Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль медиаторов липидной природы в патогенезе немедленной аллергии

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПЕДИАТРИИ И ДЕТСКОЙ ХИРУРГИИ

На правах рукописи

ТУЛУЕВСКАЯ ЛЮДМИЛА МИХАИЛОВНА

УДК 612.014.4 : 616—056.3—092

РОЛЬ МЕДИАТОРОВ ЛИПИДНОЙ ПРИРОДЫ В ПАТОГЕНЕЗЕ НЕМЕДЛЕННОЙ АЛЛЕРГИИ

14.00.36 — Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1992

Работа выполнена в Московском ордена Трудового Крас-лого Знамени научно-исследовательском институте педиатрии и детской хирургии Министерства здравоохранения РСФСР.

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Г. В. ПОРЯДИМ

Доктор медицинских наук, профессор О. Б. СВЯТКИНА

О ф н ц и а ль н ы е оппонент ы:

Доктор медицинских наук, профессор И. С. ГУЩИН,

Доктор биологических наук, профессор В. Н. ФЕДОСЕЕВА

Ведущее учреждение: Центральный ордена Ленина институт усовершенствования врачей.

Защита диссертации состоится « » 1992 г.

в « » часов на заседании специализированного ученого совета К-084.14.06. при Российском Государственном медицинском университете.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан « »......1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

Т. Е. КУЗНЕЦОВА

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы: 'Известно, что в развотии аллергического воспаления принимает участие различные биологически активнее медиаторы, а именно тетании, Срадикинин, простаглан-дины (ПГ), лейкотриены (ЛТ), лимфокины, различные хемотакси-ческие факторы, фактор активации тромбоцитов (ФАТ), гид-роксиэйкозатетраеповие гаслоты (ГЭТЩ. Действие этих кедиато-ров приводит к увеличению проницаемости сосудов, способствует развитию отека, артериальной гипотензии, вызывает сокращение гладких мышц, спазм бронхов. Под влиянием фага о ров хемотаксиса из периферической циркуляции привлекаются в шоковые органы зозинофилы, нейтрофилы, тромбоциты, способствушие дальнейшему развитию воспаления и формированию гиперчувствительпости тканей шоковых органов (Адо А. Д. 1976, Гущин IL С. 1984, Маянский Л Я 1991, Braquet Р. 1987, Pretolanl M. 1989).

Однако вопрос о ведущем механизме патологических изменений в формировании гиперроактивности на сегодняпниП день остается неясным. Такие медиаторы аллергии, как гистамин, брадики-нин, простагландины, вызывающие в эксперименте, незначительную гиперчувствительность легких (Wasserman Y. ,1988), очевидно не играют ведущей роли в процессе ее формирования.

В литературе имеются многочисленные данные, свидетельствующие о том, что ФАТ и Ж, являясь эндогенны;.«! модуляторами клеточных функций и межклеточных отношений, причастии к развитию ряда патологических состояний в организме, включая анафилаксию и воспалительные реакции различного генеза (Claency Y. et al. 1985, Braquet P. et al. 1987,Maclouf C. et al. 1988).

ФАТ индуцирует острый бронхоспазм у морских свинок (Mencia-Huerta Y.-M. 1989) и вызывает у здоровых людей немедленный бронхоспазм с последующим длительным увеличением реактивности бронхов к ацетнлхолту (Ctnzzi 1090). Существенным моментом патогенетического действия ФАТ считается вызванная им эозинофильная инфильтрация леггах (Barnet С. 1987), активация эозинофмлов и последующее высвобождение ими токсичного для респираторного эпителия продуктов. Обнару«эн феномен премирования клеток воспаления фактором активации троьйоцигов (Vargaf-

ftíg: В. et al. 1987). что выражается в появлении способности отвечать на неспецифические стимулы. Эта особенность действия ФАТ связывается с его способностью встраиваться в мембраны клеток и изменять биофизическое состояние липидов мембран (Hensori 1983, Valone 1987).

Показано, что атопическая бронхиальная астма и поллиноз у детей характеризуются специфическими структурно-функциональными изменениями мембран лейкоцитов: увеличением текучести, повышением уровня полиненасьщенных «ирных кислот фосфолипидов, повышением способности к высвобождению липидных медиаторов (ФАТ и Ж) под действием специфического аллергена in vitro (Святкина О. Б. 1987, Пэгомий Н. Е 1989, Каганов С. КХ с соавт. 1900). Однако, на сегодняшний день остаются совершенно неисследованными процессы синтеза и высвобождения ФАТ и JIT в ранние сроки формирования сенсибилизации в организме, а также влияние ФАТ на синтез JIT клетками и формирование гиперчувствительности.

Между тек, ЛТВ1 и ФАТ принимают участие в регуляции Т-клеточного звена иммунитета (Resch К. 1988, Rola-Pleszczynskí М. 1987). Поскольку недостаточность супрессии при атопии заключается не только в снижении количества Т-супрессорных лимфоцитов» но и в функциональной их недостаточности (Szentivani 1977, Порядин Г. Е 1084, Салмаси Ж. М. 1991), можно предполагать, что развитию атопических заболеваний могут способствовать, в числе прочих факторов, нарушения на уровне этого регуляторного звена Соотношения отдельных медиаторов, синтезируемых клетками в ответ на воздействие аллергена, могут играть важную роль в формировании измененной реактивности, так как известно, что ФАТ и ЛТВ4 оказывают дозозависимое и противоположное влияние на пролиферативный ответ отдельных субпопуляций Т-клеток (Berens Р. et al. 1987).

Кроме того, ЛТВ4. по своим функциональным свойствам является хемоаттрактантом, вызывающим миграцию нейтрофилов и зози-нофилов в очаг воспаления, их агрегацию, дегрануляцию, адгезию, продукцию свободных радикалов (Вгау 1986, Marom Н. et al. 1987), а пепгадолейкотриены ЛГС4, ЛТД4, ЛТЕ4 входят в состав медленно действующего вещества анафилаксии (ВДВ-А). Они вызывают длительное сокращение гладкой мускулатуры бронхов, усиливают секрецию слизи, уменьшают скорость ее удаления (Вгау 1986, Peters М. et al. 1986).

