экспериментальной неврологии. - 2008. - Т. 2, № 3. - С. 44-52 (0,56 п. л.).

6. Изменение экспрессии и активности CD38 в клетках астроглиальной природы при нарушениях нейрон-глиальных взаимодействий при перинатальном гипоксически-ишемическом поражении головного мозга / А. Б. Салмина, О. С. Окунева, Н. А. Малиновская и др. // Нейрохимия. - 2009. - Т. 26, № 3. - С. 237-244 (0,50 п. л.).

7. Модуляция экспрессии CD38 в клетках головного мозга ретиноевой кислотой / А. Б. Салмина, Н. А. Малиновская, О. С. Окунева и др. // Сибирское медицинское обозрение. - 2009. - № 1. - С. 22-26 (0,31 п. л.).

8. Лазер-индуцированная аутофлуоресценция для оценки метаболизма и гемодинамики головного мозга / А. Б. Салмина, В. В. Салмин, О. В. Фролова, Д. И. Лапетин, М. А. Фурсов, Д. П. Скомороха, А. А. Фурсов, М. А. Кондрашов, Н. Н. Медведева, Н. А. Малиновская и др. // Анналы клинической и экспериментальной неврологии. - 2011. - Т. 5, № 3. - С. 32-39 (0,50 п. л.).

9. Влияние обогащенной среды на поведение зрелых и стареющих крыс / Ю. К. Комлева, С. М. Черепанов, Н. А. Яузина, К. В. Рондова, Д. Д. Гасымлы, А. В. Моргун, Н. В. Кувачева, О. Л. Лопатина, Н. А. Малиновская и др. // Вестник НГУ. Сер. Биология, клиническая медицина. - 2012. - Т. 10, № 5. - С. 57-62 (0,38 п. л.).

10. Молекулярные механизмы нарушения развития мозга в пре- и неонатальном периоде / А. Б. Салмина, Ю. К. Комлева, Н. В. Кувачева, О. Л. Лопатина, А. И. Инжутова, С. М. Черепанов, Н, А. Яузина, Г. А. Морозова, Н. А. Малиновская и др. // Вопросы современной педиатрии. - 2012. - № 6. - С. 15-20 (0,38 п. л.).

11. НАД+-конвертирующие ферменты в клетках нейрональной и глиальной природы: CD38 как новая молекула-мишень для нейропротекции / А. Б. Салмина, А. И. Инжутова, А. В. Моргун, О. С. Окунева, Н. А. Малиновская и др. // Вестник РАМН. - 2012. - № 10. - С. 29-37 (0,56 п. л.).

12. Современные экспериментальные модели депрессии / Н. А. Яузина, Ю. К. Комлева, А. Б. Салмина, М. М. Петрова, Г. А. Морозова, Н. А. Малиновская и др. // Биомедицина. - 2013. -№ 1. - С. 61-71 (0,69 п. л.).

13. Проницаемость гематоэнцефалического барьера в норме и при нарушениях развития головного мозга и нейродегенерации / Н. В. Кувачева, А. Б. Салмина, Ю. К. Комлева, Н. А. Малиновская и др. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова - 2013. - № 4. - С. 80-85 (0,38 п. л.).

14. Изменения структурно-функциональной пластичности головного мозга, индуцированные обогащенной средой / Ю. К. Комлева, А. Б. Салмина, С. В. Прокопенко, Л. А. Шестакова, М. М. Петрова, Н. А. Малиновская и др. // Вестник РАМН. - 2013. № 6. - С. 39-48 (0,63 п. л.).

15. Молекулы-мишени при болезни Паркинсона / Н. А. Малиновская, А. Б. Салмина, А. В. Моргун и др. // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. - 2013. - № 3. - С. 187-198 (0,75 п. л.).

16. Малиновская, Н. А. Современные представления о молекулах-маркерах при болезни Паркинсона / Н. А. Малиновская // Неврологический вестник.-2013.-Т. XLV, № 3. - С. 46-56 (0,69 п. л.).