Исходя из эффектов действия ФАТ и ЛТ в организме, можно

такте предполагать, что эти медиаторы в процессе беременности могут участвовать в формировании аллергической конституции у плода, которая впоследствии, в неонатальный период развития, под влиянием внешних факторов может реализоваться в различных проявлениях атопии.

Хотя, в настоящее время накоплен обширный материал, сви-' детельствующий о существенной роли цигоплазматических мембран в механизме передачи сигнала при фиксации на поверхности клеток реагинов типа JgE (Ishlzakal981, Гущин И. С. 1984), остается практически не изученным характер липйдных перестроек в мембранах клеток-мишеней в процессе формирования сенсибилизации.

Цель и задачи исследования: Целью работы является определение роли липидных медиаторов (лейкотриенов и фактора активации тромбоцитов) в формировании сенсибилизации (в том числг' внутриутробно) в эксперименте и возможности ее предупреждения при использовании мембранотропных препаратов.

В соответствии с поставленной целью в работе решались следующие задачи:

1. Определить способность лейкоцитов, лимфоцитов и тканей легких к высвобождению ЛТ и ФАТ в различные сроки (3-14 дни) сенсибилизации в ответ на введение разрешающей дозы специфического аллергена in vitro.

2. Исследовать в различные сроки сенсибилизации животных способность клеток-мишеней секретировать в условиях in vitro ЛТ под воздействием экзогенного ФАТ.

3. Исследовать способность лейкоцитов, лимфоцитов и ткани легких молодых животных, родившихся от сенсибилизированных во время беременности морских свинок, секретировать ФАТ и ЛТ под воздействием in vitro специфического аллергена

4. Исследовать возможность предупреждения развития анафилактической реакции (в условиях m vitro и in vivo) у сенсибилизированных морских свинок мембранотропными препаратами (ди-мефосфон, альмарин).

Работа выполнена в лаборатории клинической мембранологии (руководитель - доктор медицинских наук, профессор О. ЕСвятки-на) Московского НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава РСФСР, а также на кафедре патологической физиологии (заведу*)-

щкй кафедрой - доктор медицинских наук, профессор Г. Е Шрядин) Российского Государственного медицинского университета.

Научная новизна полученных результатов:

Впервые в ралпие сроки формирования сенсибилизации (3-14 дни) обнаружна способность лиыфоцитог. селезенки, лей'эдщяов перпферичесюй крови и ткани легких высвобождать медиаторы ж-пидной природы (ФАТ и ЛТ) в ответ на воздействие специфического аллергена в условиях in vitro.

Выявлены количественные и качественные изменениям составе секретируемых клетками лшидных медиаторов аллергии в различные сроки формирования сенсибилизации у взрослых животных.

Впервые показано, что у неполовозрелых животных, родившихся от ¡.юрских свинок, сенсибилизированных во вреыд беременности овальбумином лейкоциты, лимфоциты и тгдкь легких под воздействием специфического аллергена in vitro высвобождают ФАТ и да.

Обнаружены различия в составе JTF, секретируемых тканяш ыолодых и взросли;: (родителей) морских свинок.

Впервые показано, .что на 3-14 дни сенсибилизации лейкоциты, лимфоциты и ткань легких высвобождают ЛТ под действием ФАТ.

Показано, что альмарин, препарат рыбьего .тара, обогащенный поякненасыщепннми жирными кислотами (зйкозапентаеновой к докоеагексаетосой), ингибирует в условиях in vitro высвобождение ФАТ и ЛГ лейкоцитами, лимфоцитами ц тканью легких.

Шказано, что димефосфон, препарат используемый в педиатрии для лечения атонической бронхиальной астмы у детей, изменяя состав фосфолипидов мембран лейкоцитов и ингибируя секрецию липидных медиаторов аллергии клетками- мишенями предотвращает развитие анафилактического шока у сенсибилизированных ж-вотных.

Теоретическая и практическая значимость работы:

Установлена существенная роль ФАТ и ЛГ в процессе формирования у mibothux сенсибилизации к белку. Данные о выявленных изменениях функциональной активности ¡теток-мишеней на ранних втапах аллергической перестройки организма вносят определенный вклад в развитие представлений о молекулярных механизмах аллергических йрошссов.

Доказана возможность внутриутробной сенсибилизации при

индукции аллергической реакции у беременных животных. Представленные данные могут служить методологичесюэй базой дальнейших исследований по изучению развития сенсибилизации п организме человека, в том числе у новорожде* 'ых из семей с отягощенным аллергологическим анамнезом.

У неполовозрелых животных, родившихся от сенсибилизированных во время беременности морских свинок, обнаружена гип«р-чувствитрльность тканей легких со способу стью высвобождения под действием специфического аллергена ЛТС4 и ЛТД4 - основных функционально активных компонентов МДВ-А На основании полученных результатов в дальнейшем возможна разработка новых методов ранней объективной диагностики формирования ги^ер-чувствительности при неспецифичэских бронхолегочннх заболеваниях у детей младших возрастных групп,

Установление способности альмарнка эффективно ингибир^вать процессы секреции липидных медиаторов клеткам}' мишенями сенсибилизированных животных, позволяет рекомендовать препарат для исследования возможности профилактики развития аллергической перестройки в организме человека л привенгивного лечения атонических заболеваний.

Результаты, свидетельствующие о способности димефзсфчна эффективно предупреждать развитие анафилактического шока, как при разовом парентеральном введении, гак при десятидневном курсе per os, позволяют рекомендовать его для предупреждения возможной аллергической реакции в случаях применения аналгети-ков, антибиотиков, сульфаниламидов, а также при проведении профилактических прививок в группах ослабленных деть-й и детей с предрасположенностью к аллергии.

Практическое использование материала, иг долинного в диссертации, осуществлю, гея в лекциях для клинических ординаторов в Московском научно-исследовательски институте педиатрии и детской хирургии Минздрава PCSCP.

По материалам работы оформлена заявка на г дачу патентг по изобретению "Способ профилактики анафил<. .тического шока"

Апробация работы:

Результаты работы доложены и обсуждены на: XV симпозиуме социалистических стран по проблемам детской пульмонологии (Киев, 1989), объединенном методическом совепаьли отде .ов клинической мембранологии, иммунологии, патологии обмена и пульмо-

нологии Московского НИИ педиатрии и детской хирургии (1990), Всесоюзной конференции по детской пульмонологии (Киев, 1990), I Всесоюзной школе-семинаре "Тромбоцит, как тест-система физиологических и патологических состояний человека" (Москва, 1990), Международном Конгрессе патофизиологов (Москва, 1991), васедании комиссии по аллергологии Цроблемного Научного Центра при Минздраве РСФСР (1991), конференции по новым антиаллергическим препаратам в Институте Г. Бофур (Париж, 1991).

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание методов исследования, три главы результатов собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 14 рисунками. Указатель литературы содержит 297 источников, из них отечественных 27 , иностранных 270.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

Атопия не имеет на сегодняшний день однозначной экспериментальной модели, позволяющей адекватно судить о механизмах формирования гиперреактивности. Однако, модель формирования у морских свинок первичного иммунного ответа на белок позволяет исследовать особенности изменений функционального состояния клеток-мишеней и шоковых органов, связанных с готовностью к патохимической реализации аллергической реакции.

Для исследования возможности коррекции нарушений, возникающих в остром периоде- с помощью препарата мембраностабилизи-руюшего действия димефосфона, в качестве экспериментальной модели аллергической реакции немедленного типа была выбрана реакция анафилактического шока у морских свинок. Системный анафилактический шок у морских свинок считается достаточно адекватной экспериментальной моделью для изучения механизмов развития и возможности ингибирования аллергической реакции у человека (А-Адо, 1978), так как при анафилаксии у морской свинки главным шоковым органом является гладкая мускулатура бронхоле-гочного аппарата (Уегсе11оШ 1987).

Исходя из цели и аадач исследования животные были распределены на три группы:

I группа. Экспериментальные исследования, связанные с изучением механизмов формирования сенсибилизации, проведены на 58 беспородных морских свинках массой 160-180 г, сенсибилизированных путем однократного (подкожного) введения овальбумина (0,2 мг на животное) а полном адъюванте Фрейнда.

Объектом исследования на клеточном уровне служили лейкоциты периферической крови, лимфоциты селезенки, а также легкие, относящиеся к органам, в которых при сенсибилизации наблюдается развитие иммунных реакций, превышающих по интенсивности обшую реакцию организма, что обусловлено наличием специфической слизистой лимфоидной ткани.

На 3, 5, 7, 14 дни после сенсибилизирующей инъекции белка животным под рауш-наркозом вскрывали сонную артерию, кровь собирали в пробирки с гепарином (50 Ж / мл крови). После, вскрытия грудной клетки легкие быстро промывали раствором Тироде через введенный в легочную артерию зонд, кусочки отмытого от крови легкого помещали в охлажденный (4°С) раствор Тироде (рН-7,4). Лейкоциты выделяли в градиенте 10% раствора желатины, лимфоциты в градиенте фиколл-верографина (d~ 1,078 г/см ). Отмытые физиологическим раствором клетки ресуспензировали в растворе Тироде (1,0 мл/107 клеток), количество жизнеспособных клеток (по окрашиванию IX раствором трипанового синего) составляло 96-932. Препарат ткани легких получали механическим измельчением ткани до размеров частиц 1-3 мм с последующим ресуспензированием в буфере Троде (0,1 г ткани/ 0,1 мл буфера).

II группа. Исследования механизмов патохимической реализации аллергической реакции в результате сформировавшейся внутриутробно сенсибилизации проведены на 5 неполовозрелых морских свинках массой 140-160 г в возрасте трех недель, полученных от животных, сенсибилизированных во время беременности (за неделю до родов) подкожным введением овальбумина в полном ад истайте Орейнда. Контролем служили морские свинки того же возраста и массы, полученные от интактных животных и содержащиеся в тех же условиях. Материалы для специальных исследований выделяли как описано выше.

III группа. Исследование механизма действия препарата, коррегирупцэго карупения, возникавшее в остром периоде анафилактической реакции, проведены на 35 беспородных морских евин-

ках массой 2СЛ-230 г, сенсибилизированных трехкратным (подкожным) введением (через день) овальбумина в дозе 0,25 мг на животное в адъюванте (5 мг геля гидроокиси алюминия). Разрешающую Г.озу антигена в количестве 5,0 мг в 0,5 мл физиологического раствора вводили внутривенно через 21 день после последней сенсибилизирующей иньекции белка

Для изучения подавляющего действия димефосфона на развитие анафилактического шока, были выбраны две модели эксперимента:

1. На 21 день сенсибилизации животным однократно (внутри-« веняо) вводили препарат в Физиологическом растворе за два часа до введения разрешашэй дозы аллергена. Препарат применяли в концентрации 100 и 200 ккг на мл крови, что соответствовало 8 и 16 мг/кг массы животного.

2. Начиная с 21 дня сенсибилизации ежедневно, в течение 10 чней до внутривенного разрешения аллергеном, вводили препарат per or в дозе 160 мг/кг массы.

Контролем служили интакгные и сенсибилизированные оваль-бумином (без ¡.^едварительного введения димефосфона) морские свинки. .

Уровень сенсибилизации животных определяли выборочно по реакции пассивной кожной анафилаксии (2. Ovary, 1951). Степень тяжести анафилактической реакции оценивали вычислением индекса шока по " Wigle, С. Cochrane, К. Dixon (1952).

Фосфолипиды экстрагировали иэ лейкоцитов методом Bllgh -Dyor, разделяли на индииидуальные фракции методом микротонкослойной хроматографии на пластинах Si 2 ufo1 (ЧСФР) в системах растворителей Rouser (ИКейтс, 1975). Идентификацию индивидуальных фракций фосфолипидов проводили с использованием стандартов г^оивеодства фирмы Serva и МИТХТ им. Ломоносова M.R Для количественного анализа силикагель из областей отдельных пятен снимали с пластин, сжигали в металлическом блоке в 727. хлорной кислоте. Определение неорганического фосфата, образующегося при сжигании йгсфолипидов проводилось по методу В. Све-таиква (М. Кейто, 1975).. Результаты выражали б относительных процентах содержания фосфора во всем исследуемом образце.