Патент

17. Способ коррекции постишемической когнитивной дисфункции : пат. 2315618 Рос. Федерация: МПК51 А 61К 38/21 С1 / А. Б. Салмина, С. В. Михуткина, А. А. Фурсов, Н. А. Шнайдер, Н. А. Малиновская и др. ; заявитель и патентообладатель Красноярская гос. медицинская академия. - № 2006138762/14 ; заявл. 02.11.2006; опубл. 27.01.2008, Бюл. № 3. - 8 с (0,50 п. л.).

Монография

18. Alteration of neuron-glia interactions in neurodegeneration: molecular biomarkers and therapeutic strategy / A. B. Salmina, M. M. Petrova, Т. E. Taranushenko, S. V. Prokopenko, N. A. Malinovskaya et al. // Neurodegenerative Diseases - Processes, Prevention, Protection and Monitoring. / ed. R. C.-C. Chang. - Rijeka: InTech, 2011. -P. 273-300 (0,38 п. л.).

Статья в международном журнале

19. Endothelial Dysfunction and Repair in Alzheimer-Type Neurodegeneration: Neuronal and Glial Control / A. B. Salmina, A. I. Inzhutova, N. A. Malinovskaya et al. // J. Alzheimers Dis. - 2010. - Vol. 22, №1.-P. 17-36 (1,75 п. л.).

Публикации в рецензируемых журналах

20. Изменение активности АДФ-рибозилциклазы в клетках нервной системы коррелирует с развитием постишемической когнитивной дисфункции / А. Б. Салмина, Н. А. Шнайдер, С. В. Михуткина, А. А. Фурсов, Н. А. Малиновская и др. // Международный неврологический журнал. - 2007. - № 1(11). - С. 71-78 (0,50 п. л.).

21. Модуляция активности АДФ-рибозкл цикл азы при ишемии головного мозга / Н. А. Малиновская, Г. А. Морозова, А. Б. Салмина и др. // Вестник науки Сибири. - 2012. - № 3(4). - С. 284-290 (0,44 п. л.).

Материалы конференций

22. Роль АДФ-рибозилциклазы и циклической АДФ-рибозы в регуляции электровозбудимости и жизнеспособности клеток головного мозга / А. Б. Салмина, X. Хигашида, С. В. Михуткина, А. А. Фурсов, Т. Е. Таранушенко, Р. Я. Оловянникова., Н. А. Малиновская и др. // Структурно-функциональные, нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга : сб. тр. конф. - Москва, 2007. - С. 540-544 (0,31 п. л.).

23. Динамика изменения активности АДФ-рибозилциклазы в клетках головного мозга в раннем постнатальном периоде / А. Б. Салмина, О. С. Окунева, Н. А. Малиновская и др. // Актуальные вопросы функциональной межполушарной асимметрии и нейропластичности : материалы всеросс. конф. с междунар. участием. - Москва, 2008. - С. 630-634 (0,31 п. л.).

24. Нейрон-астроглиальные взаимоотношения, опосредуемые активностью НАД+-конвертирующего фермента, при перинатальном гипоксически-ишемическом поражении головного мозга / А. Б. Салмина, О. С. Окунева, Л. Д. Зыкова, Т. Е. Таранушенко, А. А. Фурсов, H.A. Малиновская и др. // Актуальные вопросы функциональной межполушарной асимметрии и нейропластичности : материалы всеросс. конф. с междунар. участием. - Москва, 2008. - С. 625-629 (0,31 п. л.).

25. Экспрессия CD38 в клетках нейрональной и глиальной природы при гипоксически-ишемическом поражении головного мозга / А. Б. Салмина, О. С. Окунева, Н. А. Малиновская и др. // Ш Конгресс с междунар. участием «Российский медицинский форум», V междунар. конфер. «Молекулярная медицина и биобезопасность» : тезисы конф. - Москва, 2008. - С. 90-91 (0,13 п. л.).