Содержание лейкотриенов и фактора активации тромбоцитов г.ссл'лдовали в экстрактах инкубатов клеток и препаратов измель-

ченной ткани легких. Инкубацию лейкоцитов, лимфоцитов (107 кл/мл инкубационной среды) и препаратов ткани легких (0,1 г/мл инкубационной среды) с овал^бумиггом (100 мнг/мл, 10 кл. или 0,1 г ткани) или синтетическим ФАТ (2 нМ) производства фирм Amercham или Serva, проводили в буфере Тироде в течение 15 минут при 37"С. Затем пробы центрифугировали при 4* С в течение 5 мин при 3000 gö/шш, супернатанты декантировали и хранили в жидком азоте.

Спектр и количество ЛТ определяли методом обратнофаэной высокоэффективной жидкостной хроматографии при градиентном делении на колонках Ultrasphere ODS С18 (Peters et al. 1983). ФАТ определяли методом прямофезной высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонках Lichrosorb Si-60 (Vardlaw,1Q85). Для проведения анализа использовали насосы Altex-llOA, процессор Al teх-770, спектрофотометр Spektroflow-773 (Kratos, США) и интегратор Shimadzu (Япония). Для идентификации отдельных ЛТ, вычисления их количественного содержания в образцах использовались синтетические препараты фирмы Serva в качестве стандарта Содержание ФАТ в образцах рассчитывалось с использованием синтетических препаратов ФАТ-016 и ФАТ-С18 фирм Anwrsham и Serva

Результаты проведенных исследований обрабатывали с вычислением средней ошибки. Коэффициенты корреляции, а так»? достоверности различия одноименных показателей вычисляли по формулам параметрической вариационной статистики с использованием критерия Стьсдента (В.УрОах, 1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЯДЕНИЕ.

При исследовании реактивности лейкоцитов, лимфоцитов и ткани легких морских сванок в ранние сроки (3, 5, 7 и 14 дни) развития сенсибилизации к белку было установлено, что стимуляция клеток овальбумином в условиях in vttro вызывает секрецию существенных количеств липидных медиаторов воспаления и аллергии (ФАТ и ЛТ).

Большая часть секрегируемого клетками ФАТ на третий день была представлена соединением с ацильной цепью С-16 (ФАТ-С16) в молекуле (2,23*0,41 нМ/10 кл.). В остальные сроки ÍAT-C16 либо не определялся (в пределах чувствительности метода), либо

обнаруживайся в следовых количествах (четырнадцатый день).

Уровень высвобождаемого в этих условиях из лейкоцитов на третий день ФАТ-Cl 8 был значительно ниже (0,66.10,21 нМ/10' кл. ) и не изменялся в течение первой недели сенсибилизации, существенно повышаясь к концу второй недели (1,27^0,63 нМ/107кл. ).

В супернатантах фрагментов ткани легких, в отличие от "ейкоцитов, высвобождение ФАТ-С16 in vitro под действием овальбумина обнаруживалось' во все исследованные сроки сенсибилизации, наиболее существенное повышение уровня его отмечалось на третий и четырнадцатый дни (0,26*0,17 и 0,21±0,12 нМ/0,1 г гкани соответственно). На пятый и седьмой дни обнаружены лишь следовые количества этого медиатора Уровень ФАТ-С18, высвобождаемого тканью легких, со все исследованные сроки сенсибилизации колебался в пределах от 0,68*0,27 до 0,83±0,40 нМ/0,1 г ткани.

По данкым литературы, ФАТ-CIS обладает большим сродством к специфическ. л рецепторам на поверхности клеток и более по-тентеп в отношении тимуляции хемотакслса, агрегации и дегра-нуляции (Cheng *987, Сагоlan 1990). ФАТ-Cl8 отличается большей сппобтсгью встраиваться в клеточные мембраны (Lynch 1987), а также увеличивав проницаемость сосудов (Carolan 1990). Клетки секретиг'рг лишь 10-15% синтезирующегося при стимуляции ФАТ (Oda M. et al. 1985, Ibllinedo et al. 1988). Большинство своих эффектов медг лор осуществляет, оставаясь внутри клеток, будучи ассоциированным с клеточными мембранами (Henson et al. 1983). Встраиваясь в липид: мембран, он изменяет их биофизическое с стояние, увеличивая т /.учесть (Halashi et al. 1985), что существенно влияет на хемотаксис клеток (tonkado et al. 1987), и экспрессию мембранных рецепторов. Этим механизмом ФАТ активирует многие клетки, участвующие в воспалении, изменяя реактивность макрофагов (Bachelet M. 1987), полнморфноядерных лейкоцитов (Vv.i~cellotti S. 1988), а также тромбоцитов (Akkerman Y. * 987). Akkern i считает, что активация тромбоцитов ФАТ является важной стадией патофизиологии бронхиальной астмы. Клинические наблюдения свидетельствуют, что у больных аллергичиски-ми ринитами и бронхиальной астмой повышается тромбопоээ, происходит нарушение метаболизма и реактивности тромбоцитов, сопровождающееся увеличением секреции липо- и циклооксигеназных продуктов. В крови больных обнаруживаются атипичные тромбоциты увеличенного объема, а в легких, при смерти в статусе - боль-

- и -

шое количество мегакаркоцитов. Для тромбоцитов установлен такой же, как и для тучных клеток, механизм перекрестного стягивания IgE-рецепторов (Silbaugh et al. 1989), что делает партнерами тучных клеток в реакциях немедленной гиперчувствительности. Veisinger (1937) считает, что тром'оцит . ответственны за управление последовательностью клеточной инфпь трации. Большинство исследователей (Noochlko 1987. Wardlaw 1837 и др.) считают, что секреция ФАТ яв^ется основным : ->ха-низмом пополнения очага воспаления в органах-мишенях фагоцитами. Действие ФАТ приводит к увеличению инфильтрации тканей вначале тромбоцитами, а затем нейтрофилами и мононуклеарами, а при атопии преимущественно эозинофилами (Veisinger 1ъ87, Vercellotti 1987).

Синтез и секреция повышенных количеств С .Г-С.8 в первые недели формирования сенсибилизации обеспечивает активацию и премирование многих клеточных пулов. ФАТ-С16 стимулирует хемотаксис активированных клеток. Увеличение проницаемости сосудов под действием ФАТ-С18 способствует процессу шфильтрации тканей и формированию гиперреактивности на уровне шоковых органов.

Таким образом, ФАТ, очевидно является фактором, формирующим в ранние сроки после контакта с аллергеном многие нар^ле-иия, способствующие развитию аллергического заболевания и формированию гиперреактивности.

Помимо ФАТ, лейкоциты периферической крлови, лимфоциты селезенки и препараты ткани легких сенсибиливированн"х mopjk,-x свинок секретируют лейкотриены. Причем, уже в ранние сроки (третий день) высвобождаются существенные количества пепти-досодержащих лейкотрченов ЛТС4, ЛТД4, ЛТЕ4 (d сумме 7,1й±1,15 иг/10 лейкоцитов и 6,d6±l,54 нг/0,1 г ткани легких). Кроме пептидолейкотриенов, клетки-мишени секретируют в ответ ла гоз-действие антигена существенные количества ЛТк4 (2,02i0,60 нг/10 кл. и 1,55*0,55 нг/0,1 г ткани). Следуем отметить, что по мере развития сенсибилизации наблюдается тенде! дни воз растания количества ЛТВ4, секретируемого тканью легких в ответ на воздействие антигена, на четырнадцатый день он обнаруживается в количестве 2,12i0,37 нг/0,1 г ткани, что сг "-собствует хемотаксису активированных клеток в легкие. Секреция ЛГВ4 лей коцитами не изменяется к четырнадцатому дню сенсибилизации.

Среди JTT, секретируемых лейкоцитами и тканью легких i.a

третий день, в молярном отношении преобладал ЛГД4 (3,8&±0,98 нг/10 кл. и 3,5б±0,70 иг/0,1 г).

Следует подчеркнуть, что в течение первой недели сенсибилизации ш не обнаружили у сенсибилизированных животных изменений иммунологических показателей по реакции пассивной кожной анафилаксии (ПКА). На четырнадцатый день сенсибилизации титр антитела в ПКА по Овери составил 1:128, индекс шока 3,5_t0,3.

К четырнадцатому дню сенсибилизации наблюдалось увеличение секреции ЛГЕ4 и JTTC4 лейкоцитами и тканью легких под воздействием антигена Особенно существенно увеличивалось высвобождение ЛГЕ4 (4,62±0,7б нг/10 кл. и 3,45±0,S0 нг/0,1 г ткани). Известно, что ЛГЕ4 способствует увеличению секреции гистамина тучными клетками легких (Lee Tack et al. 1985), а также модулирует активность гистаминовых рецепторов на гладко-мышечных клетках (Stehwart,1984).

Известно, что большинство своих эффектов, в том числе сосудосуживающее, стимулирующее развитие отека действие (Chrísc-y, 1988), а также, отчасти, развитие бронхоспазма (Vfrzo, 1987; Наее.1987) ФАТ опосредует через стимуляцию синтеза ЛГ макрофагами (Pretolani ,1989) и аозинофилами (Bruynzeel,1987).

Нами обнаружено, что лейкоциты высвобождают лейкотриены под воздействием ФАТ уже на третий день сенсибилизации животных. Однако, количество высвобождающихся лейкоцитами под воздействием ФАТ лейкотриенов в эти сроки было существенно ниже, чем под воздействием аллергена. Среди ЛТ, секретируемых клетками под воздействием ФАТ, на третий день сенсибилизации преобладали в молярном отношении ЖВ4 и ЛТД4 (0,87±0,32 нг и 1,66¿0,92 нг/10 кл. соответственно).

К четырнадцатому дню количество ЛТ, секретируемых лейкоцитами г ответ на воздействие экзогенным ФАТ, существенно увеличивается. Среди лейкотриенов, по-прежнему преобладают ЛТШ и ЛТД4, однако количе. ^а их были существенно выше, по сравнению с третьим днем (ЛТВ4 9,81¿0,53 нг, а ЛГД4 б,43±1,0б нг/ÍO кл.). Следует подчеркнуть, что под воздействием аллергена на четырнадцатый день сенсибилизации лейкотриены В4 и Д4 высвобождаются в существенно меньшем количестве (2,40±0,32 и 2.84Ю,53

нг/10 кл. соответственно), чем под воздействием ФАТ.

Сравнивая спектр и количества ЛТ, высвобождающихся из лейкоцитов под воздействием аллергена и ФАТ в эти сроки, следует отметить, что. хотя оба фактора ст лулируют высвобождение из клеток' одних и тех же ЛТ, количество от«ельных видов ЛТ, секретируемых клетками,, существенно различается в ,авис.;мости от стимула.

Очевидно, примирование клеток воспаления при формировании сенсибилизации приводит к изменению их реактивности. Извесано, что гранулоциты больных бронхиальной астмой и аллер.'ичг~кими ринитами синтезируют в существенных количествах ЛТД4 (Koni. 1985), а эозинофилы здоровых лиц продуцируют менее высокие количества ЛТС4, чем эозинофилы больных бронхиальной астмой (io-nigushi et al. 1985).

Из препаратов ткани легких сенсибилизироъ лньи морских свинок при икубации их с ФАТ в тех ке условиях, что и клеточные препараты лейкоцитов, на третий день сенсибилизации высвобождается лишь ЛТВ4, а к четырнадцатому дню, помимо ЛТВ4, существенные количества лепгидолейкотрир'юв, среди соторых в молярном отношении преобладают JTTC4 и ЛТД4.

Таким образом к четырнадцатому дню сенсибилизации формируется комплекс изменений, свидетельствующий о возможности сенсибилизированных животных отвечать острым длительным боон-хоспаэмом в ответ на воздействие специфического аллергене., а также о формировании неспецифической гиперчувствительности.

Изменение реактивности клеток в ходе развития сенсибилизации является следствием изменения фосфолипидного состава и биофизического состояния их плазматических мембран.