26. CD38 - молекула-маркер нейрон-глиальных взаимодействий при паркинсонизме / Н. А. Малиновская, А. Б. Салмина, С. В. Прокопенко, Ю. А. Панина // Клинико-лабораторный консилиум : материалы росс, конгресса с междунар. участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное». - № 2-3(33-34). - СПб., 2010. - С. 160 (0,06 п. л.).

27. Участие АДФ-рибозилциклазы в дисрегуляции энергетического метаболизма в клетках головного мозга при перинатальном гипоксически-ишемическом поражении ЦНС / О. С. Окунева, О. В. Фролова, А. В. Морган,

Н. А. Малиновская и др. // Клинико-лабораторный консилиум : материалы росс, конгресса с междунар. участием «Молекулярные основы клинической медицины -возможное и реальное». - № 2-3(33-34). - СПб., 2010. - С. 165 (0,06 п. л.).

28. Mechanisms of signal transduction in cells of microglia in cerebral ischemia / N. A. Malinovskaya, G. A. Kirichkova, Yu. A. Panina et al. // Proceedings First International Conference «Fundamental Medicine: From Scalpel Toward Genome,Proteome and Lipidome». - Kazan, 2011. - P; 71 (0,06 п. л.).

29. Neuron-glia Interactions in Ischemic Brain Injury and Neurodegeneration / A. B. Salmina, N. A. Malinovskaya, O. S. Okuneva et. al. // BITs 2nd Annual World Congress of NeuroTalk. - Dalian, China, 2011. - P. 63 (0,06 п. л.).

30. Механизмы внутриклеточной сигнализации микроглии при глобальной ишемии головного мозга / Н. А. Малиновская, Г. А Морозова., А. Б. Салмина и др. // Научные исследования и их практическое применение, современное состояние и пути развития'2011 04-15 октября 2011 года : сб. научн. тр. междунар. науч.-практ. конф. - Одесса, 2011. - Т. 28. - С. 18-19 (0,13 п. л.).

31. Оценка когнитивной функции крыс в тесте «Водный лабиринт Морриса» при экспериментальной ишемии головного мозга у крыс / Г. А. Морозова, Н. А. Малиновская, М. М. Петрова и др. // Научные исследования и их практическое применение, современное состояние и пути развития'2011 04-15 октября 2011 года : сб. науч. тр. междунар. науч.-практ. конф. - Одесса, 2011. -Т. 28.-С. 3-4 (0,13 п. л.).

32. Оценка вегетативных нарушений в тесте «Открытое поле» в ротеноновой модели болезни Паркинсона / Н. А. Малиновская, Ю. А. Панина, Г. А. Морозова и др. // Приоритетные направления развития науки и технологий : тезисы докл. X Всеросс. науч.-технич. конф. - Тула, 2011. - С. 106-107 (0,13 п. л.).

33. Подбор тестов дня оценки нейропсихического состояния крыс при ишемии головного мозга / Г. А. Морозова, Н. А. Малиновская, А. Б. Салмина и др. // Приоритетные направления развития науки и технологий : тезисы докл. X Всеросс. науч.-технич. конф. - Тула, 2011. - С. 108-110 (0,19 п. л.).

34. Создание молекулярно-клеточной модели гематоэнцефалического барьера in vitro / А. В. Моргун, Н. А. Малиновская, А. Б. Салмина и др. // Приоритетные направления развития науки и технологий : тезисы докл. X Всеросс. науч.-технич. конф. - Тула, 2011. - С. 114-115 (0,13 п. л.).

35. Экспрессия Р-гликопротеина в клетках нейроваскулярной единицы при перинатальной гипоксии-ишемии мозга в остром периоде / А. В. Моргун, Н. А. Малиновская, О. С. Окунева и др. // Приоритетные направления развития науки и технологий : тезисы' докл. X Всеросс. науч.-технич. конф. - Тула, 2011. -С. 115-116 (0,13 п. л.).

36. Оценка моторной дисфункции у крыс при экспериментальной ишемии / Г. А. Морозова, Н. А. Малиновская, А. Б. Салмина и др. // Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине : сб. тр. междунар. науч.-практ. конф. - СПб., 2011. - С. 31-34 (0,25 п. л.).

37. Соэкспрессия CD38 и Pgp на клетках нейроваскулярной единицы при фокальной ишемии головного мозга крыс / Г. А. Кирйчкова, Н. А. Малиновская,

А. В. Моргун и др. // Ш Съезд физиологов СНГ : сб. тр. - Ялта, 2011. - С. 46 (0,06 п. л.).

38. Оценка проницаемости гематоэнцефалического барьера in vitro / H. А. Малиновская, А. В. Моргун, Г. А. Киричкова и др. // Ш Съезд физиологов СНГ : сб. тр. - Ялта, 2011. - С. 66 (0,06 п. л.).

39. Оценка функциональной активности микроглии при ишемии головного мозга / Н. А. Малиновская, В. В. Салмин, Г. А. Киричкова и др. // Рецепторы и внутриклеточная сигнализация : сб. тр. конф. - Пущино, 2011. - Т. 1. - С. 415-420 (0,38 п. л.).

40. Пилотное исследование по созданию моделей гематоэнцефалического барьера in vitro / H. А. Малиновская, А. В. Моргун, Г. А. Морозова и др. // Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии : сб. тр. междунар. Интернет-конф. - Казань, 2011. - С. 8-10 (0,19 п. л.).

41. Соэкспрсссия CD38 и тирозингидроксилазы в ткани среднего мозга при ротеноновом паркинсонизме / Г. А. Морозова, Н. А. Малиновская, C.B. Прокопенко и др. // Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии : сб. тр. междунар. Интернет-конф. - Казань, 2011. - С. 269-271 (0,19 п. л.).

42. Современная нейрохимия: поиск новых молекулярных маркеров для трансляционных исследований / А. Б. Салмина, Н. А. Малиновская, О. С. Окунева и др. // Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований : материалы Всеросс. науч.-практ. конф. биохимиков и специалистов по лабораторной медицине. - Омск, 2011. - С. 251-259 (0,56 п. л.).

43. Изменение поведения зрелых и стареющих крыс под влиянием обогащенной среды / Ю. К. Комлева, А. В. Моргун, Н. В. Кувачева, Е. А. Пожиленкова, О. Л. Лопатина, Н. А. Малиновская и др. // Приоритетные направления развития науки и технологий : тезисы докл. ХП Всеросс. науч.-технич. конф. - Тула, 2012. - С. 54-56 (0,19 п. л.).

44. Перспективы использования тестов для оценки эмоциональности и тревожности у крыс / Ю. К. Комлева, Н. А. Яузина, А. Б. Салмина, Г. А. Морозова, Н. А. Малиновская // VII Сибирский съезд физиологов : материалы съезда -Красноярск, 2012. - С. 242-243 (0,13 п. л.).

45. Молекулярные механизмы нейрон-глиальных отношений в развивающемся и зрелом мозге в норме и при патологии / А. Б. Салмина, А. В. Моргун, Н. А. Малиновская и др. // VII Сибирский съезд физиологов : материалы съезда - Красноярск, 2012. - С.463-464 (0,13 п. л.).

46. Структурная пластичность мозга при нейродегенерации / Е. В. Шилина, Е. В. Козырева, Н. А. Малиновская и др. // VII Сибирский съезд физиологов : материалы съезда - Красноярск, 2012. - С.607-608 (0,13 п. л.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ - аденозинтрифосфат

БГГ - болезнь Паркинсона

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

НАД(Ф)Н - никотинамидадениндинуклеотид (фосфат)

ОСА - общая сонная артерия

Ш И - перинатальная гипоксия-ишемия

ЦНС - центральная нервная система

CD - cluster of differentiation (кластер дифференцировки)

Сх - коннексины

NSS - шкала для оценки неврологического дефицита у животных

Pgp - Р-гликопротеин

Заказ №29/10 Тираж 100 экз.

Отпечатано: ООО «Новые компьютерные технологии» г. Красноярск, ул. К.Маркса, 62; офис 120; тел.: (391) 226-31-31, 226-31-11