У сенсибилизированных животных т фосфолипидах цитоплазма-тических мембран лейкоцитов к четырнадцатому дня сенсиб.глш л-ции существенно увеличивается содержание фосфатидилиноэита ( с 4,2±1,2.7. в контроле до 18,9±1,0Х ). При •чтом снижается содержание фосфатидилхолина ( с 38,2±0,9Х у интактных живо', лнх, «о 31,8±0,3% у сенсибилизированных ), а также сфингомиелина (10,9±0,2%) по сравнению с контролем (20,7iO, 6%). Так^е изменение метаболизма отдельных классов фосфолипидов г ¡иводит к уменьшению соотношения фосфатидилхолина и сфиуомиелина и, |<лк следствие, увеличению текучести мембран (Rergelson et

al. 1977,1085). Увеличению текучести способствует также накопление в фосфолипидах их дегкоокисляющихся компонентов, таких как фосфатидилиноаит (Е. Бурлакова с соавт. 1977). Высокое содержание фосфатидилинозита указывает также на определенную готовность клетки к синтезу-липооксигеназннх метаболитов арахи-доновой кислоты, так как большая ее часть (S0X) высвобождается при активации клеток в результате гидролиза фосфоиноаитидов (Naccache,1987). Не исключено также, что обнаруженное снижение содержания фосфатидилхолина в мембранах является следствием биосинтеза из него ФАГ активированными клетками (Shaw,1985). Увеличение синтеза ФАТ, в свою очередь приводит к увеличению текучести цигоплагмагических мембран.

При исследовании лейгоцитов, лимфоцитов и препаратов ткани легких неполовозрелых животных, родившихся у морских свинок, сенсибилизированных во время беременности, было обнаружено, что в условиях инкубации in vitro с овальбумином они сек-рэтируюг существеннее количества ФАТ и ЛТ, в отличие от животных, рожденных интактными морскими свинками.

Лейкоциты периферической крови молодых (три недели) животных секрегировали ФАТ-С16, ЛГС4, ЛТД4 в существенных количествах , в меньшем количестве секретировался ФАТ-С18, а также

ЛТВ4, ЛГЕ4 был обнаружен в следовых количествах (менее 0,5

i

нг/10 кл.). В эти же сроки сенсибилизации лейкоциты взрослых морских свинок (родителей) секреткровали под воздействием аллергена лишь ФАТ-С18 и ЛТД4.

Было обнаружено татке, что инкубация ткани легких молодых животных с антигеном in vitro приводила к высвобождению широкого спектра медиаторов, большая часть которых представлена ФАТ-С16 и ЛТД4, в сравнительно меньших количествах секретиро-вались ЛГС4, ЛТЕ4, а также ЛТВ4 и ФАТ-С18. При анализе инкуба-тов ткани легких взрослых морских свинок (родителей) обнаружены лишь ФАТ-С18, ЛТВ4, а также ЛГЕ4.

Аналогичная реакция клеток в ответ на воздействие специфического аллергена in vitro выявлена при исс. ;е давании пула лимфоцитов селезенки неполовозрелых животных. Лимфоциты секре-тировали существенные количества медиаторов аллергии, а именно ФАТ-С16. ФАТ-С18 и лейкотриены С4, М, Е4, В то время как лимфоциты взрослых животных секретировали под воздействием аллергена в эти же сроки сенсибилизации лишь лейкотриены С4, Д4 и В4. Это свидетельствует о том, что изменения метаболизма и от-

Высвобождение леЯкотриеноп (ЛТ) и фактора активации тромбоцитов (ФАТ) из препаратов ткани легких иорских свинок под действием овальбумина ш таЛго (М+ ш, нг ЛТ или нМ ФАТ/ 0,1 г ткани).

Группы животных

ЛТВ

'4

ЛТС

4

ЛТДл

ЛТЕ,

$АТ-С1б

ФАТ-С18

Взрослые интактные животные-: - контроль ( п-7) :

н.о.

и.о.

н.о.

Взрослые сенсибилизирован- : ные животные: :

а) на третий день ( а- 7) : 1,55+0,55

б) на четырнадцатый день(п»в) 2,12+0,37

: Рз_й -О,' Взрослые сенсибилизирован- : ныа животные - родители (а «5): 2,07+0,71

05

1,82+0,52 2,86+1,02' РЗ-14

менее 0,5

3,56+0,70 .2,62+0,52

05

Молодые животные, ровденные : сенсибилизированными морскими : свинками ( п«5) ; 1,75+0,73

Молодые животныз, рожденные интактныыи морскими свинками - контроль ( а«5) : н.о.

1,13+0,47

н.о.

менее 0,5

5,91+1,17

и.о.

н.о.

1,58+1,32 3,45+0,90

РЗ-14^.02

1,66+0,43

1,23+0,75

н.о.

н.о.

0,26+0,17 0,21+0,12

н.о.

5,00+0,89

н.о.

с

I

0,68+0,27 0,8370,31 Р3_14 -°«05

0,82+0,53

2,63+0,67

н.о.

Примечание: н.о. - не определялись в пределах чувствительности метода.

Высвобождение лейкотриенов (ЛТ) и фактопа активации тромбоцитов (ФАТ) из лейкоцитов периферической крови морских сг^нок под действием оваль-бумина Ш ( М+ а, нг ЛТ или нМ ФАТ/ 10^ клеток).

Группы животных

ЛТВд

та,

ЛТД.

ЛТЕ„

ШАТ-С16 : ФАТ-СГ8

Взрослые интактные животтае-

- контроль ( п.а'7)

Взрослые сенсибилизированные животные:

а) на третий день ( а»7)

б) на четырнадцатый день (а =8)

Взрослые сенсибилизированные животные - родители(п=5)

Молодые животные, рожденные сенсибилизированными морскими свинками ( п«5)

Молодые животные, рожденные интактнши морскими свинками

- контроль ( а»5)

н.о.

2,02+0,68 2,40+0,32

2,70+0,50

1,25+0,42

н.о.

н.о.

н.о.

н.о.

н.о.

н.о.

1,28+0,32 2,04+0,43. РЗ_14 >0.05

3,86+0,98 2,84+0,53

2,05+0,65 4,62+0.76. РЗ_14 -0.01

2,23+0,41 :0,66*0,21 мскэе 0,5 :1,27+0,63 :РЗ-Т4^0'02

н.о.

2,16+0,57

н.о.

2,07+0,73

2,12+0,66

н.о.

н.о.

менее 0,5

н.о.

н.о.

6,03+0,49

н.о.

О,76+0,33

0,80+0,38

н.о.

Примечание: н.о. - не определялись в пределах чувствительности метода.

Высвобождение in vitro JIT (н г/ 10^ кл.) лейкоцитами пэри1юри"ескол крови морских свинок под воздействием ФАТ ^Mj а).

: йнтактшге Лейкотриены : животине,п =5

Се ноибилкз иров а иные животные

на Я день,а =6 : на 14 пень. а°6

ЛГВ4 ЛТС4 ЛТД^ ЛТК.

н.о. и.о. и.о. и.о.

0,87*0,32 менее 0,5 1,66*0,92 И.О.

9,81±0,53 1,70±.0,49 6,43*1,06 1,73*1,03

Высвобождение in vitro ЛТ (иг/ О, I г ) препаратами ткани легких морских свинок под воздействием ФАТ

( U + ш>

Леикотриены

Ингактныэ животные, п=7

Сенсибилизированные

_животные _

Тш~3 день, п=|" на i.4 день,п =/

ЛТВ4

ЛТД^ ЛТЕ,

н.о.

Н.О.

н.о. н.о.

2,05±0,75 н.о. н.о. н.о.

2, г<Ж>, 82 2, 73*0,39 з,45±1, гб 0,71*0,24

Примечание: н.о. - не определялись в пределах чувствительности используемого метода.

вечаемости клеток, происходящие при формировании атопии, затрагивают многие клеточные пулы.

Бри сравнении спектра и количества секретируешх липвдных медиаторов аллергии препаратами клеток и тканей неполовозрелых морских свинок и их родителей видно, что эти изменения не адекватны по своему характеру наблюдаемым у взрослых животных (родителей) в эти же сроки сенсибилизации. Это может быть, отчасти, следствием возрастных изменений функциональной активности клеток. Дая полиморфноядерных лейкоцитов человека, например, известно снижение текучести мембран в детском возрасте, что отражается на хемотаксисе и степени экспозиции мембранных рецепторов (Мопкас!о И, а1.109О).

Из полученных результатов становится очевидным, что сенсибилизация материнского организма во время беременности приводит к формированию гиперчувствительности клеток-мишеней плода. Перенос факторов сенсибилизации может осуществляться клетками. Известно, что клетки иммунологической памяти - малые лимфоциты, а также тромбоциты (Лозовская М. с соавт.1975, Jahгrett,1984) способны проходить через плаценту. Предположения о возможном механизме передачи факторов сенсибилизации через плаценту на сегодняшний день являются исключительно гипотетическими.

У детей, родившихся у матерей-атопиков клинически здоровыми, обнаруживаются высокие концентрации в пуповинной крови, что свидетельствует о внутриутробной сенсибилизации (Сотраепоп! еЬ а1.1987). Поскольку через плаценту не проходит, у новорожденных он синтезируется самостоятельно (ЗаЬггв1Ъ,1984), очевидно, трансплацентарно передается иной информационный материал.

Доказана возможность внутриутробной сенсибилизации плода с выработкой антител, преимущественно 1еО класса, к пищевым аллергенам, которые содержались в рационе беременной (Са]кЬоУеп, 1391). Поскольку многие пищевые аллергены имеют общие антигенные детерминанты с ингаляционными аллергенами, иммунная стимуляция пищевыми продуктами предрасполагает к формированию сенсибилизации к пыльце трав и деревьев. СаШюуеп показал, что наличие интенсивной иммунной реакции !гв класса антител у новорожденных является, фактором, предрасполагающим к последующему развитию аллергических реакций. формированию внутриутробной сенсибилизещяи способствует повышенная проница-

емость кишечника у матерей, страдающих атонией. У новорожденных этой группы часто обнаруживается распространенная токсическая эритема, которую относят к пограничным состояниям и считают одним на ранних проявлений зкссудативного диатеза (Т. Гумярова,1982). В генезе токсической эритемы значительную! роль играет яи-лшй белок, гиперчувствительность к которому отпечена у 067. новорооденкых этой группы (Г. Елиневская, 1984).

Важное значение для становления аллергической реактивности плода имеет состояния, ведущие к изменениям в системе мать- плацента-плод с повышением проницаемости плацентарного барьера как для аллергенов, так и для сенсибилизированных клеток. Не исключено, что увеличение проницаемости на уровне тро-фобласта под действием секретируемого в повышенных количествах ФАТ может приводить к нарушению барьерных функций плаценты в отношении веществ, несуща чужеродную для организма плода информацию. Возможна как индукция сенсибилизации плода овальбу-мином, проходящим через плаценту, так и передача сенсибилизированными клетками.

Очевидно, в целом механизмы формирования атонической настроенности плода имеют мумтнфакториальную природу. Наличие генетически обусловленной предрасположенности к формированию атопии усугубляется влиянием факторов, действующих на плод в процессе развития сенсибилизации в организме матери.

Одной из вадач работы явилось исследование действия препаратов, способных оказывать терапевтический и профилактический эффект, влияя на метаболизм арахидоновой кислоты. Установлено, что альмарин, содержащий полиненасышенные жирные кислоты эйкозалентаеновую ОПЕК) и докозагексаеновую (ДГЕК), способен тормозить in vitro высвобождение ЛТ и ФАТ клетками и тканью легких сенсибилизированных овальбумином взрослых, а такжз неполовозрелых, сенсибилизированных внутриутробно, животных при воздействии специфического аллергена При этом альмарин оказывает избирательное действие на различные молекулярные формы ФАТ, . оказывая более сильное влияние на процессы синтеза и высвобождения ФАТ-С16.

Инкубация лейкоцитов и ткани легких с альмарином приводит к существенному снижению уровня ФАТ, высвобождающегося под воздействием аллергена, соответственно 0,82*0,15 нМ/10 кл. и 0,40±0,17 hW0,1 г ткани. Механизм действия препарата связыва-

ется, в частности с тек, что ЗПЕК, входящая в его состав, легко инкорпорируется в фосфолипиды клеточных мембран-(Lokesh et al. 1987), заменяя в них арахидоновую кислоту. Метаболиты, образующиеся из ЭПЕК при стимуляции клеток, не обладают свойствами биологически активных медиаторов аллергии и воспаления (Lessof at al. 1987; Careaga-Houck et al. 1990).

Установлено также, что мембранотропный противоаллергический препарат ' димефосфон, применяющийся для лечения атопи-ческой бронхиальной астмы у детей эффективно предупреждает развитие анафилактического шока при внутривенном введении сенсибилизированным морским свинкам минимальной летальной дозы аллергена. Защитный эффект от применения димефосфона отмечен при однократном внутривенном введении его в дозе 16 мг/кг за два часа до разрешения аллергеном, а также в дозе 360 мг/кг per os в течение десяти дней до разрешающей инъекции аллергена Механизм действия препарата заключается в торможении секреции липидных медиаторов аллергии и воспаления клетками-мишенями, а также в стабилизации мембран вследствие изменения их фосфоли-пидного состава под воздействием димефосфона. Устойчивость ци-топлазматических мембран в условиях анафилактического шока обеспечивается увеличением содержания в фосфолипидах мембран лейкоцитов сфингомиелина и снкмзккем содержания фосфатидилино-зита

Таким образом, результаты работы свидетельствуют о значительном изменении реактивности отдельных клеточных пулов сразу ле после введения аллергена, в ранние сроки развития сенсибилизации в организме, еще до повышения уровня IgE и развития картины общей и местной анафилаксии в ответ на введение разрешающей дозы антигена

Кроме того, сенсибилизация материнского организма может являться причиной измененной клеточной реактивности и индукции гиперчувствительности к аналогичным аллергенам у потомства.

ВЫВОДИ

• 1. Развитие сенсибилизации к белку у морских свинок характеризуется существенным увеличением реактивности лейкоцитов крови, что выражается в способности к высвобождению липидных медиаторов (лейкотриенов и фактора активации тромбоцитов) под действием специфического аллергена in vitro ужз в ранние сроки

- ZL -

формирования первичного иммунного ответа, когда още отсутствуют проявления реакции анафилшссни.

2. Стимуляция специфическим аллергеном (in vitro) на третий день сенсибилизации приводит к внсвоиожде1''"0 лейкоцитами ФАГ-С16, а препаратами легочной гкани ФАТ-С18.

3. В составе лейкотриенов, секрзтируемых лейкоцитами, лимфоцитам! и тканьп легких на третий день сенсибилизации в молярном отношении преобладают пептидосодег чащие лешотриены ЛТС4 и ЛТД4.

4. .К четырнадцатому дню сенсибилизащ"' животных формуется гиперчувствительность клеток-мишеней к фактору активацил тромбоцитов. В ответ на воздействие экзогенного ФАТ препарг'-ы лейкоцитов и ткани легких сокретирукгг существенные количества пептвдолейкотриенов, а тают? ЛТВ4, причем количество ЛТР4, секретируемого лейкоцитами в ответ на Бездействие фактора активации тромбоцитов, достоверно выше (р<0,001), чем при воздействии аллергена.

5. Па четырнадцатый день сенсибилизации животных изменяется фос^дипидный состав цитоплас...атнческих мембран лейцитов периферической крови: увеличивается в четыре раза содержание фосфагидшшиозита, снижается в два раза содержание сфипгс-тголина, а также достоверно (р<0,02) уменьшается содержание фосфатидмлхолииа.

6. Сенсибилизация морских свинок овальбумином во врамя беременности приводит к внутриутробно!? сенсибилизации плода. Обнаружено, что клегга-мишеня молодых жгаотных, родившихся от сенсибилизированных во время беременности морских свинок, се-ретлруют в ответ на воздействие специфического аллергена существенные количества ФАТ и ЛГ.

7. Состав шциатс эв, секретируемых клетками и тканью легких неполовозрелых животных и взрослых животных (родителей) различается. В сумме медиаторов, секретируемых te тками-мише-нями молодых ¡швотных преобладает пептидосодержаг э лейкотриены ЛТС4, ЛТД4 и ФАТ-С16, а взрослых етвоп х - ЛТВ4 и ФАГ- 018.

0. Инкубация лейкоцитов, лимфоцитов и фрагментов ткани легких сенсибилизированных >,юрских свинок с алькарином г концентрации iDjjr/10 клеток или 0,1 г ткани в течение 20 минут приводит к полному подавления вкейобашгения ЛГ, десятикратному снижению секреции ФАГ-С16 ч существенно^ сн.ьгзнию . экрецпи 'ЗАТ-С18 s ответ j¡а дсЛаддакйЭ в текуСв? специфического аялер-

гена.

9. Димефоефон, путем стабилизации фосфолипидкого состава цитоплааматических мембран лейкоцитов и ннгибищш высвобождения липидных медиаторов клетками-мишенями, предупреждает развитие анафилактического шока у сенсибилизированных белком морских свинок. В дозе 160 мг/кг перорально в течение десяти дней и в дозе 16 мг/кг внутривенно аа два часа до введения овальбумина препарат полностью защищал животных от минимальной летальной дозы аллергена.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИЯ

Определение высвобождения ФАТ и ЛГ под воздействием специфического аллергена in vitro лейкоцитами пуповинной крови может служит*» критерием уровня сенсибилизации новорожденных детей матерей с атопическими заболеваниями.

Препарат альмарин, эффективно ингибирующий процессы секреции липидных медиаторов клетками-мишенями, может быть рекомендован для профилактики .развития аллергической реакции в организме человека.

Димефосфон, блокируг-чий высвобождение липидных медиаторов из лейкоцитов, предлагается как эффективный препарат в комплексном лечении атопических заболеваний, а также для предупреждения развития анафилактической реакции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Роль медиаторов ляшдной природы в формировании гипер-чувствительнопти легких в организме. //Тез. докл. II Всесоюзного конгр. по болезням органов дыхания. - Челябинск. 1991.- с.62. (в соавт.со Святкиной 0.В., Порядиным Г.К , Вельтицевым Ю. Е.).

2. Роль медиаторов' липидной природы в формировании сенсибилизации.// Патол. физиол.-1992. - N3.- с. 47-51. (в соавт. со Святкиной О. Б., Порядиным Г. В., Вельтицевым KL Е.).

Зак 129 Тира« ЮООэкз.

ЦНИИТЗИавтос«льхозмал.